Chương 5 phân tích protei trong thực phẩm pttp 1

CHƯƠNG
CHƯƠNG 5:PHÂN
5:PHÂN TÍCH
TÍCH PROTEIN
PROTEIN TRONG
TRONG
THỰC
THỰC PHẨM
PHẨM






Vai trò của protein cho cơ thể
Phân tích định lượng protein
Nhóm các phương pháp xác định Protein thô
Nhóm các phương pháp xác định protein hòa tan
Nhóm các phương pháp xác định phi Protein


TẦM
TẦM QUANG
QUANG TRỌNG
TRỌNG CỦA
CỦA PROTEIN
PROTEIN
 Vai trò sinh học của Protein
 Vai trò dinh dưỡng của Protein

VAI
VAI TRÒ
TRÒ SINH
SINH HỌC
HỌC CỦA
CỦA PROTEIN
PROTEIN
Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ
thể sống. Protein là nền tản về cơ thể và chức năng của cơ
thể sinh vật. Dưới đây là một số chức năng quan trọng của
protein:
+ Xúc tác
+ Vận tải
+ Chuyển động
+ Bảo vệ
+ Truyền xung thần kinh
+ Điều hòa
+ Kiến tạo chống đỡ cơ học
+ Dự trữ dinh dưỡng


VAI
VAI TRÒ
TRÒ VÀ
VÀ GIÁ
GIÁ TRỊ
TRỊ CỦA
CỦA PROTID
PROTID

TRONG
TRONG DINH
DINH DƯỠNG
DƯỠNG
+ Protein là hợp phần chủ yếu quyết định toàn bộ các đặc
trưng của khẩu phần thức ăn. Khi thiếu protein trong chế độ
ăn hàng ngày sẽ dẫn đến nhiều biểu hiện xấu:
- Sức khỏe bị suy dinh dưỡng, sút cân mau, chậm lớn đối
với trẻ em
- Giảm khả năng miễn dịch, khả năng chống đở của cơ thể
đối với một số bệnh


VAI
VAI TRÒ
TRÒ VÀ
VÀ GIÁ
GIÁ TRỊ
TRỊ CỦA
CỦA PROTID
PROTID
TRONG
TRONG DINH
DINH DƯỠNG
DƯỠNG
- Gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động bình thường của
nhiều cơ quan chức năng như gan, tuyến nội tiết và hệ
thần kinh
- Làm thay đổi thành phần hóa học và cấu tạo hình thái
của xương (lượng calci giảm, lượng magie tăng cao).

- Do đó mức protein cao chất lượng tốt (protein chứa
đủ các acid amin không thay thế) là cần thiết trong
khẩu phần ăn cho mọi lứa tuổi.
Protein là thành phần nguyên sinh chất của tế bào
Protein tham gia cân bằng năng lượng của cơ thể
Protein là chất kích thích ngon miệng


ĐỊNH
ĐỊNH LƯỢNG
LƯỢNG PROTEIN
PROTEIN THÔ
THÔ
 Phương pháp KjelDahl
 Phương pháp Dumas


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP KJELDAHL
KJELDAHL (1883)
(1883)
• Nhà hóa học người Đan mạch; X Johan G.C.T. Kjeldahl
(1883).

• Mục đích: Xác định hàm lượng nitơ tổng


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP

PHÁP KJELDAHL
KJELDAHL (1883)
(1883)

Phân hủy

Chưng cất

Chuẩn độ

Quy Trình

8


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP KJELDAHL
KJELDAHL (1883)
(1883)
Các yếu tố:
+ Điều kiện vô cơ hóa mẫu
+ Thứ tự cho mẫu và hóa chất vào bình Kjeldalh
+ Thiết lập nồng độ cho NaOH
+ Thử quá trình chưng cất là hoàn toàn
+ Làm mẫu trắng để loại bỏ ảnh hưởng của môi
trường


PHƯƠNG

PHƯƠNG PHÁP
PHÁP DUMAS
DUMAS CẢI
CẢI TIẾN
TIẾN
A sample of known mass
CO2, H2O and N2

Combustion (900 oC)

Nitrogen
Thermal conductivity detector

The nitrogen content is then measured
10


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP DUMAS
DUMAS CẢI
CẢI TIẾN
TIẾN


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP DUMAS
DUMAS CẢI
CẢI TIẾN

TIẾN
+ Đầu dò TCD chứa một dây
Detector TCD
tóc được đốt ở một nhiệt độ
nhất định.
+ Trong điều kiện bình thường
có một dòng nhiệt ổn định từ
dây tóc đến detector. Tạo ra
thế ổn định.
+ Khi có một chất được rữa
giãi từ cột, thì lập tức độ dẫn
nhiệt của cột bị giảm, dây tóc
nóng lên làm điện trở thay đổi.
+ Sự thay đổi điện trở này thường được cảm nhận bởi một mạch cầu
Wheatstone mà từ đó sinh ra một sự thay đổi điện áp.
+ Để xác định hàm lượng khí Nito của mẫu người ta so sánh mức độ
thay đổi điện áp của nó với sự thay đổi điện áp của mẫu thực phẩm có
chứa hàm lượng nito xác định (chất chuẩn). Từ đó tính ra hàm lượng


CÁC
CÁC PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP XÁC
XÁC ĐỊNH
ĐỊNH
PROTEIN
PROTEIN HÒA
HÒA TAN
TAN






Phương pháp Lowry
Phương pháp BCA
Phương pháp Braford
Phương pháp phổ UV

13


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP LOWRY
LOWRY (1951)
(1951)
Nguyên Tắc:

Nồng độ protein được xác định, trong đó có chứa các gốc
phenol như tyrosine bằng cách cho phản ứng với hợp chất
màu phenol Folin-Ciocalteu, phản ứng kép tạo phức
đồng. Phản ứng gồm hai bước:
Cu2+ tạo phức với các liên kết peptide trong protein ở
pH kiềm.
Phức hợp protein-Cu2+ sẽ xúc tác cho phản ứng oxy
hóa các nhóm phenol có trong tyrosine hay trytophan
bằng thuốc thử Folin-phenol: (Na2MoO4 + Na2WO4 +
H3PO4 trong phenol) tạo phức hợp có màu xanh dương

PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP LOWRY
LOWRY (1951)
(1951)


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP LOWRY
LOWRY (1951)
(1951)
+ Độ nhạy cao: cho phép xác định từ 10 - 200 µg of
protein, bước sóng hấp thụ trong khoảng : 500 - 750 nm
+ Các acid mạnh và muối ammonium sulphat ảnh hưởng
lên phản ứng.
+ Phản ứng nhạy với các tạp chất màu khác
+ Thành phần acid amin ảnh hưởng đến sự phát triển màu
trong phản ứng LOWRY (để dựng đường chuẩn nên dùng
các protein có cấu trúc tương tự để có kết quả chính xác.)
+ Những biến đổi của hóa chất, nhiệt độ, và thời gian đòi
hỏi phải dựng đường chuẩn mỗi lần khi tiến hành.


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP LOWRY
LOWRY (1951)

(1951)
+ Sự hiện hiện của 5 acid amin có tính khử (tyrosine,
tryptophan, cysteine, histidine, and asparagine) trong
chuổi peptide hay trong mạch protein sẽ làm tăng
cường độ màu của sản phẩm khử, làm cho cần bằng
chuyển dịch về phía phải.


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP LOWRY
LOWRY (1951)
(1951)
Thuốc thử Lowry A
21,2 g natri cacbonat (2% w / v)
40 ml 1 N NaOH (hoặc 4,0 g NaOH; dung dịch 0,1N)
Thêm nước cất hoặc nước khử i-on vào 1 lít. Pha ngay khi dung
Thuốc thử Lowry B
0,5 g CuSO4.5H2O (0,5% V)
1 g Natritartrate (1% V)
Pha định mức 100ml
Lowry thuốc thử C (1 N Folin thuốc thử phenol)
Pha loãng 2 N Folin phenol (Sigma, Fisher, hoặc VWR) với một lượng nước tương
đương.
Chuẩn bị ngay trước khi sử dụng.
Lowry thuốc thử D (thuốc thử A và B kết hợp)
Trộn 1 thể tích thuốc thử B và 50 thể tích thuốc thử A . Chuẩn bị ngay trước khi sử
dụng.
Thuốc thử Lowry D’
Thêm 2 ml dung dịch 10% sodium dodecyl sulfate vào nước khử ion định mức 100ml.

Chuẩn bị ngay khi dùng


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP LOWRY
LOWRY (1951)
(1951)
DD chuẩn 0,1
mg/ml
Maul
DD thuốc thử D

0

1

2

3

4

0

0,5

1

1.5

2

1

1

1

1

1

M1

M2

0,5
1

0,5
1

0,5

0,5

3
?

3
?

Lắc kỹ - để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng
DD thuốc thử C

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

Lắc kỹ - để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng
Nước cất khử ion 3.5
C mg/ml
0

3
2.5
0.01 0.02

2
0.03

1.5
0,04

PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP BCA
BCA (1985)
(1985)
*

Nguyên Tắc:

Cu2+ bị khử bởi các liên kết peptide cho ra Cu+. Hai phân tử
BCA sẽ tạo phức Bicinchoninic acid với Cu+, phức màu tím,
hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 562nm
*

BCA = 2,2'-Bicinchoninic Acid or 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline.


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP BCA
BCA (1985)
(1985)
+ Phương pháp này có độ nhạy gấp 100 lần so với phương
pháp biure, ngưỡng phát hiện tương đối lớn từ 20- 2000
µg.
+ Các hợp chất như đường khử và amoniac có ảnh hưởng
đến quá trình

PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP BCA
BCA (1985)
(1985)


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP BCA
BCA (1985)
(1985)

DD chuẩn 0,1
mg/ml

0

1

2

3

4

0

0,5

1

1.5

2

Mẫu
DD thuốc thử BCA 2

2
2
2
Lắc Vortex

2

M1

M2

0,5
2

0,5
2

Nước cất khử ion
3
2.5 2

1.5
1
2.5 2.5
Để yên 30 phút ở nhiệt độ 370C, làm lạnh ở nhiệt độ phòng
C mg/ml
0
0.01 0.02 0.03 0,04
?
?

Đo độ hấp thụ ở bước sóng 562nm


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP
PHÁP BRADFORF
BRADFORF (1976)
(1976)
Nguyên tắc:

Trong môi trường H+ Protein kết hợp với Coomassie
(Coomassie Brilliant Blue G - 250) tạo ra phức màu
xanh, có khả năng hấp thu bức xạ ở bước sóng 595nm.
Cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.
Từ phương trình đường chuẩn ta tính được hàm lượng
protein.


PHƯƠNG
PHƯƠNG PHÁP

PHÁP BRADFORF
BRADFORF (1976)
(1976)
Vật liệu và cách tiến hành
Chuẩn protein 2mg/ml BSA (Bovine serum albumin)
Mẫu protein
Thuốc nhuộm Coomassie
+ 100mg Coomassie Brilliant blue G-250
+ 50ml etanol 95%
+ 100ml acid phosphoiric 85%
Thuốc thử được hòa tan bằng etanol sau đó
pha loãng bằng nước khử ion