Nghiên cứu phân lập thành phần Flavonoit từ lá cây Me rừng (phyllanthus Emblica)

Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

M

U

Cùng v i s phát tri n c a khoa h c công ngh là ô nhi m môi tr

ng

và n y sinh nh ng v n đ khác, ví d nh các c n b nh nguy hi m (ung th ,
kháng sinh, cúm H1N1, H7N9,…). Nguyên nhân c a các c n b nh trên đ n
t nhi u ngu n khác nhau, có th do ô nhi m môi tr
Tr

ng, do kháng sinh.

c tình tr ng đó, nhi u qu c gia trên th gi i đã ti n hành các ch

ng

trình nghiên c u tìm ki m các ho t ch t t thiên nhiên, v i hy v ng các d

c

ph m m i có ngu n g c th c - đ ng v t s giúp gi m thi u các c n b nh nguy
hi m nêu trên, t ng c
ng

ng công tác ch m sóc s c kh e và kéo dài tu i th con

i. Nh ng nghiên c u tìm ki m các h p ch t có ho t tính sinh h c cao đ

ng d ng trong y h c, nông nghi p và các m c đích khác trong đ i s ng con
ng

i đã và đang tr thành nh ng nhi m v quan tr ng c a các qu c gia trên

th gi i.
Là qu c gia n m trong khu v c nhi t đ i gió mùa, l
đ i l n, đ

ng m a t

ng

m cao (kho ng trên 80%), nhi t đ trung bình kho ng t 15 -

270C, Vi t Nam có đi u ki n thu n l i cho các sinh v t phát tri n và t o ra s
phong phú c a nhi u loài đ ng th c v t và nhi u h sinh thái khác nhau. i u
này có ý ngh a r t quan tr ng t i s phát tri n c a n n y h c c truy n c a
Vi t Nam.
Trong s các loài th c v t c a Vi t Nam, các loài th c v t thu c h
Th u d u hi n đang thu hút s quan tâm c a nhi u nhà khoa h c. Ví d nh :
cây Me r ng (Phyllanthus emblica), thu c h Th u d u, là m t loài cây đã

đ

c s d ng làm thu c ch a b nh t lâu trong y h c dân gian nh ch a

huy t áp cao, viêm ru t, viêm da, đau h ng, đau r ng, r n c n,... Tuy nhiên,
đ có đ

c c s khoa h c nh m phát tri n và ng d ng c th loài cây này,

c n có nh ng nghiên c u c th v hóa h c, ho t tính sinh h c và nh ng

Chu Kim Ngân

1

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

nghiên c u sâu h n v d

Khóa lu n t t nghi p

c lý đ gi i thích tác d ng trong y h c c truy n

c a loài cây này, qua đó t o c s đ tìm ki m ph

ng thu c đi u tr b nh.

Xu t phát t ý ngh a th c ti n trên tôi ch n đ tài cho khoá lu n t t
nghi p là:
“Nghiên c u phơn l p thƠnh ph n flavonoit t lá cây Me r ng”.
Khóa lu n t p trung nghiên c u thành ph n flavonoit t lá cây Me r ng
bao g m nh ng n i dung chính là:
1. Thu m u lá cây Me r ng (Phyllanthus emblica), x lý m u và t o
d ch chi t.
2. Phân l p các h p ch t flavonoit.
3. Xác đ nh c u trúc hóa h c c a các h p ch t đã phân l p đ

Chu Kim Ngân

2

c.

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

CH

Khóa lu n t t nghi p

NG 1: T NG QUAN

1.1. Gi i thi u chung v cơy Me r ng
1.1.1. Th c v t h c cây me r ng
Cây Me r ng (Hình 1.1) hay còn đ

c g i là chùm ru t núi, chùm ru t

r ng, bông ngót, cam tú, ng u cam tú, du cam tú, m c kham. Cây có tên khoa
h c là Phyllanthus emblica.

ây là cây g nh ho c b i, cao 3-8(-10) m, v

m ng, màu nâu nh t, nâu ho c màu xám, nh n. Thân th

ng cong queo, phân

cành nhi u, cành nh m m, cành già màu xám nh t, mang các nhánh nh , có
lông. Cành mang lá m nh, màu xanh nh t. Cành mang lá và lá cùng s p x p
g n nh trên m t m t ph ng. Phi n lá hình b u d c khuôn, hai đ u tù, kích
th

c (3-)12-20 x (1-)3,5 - 5 mm, nh n; g n nh không cu ng ho c r t ng n.

Lá kèm r t nh , hình tam giác, màu đ nâu. Hoa đ n tính cùng g c.

Hình 1.1. M u lá, qu vƠ tiêu b n cơy me r ng

Hoa nh m c thành xim co

nách lá phía d

i cành, g m nhi u hoa

đ c và 1-2 hoa cái. Hoa đ c có cu ng ng n; đài g m 6 m nh màu h ng ho c
xanh nh t, hình b u d c. Hoa cái g n nh không cu ng; đài có 6 thu t
t hoa đ c. Qu hình c u, kích th

c 13-25 x 20-30 mm, m ng n

ng

c, màu

vàng xanh; khi khô thành qu nang, t m . H t d ng 3 c nh, màu h ng nh t
hay nâu nh t [1, 2, 4, 5].
Chu Kim Ngân

