Luận văn sư phạm Nghiên cứu mối tương quan di truyền của các dòng lúa đột biến chất lượng bằng chỉ thị phân tử

Khóa luận tốt nghiệp

Mục lục

Trang

Lời cảm ơn

3

Lời cam đoan

4

Danh mục các chữ viết tắt

5

Danh mục các bảng

6

Mở đầu

7

1. Lí do chọn đề tài

7

2. Mục đích nghiên cứu

8

3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

8

Chương 1. Tổng quan tài liệu nghiên cứu

9

1.1.

9

Nguồn gốc và giá trị kinh tế của cây lúa

1.1.1 Nguồn gốc

9

1.1.2. Giá trị kinh tế và định hướng phát triển cây lúa ở Việt Nam

10

1.2. Chỉ thị phân tử và ứng dụng của chỉ thị phân tử
trong chọn tạo giống lúa

11

1.2.1. Cơ sở khoa học

11

a.

Thành phần và cấu trúc hoá học của ADN

11

b.

Biến tính và hồi tính của ADN

12

c.

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

12

1.2.2. Phân loại

14

a. Chỉ thị sinh hoá

14

b. Chỉ thị phân tử

15

1.2.2. Các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR

15

a. Chỉ thị RFLP (Random Fragment Length Polymorphism)

15

b. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

17

c. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)

17

d. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)

18

1.2.4. ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa

Nguyễn Thị Huyền

1

19

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

1.2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

21

a. Tình hình nghiên cứu trong nước

21

b. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

22

Chương 2. Vật liệu, thời gian, địa điểm và phương pháp nghiên cứu

23

2.1. Vật liệu nghiên cứu

23

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

23

2.3. Phương pháp nghiên cứu

23

2.3.1. Phương pháp thu mẫu (lá lúa)

23

2.3.2. Phương pháp tách chiết ADN từ lá lúa

23

2.3.3. Kiểm tra nồng độ ADN tổng số

25

2.3.4. Tiến hành phản ứng PCR

25

2.3.5 Phương pháp điện di sản phẩm PCR

26

2.3.6 Phân tích kết qủa PCR bằng NTSYS - version 2.0

27

Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

29

3.1. Kết quả tách chiết ADN

29

3.2. Phân tích mối quan hệ giữa các giống lúa đột biến dựa
trên kết quả đa hình của mồi RAPD

29

3.2.1. Mồi OPC4

29

3.2.2. Mồi OPC5

31

3.2.3. Mồi OPN12

32

3.2.4. Mồi OPM6

33

3.3. Mối quan hệ giữa các giống lúa đột biến dựa trên phân tích RAPD

35

Kết luận và đề nghị

38

1. Kết luận

38

2. Đề nghị

38

Tài liệu tham khảo

40

Nguyễn Thị Huyền

2

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Lời cảm ơn
Để hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này, trước hết em xin bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc tới Th.s Nguyễn Như Toản giáo viên hướng dẫn người

đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em cũng xin chân thành cảm ơn Viện di truyền Nông nghiệp, đã tạo
điều kiện cơ sở vật chất cho em hoàn thành quá trình thực nghiệm.
Tiếp theo, em xin cảm ơn các thầy, cô giáo khoa sinh KTNN, trường
ĐHSP Hà Nội 2, là những người đã dìu dắt, đem đến cho em niềm đam mê
khoa học, và những kiến thức bổ ích về môn khoa học thú vị này.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
động viên, cổ vũ và giúp đỡ em trong suốt 4 năm học tập và hoàn thành
khoá luận tốt nghiệp này.
Vĩnh Phúc, ngày 14 tháng 05 năm 2008
Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền

Nguyễn Thị Huyền

3

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan những kết quả trình bày trong khoá luận là chính xác,
trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì hội nghị khoa học nào.
Một số dẫn liệu trong đề tài tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ
sung cho khoá luận của mình.
Nếu sai tôi hoàn toàn chịu trách nhịêm.
Sinh viên

Nguyễn Thị Huyền

Nguyễn Thị Huyền

4

K30C_Sinh_KTN N


Khãa luËn tèt nghiÖp

Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t
ADN:

Acid deoxyribonucleic

AFLP:

Amplified Fragment Length Polymorphism.

