Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của A-Mangostin Từ Vỏ Quả Măng Cụt (Garcinia Mangostana L.) Lên Vi Khuẩn

1


VI N HÀN LÂM KHOA H C VÀ CÔNG NGH VI T NAM
VI N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH V T
****************

LU NăV NăTH C S SINH H C

TÀI:ăXỄCă

NH T N SU Tă

T BI Nă I M VÙNG

D ậ LOOP TRONG H GEN TY TH

NG

Chuyên ngành

: Sinh h c th c nghi m

Mã s

: 60 42 01 14

Ng

iăh

Ng

i th c hi n

L p

I VI T NAM

ng d n khoa h c : PGS.TS. LÊ QUANG HU N
: NGUY N THÙY LINH
: Cao h c K17

Hà N i ậ 2015

2


M ă

U

t v năđ

1.

Trong vƠi n m tr l i đơy, h
nh m t ch th sinh h c đang đ

ng nghiên c u s d ng ADN ty th (ADN ty th )
c phát tri n nhanh chóng trong nhi u l nh v c khác

nhau. Bên c nh đó, nh ng v n đ v r i lo n ty th liên quan đ n b nh ty th , các b nh
chuy n hóa hi m g p, lưo hóaầ.đ

c xem là m t trong nh ng m c tiêu nghiên c u c

b n c a di truy n h c và y h c.
V i nhi u phát minh c ng nh các nghiên c u m i v di truy n t các th k
tr

c mà tiêu bi u là vi c công b trình t h gen ng

chi u” (Cambridge Reference Sequencing ậ CRS) đ

i hay còn g i lƠ “ trình t tham
c Anderson và c ng s công b

đ u tiên vƠo n m 1981 vƠ “trình t tham chi u s a đ i” ậ rCRS (Andrew và c ng s .
1991) đư t o đi u ki n thu n l i cho các nhà khoa h c nghiên c u sinh h c mƠ đ c bi t
là nh ng nghiên c u v loƠi ng
các cá th ng

i. Sau khi có b n đ gen ng

i, ng

i ta th y r ng

i gi ng nhau đ n 99.9% và ch khác nhau r t nh (0.1%) v c u trúc h

gen. Trong 0.1% khác bi t gi a hai cá th thì có đ n h n 80% lƠ các đa hình nucleotit
đ n (Single Nucleotide Polymorphism vƠ đ
đ

c s d ng r ng rãi các m ng y d

ích trong quá trình ti n hóa loƠi ng

c vi t t t là SNP). Chính vì th SNP

c h c, hình s và cung c p nh ng ki n th c h u
i

các vùng đ a lý trong b i c nh và l ch s khác

nhau.
Vi c tìm đ

c danh sách các SNP c a ng

i Vi t Nam s góp ph n h tr vào

nghiên c u ti n hóa di truy n, đ ng th i c ng cung c p đ
có liên quan đ n các c n b nh ung th , r i lo n

ng

c thông tin v các đ t bi n

i. Nh n th c đ

c t m quan

tr ng v vi c tìm hi u các d li u di truy n v dân t c Vi t Nam chính vì th trong
khuôn kh lu n v n nƠy, chúng tôi ti n hành nghiên c u: “Xácăđ nh t n su tăđ t bi n
đi m vùng D ậ Loop c a h gen ty th ng
2.

M c tiêu:
L pđ

c a ng
3.

i Vi t Nam”.

c danh sách các SNP trong vùng D ậ Loop c a AND ty th đ c tr ng

i Vi t Nam.

N i dungăđ tài:
- Tách chi t ADN t các m u móng tay
- Gi i trình t gen vùng D ậ Loop
3


- Phân tích trình t gen vùng D ậ Loop

các m u và so sánh trình t m u phân

tích v i trình t tham chi u s a đ i (rCRS) vƠ tìm đ c tr ng SNPs
Nam.

4

ch ng ng

i Vi t


CH
1.

NGăIăậ T NGăQUANăTÀIăLI U

Gi i thi u chung v ty th
Ty th (Mitochondrion) là bào quan có th tìm th y trong g n nh t t c các t

bào có nhân. S l

ng c a ty th trong m i t bào

m i loài là khác nhau. Ty th là

trung tâm hô h p c a t bƠo, lƠ n i s n sinh ra ATP m t d ng n ng l

ng có th s

d ng cho các ph n ng c a t bào. Không có ty th các t bào s ph i d a vào quá
trình đ

ng phân k khí đ cung c p t t c adenosin triphotphat (ATP) cho ho t đ ng

c a mình. Ty th có h gen đ c l p nên có kh n ng t sinh s n b ng cách phơn đôi ty
th m đ sinh ra các ty th con (Alberts B, Johnson A, Lewis J và c ng s . 2002).
Hình 1.1.

Hìnhă1.1.ăTyăth
(Thepsychguru.com – 2012)
1.1. C u t o và ch căn ngăc a ty th

1.1.1. C u t o
Ty th là bào quan có hình tròn ho c hình tr dƠi, có kích th

cđ

ng kính 0.1

ậ 0.5 µm, chi u dài 1 ậ 2 m. Ty th có c u trúc màng kép bao g m màng ngoài (outer
membrane) và màng trong (inner membrane). Màng ngoài ch a các protein t p kênh
l n (g i là porin) và cho phép t t c các phân t nh h n 5kDa th m qua đ
trong đ

c. Màng

c cu n g p r t ph c t p t o thành các c u trúc g i là mào ho c r ng l

c

(cristate). Khác v i màng ngoài, màng trong ch th m ch n l c m t s ion. Vùng b

m t khá l n c a màng trong ty th (intermembrane space) ch a các enzym tham gia
vào quá trình oxy hóa - photphoryl hóa và t ng h p ATP. Ph n ch t n n (matrix space)
c a ty th ch a các enzym c n thi t cho s oxy hóa pyruvat và các axit béo, các enzym
tham gia vào chu trình axit tricacboxylic (ATC) (Cooper. 2000). Khoang n n c ng
5


ch a nhi u b n sao c a ADN ty th , các ribosome c a ty th , RNA v n chuy n
(tRNA) và nhi u lo i enzym c n thi t cho phiên mã và d ch mã c a các gen ty th .
Hình 1.2.