3

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

1.1.2. Phân b sinh thái
Cây m c ph bi n kh p n i

Vi t Nam, nh t là

các t nh mi n núi và

trung du phía b c [1, 2, 4, 5].
Me r ng là loài có vùng phân b r ng

nhi u n

c châu Á, t

n

đ n Myanmar, Nepal, Thái Lan, Malaysia, Lào, Campuchia, mi n nam Trung
Qu c. Hi n me r ng đã đ

c đ a vào tr ng t i Nh t B n, Hoa K

và

Australia.
1.1.3. Công d ng
Nhi u b ph n c a loài Me r ng (P. emblica L.) có ho t tính kháng

khu n, kháng oxy hóa, ch ng suy gi m mi n d ch, kháng đ c và b o v t bào
gan do các kim lo i màu gây ra [1, 2, 4, 5],…
Trong y h c dân gian, lá đ

c dùng ch a phù th ng, viêm da, m n

ng a. H t dùng ch a hen, viêm cu ng ph i và thi u n ng m t. R dùng đ
ch a huy t áp cao, đau th
Qu th

ng v , viêm ru t và lao h ch b ch huy t [5],...

ng dùng n t

làm thu c nhu m r ng, n

i, làm ô mai, n

c hoa qu , gi i khát, h m th t,

c g i đ u đ kích thích m c tóc. Qu c ng đ

c

dùng làm thu c ch a b nh thi u vitaminC (b nh Scorbut), viêm đau gan, vàng
da, r i lo n ti t m t, viêm đau d dày, ki t l , tiêu ch y, nhu n tràng, kích
thích tiêu hóa, l i ti u, đái đ

ng, gi i nhi t, xu t huy t, c m máu, thi u máu,

gi m huy t áp, đau nh c đ u, đau nh c m t, gi m s t, choáng váng, ho, viêm
ph qu n, viêm s ng ph i,… H t dùng ch a hen suy n, viêm ph qu n, thi u
n ng m t,… Hoa đ

c dùng làm thu c nhu n tràng, gi i nhi t và làm thu c

x . Lá me dùng làm thu c gi i nhi t, ch a phù th ng và m t s b nh ngoài
da. V thân dùng làm thu c ch a tiêu ch y, l amip, c m máu. R cây đ
dùng đ ch a tr các b nh cao huy t áp, đau th

ng v , viêm ru t, lao h ch

b ch huy t,… C ng đ ng các dân t c t i mi n núi

Chu Kim Ngân

4

c

Vi t Nam và các n

c

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Trung Qu c, Thái Lan, Malaysia,
cây Me, đ c bi t là qu đ

Khóa lu n t t nghi p

n

,… th

ng s d ng các b ph n c a

n c ng nh làm thu c khá r ng rãi [1, 2, 4, 5].

1.1.4. Thành ph n hóa h c
Qu me r ng có v chua, ngu n nguyên li u r t giàu vitamin C. Trong
qu ch a các trigalloyglucose, ellagic acid, corilagin, terchebin, phylleblin,
phyllemblic acid và emblicol. Các nghiên c u g n đây cho bi t c vitamin C
và acid gallic cùng có đ c tính kháng oxy hóa, kháng n m, kháng khu n. Ho t
tính c ch các quá trình oxy hóa có th còn do tác d ng c a các tannin,
emblicanin A, emblicanin B, punigluconin và pedunculagin

trong qu me

r ng [5].
Phyllemblin đ

c coi là ho t ch t có tác d ng t

gây gi m đau, an th n, đ c bi t là v i h th n kinh trung
Nh ng acid h u c

ng t nh adrenalin,
ng [5],…

trong qu me r ng nh : acid aspartic, ellagic,

gallic, myristic, ascorbic, các alanine, glycine, histidine, methionine, niacin,
tyrosine cùng v i m t s h p ch t tannin đ

c coi là có tác d ng phòng ch ng

m t s d ng ung th và kìm hãm s phát tri n c a virut HIV [5],…
Lá là ngu n nguyên li u giàu flavonoid, tannin và sterol. T lá có th
tách chi t đ

c các ho t ch t ellagic acid, amlaic acid, kaempferol-3-

glucoside, kaempferol, lupeol, -amyrin acetat, các phytosterol C29 nh

-

sitosterol, poriferasterol, -sitosterol-3-O-D-glucopyranosid [5],...
V cây ch a -sitoserol,(+)-leucodelphinidin (3,75%), lupeol (2,25%)
và tannin. Thành ph n ch y u trong tannin g m phyllembin, gallotannin nh
1,2,3-trigalloyglucose, ellagitannin terchebin, corilagin, chebulagic acid,
chebulinic acid. H t ch a kho ng 16% d u béo, ch y u là các linoleic acid
(44%), oleic acid (28,4%), linolenic acid, stearic acid, palmatic và myristic

acid [5].

Chu Kim Ngân

5

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

D

Khóa lu n t t nghi p

i đây là ví d v c u trúc m t s h p ch t t cây me r ng:
OH

O

OH

OH

O

OH

OH

Keamferol

Quercetin
OH

OH

OH
OH
O

OH

O

OH

O
O

OH

O

OH
OH

OH

O

O
O

O

O

OH

OH
O
O

OH

OH

O

O
OH

OH

Astragalin

OH

Emblicanin A

OH

OH

OH
OH

OH
OH

O
OH

O
O
OH
O
O

O
OH
O

O
OH
OH

O
OH

O

O
O
O

OH

O

O

O
O

OH

OH

OH

OH
OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

Emblicanin B

OH

Corilagin

Hình 1.2. C u trúc m t s h p ch t t cơy me r ng

Chu Kim Ngân

6

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

1.2. Gi i thi u v l p ch t flavonoit [10-14]
Flavonoit là m t trong nh ng nhóm h p ch t phân b r ng rãi nh t
trong t nhiên. Cho đ n nay có h n 4000 Flavonoit đ
Ban đ u chúng đ

c tìm th y t th c v t.