ARN:

Acid ribonucleic

CTAB: Cetyl Trimetyl Amonium Bromit
dNTP: Dideoxyribonucleozit triphosphat
EDTA: Etylen Diamine Tetra Acetic acid
FAO:

Tæ chøc N«ng L­¬ng thÕ giíi

IRRI:

ViÖn nghiªn cøu lóa quèc tÕ

NTSYS: Numerial Taxonomy System
PCR:

Polymerase Chain Reaction

PVP:

Polyvinyl Pyroledone

RAPD: Random Amplyfied Polymorphic DNA
RE:

Restriction Enzyme

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
SDS:

Sodium dodecyl sunphate

SSR:

Simple Sequence Repeats

TAE:

Tris- Acetat- acid EDTA

TE:

Tris EDTA

UV:

Ultra violet

NguyÔn ThÞ HuyÒn

5

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Danh mục các bảng và hình vẽ
1. Danh mục các bảng
Bảng 3.1 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng
PCR_RAPD với mồi OPC4
Bảng 3.2 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng
PCR_RAPD với mồi OPC5
Bảng 3.3 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng
PCR_RAPD với mồi OPN12
Bảng 3.4 Các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng
PCR_RAPD với mồi OPM6

Bảng 3.5 Tổng số các phân được nhân bản ngẫu nhiên của các mồi đa hình
Bảng 3.6 Thống kê các mồi xuất hiện đa hình
Bảng 3.7 Ma trận tương đồng của 16 giống (dòng) lúa đột biến
2. Danh mục các hình
Hình 3.1 Kết quả phân tích sản phẩm PCR_RAPD ở 16 giống (dòng) lúa đột
biến với mồi OPC4.
Hình 3.2 Kết quả phân tích sản phẩm PCR_RAPD ở 16 giống (dòng) lúa đột
biến với mồi OPC5.
Hình 3.3 Kết quả phân tích sản phẩm PCR_RAPD ở 16 giống (dòng) lúa đột
biến với mồi OPN12.
Hình 3.4 Kết quả phân tích sản phẩm PCR_RAPD ở 16 giống (dòng) lúa đột
biến với mồi OPM6.
Hình 3.5 Sơ đồ hình cây của 16 giống (dòng) lúa đột biến

Nguyễn Thị Huyền

6

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Mở đầu
1. Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là nguồn thu nhập và cuộc sống của hàng triệu nông dân trên toàn
thế giới. Hàng năm có khoảng 150 triệu ha đất được dùng để trồng lúa, đạt sản
lượng khoảng 600 triệu tấn. Có khoảng trên 20 triệu tấn gạo được dùng làm
hàng hóa buôn bán trên toàn thế giới. Theo dẫn liệu từ tổ chức Nông Lương
thế giới (FAO) năm 2006 sản lượng gạo hàng hóa có thể đạt 27,8 triệu tấn,

nhưng vẫn thấp hơn so với năm 2005 (29 triệu tấn).
Châu á hiện là nơi sản xuất và tiêu thụ khoảng 90% lượng gạo toàn thế
giới. Trong đó các nước có khối lượng gạo xuất khẩu lớn là Thái Lan (7 - 8
triệu tấn), Việt Nam (4 - 5 triệu tấn), ấn Độ (4 triệu tấn) (http://
vi.wikipedia.org) [24].
Đáp ứng đòi hỏi trên việc nâng cao năng suất và chất lượng lúa gạo đang là
vấn đề được nhiều nhà khoa học quan tâm. Để làm được điều này thì việc
nghiên cứu, đánh giá nguồn gen lúa cũng như việc tìm hiểu sự đa hình di
truyền của các dòng, giống lúa là rất cần thiết, nhằm mục đích khai thác và sử
dụng chúng có hiệu quả hơn.
áp dụng công nghệ sinh học đặc biệt là sử dụng chỉ thị phân tử trong sinh
học phân tử vào chọn tạo giống để phân tích, xác định đa dạng di truyền của
các giống đã được khoa học quan tâm nghiên cứu. Dựa vào chỉ thị phân tử có
thể xác định tính đa dạng di truyền giữa các giống, các loài, giữa các cá thể
trong cùng loài. Mối quan hệ này là cơ sở cho sự phân loại và phát hiện loài
mới (Trần Duy Quý, 1997) [17]. Chỉ thị phân tử có thể được sử dụng để phát
hiện, đánh giá và nghiên cứu phả hệ. Ngoài ra nó còn được sử dụng để đánh
giá những biến động và quan hệ di truyền của sinh vật mà không phụ thuộc
điều kiện môi trường (Phạm Xuân Hội và cs., 2002) [7].