Hình 1.2. C u trúc ty th
(hallcpbio.com)

1.1.2. Ch căn ngăc a ty th
Ty th là trung tâm gi i phóng và chuy n hóa n ng l
hóa ậ oxy hóa). Ph n l n n ng l

ng đ

ng c a t bào (photphoryl

c tích l y trong các nguyên li u h u c đ

c

gi i phóng và chuy n thành d ng ATP s d ng trong pha phân gi i hi u khí di n ra
ty th . Vì v y ty th đ

c xem lƠ “nhƠ máy n ng l

ng” c a t bào (Dahout, Gonzalez

. 2006).
Trong m i t bào s l

ng ty th dao đ ng t 50 ậ 1.000. Các t bào ho t đ ng

m nh nh t bƠo c vƠ t bào gan có s l

ng l n ty th .

n i t bào ho t đ ng nhi u

thì s vách ng n l i t ng lên, ng v i s enzym t ng lên. Bên trong t bào ty th phân
b
l

n i c n dùng nhi u n ng l

ng. Ví d trong t bào gan, ty th n m chèn m ng

i n i ch t h t n i c n nhi u n ng l
T ng h p n ng l

r t nh

n ng l

cacbohydrat đ

ng d

ng cho t ng h p protein.

ng trong ty th thông qua quá trình đ
tr

c a gluco đ

ng phân. Ch m t ph n

c chuy n hóa (2ATP). S

c hoàn t t khi s n ph m c a quá trình đ

chuy n vào trong ty th và b oxy hóa t O2 thành CO2, n

chuy n hóa

ng phơn (pyruvat) đ

c

c và 36 ATP.

Các protein liên quan trong quá trình oxy hóa ậ photphoryl hóa đ u đ nh v
màng trong ty th , bao g m các thành ph n trong chu i truy n đi n t (ph c h 1 đ n

6

4), enzym F0F1 ATP synthase. Quá trình truy n đi n t và t ng h p ATP đ

c tóm t t

hình 1.3.

Hìnhă1.3.ăS ăđ ăt ngăh păATPătrongătyăth
Ty th còn có kh n ng t ng h p các ch t: photpholipit, axit béo vƠ đ c bi t là
protein (protein c u trúc và các enzym). ADN trong ty th ch u trách nhi m t ng h p
ph n protein ty th .
Ty th có kh n ng di truy n đ c l p đ i v i nhân. Tuy nhiên v n có s ph i h p
gi a nhơn, c ch t c a t bào ch t v i c ch t c a ty th trong quá trình bi u hi n c a
gen (phiên mã và t ng h p protein).
căđi m c a ADN ty th ng

1.2.

i và ng d ng trong nghiên c u

Ty th đóng vai trò quan tr ng đ i v i s ti n hóa c a đ ng v t. Nh ng nghiên
c u ph bi n hi n nay đ i v i di truy n

ng

i là trên ADN ty th (mitochondrial

DNA ậ ADN ty th ). M c dù b gen ty th ng

i ch b ng 0.0005% so v i toàn b

kích th

c tìm th y trong gen ty th có liên

c b gen trong nhơn nh ng các SNP đ

quan đ n nhi u b nh chuy n hóa, r i lo n c ng nh các đ c tr ng
là các SNP

1.2.1.

ng

i vƠ đ c bi t

vùng D ậ Loop.

căđi m c a h gen ty th ng

H gen ty th ng

i

i có chi u dài kho ng 16.569 bp, là m t phân t m ch vòng

kín n m trong ch t n n ty th và có hàng ngàn b n sao trong m t t bào. Phân t ADN
ty th có hai chu i khác nhau v thành ph n nucleotit:
 Chu i n ng có ch a nhi u Guanin (H ậ strand), mã hóa cho 28 gen.

7




Chu i nh ch a nhi u Cytosin (L ậ strand), mã hóa cho 9 gen trong t ng s 37

gen c a h gen ty th .
Trong 37 gen này có 13 gen mã hóa cho 13 chu i polypeptide c n thi t cho h
th ng photphoryl hóa ậ oxy hóa, bao g m 7 ti u đ n v c a ph c h I (complex I), m t
ti u đ n v c a ph c h III (complex III), 3 ti u đ n v c a ph c h VI (complex VI)
và hai ti u đ n v c a ph c h V (complex V). S gen còn l i mã hóa cho 22 tRNA, 2
rRNA (12S và 16S) ph c v quá trình d ch mã c a ty th (Anderson S. 1981). Các
chu i polypeptit khác c n thi t cho c u trúc và ch c n ng c a ty th đ
gen nhơn vƠ đ

c mã hóa b i

c t ng h p trong ribosom c a t bào ch t.