c phát hi n v i vai trò là các s c t c a th c v t vào

mùa thu khi các loài hoa, lá cây d n chuy n sang màu vàng, da cam, đ . Các
Flavonoit c ng đ

c tìm th y trong rau, qu , qu h ch, h t, c , gia v , thân

cây, các lo i hoa c ng nh trong chè và r

u vang đ . Flavonoit có m t trong

h u h t các b ph n c a cây nh lá, hoa, qu , ph n, r ,… và c trú

thành t

bào. Nó tham gia vào s t o thành màu s c c a cây đ c bi t là hoa (t o cho
hoa nh ng màu s c r c r đ quy n r các lo i côn trùng giúp cho s th
ph n c a cây).
Các flavonoit là l p ch t ph bi n có trong th c v t. Chúng là h p ch t
có c u t o g m 2 vòng benzen A, B đ

c n i v i nhau b i m t d vòng C v i

b khung cacbon C6-C3-C6. Vi c phân lo i các flavonoit d a trên s khác
nhau c a nhóm C3 (các glicosit c a nó có màu vàng nh t và màu ngà;
antoxianin và antoxianiđrin màu đ , xanh, tía và các d ng không màu;
isoflavon, catecin và leucoantoxianiđrin là các ch t tan trong n

c và th

ng

n m trong không bào).
2'

A

B

3'

O

1'

8
9

7

O

4'

2

OH

RO

5'
3

6

10
5

4

6'

C

O

Hình 1.3. Khung c b n c a các

Hình 1.4. Khung c b n c a các

flavan

flavon

Chu Kim Ngân

7

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p
OR
O

O
OH

RO

RO
OH

OH

O

O

Hình 1.5. Khung c b n c a các

Hình 1.6. Khung c b n c a các

flavonol

Flavanonol-3

Flavon (Hình 1.4) và flavonol (Hình 1.5) r t ph bi n trong t nhiên.
Công th c c u t o c a chúng ch khác nhau

v trí cacbon s 3.

Trong th c v t, các flavon và flavonol th
t do mà th

ng d

ng không t n t i d

i d ng

i d ng glycozit.

Bên c nh các h p ch t có d ng khung flavan, flavon, flavonol còn có
các h p ch t thu c d ng Flavanonol-3 (Hình 1.6) và m t s h p ch t thu c

khung Chalcon (Hình 1.7), khung auron (Hình 1.8).
OR
OH

O

RO

A

RO

O

OR

C

CH

B

O

Hình 1.7. Khung c b n c a các

Hình 1.8. Khung c b n c a các h p

h p ch t chalcon

ch t Auron

1.3. Các ph

ng pháp chi t m u th c v t

Sau khi ti n hành thu hái và làm khô m u, tu thu c vào đ i t

ng ch t

có trong m u khác nhau (ch t phân c c, ch t không phân c c, ch t có đ phân
c c trung bình,...) mà ta ch n dung môi và h dung môi khác nhau.
1.3.1. Ch n dung môi chi t
Th

ng thì các ch t chuy n hoá th c p trong cây có đ phân c c khác

nhau. Tuy nhiên nh ng thành ph n tan trong n
môi dùng trong quá trình chi t c n ph i đ
Chu Kim Ngân

8

c ít khi đ

c quan tâm. Dung

c l a ch n r t c n th n.
K35C – Khoa Hóa H c

Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

i u ki n c a dung môi là ph i hoà tan đ
th c p đang nghiên c u, d dàng đ

c nh ng ch t chuy n hoá

c lo i b , có tính tr (không ph n ng

v i ch t nghiên c u), không đ c, không d b c cháy.
Dung môi l n t p ch t thì nh h
quá trình chi t do v y c n ph i đ
khi s d ng. Th

ng đ n hi u qu và ch t l

c ch ng c t đ thu đ

ng c a

c d ng s ch tr

c

ng có m t s ch t d o l n trong dung môi nh các diankyl

phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Nh ng ch t này có th l n
v i dung môi trong quá trình s n xu t ho c trong khâu b o qu n nh trong
các thùng ch a ho c các nút đ y b ng nh a.
Methanol

và

chloroform

th

ng

ch a

dioctylphtalat

[di-(2-

etylhexyl)phtalat ho c bis-2-etylhexyl-phtalat]. Ch t này s làm sai l ch k t
qu phân l p trong các quá trình nghiên c u hoá th c v t, th hi n ho t tính
trong th nghi m sinh h c và có th làm b n d ch chi t c a cây. Chloroform,
metylen clorit và methanol là nh ng dung môi th

ng đ

c l a ch n trong

quá trình chi t s b m t ph n c a cây nh : lá, thân, r , c , qu , hoa,...
Nh ng t p ch t c a chloroform nh

CH2Cl2, CH2ClBr có th ph n ng

v i m t vài h p ch t nh các ancaloit t o mu i b c 4 và nh ng s n ph m
khác. T

ng t nh v y, s có m t c a l

có th gây ra s phân hu , s kh n

c hay s đ ng phân hoá v i các h p

ch t khác. Chloroform có th gây t n th
vi c v i ch t này c n đ
đeo m t n

ng nh axit clohiđric (HCl) c ng
ng cho gan và th n nên khi làm

c thao tác khéo léo, c n th n

n i thoáng và ph i

phòng đ c. Metylen clorit ít đ c h n và d

bay h i h n

chloroform.
Methanol và etanol 80% là nh ng dung môi phân c c h n các
hiđrocacbon th clo. Ng

i ta cho r ng các dung môi thu c nhóm r

u s

th m t t h n lên màng t bào nên quá trình chi t v i các dung môi này s thu
đ

cl

ng l n các thành ph n trong t bào. Trái l i, kh n ng phân c c c a

Chu Kim Ngân

9

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

chloroform th p h n, nó có th r a gi i các ch t n m ngoài t bào. Các ancol
hoà tan ph n l n các ch t chuy n hoá phân c c cùng v i các h p ch t phân
c c trung bình và th p. Vì v y khi chi t b ng ancol thì các ch t này c ng b
hoà tan đ ng th i. Thông th

ng dung môi c n trong n

c có nh ng đ c tính

t t nh t cho quá trình chi t s b .
Tuy nhiên c ng có m t vài s n ph m m i đ

c t o thành khi dùng

methanol trong su t quá trình chi t. Thí d trechlonolide A thu đ
Trechonaetes aciniata đ
hu
đ

c t

c chuy n thành trechonolide B b ng quá trình phân

1-hydroxytropacocain c ng x y ra khi erythroxylum novogranatense
c chi t trong methanol nóng.
Ng

i ta th

ng ít s d ng n

thay vào đó là dùng dung d ch n
ietyl ete hi m khi đ

c đ thu đ

c d ch chi t thô t cây mà

c c a methanol.

