Các phương pháp xác định sự hiện diện và biểu hiện của gen ngoại lai

Các phương pháp xác định sự hiện diện và biểu hiện
của gen ngoại lai


I. Southern blot
Southern blot là một trong những phương pháp trung tâm của Sinh học phân
tử. Nó còn có tên gọi khác là Southern blotting, phương pháp lai Southern hay
phương pháp lai DNA .
Nguyên tắc của Southern blot là màng lai nitrocellulose có khả năng tiếp
nhận DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứu lai axit
nucleic khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960. Vào thời kỳ này DNA cố
định không được phân đoạn, chỉ đơn giản bao gồm DNA tổng số được gắn trên
màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel vào đầu thập
niên 1970 đã cho phép các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được
phân tách dựa trên cơ sở kích thước của chúng. Từ đó bước phát triển tiếp theo
của phương pháp là chuyển các đoạn DNA phân tách từ gel lên màng lai
nitrocellulose. Phương pháp này được E. M. Southern mô tả tại Ðại học
Edingburgh vào năm 1975. Phương pháp Southern blot đơn giản và hiệu quả.
Mặc dù đã được cải tiến nhưng phương pháp đang được sử dụng ở nhiều phòng
thí nghiệm sinh học phân tử sai khác không đáng kể so với phương pháp ban
đầu.
Southern blot bao gồm các bước cơ bản sau:
-Cắt DNA bằng enzyme hạn chế thích hợp.
-Ðiện di sản phẩm cắt trên gel agarose.
-Làm biến tính DNA (thông thường khi nó còn ở trên gel): ví dụ có thể nhúng
nó vào trong dung dịch NaOH 0.5M, DNA sợi kép sẽ được tách thành DNA sợi
đơn. Chỉ DNA sợi đơn mới có thể chuyển lên màng lai.
-Chuyển DNA đã biến tính lên màng lai. Thông thường màng lai được sử
dụng là màng nitrocellulose. Người ta cũng có thể sử dụng màng nylon. Màng
nitrocellulose điển hình có khả năng tiếp nhận 100µg DNA/cm
2

, trong khi màng
nylon có khả năng tiếp nhận 500µg DNA/cm
2
. Mặt khác màng nylon có khả năng
giữ DNA chắc hơn và ít đứt gãy hơn. Việc chuyển DNA thường được tiến hành
bằng hoạt tính mao dẫn trong khoảng vài tiếng hoặc có thể dùng một thiết bị thấm
chân không. Nếu dùng thiết bị thấm chân không thì sẽ nhanh hơn, chỉ mất
khoảng một tiếng. Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn DNA vẫn được giữ
nguyên không thay đổi.
-Lai DNA đã được cố định trên màng với mẫu dò (probe) DNA có đánh dấu.
Quá trình này dựa trên nguyên tắc bổ sung (giữa DNA trên màng lai với mẫu dò).
Ðể đánh dấu người ta thường sử dụng P
32
, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò
phát quang sinh học.
-Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò. Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng
xạ thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử
dụng biotin/streptavidin thì dùng phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dò
phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang.
Phương pháp Southern blot được thiết kế để xác định sự hiện diện, kích
thước, số lượng bản sao, tính đồng dạng của DNA trong một phức hợp. Ví dụ,
Southern blot có thể được sử dụng để phát hiện một gen đặc biệt ở trong một
genome nguyên vẹn.

II. Northern blot
Sau khi E. M. Southern mô tả phương pháp Southern blot vào năm 1975,
người ta đã dùng một phương pháp tương tự để xác định các đoạn RNA đặc biệt
gọi là Northern blot. Phương pháp này còn được gọi là Northern blotting, phương
pháp lai Northern hay phương pháp lai RNA.
Northern blot bao gồm các bước cơ bản sau:

-RNA (RNA tổng số hoặc chỉ mRNA) được phân tách bằng điện di trên gel
agarose.

Hình 3.1: Sơ đồ mô tả phương pháp Southern
blot

-RNA sau khi đã phân tách được chuyển lên màng lai (các phân tử RNA giữ
nguyên vị trí như ở trên gel).
-RNA cố định trên màng được lai với mẫu dò DNA sợi đơn (hoặc RNA) có
đánh dấu phóng xạ hoặc được gắn với một enzyme (alkalin phosphatase hoặc
horseradish peroxidase) tạo thành phân tử lai RNA-DNA (hoặc RNA-RNA) sợi
kép.

Hình 3.2: Sơ đồ mô tả phương pháp Northern blot

-Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được
đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ
với một cơ chất không màu. Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản
phẩm màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng
phim X quang một cách trực tiếp.
Phương pháp Northern blot cho phép phát hiện sự có mặt, xác định kích
thước, trọng lượng phân tử, khối lượng mRNA ở trong các mẫu khác nhau. Ðây là
một phương pháp rất tốt để phân tích sự biểu hiện của gen khi chúng ta cần định
lượng để phân biệt sự khác nhau giữa hai mẫu và nó rất nhạy bởi vậy chúng ta có
thể điện di một lượng lớn RNA tổng số hoặc mRNA trên gel.

III. Western blot
Western blot là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của
kháng thể để phát hiện protein đã được điện di trên gel SDS-PAGE (sodium
dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) và chuyển lên màng lai.

Western blot cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử, định
lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau.
Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay là phương pháp lai
thấm protein.
Western blot bao gồm các bước cơ bản sau:
-Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE.
-Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như
đã phân tách trên gel.
-Ủ màng lai đã cố định protein với một kháng thể sơ cấp (primary antibody).
Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một
phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm.
-Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có
enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm. Kháng thể thứ
cấp sẽ bám vào kháng thể sơ cấp giống như kháng thể sơ cấp đã bám vào
protein.
-Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Nếu
mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi
nào có mặt phức hợp protein-kháng thể sơ cấp- kháng thể thứ cấp-enzyme hay
nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm.
-Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng
phát ra do enzyme.

Hình 3.3: Sơ đồ mô tả phương pháp Western blot

IV. ELISA (Enzymee-Linked Immunosorbent Assay)
ELISA được mô tả lần đầu tiên vào năm 1971 và từ đó đã trở thành một
phương pháp được sử dụng ngày càng rộng rãi và quan trọng hơn trong nghiên
cứu, chẩn đoán và xét nghiệm bởi vì nó có khả năng phát hiện nhạy bén với một
lượng vật chất rất nhỏ.
ELISA đã thay thế một số kỹ thuật huyết thanh “cổ điển“ phức tạp, cồng kềnh

tốn nhiều thời gian hơn và mở rộng phạm vi phương pháp phát hiện virus cũng
như các marker liên quan đến sự nhiễm của chúng.
Xét nghiệm ELISA có thể được tiến hành với một số phương pháp như
ELISA “trực tiếp“, “gián tiếp“, “sandwich“ và “cạnh tranh“.
Nguyên tắc cơ bản của phương pháp ELISA là kháng nguyên đã hoà tan
trong dung dịch đệm thích hợp có thể phủ lên bề mặt plastic (như polystyrene).