M t đ c đi m đáng chú Ủ lƠ h gen ty th ng
hóa. Ch có kho ng 7% gen ty th ng

i có r t ít ph n trình t không mã

i không mã hóa các protein, rRNA, tRNA

trong khi ph n l n h gen nhơn lƠ các vùng ADN không mư hóa (intron). o n ADN
gi a các gen ty th ho c là không có ho c là ng n h n 10 bp.

mã k t thúc mRNA c n đ

m t vài gen thay vì có

c polyadenin hóa đ t o thành mã k t thúc. Kho ng 90%

s gen ty th không mã hóa l i n m trong vùng đi u khi n hay D ậ Loop. Ph n l n các
trình t liên quan t i quá trình nhơn đôi c a ADN ty th hay quá trình phiên mư đ u
n m trong ho c g n vùng D ậ Loop.

o n D ậ Loop có kích th

c kho ng 1.1 kb

ADN ty th có m t s vùng b t bi n n m trong vùng D ậ Loop bao g m vùng
promoter và vùng CSB (Conserved Sequence Block) I, II và III. Vì các trình t b t
bi n nƠy đ u n m
nên chúng đ

D ậ Loop vƠ đ

cb ot n

r t nhi u loƠi đ ng v t có x

ng s ng

c cho r ng có vai trò quan tr ng trong quá trình nhơn đôi c a ADN ty

th . Ví d , CSB I có v trí ngay g n vùng kh i đ u c a quá trình nhơn đôi chu i n ng

(Wallberg and Clayton. 1981). Thêm n a, vùng D ậ Loop còn ch a các vùng siêu bi n
(hypervariable regions) HVI, HVII và HVIII. Nh ng vùng này có t n su t đ t bi n cao
h n đáng k so v i các vùng khác c a h gen ty th (Greenberg. 1983).

8


Hìnhă1.4.ăC uătrúcătyăth ăng

i

(Innovitaresearch – 2003)

1.2.2. V tríăvƠăđ dƠiăvùngăgenăđi u khi n D ậ Loop
Nh đư gi i thi u

trên, vùng gen đi u khi n D ậ Loop có chi u dài x p x 1.100

bp và ch a các trình t kh i đ u cho quá trình tái b n h gen ty th vƠ các đo n đi u
khi n cho quá trình phiên mã c a các gen ch c n ng trong vùng đ

c mã hóa

(Anderson. 1981, Lightowlers. 2001). H th ng đánh s baz b t đ u t i đi m g n
gi a vùng đi u khi n vƠ đi v hai phía, vì th vùng đi u khi n tr i dài t v trí 16024
đ n 16569, sau đó ti p t c t v trí baz 1 cho đ n 576.

ơy lƠ vùng xu t hi n nhi u

đ t bi n nh t v i t n s đ t bi n cao h n so v i các vùng khác c a h gen ty th

(Horai. 1995, Sorenson, Fleischer. 1996). Hình 1.5

Hìnhă1.5.ăVùngăđi uăkhi năDăậ Loopăc aătyăth ăng
()
9

i


 Vùng siêu bi n 1 (HV1) kéo dài t v trí 16024 đ n 16365.
 Vùng siêu bi n 2 (HV2) kéo dài t v trí 73 đ n 340.
 Vùng siêu bi n 3 (HV3) kéo dài t nucleotit 438 đ n 574.
1.3.

aăhìnhănucleotităđ nă(SingleăNucleotideăPolymophismsăậ SNPs)

1.3.1. aăhìnhănucleotităđ nălƠăgì?
a hình nucleotit đ n hay còn g i lƠ SNPs, đ

c đ nh ngh a lƠ bi n th trình t

ADN x y ra khi m t nucleotit đ n A, T, G hay C trong h gen khác bi t so v i các cá
th khác trong cùng m t loài.

Hìnhă1.6.ă aăhìnhănucleotităđ n
(learn.genetics.utah.edu)
cá th ng

i, có 99.9% là gi ng nhau, ch 0.1% là khác bi t. S khác bi t này

có th lƠ các đ c tr ng tính tr ng. Ví d nh các s phát tri n b nh nƠo đó

ng

i

ho c ki u hình ầ
Nh ng bi n đ i này có th không có h i (nh ng thay đ i v ki u hình), có h i
(gây b nh ung th , b nh tim, Huntington’s, b nh tan huy t b m sinh), ho c phát tri n
sau khi v giƠ (đơy lƠ nh ng bi n đ i đ

c tìm th y trong vùng mư hóa vƠ đi u hòa

gen).

1.3.2. Các v trí SNP trên gen
SNP có th n m trong vùng mã hóa các gen, vùng không mang mã ho c trong
vùng xen gi a các gen. Các SNP trong trình t mã hóa không nh t thi t s làm thay
đ i trình t các axit amin.

10


Các SNP xu t hi n

ngoƠi gen thì th

ng không nh h

ng đ n ch c n ng và

s n ph m c a protein.
Các SNP x y ra trong vùng gen không mư hóa lƠm thay đ i hƠm l
đ

ng protein

c t o ra.
Các SNP xu t hi n trong vùng gen mã hóa (t đó d n đ n thay đ i bi u hi n gen

nh hình 1.7.

Hình 1.7. V trí SNPs trong gen
()
Tuy nhiên trong m t s tr
v n có th gây nh h

ng h p, SNP không n m trong vùng mã hóa protein

ng đ n s n i ghép các gen, tác đ ng lên các y u t phiên mã,

lƠm suy thoái RNA thông tinầ. S bi u hi n gen b nh h

ng b i d ng nƠy đ

cg i

là m t eSNP (s bi u hi n SNP) và có th bi u hi n t ng ho c gi m trong gen.