c dùng cho các quá trình chi t th c v t vì nó r t

d bay h i, b c cháy và r t đ c, đ ng th i nó có xu h

ng t o thành peroxit

d n , peroxit c a dietyl ete d gây ph n ng oxi hoá v i nh ng h p ch t
không có kh n ng t o cholesterol nh các carotenoit. Ti p đ n là axeton
c ng có th t o thành axetonit n u 1,2-cis-diol có m t trong môi tr
Quá trình chi t d

i đi u ki n axit ho c baz th

ng đ

ng axit.

c dùng v i quá trình

phân tách đ c tr ng, c ng có khi x lý các d ch chi t b ng axit - baz có th

t o thành nh ng s n ph m mong mu n.
S hi u bi t v nh ng đ c tính c a nh ng ch t chuy n hoá th c p
trong cây đ

c chi t s r t quan tr ng đ t đó l a ch n dung môi thích h p

cho quá trình chi t tránh đ

c s phân hu ch t b i dung môi và quá trình t o

thành ch t mong mu n.
Sau khi chi t dung môi đ

c c t ra b ng máy c t quay

nhi t đ không

quá 30 - 400C, v i m t vài hoá ch t ch u nhi t có th th c hi n

nhi t đ cao

h n.
Chu Kim Ngân

10

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

1.3.2. Quá trình chi t
H u h t quá trình chi t đ n gi n đ

c phân lo i nh sau:

- Chi t ngâm.
- Chi t s d ng m t lo i thi t b là bình chi t Xoclet.
- Chi t lôi cu n theo h i n

c.

Chi t ngâm là m t trong nh ng ph

ng pháp đ

c s d ng r ng rãi

nh t trong quá trình chi t th c v t b i nó không đòi h i nhi u công s c và
th i gian. Thi t b s d ng là m t bình thu tinh v i m t cái khoá

d

i đáy

đ đi u ch nh t c đ ch y thích h p cho quá trình tách r a dung môi. Dung
môi có th nóng ho c l nh nh ng nóng s đ t hi u qu chi t cao h n. Tr

c

đây, máy chi t ngâm đòi h i ph i làm b ng kim lo i nh ng hi n nay có th
dùng bình thu tinh.
Thông th

ng quá trình chi t ngâm không đ

pháp chi t liên t c b i m u đ
24 gi r i ch t chi t đ

c s d ng nh ph

ng

c ngâm v i dung môi trong máy chi t kho ng

c l y ra. Thông th

ng quá trình chi t m t m u ch

th c hi n qua 3 l n dung môi vì khi đó c n chi t s không còn ch a nh ng
ch t giá tr n a. S k t thúc quá trình chi t đ

c xác đ nh b ng m t vài cách

khác nhau.
Ví d :
- Khi chi t các ancaloit, ta có th ki m tra s xu t hi n c a h p ch t
này b ng s t o thành k t t a v i nh ng tác nhân đ c tr ng nh tác nhân:
ragendroff và tác nhân Mayer.
- Các flavoloit th

ng là nh ng h p ch t màu, vì v y khi d ch chi t

ch y ra mà không có màu s đánh d u s r a h t nh ng ch t này trong c n
chi t.
Nh v y, tu thu c vào m c đích c n chi t l y ch t gì đ l a ch n dung
môi cho thích h p và th c hi n quy trình chi t h p lý nh m đ t hi u qu cao.
Chu Kim Ngân

11

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

Ngoài ra, có th d a vào m i quan h c a dung môi và ch t tan c a các l p
ch t mà ta có th tách thô m t s l p ch t ngay trong quá trình chi t.

1.4. Các ph
Ph

ng pháp s c ký trong phơn l p các h p ch t h u c

ng pháp s c ký (chromatography) là m t ph

h u hi u nh t hi n nay, đ

ng pháp ph bi n và

c s d ng r ng rãi trong vi c phân l p các h p

ch t h u c nói chung và các h p ch t thiên nhiên nói riêng.
1.4.1.

c đi m chung c a ph
S c ký là ph

ng pháp s c ký

ng pháp tách các ch t d a vào s khác nhau v b n ch t

h p ph và s phân b khác nhau c a chúng gi a hai pha: pha t nh và pha
đ ng.
S c ký g m có pha t nh và pha đ ng. Khi ti p xúc v i pha t nh, các c u
t c a h n h p s phân b gi a pha đ ng và pha t nh t

ng ng v i tính ch t

c a chúng (tính b h p ph , tính tan,...). Các ch t khác nhau s có ái l c khác
nhau v i pha đ ng và pha t nh. Trong quá trình pha đ ng chuy n đ ng d c
theo h s c ký h t l p pha t nh này đ n l p pha t nh khác, s l p đi l p l i quá
trình h p ph và ph n h p ph . K t qu là các ch t có ái l c l n v i pha t nh
s chuy n đ ng ch m h n qua h th ng s c ký so v i các ch t t
h n v i pha này. Nh đ c đi m này mà ng

ng tác y u

i ta có th tách các ch t qua quá

trình s c ký.
1.4.2. C s c a ph
Ph

ng pháp s c ký

ng pháp s c ký d a vào s phân b khác nhau c a các ch t gi a

hai pha t nh và pha đ ng.
ph thu c c a l

đi u ki n nhi t đ không đ i, đ nh lu t mô t s

ng ch t b h p ph lên pha t nh v i n ng đ c a dung d ch

(ho c v i ch t khí là áp su t riêng ph n) g i là đ nh lu t h p ph đ n phân t
đ ng nhi t Langmuir:

n

Chu Kim Ngân

n .b.C
1  b.C
12

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Trong đó:

Khóa lu n t t nghi p

n -L

ng ch t b h p ph lên pha t nh lúc đ t cân b ng.

n∞ - L

ng c c đ i c a ch t có th b h p ph lên m t ch t

h p ph nào đó.
b - H ng s .
C - N ng đ c a ch t b h p ph .

