CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYM LIPASE

Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT
TÍNH CỦA ENZYM LIPASE
Enzym thuỷ phân chất béo có nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các
tế bào của những cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển
của lipit từ cơ quan này sang cơ quan khác. Một khía cạnh quan trọng của hệ
enzym thuỷ phân chất béo là chúng chỉ xúc tác cho các phản ứng lý hố tại bề
mặt tiếp xúc giữa hai pha béo-nước, nhờ cơ chế hấp phụ bề mặt (kiểu xúc tác
sensu stricto). Hầu hết enzym Lipase là enzym hồ tan được trong nước hoạt
động trên những cơ chất khơng tan trong nước. Đặc tính phức tạp của loại xúc
tác này làm cho nó khó định lương đươc chính xác cả về tỷ suất bề mặt cũng
như những tham số tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha (như lực căng bề mặt, tính
nhớt bề mặt, điện thế bề mặt) và liên quan với chất lượng bề mặt của cơ chất
mà q trình phân ly chất béo phải phụ thuộc. Sự nhũ hố giữa nước và các
chất khơng tan trong nước sẽ cần đến sự tồn tại của các chất hoạt động bề mặt
như: các chất tẩy rửa, các chất béo khác nhau, protein… ngay tại bề mặt giao
tiếp giữa hai pha, vì vậy có thể ảnh hưởng một cách mạnh mẽ đến phương
pháp đo hoạt tính của enzym Lipase mà sự kìm hãm khơng đặc hiệu của lipase
do sự xuất hiện của Protein tại bề mặt tiếp xúc của hai pha dầu-nước là một ví
dụ điển hình.
Các enzym Lipase đã được định nghĩa bằng những thuật ngữ động học, được
dựa trên hiện tượng “ hoạt động bề mặt giữa các pha “, nghĩa là sự gia tăng
hoạt tính xuất hiện khi một phần cơ chất tan trong nước trở thành cơ chất
khơng tan trong nước. Q trình này chưa được quan sát trên các esterases
( nhóm enzym xúc tác sự tổng hợp và thuỷ phân các ester ). Cấu trúc 3-D của
lipase được xác định gần đây cho thấy các nếp gấp α/β của hydrolase và tâm ái
nhân có chứa gốc Serin. Một số lipase ( khơng phải là tất cả ) còn có vùng
kieểm sốt trung tâm hoạt động và hiện tượng “ hoạt động bề mặt “chưa phải
là tiêu chuẩn thích hợp để phân loại các esterases đặc biệt như lipase. Vì các
enzym thường được đặt tên theo kiểu phản ứng mà chúng xúc tác, lipase có thể
được định nghĩa lại là các carboxy-esterases hoạt động trên chuỗi

acylglycerols mạch dài: chúng là những enzym phân cắt lipit đơn giản.
Ở những nước cơng nghiệp phát triển, các chất béo ăn được đã có mặt trong
bữa ăn của con người, mà thành phần chủ yếu là triacylglycerols (TAG
s
) từ
100-150g mỗi ngày, chiếm khoảng 30% năng lượng mà cơ thể đưa vào hàng
ngày. Những phân tử TAG khơng thể tự đi qua màng ruột được. Một chuỗi các
phản ứng thuỷ phân và hấp thụ cần xảy ra để giải phóng hố năng có mặt
trong các mạch hydrocacbon của TAG sinh vật có thể sử dụng được.
Enzym lipase bên trong bộ máy tiêu hố đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong
những chu trình cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người và những động vật
bậc cao. Lipase hiện nay được sử dụng rộng rãi như những chất xúc tác chọn
lọc trong mơi trường có nước ( hoặc ít nước ) và nhiều phân tử tổng hợp mà có
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
thể được sử dụng như những cơ chất của lipase. Trong q trình này, chúng ta
chỉ đề cập đến sự phân tích lipase kéo theo sự thuỷ phân ester carboxylic.
Những phản ứng này thường được thực hiện dưới điều kiện hoạt độ của nước
thấp. Hơn nữa, người đọc được tham chiếu tới những điều lệ phổ biến mà liên
quan đến enzym Lipase trong phép phân tích lập thể chọn lọc.
Trong enzym học, người ta khơng định lượng enzym một cách trực tiếp mà
thường xác định gián tiếp thơng qua xác định mức độ hoạt động ( hoạt độ )
của enzym. Bởi vì, khi có mặt enzym thì sự hoạt động của nó được biểu hiện
ra ở chỗ nó làm thay đổi cac tính chất vật lý, hố lý cũng như tính chất hố học
của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác
mức độ hoạt động của enzym thơng qua xác định lượng cơ chất bị mất đi hay
lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng.
Về nguỵên tắc, có thể chia ra 3 nhóm phương pháp sau:
1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lương sản phẩm được tạo thành trong
một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzym xác định
2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của