1.3.3.

ng d ng và t m quan tr ng
ng d ng đ u tiên c a SNPs ph i k đ n đó lƠ chìa khóa ti m n ng trong vi c

ti n hành y h c cá nhân. Các bi n th trong trình t ADN c a con ng
h

i có th

nh

ng đ n cách c th phát tri n b nh, cách c th đáp ng v i các tác nhân gây b nh,

các hóa ch t, thu c, vacxin và các lo i tác nhân khác. Tuy nhiên, vai trò quan tr ng
nh t c a chúng trong các nghiên c u y h c lƠ đ so sánh các vùng c a h gen gi a các
nhóm ng

i (có th là gi a b nh nhơn vƠ ng

i kh e m nh trong các nghiên c u

m c toàn b h gen (Genome Wide Association studies ậ GWAS)).
M t SNP có th là nguyên nhân gây ra m t b nh di truy n.
ph c t p, các SNP th

ng không ho t đ ng đ n l , chúng th
11

i v i các b nh

ng ho t đ ng trong m t


s k t h p v i các SNP khác đ bi u hi n m t trình tr ng b nh nh ta th y
loưng x

b nh

ng.

Các nghiên c u v SNP không nh ng t o ra đi u ki n thu n l i trong quá trình
phát hi n các bi n th di truy n và b nh di truy n mà còn phát tri n nghiên c u nh m
tìm ra cách phòng ng a và ch a b nh trong t

ng lai. Các SNP có th mang l i các

ph n ng khác nhau đ i v i thu c đi u tr . Ngoài ra nhi u SNP đ

c s d ng làm ch

th giúp cho vi c l p b n đ gen liên quan đ n b nh ho c m t đ c đi m nƠo đó. Nh ng
SNP có liên h v i các b nh
mi n, b nh th n kinh có th đ

ng

i nh ung th , các b nh truy n nhi m, các b nh t

c s d ng đ tìm ra đích tác d ng c a thu c và các li u

pháp ch a tr (John M. Butler và c ng s ., 2004).
N m 2004, John M.Butler và c ng s c ng đã ch ra m t vai trò khác c a SNP đó
lƠ đ c tr ng cho dơn t c ng

i nƠo đó, nh ng dân t c phân b

không gian, th i ti t khác nhau th
1.4.

các khu v c đ a lý,

ng có nh ng đ c tr ng riêng.

t bi n ty th và b nh ty th
Do h gen ty th ch mã hóa cho m t s l

ch c n ng ty th còn đ
quy t đ nh vƠ đ

ng r t ít protein/enzym. Chính vì v y

c th c hi n nh vào hàng lo t các protein/enzym do gen nhân

c t ng h p trong t bào ch t r i đ

c v n chuy n đ n ty th . Chính

vì v y, các r i lo n ty th (hay b nh do ty th có th phát sinh do nh ng đ t bi n
nhân ho c gen ty th (ADN ty th ). M t s r i lo n nh h

ng đ n m t c quan nh

b nh th n kinh th giác di truy n Leber. Nh ng c ng có nh ng r i lo n nh h
r t nhi u c quan vƠ th
Hi n nay ng

gen

ng đ n

ng có nh ng đ c đi m n i tr i v th n kinh ậ c .

i ta đư bi t đ n có trên 150 b nh di truy n khá nhau theo m u h

do ty th quy t đ nh. Các b nh do r i lo n ADN ty th th

ng r t đa d ng. Chúng có

th liên quan đ n r i lo n quá trình mã hóa protein ho c đ n thu n ch là nh ng đ t
bi n đi m thay đ i các nucleotit (Sevidei et al. 2002).

1.4.1.

t bi n ty th trong vùng D ậ Loop
t bi n đi m

Phơn tích đ t bi n ADN ty th

b nh ung th vú (Tan và c ng s . 2002) đư gi i

trình t h gen ty th trên 19 c p mô ung th vƠ mô bình th

ng c a b nh nhơn vƠ đư

cho th y 74% b nh nhơn mang đ t bi n soma, trong đó có 81.5% đ t bi n thu c vùng
D ậ Loop.

12


V i b nh ung th bu ng tr ng (Liu và c ng s . 2004) đư xác đ nh đ

c 60% đ t

bi n ADN ty th , trong đó ph n l n là d ng đ ng nh t (homoplasmy) và h u h t lƠ đ t
bi n đi m T ậ C ho c G ậ A. B n vùng có đ t bi n đi m này là D ậ Loop, 12sRNA,
16S rRNA và cytochrome b, ch ng t các vùng này là nh ng vùng nóng có t n su t
đ t bi n cao trong b nh ung th bu ng tr ng.
Phân tích

b nh ung th d dày (Wu và c ng s . 2001) đư xác đ nh đ

mang đ t bi n soma

c 48%

vùng D ậ Loop, trong s đó có t i 67% lƠ đ t bi n thêm ho c

m t baz t i v trí nucleotide 303 ậ 309 (V trí D310).
Trong các nghiên c u khác (Burgart và c ng s . 2001) đư tìm th y đ t bi n m t đo n

nh (50 bp) trong vùng D ậ Loop

4/32 (12.5%)

b nh nhơn ung th d dày.

Thêm đo n
(Wu và c ng s . 2001) đư xác đ nh đ

c đ t bi n thêm đo n nh (ả 260 bp vƠ ả

520 bp) trong vùng D ậ Loop c a ADN ty th trong mô ung th c a m t b nh nhân
ung th d dƠy. Hai đ t bi n nƠy đ c tr ng b i có 2 ho c 3 đo n l p l i k ti p nhau.