1.4.3. Phân lo i các ph
Trong ph

ng pháp s c ký

ng pháp s c ký pha đ ng là các l u th (các ch t

thái khí hay l ng), còn pha t nh có th là các ch t
D a vào tr ng thái t p h p c a pha đ ng, ng

tr ng thái l ng ho c r n.

i ta chia s c ký thành hai nhóm

l n: s c ký khí và s c ký l ng. D a vào cách ti n hành s c ký, ng
thành các ph

tr ng

i ta chia ra

ng pháp s c ký ch y u sau:

1.4.3.1. S c ký c t (C.C)
ây là ph

ng pháp s c ký ph bi n nh t, ch t h p ph là pha t nh g m

các lo i silicagel (có kích th

c h t khác nhau) pha th

ODS, Dianion. Ch t h p ph đ

ng và pha đ o YMC,

c nh i vào c t (c t có th b ng thu tinh

ho c kim lo i, ph bi n nh t là c t thu tinh).

m n c a ch t h p ph h t

s c quan tr ng, nó ph n ánh s đ a lý thuy t hay kh n ng tách c a ch t h p
ph .

h t c a ch t h p ph càng nh thì s đ a lý thuy t càng l n, kh n ng

tách càng cao và ng

c l i. Tuy nhiên n u ch t h p ph có kích th

càng nh thì t c đ ch y càng gi m. Trong m t s tr
tr

ng không đ l n thì gây ra hi n t

đ

c), khi đó ng

ch t

ng h p n u l c tr ng

ng t c c t (dung môi không ch y

i ta ph i s d ng áp su t, v i áp su t trung bình (MPC), áp

su t cao (HPLC).
Trong s c ký c t, t l đ

ng kính c t (D) so v i chi u cao c t (L) r t

quan tr ng, nó th hi n kh n ng tách c a c t. T l L/D ph thu c vào yêu
c u tách, t c là ph thu c vào h n h p ch t c th . Trong s c ký, t l gi a
quãng đ

ng đi c a ch t c n tách so v i quãng đ

Chu Kim Ngân

13

ng đi c a dung môi g i là
K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

Rf, v i m i m t ch t s có m t Rf khác nhau. Nh vào s khác nhau v Rf này
mà ta có th tách t ng ch t ra kh i h n h p. T l ch t so v i t l ch t h p
ph c ng r t quan tr ng và tu thu c vào yêu c u tách. N u tách thô thì t l
này th p (t 1/5 – 1/10), còn n u tách tinh thì t l này cao h n và tu vào h
s tách (t c ph thu c vào s khác nhau Rf c a các ch t), mà h s này trong
kho ng 1/20-1/30.
Trong s c ký c t, vi c đ a ch t lên c t h t s c quan tr ng. Tu vào
l

ng ch t và d ng ch t mà ng

pháp khác nhau. N u l

i ta có th đ a ch t lên c t b ng các ph

ng

ng ch t nhi u và ch y thô, thì ph bi n là t m ch t

vào silicagel r i làm khô, t i hoàn toàn, đ a lên c t. N u tách tinh, thì đ a
tr c ti p ch t lên c t b ng cách hoà tan ch t b ng dung môi ch y c t v i
l

ng t i thi u.
Có hai ph

- Ph

ng pháp đ a ch t h p ph lên c t:

ng pháp 1: Nh i c t khô. Theo cách này, ch t h p ph đ

cđ a

tr c ti p vào c t khi còn khô, sau đó dùng que m m đ gõ nh lên thành c t
đ ch t h p ph s p x p ch t trong c t. Sau đó dùng dung môi ch y c t đ
ch y c t đ n khi c t trong su t.
- Ph

ng pháp 2: Nh i c t

dung môi ch y c t tr
c t đ n khi đ l

c hoà tan trong

ng dung môi t i thi u. Sau đó đ a d n vào

ng c n thi t.

L u ý: không đ
hi n t

cv il

t, t c là ch t h p ph đ

c đ b t khí bên trong c t (n u có b t khí gây nên

ng ch y r i trong c t và gi m hi u qu tách), c t không đ

c n t,

g y, dò.
T c đ ch y c a dung môi c ng nh h

ng đ n hi u qu tách. N u t c

đ dòng ch y quá l n s làm gi m hi u qu tách. Còn n u t c đ dòng ch y
quá th p thì s kéo dài th i gian tách và nh h
Chu Kim Ngân