cơ chất hay sản phẩm ứng với một nồng độ enzym nhất định.
3. Chọn nồng độ enzym cần thiết như thế nào để trong một thời gian nhất
định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm.
Ba nhóm phương pháp này được tóm tắt trong bảng sau :
Nhóm Các thơng số cố định Các thơng số thay đổi
1 Thời gian
Nồng độ enzym
Biến thiên của S hay P
2 Lượng cơ chất mất đi (hay
lượng sản phẩm tạo thành).
Nồng độ [E]
Thời gian
3 Thời gian
Lượng S mất đi (hay P tạo
thành)
Nồng độ E
Có thể tìm thấy trên các bài báo, tạp chí khoa học nhiều phương pháp để đo
hoạt tính thuỷ phân của enzym lipase. Những phương pháp này có thể được
phân loại như sau :
1. Phương pháp chuẩn độ ( Titrimetry )
2. Phương pháp quang phổ ( Spectroscopy ( photometry,fluorimetry ))
3. Phương pháp sắc ký ( Chromatography )
4. Phương pháp phóng xạ ( Radioactivity )
5. Phương pháp sức căng bề mặt ( Interfacial tensionmetry )
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
6. Phương pháp đục kế ( Turbidimetry )
7. Phương pháp đo độ dẫn điện ( Conductimetry )
8. Phương pháp hố học miễn dịch ( Immuno-chemistry )
9. Phương pháp hiển vi ( microscopy )
….

Phản ứng thuỷ phân triacylglycerol được xúc tác bởi enzym Lipase có thể
được viết :
TAG DAG MAG Glycerol
FFA FFA FFA
TAG = triacylglycerols
DAG = diacylglycerols
MAG = monoglycerols
FFA = free fatty acids.
I.Các phương pháp hố lý :
I.1. Sự biến mất của cơ chất :
I.1.1. Phương pháp đo độ đục :
a) Trong mơi trường rắn :
Phương pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester
carboxylic được dùng làm cơ chất , bản chất là xác định đường kính của vùng
khuyếch tán sản phẩm. Sự phân giải chất béo sẽ làm lan rộng vùng sáng màu
trên đĩa thạch. Hiện tượng quang học này chỉ quan sát được khi các acid béo
được giải phóng ra hồ tan một phần vào nước. Q trình sáng màu này là kết
quả của sự giảm kích thước của các hạt nhũ bị thuỷ phân có tác dụng làm giảm
ánh sáng khuyếch tán.
Kỹ thuật này cũng có thể được áp dụng trong q trình theo dõi sự thuỷ phân
của Twees do các enzym lipase khác nhau xúc tác.
b) Trong mơi trường lỏng:
Phương pháp này theo dõi sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian. Kỹ
thuật này rất nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối với các hệ nhũ tự nhiên ví dụ
như huyết tương chẳng hạn, thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác có thể ảnh
hưởng đến q trình. Thêm vào đó, kết quả khơng hồn tồn tuyệt đối là
những giá trị hoạt động của enzym Lipase và thu được dữ liệu đáng tin cậy. Vì
vậy, enzym Lipase thuần khiết được sử dụng để xây dựng một đường chuẩn.
Bước chuẩn hố này đã hạn chế sự khuyếch tán rộng của phương pháp nhạy
cảm này.