1.4.2.

t bi n ty th n m ngoài vùng D ậ Loop

Các b nh nh

li t m t t ng ti n kinh niên (Chronic Progressive External

Ophthalmoplegia, CPRO), h i ch ng Kearn ậ Sayre (Kearn ậ Sayre syndrome, KSS),
đái đ

ng vƠ cơm đi c (Diabetes and deafness) đ u do m t đo n ho c s p x p l i trong

gen t i v trí 1555G. Các đ t bi n G1177A, T14484C, G3460A, 14459A, c ng lƠm
bi n đ i protein, d n đ n li t th n kinh th giác di truy n Leber (Leber hereditary optic
neuropathy, LHON).

t bi n trong gen cytb gây b nh không dung n p v n đ ng và

myoglobin ni u (Chia-Chi Hsu và c ng s . 2013)
Cho đ n nay nhi u d ng đ t bi n ADN ty th đ

c xác đ nh, các đ t bi n này

bao g m: đ t bi n đi m, đ t bi n thêm ho c m t baz , đ t bi n l p đo n, m t đo n hay
thay đ i s l

ng b n sao ADN ty th .

t bi n đi m
Tan và c ng s . 2002 phơn tích đ t bi n ADN ty th
18.5% b nh nhân mang đ t bi nđ

b nh ung th vú vƠ ch ra

c xác đ nh trong các gen 16S rRNA, ND2 và

ATPase 6. Trong s các đ t bi n trên đ t bi n thêm ho c m t baz chi m 42% thu c
vùng D ậ Loop, còn l i 52% lƠ đ t bi n đi m thu c vùng mã hóa và không mã hóa.

13


t bi n ADN ty th đ

c tìm th y

b nh ung th đ i tr c tràng (Polyak và c ng s .

1998) đư tìm th y đ t bi n ADN ty th trong các vùng mã hóa ND1, ND4, ND5,
cytochrome b, COXI, COXII vƠ COXIII c ng nh các gen rRNA 12S vƠ 16S.
M t đo n
ADN ty th b m t m t đo n l n nh m t đo n 4977 bp đư đ

c xác đ nh

ung

th vú, ung th đ i tr c tràng.
Thay đ i s b n sao ADN ty th
Bi n đ i v s b n sao ADN ty th đư đ
S b n sao ADN ty th t ng
Bi n đ i theo h

c phát hi n

nhi u lo i b nh ung th .

ung th tuy n giáp, ung th ph i, ung th đ i tr c tràng.

ng gi m s b n sao ADN ty th đ

c xác đ nh th y

b nh nhân ung

th vú, ung th bi u mô t bƠo gan, ung th bu ng tr ng. Nh v y bi n đ i v hàm
l

ng ADN ty th có liên quan v i lo i ung th .
Ng

i ta cho r ng s l

ng b n sao ADN ty th trong b nh ung th có th ph

thu c vào v trí c a đ t bi n trong b nh ung th đó. Ví d nh các đ t bi n trong vùng
D ậ Loop đi u khi n s sao chép ADN ty th s làm gi m s b n sao. M t khác đ t
bi n ADN ty th

các gen mã hóa cho các protein c a chu i photphoryl hóa ậ oxy hóa

l i có th lƠm t ng s b n sao nh lƠ m t cách đ đáp ng l i s m t ch c n ng c a ty
th .

14


CH
2.1.

NGă2.ăV TăLI UăVÀăPH

NGăPHỄPăNGHIểNăC U

V t li u

2.1.1. Ph

ngăphápăl y m u

M u sinh ph m đ
nh ng ng

c dùng đ tách chi t ADN là móng tay ho c móng chân c a

i kh e m nh, không có quan h huy t th ng, kích c m u (n=200). Quy

trình thu th p m u đ

c ti n hƠnh theo các b

(A)

(B)

(C)

Hìnhă2.1.ăCácăb
(A) Móng tay/móng chơn đ
(B)

c nh trong hình 2.1 .

(D)

căti năhƠnhăthuăth păm uăsinhăph m
c r a s ch b ng xƠ phòng vƠ n

eo g ng tay đ tránh nhi m ADN t ng

(C) S d ng c t móng tay m i ho c đư đ
trong n

c 5 phút. M u đ

bƠn tay/chơn đ thu đ

i nƠy sang ng

c tr

c khi l y m u

i khác

c kh trùng hoàn toàn b ng cách đun

c l y ít nh t là 1 bên bàn tay, n u có th s l y

c 2

c nhi u m u h n.

(D) M u móng tay/chơn đ

c đ ng trong d ng c ch a m u đư đ

nh túi nh a ho c phong bì đ d dàng g i đi.
(E)

(E)

óng gói vƠ chuy n m u đi theo h

ng d n.

2.1.2. Hóa ch t
Agarose (Sigma)
B kit tinh s ch DNA t ng s (Fermentas)
B kit tinh s ch s n ph m PCR (Fermentas)
B kit dùng cho ph n ng PCR (Roche)
Các m i cho ph n ng PCR đ t c a (Sigma)
Proteinase K (Fermentas)
Dung d ch: Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25:24:1)
Dung d ch : Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1)
Etanol (Fermentas)
RNase A (Fermentas)
H2O vô trùng (Fermentas), Marker 1 kb (Fermentas)
15

c kh trùng


2.2. Trang thi t b
Các thi t b khác phòng thí nghi m tr ng đi m Công ngh Gen, Vi n Công ngh

Sinh h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam.
Các trang thi t b s d ng cho nghiên c u đ
ng d ng

c li t kê trong B ng 2.1.