14

ng đ n ti n đ công vi c.
K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

1.4.3.2. S c ký l p m ng
S c ký l p m ng (SKLM) th
h

ng cho s c ký c t. SKLM đ

ng đ

c s d ng đ ki m tra và đ nh

c ti n hành trên b n m ng tráng s n

silicagel trên đ nhôm hay đ thu tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng đ đi u
ch thu ch t tr c ti p. B ng vi c s d ng b n SKLM đi u ch (b n đ
silicagel dày h n), có th đ a l
s c ký, ng

c tráng

ng ch t nhi u h n lên b n và sau khi ch y

i ta có th c o riêng ph n silicagel có ch a ch t c n tách r i gi i

h p ph b ng dung môi thích h p đ thu đ

c t ng ch t riêng bi t. Có th

phát hi n ch t trên b n m ng b ng đèn t ngo i, b ng ch t hi n màu đ c
tr ng cho t ng l p ch t ho c s d ng dung d ch H2SO4 10%.
1.5. M t s ph

ng pháp hoá lý xác đ nh c u trúc c a các h p ch t h u

c [5-7]
C u trúc hoá h c các h p ch t h u c đ

c xác đ nh nh vào các

ph

ng pháp ph k t h p. Tu thu c vào c u trúc hoá h c c a t ng ch t mà

ng

i ta s d ng ph

c u ph i h p các ph

ng pháp ph c th nào. C u trúc càng ph c t p thì yêu
ng pháp ph càng cao. Trong m t s tr

xác đ nh chính xác c u trúc hoá h c c a các h p ch t, ng
các ph
ph

ng h p, đ

i ta ph i d a vào

ng pháp b sung khác nh chuy n hoá hoá h c, k t h p v i các

ng pháp s c ký so sánh,…

1.5.1. Ph h ng ngo i (Infrared spectroscopy, IR)
Ph h ng ngo i đ

c xây d ng d a vào s khác nhau v dao đ ng c a

các liên k t trong phân t h p ch t d
M i ki u liên k t đ

i s kích thích c a tia h ng ngo i.

c đ c tr ng b i m t vùng b

d a vào ph h ng ngo i, có th xác đ nh đ

c sóng khác nhau. Do đó,

c các nhóm ch c đ c tr ng

trong h p ch t, ví d : dao đ ng hoá tr c a nhóm OH t do trong các nhóm
hydroxyl là 3300- 3450 cm-1, c a nhóm cacbonyl C = O trong kho ng 17001750 cm-1,...
Chu Kim Ngân

15

K35C – Khoa Hóa H c

Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

1.5.2. Ph kh i l
Ph kh i l

Khóa lu n t t nghi p

ng (Mass spectroscopy, MS)

ng đ

c s d ng khá ph bi n đ xác đ nh c u trúc hóa h c

c a các h p ch t h u c .
Nguyên t c c a ph
phân t ch t d

ng pháp ph này là d a vào s phân m nh ion c a

i s b n phá c a chùm ion bên ngoài. Ph MS còn cho các

pic ion m nh khác mà d a vào đó ng
m nh và d ng l i đ
lo i ph kh i l

i ta có th xác đ nh đ

c c ch phân

c c u trúc hoá h c các h p ch t. Hi n nay có r t nhi u

ng, nh nh ng ph

ng pháp ch y u sau:

- Ph EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) d a vào
s phân m nh ion d

i tác d ng c a chùm ion b n phá n ng l

ng khác nhau,

ph bi n là 70eV.
- Ph ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) g i là
ph phun mù đi n t . Ph này đ

c th c hi n v i n ng l

h n nhi u so v i ph EI-MS, do đó ph thu đ

ng b n phá th p

c ch y u là pic ion phân t

và các pic đ c tr ng cho s phá v các liên k t có m c n ng l

ng th p, d b

phá v .
- Ph FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là ph b n phá
nguyên t nhanh v i s b n phá nguyên t nhanh
ph thu đ

c c ng d thu đ

- Ph kh i l

n ng l

ng th p, do đó

c pic ion phân t .

ng phân gi i cao (High Resolution Mass Spectroscopy),

cho phép xác đ nh pic ion phân t ho c ion m nh v i đ chính xác cao.
Ngoài ra, hi n nay ng

i ta còn s d ng k t h p các ph

ng pháp s c

ký k t h p v i kh i ph khác nh : GC-MS (s c ký khí-kh i ph ), LC-MS
(s c ký l ng-kh i ph ). Các ph

ng pháp k t h p này còn đ c bi t h u hi u

khi phân tích thành ph n c a h n h p ch t (nh t là phân tích thu c trong
ngành d

c).

Chu Kim Ngân

16

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

1.5.3. Ph

c ng h

ng t

Khóa lu n t t nghi p

h t nhân (Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy, NMR)

Ph c ng h

ng t h t nhân là m t ph

ng pháp ph hi n đ i và h u

hi u nh t hi n nay. V i vi c s d ng k t h p các k thu t ph NMR m t
chi u và hai chi u, các nhà nghiên c u có th xác đ nh chính xác c u trúc c a
h p ch t, k c c u trúc l p th c a phân t .
Nguyên lý chung c a các ph
cacbon) là s c ng h
d ng c a t tr

ng pháp ph

NMR (ph proton và

ng khác nhau c a các h t nhân t ( 1H và 13C) d

ng ngoài. S c ng h

ng khác nhau này đ

i tác

c bi u di n b ng

đ chuy n d ch hoá h c (chemical shift). Ngoài ra, đ c tr ng c a phân t còn
đ

c xác đ nh d a vào t

ng tác spin gi a các h t nhân t v i nhau (spin

coupling).
1.5.3.1. Ph

1

H-NMR

Trong ph

1

H-NMR, đ chuy n d ch hoá h c () c a các proton đ

c

xác đ nh trong thang ppm t 0-14ppm, tu thu c vào m c đ lai hoá c a
nguyên t c ng nh đ c tr ng riêng c a t ng ph n. D a vào nh ng đ c tr ng
c a đ chuy n d ch hoá h c và t

ng tác spin mà ta có th xác đ nh đ

cc u

trúc hoá h c c a h p ch t.
1.5.3.2. Ph

13

C-NMR

Ph này cho tín hi u v ch ph cacbon. M i nguyên t cacbon s c ng
h

ng

ph

13

m t tr

ng khác nhau và cho tín hi u ph khác nhau. Thang đo c a

C-NMR là ppm, v i d i thang đo r ng 0 - 230ppm.