Pháp phân tích esterase bằng phương pháp đo độ đục đã được phát triển, sử
dụng một dung dịch Tween 20 với sự hiện diện của CaCl
2
, và sử dụng esterase
từ Lysobacter enzymogenes làm nguồn enzym. Phản ứng được theo dõi bằng
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
việc đo sự gia tăng mật độ quang ở bước sóng 500nm vì q trình thuỹ phân
giải phóng ra các acid béo từ Tween 20 và sự kết tủa của chúng dưới dạng
muối Canxi.
Phương pháp phân tích đo độ đục này đã được sử dụng để xác định hoạt tính
riêng của enzym lipase từ chủng Chromobacterium ( với liều lượng là 87
IU.mg
-1
) và chủng Candida cylindracea ( với liều lượng là 0.5 IU.mg
-1
).
II. Phương pháp đĩa Wilhelmy:
II.1. Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết:
Trong số các phương pháp xác định sức căng bề mặt thì kĩ thuật màng film
đơn phân tử tại bề mặt tiếp xúc của khơng khí -nước đã được phát triển rộng
và được nhóm nghiên cứu của Fréderic Beisson, Claude Rivìere cũng như
nhóm của Brockman sử dụng. Kỹ thuật này về cơ bản gồm một lớp Teflon
( lớp chống dính ) phủ trên máng, mà trên đó là một dung dịch. Một bản mỏng
Pt nhúng trong bề mặt của pha nước được gắn liền với một
electromicrobalance để đo áp suất bề mặt mà nó trực tiêp` liên quan đến sức
căng bề mặt.
Một vài cơng ty đã có sẵn thiết bị này và được thương mại hố: KSV
( Helsinki, Finland ), Kruss GmbH ( Hamburg, Germany ) và Kibron Inc
(Helsinki, Finland). Một màng film đơn phân tử của chất béo có thể được phân
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam

bố tại bề mặt của pha nước, sử dung dung mơi dễ bay hơi như chloroform để
hồ tan chất béo. Dung dịch chất béo được áp dụng ở dạng những giọt nhỏ mà
chúng có khả năng bay hơi được. Vùng bị chiếm giữ bởi lớp chất béo có thể là
hàng rào được điều chỉnh bởi một lớp Teflon qt trên bề mặt của pha nước.
Áp suất bề mặt có thể được duy trì bề mặt có thể được duy trì khơng đổi tự
động bằng cách sử dụng sự thun chuyển của Teflon mà được kiểm sốt và
điều chỉnh phụ thuộc vào đầu ra của electromicrobalance. Dung dịch chứa
enzym lipase được tiêm vào bên dưới màng film chất béo, áp suất bề mặt sẽ
giảm vì sự hồ tan của những sản phẩm phản ứng thuỷ phân chất béo. Khi lớp
màng chắn này di chuyển có tác dụng duy trì hằng số áp suất bề mặt, động học
của phản ứng có thể được theo dõi bằng cách ghi lại sự chuyểng động của lớp
màng chắn này theo thời gian.
Với kỹ thuật này, ta có thể đo và điều khiển những tham số bề mặt quan trọng
như áp suất bề mặt ( năng lượng tự do của bề mặt tiếp xúc giữa các pha) và
vùng phân tử của cơ chất. Phương pháp màng film đơn phân tử thích hợp để
nghiên cứu những phản ứng enzym trên chất béo mà được phân bố tại bề nặt
tiếp xúc khơng khí-nước.
Phương pháp này có độ nhạy cao, và lương chất béo thấp đáp ứng u cầu để
thực hiện những phép đo động học đáng tin cậy.
II.2. Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất:
Hầu hết những nghiên cứu động học về hoạt động của enzym thuỷ phân chất
béo đã được thực hiện invitro, dùng những chất béo thuần khiết làm cơ chất.
Thực tế, tất cả các mặt phân cách của sinh vật đều là sự pha trộn phức tạp của
hỗn hợp gồm lipit và Protein. Kỹ thuật đơn lớp lý tưởng thích hợp cho việc
nghiên cứu kiểu hoạt động của hệ enzym thuỷ phân chất béo tại mặt phân
cách, sử dụng hỗn hợp chất béo đã được điều chỉnh. Có 2 phương pháp từ hỗn
hợp chất béo tạo màng đơn lớp tại bề mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách
phân bố hỗn hợp chất béo khơng tan trong nước vào một dung mơi hữu cơ dễ
bay hơi, hoặc tiêm một dung dịch nhũ tương của chất tẩy rửa vào trong pha
nước,được bao phủ bởi lớp đơn chất béo khơng tan.

Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và
Verger [70] cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở
mật độ bề mặt khơng thay đổi và thành phần chất béo cố định như sơ đồ biểu
diễn trong hình Fig 1A.
Màng chắn bằng teflon được đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “ Zero-order “
để ngăn truyền thơng bề mặt giữa màng chứa ( reservoir ) và bộ phận phản ứng
(reaction compartment). Áp suất bề mặt được xác định rõ đầu tiên bằng cách
đặt bản Pt vào trong bộ phận phản ứng , nơi mà hỗn hợp film được phân bố ở
áp suất u cầu. Áp suất bề mặt được đo sau khi chuyển bản Pt tới màng chứa,
nơi mà film cơ chất thuần khiết được phân bố tiếp sau.Áp suất bề mặt của
màng chứa bằng với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng bằng việc di chuyển
lớp màng chắn di động. Màng chắn giữa 2 bộ phận được chuyển dịch cho phép
Tổng quan về enzym lipase từ cá GVHD: Trần Bích Lam
những bề mặt tiếp xúc với nhau và enzym được tiêm vào trong bộ phận phản
ứng và kết quả động học được ghi chép như mơ tả.
II.3. Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp:
Bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp đơn phân tử, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo
rằng giá trị tối ưu xảy ra ở mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt. Giá
trị chính xác của điểm tối ưu biến đổi tuỳ theo sự kết hợp giữa enzym và cơ
chất được sử dụng. Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích
hiện tượng này là: Giả thuyết đầu tiên, được đề nghị bởi Hughes và những
người làm việc thuộc thế hệ sau ơng: Sự định hướng phụ thuộc màng bao của
cơ chất có lẽ là một trong những nhân tố điều hồ mà q trình phân giải chất
béo phụ thuộc.
Sử dụng những enzym đã được đánh dấu phóng xạ, Verger và Pattus đã thiết
lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự tương quan giữa vận tốc và áp
suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính hoạt động bề mặt của
enzym. Thật vậy, sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system)
nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và tỉ lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều
trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỉ lệ này thường là 1 cm

-1
, phụ thuộc vào độ
sâu của cái máng. Trong khi đó, ở khối lớn tỉ lệ này có thể cao khoảng 10
-5
cm
-1
, phụ thuộc vào lượng lipit sử dụng và trạng thái của sự phân giải lipit. Kết
quả là ở trường hợp của khối lớn sự hấp phụ hầu hết các enzym xuất hiện tại
bề mặt giao tiếp, trong khi ở lớp đơn chỉ có 1 phân tử enzym trong hàng trăm
các enzym có thể xuất hiện tại bề mặt giao tiếp. Vì ở tình trạng này, một lượng
nhỏ khơng xác định ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ thuỷ phân được hấp phụ
trên lớp đơn. Để khắc phục sự giới hạn này thì nhiều phương pháp đã được đề
ra để phục hồi và đo lượng enzym đã được hấp phụ tại bề mặt giao tiếp.
Sau khi đo tốc độ, Momsen và Brockman [77] đã chuyển lớp đơn đến 1 mẩu
giấy kỵ nước và những enzym được hấp phụ sau đó được phân tích bằng
phương pháp chuẩn độ. Sau khi so sánh với tốc độ của mẫu trắng và pha mang
( subphase ), số lượng của những enzym được hấp phụ sẽ được tính tốn từ
vận tốc của mạng lưới và hoạt động của những enzym đặc hiệu.
Trong bảng phân tích những enzym hoạt động phóng xạ, màng film được hút
ra bằng cách lồng những đáy của ống mao quản thuỷ tinh cong vào trong chất
lỏng và nổi lên trên đỉnh của một phần thành Teflon. Khi những phân tử
enzym được đánh dấu phóng xạ tan trong pha mang sẽ bị hút ra cùng với
những thành phần đi kèm với màng film. Kết quả sẽ được kiểm tra dựa trên sự
hoạt động phóng xạ trong cùng một thể tích của pha mang được hút ra. Sự
khác biệt giữa 2 giá trị thực sự đã phản ánh được hoạt động phóng xạ vượt
mức tồn tại ở bề mặt tiếp xúc, được quy cho phân tử enzym có liên kết với
màng film. Bởi vì có thể sử dụng kỹ thuật lớp đơn để đo tốc độ phản ứng được
thể hiện bằng đơn vị mol.cm
-2
.min

-1
và sự vượt mức của enzym ở bề mặt bằng
đơn vị mg.cm
-2
. Ta dễ

dàng đạt được giá trị hoạt động đặc hiệu của enzym
thường được đo bằng đơn vị là mol.min
-1
.
mg
-1
( IU.mg
-1
).