Thi t b

Hãng s n xu t
Eppendorf CHLB

Ly tâm nhanh
Ly tâm

Avanti TM 30 centifuge

Ly tâm l nh

Beckman

o OD

So màu
o pH
Cân

Hewlett Packard, M

S20

Metter Toledo

Cân 10-4

Ohaus

i n di

i n di Agarose

Pipetman
Kh trùng
Gi i trình t
DNA
PCR

Bio-rad

10µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl,
1ml

Eppendorf

HVE-50

Hirayama, Nh t B n

ABI 3100 Avant

(Applied, Biosystem).

PCR 9700

(Applied, Biosystem).

Máy khu y t

RotoLab, OSI

Vortex

Rotolab, OSI

n/gia nhi t

B

n nhi t

Techne, OSI

Lò vi sóng

Samsung

T l nh sâu ậ 750C, T l nh
-200C

T l nh

T l nh th
Ch p nh

c

ng

Sanyo, Nh t B n
Sanyo, Nh t B n

Máy soi ch p nh gel

Phamarcia

T c y

Sanyo, Nh t B n
B ng 2.1. Danh sách các trang thi t b s d ng cho nghiên c u

2.3. Ph n m m tin sinh h c
Các ph n m m tin sinh h c đ
chúng đ

c s d ng trong nghiên c u này và ch c n ng c a

c li t kê theo B ng 2.2.
16


Ch c n ng

Ph n m m

Ki m tra ch t l

BioEdit

a ch

ng trình t và so

/>
sánh trình t

oedit.html

So sánh trình t v i gen chu n

BLAST

/>
công b trên ngân hàng gen

SOFTGEN Bao g m các ph n m m b tr tìm
đ t bi n đi m

ETICS

/>
B ngă2.2.ăPh năm măs ăd ng

2.4. Ph

ngăphápănghiênăc u

2.4.1. Ph

ngăphápătáchăchi t ADN t móng tay

D a theo ph

ng pháp tách ADN t

móng tay s

(Sambrook và c ng s . 1989) vƠ quy trình đ
- M u móng tay đ

d ng Phenol: Chroloform

c tóm t t nh sau:

c cho vào ng Eppendorf 1.5 ml, r a 5 ậ 10 l n b ng n

kh trùng
- R a l i b ng c n 70%
- B sung 200 µl EDTA (pH 8, 0.5M)
-

o nh ,

trong 1h

nhi t đ phòng

- Lo i d ch, b sung 200 µl SDS trong EDTA + proteinase K (5 µl)
-

trong 1h

- R a l i b ng n

c kh trùng

- B sung 400 µl NaOH 2N r i qua đêm
- Ch nh pH v 6 ậ 7
- B sung dung d ch 25:24:1 theo t l 1:1
- Ly tâm 12000 v/p trong 10 phút
- Thu d ch trong
- B sung Etanol 100% + Natri Axetat NaOAc 3M
-

trong t -200C trong 30 phút

- Ly tâm thu t a
- R a l i t a b ng c n Etanol 700
- Ly tâm
- Làm khô và hòa tan l i b ng n

c
17

c


2.4.2.
Ph

nhăl

ng ADN tách chi t b ngăph

ngăphápăquangăph k

ng pháp quang ph k cho phép xác đ nh m t cách t

đ ng th i ki m tra đ

ng đ i n ng đ ADN

c đ tinh s ch c a m u ADN tách chi t.

Nguyên t c: D a vào s h p th c c đ i ánh sáng t ngo i
(OD260) đ i v i axit nucleic và

b

M c đ h p th ánh sáng

b

c s ng 260 nm

c sóng 280 nm (OD280) đ i v i protein.
b

c sóng 260 nm c a m u đó cho phép xác đ nh

n ng đ axit nucleic trong m u theo t

ng quan: M t đ n v OD260 t

n ng đ 50 µg/ml ADN s i kép. Do v y, n ng đ A s đ

ng ng v i

c tính theo công th c:

CDNA = OD260 x 50 x d
Trong đó: d =

pha loãng m u khi đo; CADN =N ng đ ADN

Tuy v y, cách tính trên ch chính xác khi dung d ch axit nucleic là s ch, n u dung
d ch ch a ADN còn có l n protein ho c 1 s dung môi, hóa ch t tách chi t thì protein
c ng s h p th ánh sáng

b

c sóng 260 nm vƠ 230 nm do đó lƠm sai l ch giá tr th t

c a n ng đ ADN trong m u.
thêm giá tr OD280 đ

kh ng đ nh cho k t qu chính xác h n, chúng tôi đo

đánh giá đ

tinh s ch c a dung d ch ADN. N u t

OD260/OD280> 1,8 thì m u ADN tách chi t đ

l

c đánh giá lƠ đ t yêu c u v m c đ

tinh s ch cho các thí nghi m sinh h c phân t ti p theo.
2.4.3. Nhơnăđo n gen b ng ph n ng PCR
Ph n ng PCR (Polymerase Chain Reaction) là m t ph n ng sinh hoá ph thu c
nhi t đ , s d ng đ c đi m c a quá trình sao chép ADN v i s tham gia c a m t lo i
enzym DNA polymerase ch u nhi t, có 2 đo n ng n ADN m t s i làm m i và dùng
các đo n ADN m ch đ n lƠm khuôn đ t ng h p nên s i m i b sung v i nó. Vì v y
đ kh i đ u quá trình t ng h p ADN c n cung c p đo n m i oligonucleotit (có đ dài
t 6 ậ 30 nucleotit).
đ