1.5.3.3. Ph DEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)
Ph này cho ta các tín hi u phân lo i các lo i cacbon khác nhau. Trên
ph DEPT, tín hi u c a các cacbon b c b n bi n m t. Tín hi u c a CH và
CH3 n m v m t phía và c a CH2 v m t phía trên ph DEPT 1350. Trên ph
DEPT 900 ch xu t hi n tín hi u ph c a các CH.
Chu Kim Ngân

17

K35C – Khoa Hóa H c

Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

1.5.3.4. Ph 2D-NMR
- Ph
t

HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): Các

ng tác tr c ti p H-C đ

Trên ph , m t tr c là ph

c xác đ nh nh vào các t
1

ng tác trên ph này.

H-NMR, còn tr c kia là 13C-NMR. Các t

ng tác

HMQC n m trên đ nh các ô vuông trên ph .
- Ph

1

H-1H COSY (HOMOCOSY) (1H-1H Chemical Shift Correlation

Spectroscopy): Ph này bi u di n các t

ng tác xa c a H-H, ch y u là các

proton đính v i cacbon li n k nhau. Nh ph này mà các ph n c a phân t
đ

c n i ghép l i v i nhau.
- Ph HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity):

bi u di n t

ây là ph

ng tác xa trong không gian phân t . Nh vào các t

ng tác trên

ph này mà t ng ph n c a phân t c ng nh toàn b phân t đ

c xác đ nh

v c u trúc.
- Ph NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy): Ph này bi u
di n các t

ng tác xa trong không gian c a các proton không k đ n các liên

k t mà ch tính đ n kho ng cách nh t đ nh trong không gian. D a vào k t qu
ph này có th xác đ nh c u trúc không gian c a phân t .
Ng

i ta còn s

d ng hi u

ng NOE b ng k

thu t ph

NOE

differences đ xác đ nh c u trúc không gian c a phân t . B ng vi c đ a vào
m t xung đúng b ng t tr

ng c ng h

ng c a m t proton xác đ nh thì các

proton có cùng phía v không gian c ng nh g n nhau v không gian s c ng
h

ng m nh h n và cho tín hi u v i c

ng đ m nh h n.

Ngoài ra, còn s d ng ph X-RAY (nhi u x R ngen) đ xác đ nh c u
trúc không gian c a toàn b phân t c a h p ch t k t tinh

d ng đ n tinh th .

Nh ng ph m vi s d ng c a nó h n ch vì yêu c u c n tiên quy t c a ph

ng

pháp này là c n ph i có đ n tinh th . ây là m t đi u ki n không ph bi n đ i
v i các h p ch t h u c .
Chu Kim Ngân

18

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

Nh trên đã đ c p, ngoài vi c s d ng các lo i ph , ng
k t h p v i các chuy n hoá hoá h c c ng nh các ph
sánh k t h p khác.

ng pháp phân tích, so

c bi t đ i v i các phân t nhi u m ch nhánh dài, tín

hi u ph NMR b ch ng l p nhi u khó xác đ nh chính xác đ
m ch.
đ

i v i phân t có các đ n v đ

ng c ng nh c u hình đ

thu phân r i xác đ nh b ng ph
các đ

i còn s d ng

c chi u dài các

ng thì vi c xác đ nh chính xác lo i

ng thông th

ng ph i s d ng ph

ng pháp

ng pháp so sánh LC-MS ho c GC-MS v i

ng chu n d ki n.

Chu Kim Ngân

19

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

CH

NG 2:

IT

Khóa lu n t t nghi p

NG VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1. M u th c v t
M u cây Me r ng thu th p t i Mê Linh – V nh Phúc. Ng
đ nh loài: TS Nguy n Th C

i thu th p và

ng, Vi n Sinh thái và Tài nguyên Sinh v t,

Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam giám đ nh. Tiêu b n m u
(VNB_21) đ

c l u t i Vi n Hóa sinh bi n, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công

ngh Vi t Nam. Hình nh m u và tiêu b n (Hình 1.1).
2.2. Ph

ng pháp phơn l p các h p ch t

2.2.1. S c ký l p m ng (TLC)
S c ký l p m ng đ

c th c hi n trên b n m ng tráng s n DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hi n ch t b ng đèn t ngo i
hai b

c sóng 254 nm và 368 nm ho c dùng thu c th là dung d ch H 2SO4

10% đ

c phun đ u lên b n m ng, s y khô r i h nóng trên b p đi n đ n khi

hi n màu.

2.2.2. S c ký l p m ng đi u ch
S c ký l p m ng đi u ch th c hi n trên b n m ng tráng s n Silicagel
60G F254 (Merck, ký hi u 105875), phát hi n v t ch t b ng đèn t ngo i hai
b

c sóng 254 nm và 368 nm, ho c c t rìa b n m ng đ phun thu c th là

dung d ch H2SO4 10%, h nóng đ phát hi n v t ch t, ghép l i b n m ng nh
c đ xác đ nh vùng ch t, sau đó c o l p Silicagel có ch t, gi i h p ph b ng
dung môi thích h p.
2.2.3. S c ký c t (CC)
S c ký c t đ

c ti n hành v i ch t h p ph là Silicagel pha th

pha đ o. Silicagel pha th

ng và

ng có c h t là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh).

Silicagel pha đ o ODS ho c YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).