o n này g n k t v i ADN khuôn t i đi m kh i đ u sao chép, và

c enzym DNA polymerase đi u khi n đ t ng h p nên m t s i ADN đ c thù. Các

s i ADN m ch đ n lƠm khuôn đ

900C (92 ậ 980C) mƠ th

c t o ra theo cách đ n gi n là nâng nhi t đ lên trên

ng là 940C cho chu i xo n kép ADN bung ra (Lê Thanh Hoà

và c ng s . 2001b).
C 2 s i ADN đ u đ

c dùng làm khuôn cho quá trình t ng h p n u các đo n

m i (g i lƠ oligonucleotit hay primer) đ

c cung c p đ bám vào v trí t

ng ng cho

c 2 s i. Trong k thu t PCR, các đo n m i đ

c ch n n m

nhân lên, sao cho các s i ADN t ng h p m i đ

c b t đ u t i m i đo n m i và kéo dài

18

2 đ u đo n ADN c n

v phía đo n m i n m trên s i kia, cho s n ph m có đ dài n m gi a 2 đo n m i này.
dài c a s n ph m PCR có th t vƠi tr m cho đ n hàng ngàn, th m chí hàng ch c
ngàn c p nucleotit. Nh v y, sau m i chu k , các đi m bám cho các đo n m i l i xu t
hi n trên m i s i ADN m i đ

c t ng h p. H n h p ph n ng l i đ

c nâng nhi t đ

lên thích h p sao cho các s i ban đ u tách kh i s i m i t ng h p, các s i nƠy sau đó
đ

c dùng làm khuôn cho chu k ti p theo, bao g m các b

c: g n m i, t ng h p

ADN và tách r i các đo n.
K t qu cu i cùng c a ph n ng PCR là sau n chu k c a ph n ng, tính theo lý
thuy t, ta s có 2n b n sao các phân t ADN m ch kép n m gi a 2 đo n m i (Hình
2.2). Nh v y, k t qu là m t đo n ADN đ nh tr
l n. Ví d sau 30 chu k s l

cđ

c “nhơn lên” v i m t l

ng r t

ng b n sao ADN c a PCR s là 230 = 1.073.741.824.

Hìnhă2.2.ăS ăđ nguyên lý ph n ng PCR
PCR là m t k thu t phòng thí nghi m đa n ng vƠ ph

ng d ng h t s c r ng rãi.

V t li u kh i đ u cho PCR là ADN có ch a đo n c n nhân lên, g i là khuôn ADN.
Không ph i lúc nƠo c ng c n thi t ph i tách chi t đo n c n nhân lên vì vi c đó đư
đ

c các đo n m i dùng trong ph n ng xác đ nh. Tuy nhiên n u ADN làm khuôn tinh

khi t thì ph n ng PCR s r t nh y vƠ đ c hi u. HƠm l
ng PCR r t nh . Trong các thí nghi m bình th
19

ng

ng ADN khuôn c n cho ph n
phòng thí nghi m ch c n 1 ậ


100 ng DNA t ng s c a h gen lƠ đ . Tuy nhiên ngày nay trong nhi u tr

ng h p,

ph n ng PCR có th nhơn các đo n ADN ch t m t phân t ADN riêng l .
Thành ph n ch y u c a ph n ng PCR bao g m:
- ADN làm khuôn
- Hai đo n m i đ xác đ nh các đi m b t đ u t ng h p ADN (primer)
- Enzym ch u nhi t DNA - polymerase (hi n nay đ

c dùng ph bi n nh t là Taq,

chi t xu t t vi khu n ch u nhi t Thermus aquaticus).
- H n h p c a t t c 4 ti n ch t deoxynucleotit ( d ng dNTP).
- Môi tr
- N

ng đ m cung c p ion Magie (Mg++).

c tinh khi t (không có DNAase; RNase v.v...)

- Dung tích t ng s cho m t ph n ng PCR là 50 l ho c 25 l.
Có 3 giai đo n (ba b

c đi u ch nh nhi t đ ) cho 1 chu k (Hình 2.3).

Bung liên k t c a ADN (Denaturation):

c th c hi n

nhi t đ 90C - 98C

trong vƠi giơy đ n vài phút. T i nhi t đ này, các phân t ADN m ch kép s b tách ra
t o nên các s i đ n dùng đ lƠm khuôn cho các đo n m i bám vào và enzym RNA
Polymerase xúc tác t ng h p.
M i bám (hay còn g i là
đ đ

v i m i ậ Annealing). Sau b

c 1, ngay l p t c, nhi t

c h xu ng 37 ậ 68°C đ các đo n m i bám vào v i các trình t b sung t

ng

ng trên các phân t ADN làm khuôn.
T ng h p (hay còn g i là kéo dài ậ Extension): Nhi t đ ngay l p t c đ
lên 68°C ậ 72°C (thông th
ADN v a đ

c nâng

ng 72C) trong vài ch c giơy đ n vài ch c phút đ các s i

c t ng h p xo n vào nhau t o nên ADN s i kép, chính là s n ph m

PCR.

Hìnhă2.3.ăCácăb

c c a m t chu k PCR
20


C nh v y, ph n ng x y ra trong 25 ậ 40 chu k và ti p t c cho đ n chu k
cu i cùng. Sau chu k cu i, nhi t đ đ

c duy trì

72C trong 5 ậ 10 phút sao cho t t

c các s i đ n ADN có trong ph n ng xo n l i t o nên s n ph m PCR. Cu i cùng,
nhi t đ h xu ng 4C đ b o qu n s n ph m.
S n ph m c a ph n ng PCR lƠ đo n ADN mà ta c n nhân lên. S n ph m đ

c

ki m tra b ng cách ch y đi n di trên th ch agarose (n ng đ 0,8% - 2%), và ADN c a
PCR s đ

c nhìn th y rõ d

i tác d ng c a tia c c tím (ultra ậ violet) sau khi đ

c

nhu m b ng Ethidium Bromide, m t lo i hoá ch t có kh n ng bám vƠ lƠm hi n th
ADN.

dài c a ADN s n ph m đ

c tính b ng cách so sánh v i ch th ADN (DNA

Marker).
2.4.4. Ph

ngăphápăgi i trình t theoăph

ngăphápăF.ăSanger

Sau khi thu s n ph m PCR, chúng tôi ti n hƠnh xác đ nh trình t d a trên ph

ng

pháp t ng h p Sanger trên máy gi i trình t ABI PRISM t i Singapore.
Gi i trình t b ng ph

ng pháp Sanger

VƠo n m 1975, F. Sanger vƠ A.R.Coulson l n đ u tiên gi i thi u ph

ng pháp gi i

trình t ADN, công trình h u ích nƠy đư giúp cho sinh h c phân t có nh ng b
m i.

c tr ng c a ph

ng pháp nƠy lƠ ngoƠi nh ng nucleotide thông th

d ng thêm 4 lo i dideoxynucleotit (m t nhóm - 3’OH).

c đi

ng còn s

i u này khi n các

dideoxynucleotit không còn kh n ng hình thƠnh các c u n i photphodieste v i các
nucleotit ti p theo d n đ n làm ng ng quá trình t ng h p ADN. Hình 2.4.

21


Hình 2.4. Nguyên lý gi i trình t ADNătheoăph

ngăphápăSanger

(esciencecentral.org)
2.4.5. Ph

ngăphápăphơnătíchăch tăl

ng d li u trình t

Các thông s và d li u thu nh n sau khi đ c trình t (Hình 2.5) đ

c ki m tra

b ng ph n m m BioEdit. Ph n m m này cho phép xem xét đ phơn tách các đ nh tín
hi u và các ph n nhi u tín hi u (background noise).

22


M u đ c trình t ch tl

ng t t

M u đ c trình t có nhi u tín hi u nh ng

m c ch p nh n đ

M u đ c trình t có nhi u nhi u tín hi u, ch t l
Hình 2.5. Ki m tra ch tăl
M c dù là m t ph

c

ngkhông t t

ngătínăhi u d a trên d li u trình t

ng pháp tiên ti n xong vi c đ c trình t b ng máy v n có

nh ng l i mà các ph n m m không th t đ ng s a, vì v y d a trên các bi u đ hi n
th tín hi u, chúng tôi th c hi n ki m tra th công đ phơn đ nh c a tín hi u m t l n
n a b ng m t th

ng và thay th các nucleotit mƠ máy đ c không th xác đ nh ho c

g i nh m (Hình 2.6).

23


L i nh n bi t tínhi u sai

Hình 2.6. Ki m tra ch tăl
2.4.6. Ph

ng gi i mã trình t b ngăph

ngăphápăph thông

ngăphápătìmăđ t bi n gen

Các trình t

đ

c đ a so sánh v i trình t

tham chi u s a đ i Revised

Cambridge Reference Sequence (rCRS) (NC_012920.1) trên ch
m t vƠi ch

ng trình BLAST vƠ

ng trình tìm ki m đ t bi n đi m khác nhau nh GeneMarker, NovoSNP

và MutationSurveyor. D a trên k t qu t ng h p phân tích t t t c các ph n m m, đ t
bi n đ c tr ng đ
th đư đ

c xác đ nh d a trên ph n tr m các đi m đ t bi n xu t hi n

c l y m u đ phân tích trình t .

24

các cá


CH

NGăIIIăậ K TăQU ăVÀăTH OăLU N

3.1. Tách chi t ADN t ng s t m u sinh ph m
ADN t ng s là nguyên li u c b n c a ph n ng PCR, vì v y ch t l
quy t đ nh đ n ch t l

ng c a nó

ng c a ph n ng PCR và các k t qu thí nghi m sau này. ADN

t ng s có đ tinh s ch cao, tr ng thái không b đ t gãy và có n ng đ h p lý c n thi t
cho quá trình th c hi n ph n ng PCR hi u qu và t o c s t t cho các công vi c ti p
theo.
Sau khi tách chi t đ
trong m u b ng ph

c ADN t ng s , chúng tôi ti n hành ki m tra n ng đ ADN

ng pháp đo quang ph

b

c sóng 260 nm và 280 nm.

B ngă3.1.ăK tăqu đoăki mătraăgiáătr ăh păth ăánhăsángăt ăngo iăt iă2ăb

căsóngă

260 nm và 280 nm
3.2. Nhân gen b ngăph
Vùng D ậ Loop đ

ngăphápăPCR
c ch n nghiên c u. C p m i dùng cho ph n ng PCR bao

g m m i xuôi: đ nh v trên RNA v n chuy n Proline (RNAvPro) và m i ng

c: đ nh

v trên vùng b o t n D ậ Loop, nhơn đo n ADN cho đ dài x p x 1000 c p nucleotit .
Chúng tôi dùng trình t

h gen ty th ng

i đ

() đ th c hi n các b

c công b

t i Ngân hàng Gen

c thi t k m i và so sánh trình t .

Thi t k m i
M i là nh ng đo n nucleotit m ch đ n có kích th
b t c p b sung v i trình t khuôn
(primer forward) và m i ng

c t 6 ậ 100 bp, có trình t

2 đ u m ch đ n. Có 2 lo i m i là m i xuôi

c (primer reverse) tham gia vào PCR.

M i xuôi b t c p và g n vƠo đ u 5’ c a m ch khuôn, m i ng
g n vƠo đ u 3’ c a m ch khuôn. M i nh h
25

c b t c p b sung và

ng r t nhi u đ n hi u qu c a PCR.