Chu Kim Ngân

20

K35C – Khoa Hóa H c

Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

2.3. Ph

Khóa lu n t t nghi p

ng pháp xác đ nh c u trúc hoá h c các h p ch t

2.3.1. i m nóng ch y (Mp)
i m nóng ch y đ

c đo trên máy Kofler micro - hotstage c a Vi n

Hóa sinh bi n, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam.
2.3.2. Ph kh i l
Ph
spectra) đ

ng (ESI-MS)

kh i l

ng phun mù đi n t

(Electron Spray Ionization mass

c đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap c a Vi n Hoá h c,

Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam.
2.3.3. Ph c ng h

ng t h t nhân (NMR)

Ph c ng h
NMR (125 MHz) đ

ng t h t nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và

13

C-

c đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer,

Vi n Hóa h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam.
2.3.4.

quay c c []D
quay c c đ

c đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter c a

Vi n Hoá h c, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam.
2.4. D ng c vƠ thi t b
2.4.1. D ng c và thi t b tách chi t
Các d ng c và thi t b dùng cho tách chi t và tinh ch ch t s ch đ

c

s d ng bao g m:
+ Bình chi t 30 lít
+ Máy cô quay chân không
+ èn t ngo i hai b

c sóng 254 và 368 nm

+ T s y chân không
+ Máy s y
+ Micropipet
+ Bình s c ký lo i phân tích và đi u ch
+ C t s c ký pha th
Chu Kim Ngân

ng các lo i đ
21

ng kính
K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

+ C t s c ký pha ng

Khóa lu n t t nghi p

c trung áp

+ Máy phun dung d ch thu c th
+ B p đi n
2.4.2. D ng c và thi t b xác đ nh c u trúc
+ Máy ph

c ng h

ng t

h t nhân NMR AM500 FT-NMR

spectrometer.
+ Máy s c ký l ng cao áp ghép n i kh i ph (ESI) AGILENT 1200
LC-MSD Trap spectrometer.
+ Thi t b đo đi m nóng ch y Kofler micro-hotstage.
+ Thi t b đo đ quay c c JASCO.
2.5. Hoá ch t
+ Silicagel 60 (0,04 - 0,063 mm) Merck.
+ Silicagel pha đ o ODS ho c YMC (30 - 50 m, FuJisilisa Chemical
Ltd.).
+ B n m ng tráng s n pha th

ng DC-Alufolien 60 F254 (Merck

1,05715).
+ B n m ng tráng s n pha ng
+ B n m ng đi u ch pha th

c RP18 F254s (Merck).
ng DC-Alufolien 60 F254 (Merck).

+ Các lo i dung môi h u c

nh

methanol, etanol, ethyl acetate,

chloroform, hexane, acetone,... là lo i hoá ch t tinh khi t c a Merck.

Chu Kim Ngân

22

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

CH

Khóa lu n t t nghi p

NG 3. TH C NGHI M VÀ K T QU

3.1. Chi t vƠ phơn l p các h p ch t
M u lá c a cây me r ng, đ
đó s y khô b ng t s y
thu đ

c r a s ch, ph i khô trong bóng râm, sau

nhi t đ 50oC, sau cùng đem nghi n nh thành b t

c 7 kg b t khô.
Ph n lá khô c a Phyllanthus emblica (7 kg) đ

đó đem chi t v i MeOH 3 l n. Ph n d ch chi t đ

c đem nghi n nh sau
c quay khô v i áp su t

gi m đ t o thành c n chi t MeOH (430 g). C n MeOH đ
và phân l p l n l
khô thu đ

t v i Hexan và EtOAc đ thu đ

c hòa vào n

c

c các d ch chi t r i quay

c c n chi t Hexan (124 g) và EtOAc (186 g).

Chu Kim Ngân

23

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

B t khô (7 kg)
Phyllanthus
emblica
- Chi

t ba l n b ng MeOH
- L c, c t quay lo i dung môi
- Thu h i dung môi chi t l p l i

C n chi t MeOH

(430 g)
B sung n
n-hexane: n

c

B sung n-hexane

c 1/1

B sung EtOAc

C n chi t n-hexane
PE_H(124 g)

EtOAc: n

c 1/1
-C nn c
- C t quay lo i b n

C n chi t EtOAc
PE_Et(186 g)

c

C nn c
PE_W(110 g)

Hình 3.1. S đ t o d ch chi t phơn đo n

Do th i gian th c nghi m có h n, n i dung nghiên c u c a khóa lu n
ch d ng l i trong phân l p ph n d ch chi t EtOAc, các phân đo n khác đang
đ

c ti n hành t i đ n v nghiên c u.

Chu Kim Ngân

24

K35C – Khoa Hóa H c


Tr

ng

i H c S Ph m Hà N i 2

Khóa lu n t t nghi p

T ph n c n chi t EtOAc ti n hành s d ng s c ký c t th y tinh v i
dung môi r a gi i là CHCl3 : MeOH (ch y gradient v i t l dung môi t
100% CHCl3 đ n 100% MeOH), thu đ

c ba phân đo n l n l

t là PE_Et_A

(30,6 g); PE_Et_B (41,2 g) và PE_Et_C (104,7 g). Do yêu c u c a th i gian

nghiên c u, do đó trong khóa lu n này ch ch n phân đo n d nghiên c u
nh t, phân đo n PE_Et_B, v i l

ng v t hi n th trên b n TLC r t rõ. T

PE_Et_B, ti n hành s d ng s c ký c t th y tinh v i dung môi r a gi i là
Clorofom : metanol : n

c (T l 6:1:0,1) thu đ

c h p ch t PU1 (120,1 mg)

và PUW1 (39,7 mg).
C n chi t EtOAc
PE_Et (186 g)

CC,Silicagel Clorofom:metanol (100:10:100)
100% Cloroform

50%
Cloroform

PE_Et_A
(30,6 g)

PE_Et_B
(41,2 g)

100% MeOH

PE_Et_C
(104,7 g)

CC,Silicagel Clorofom:metanol:n
6:1:0.1

PU1
(120,1 mg)

c

PUW1
(39,7 mg)

Hình 3.2. S đ chi t vƠ phơn l p các h p ch t t lá me r ng
Chu Kim Ngân

25

K35C – Khoa Hóa H c