Nguyễn Thị Huyền

7

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Để góp phần tìm hiểu rõ hơn về mối quan hệ giữa các dòng lúa đột biến

thu được, bổ sung sự đa dạng về nguồn gen, tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu
thêm phong phú cho công tác chọn tạo giống lúa chúng tôi tiến hành đề tài:
Nghiên cứu mối tương quan di truyền của các dòng lúa đột biến chất
lượng bằng chỉ thị phân tử
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu mức độ đa hình và tương quan di truyền của các
dòng, giống lúa đột biến.
- Phân tích, xác định mối quan hệ di truyền giữa các dòng,
giống lúa đột biến đó với nhau và với giống gốc dựa trên sự
sai khác ở mức độ phân tử.
3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các dòng, giống lúa đột biến ở mức
độ ADN sẽ góp phần rất lớn cho phương pháp chọn lọc giống truyền thống:
1/ Nhanh chóng xác định được thông tin phả hệ của các dòng, giống lúa
đã được xử lí đột biến.
2/ Xác định nhóm ưu thế lai.
3/ Dự đoán ưu thế lai của các cặp lai ưu tú.
4/ Giảm thiểu chi phí công sức lao động.
Với những kết quả thu được, chúng tôi hi vọng sẽ đóng góp phần nào
cho những nghiên cứu di truyền về lúa và cung cấp những thông tin ban đầu
hữu ích cho công tác chọn giống lúa ở nước ta.

Nguyễn Thị Huyền

8

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Chương 1. Tổng quan tài liệu nghiên cứu
1.1. Nguồn gốc và giá trị kinh tế của cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc
Cây lúa nước được phân loại như sau:
Angiospermae

Nghành:

Hạt kín:

Lớp:

Một lá mầm: Monocotyledoneae

Bộ :

Lúa:

Poales

Họ:

Lúa:

Poaceae

Chi:

Lúa:

Oryza

Lúa có 12 cặp nhiễm sắc thể (2n = 24) là cây tự thụ phấn.
Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại
cách đây ít nhất 130 triệu năm. Hiện nay, có khoảng 21 loài cây hoang dại
thuộc chi này và 2 loài lúa đã được thuần hóa là lúa châu á (Oryza sativa) và
lúa châu Phi (Oryza glaberrima).
Lúa châu á O.sativa tổ tiên là một loại lúa hoang (O.rufipogon) phân
bố quanh chân núi Himalaya, có hai thứ sau:
+ Oryza sativa var indica (ở phía ấn Độ)
+ Oryza sativa var japonica (ở phía Trung Quốc).
Hiện nay, đây là giống lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực
trên khắp thế giới. Có nhiều giả thuyết khác nhau về nơi đầu tiên tiến hành
gieo trồng hay thuần hóa giống lúa này.
Lúa châu Phi: đã được gieo trồng trong khoảng 3500 năm trên lưu vực
châu thổ sông Niger. Tuy nhiên loài này không được phát triển rộng thậm chí
việc gieo trồng còn suy giảm do các giống châu á được đem tới trong khoảng
thế kỉ 7 đến thế kỉ 11 (http:// vi.wikipedia.org) [24].

Nguyễn Thị Huyền

9

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Theo Cadnalle (1998) cây lúa có nguồn gốc từ ấn Độ.

Theo Roseleviez (1931) cây lúa có nguồn gốc từ Đông Nam á đặc biệt
là từ ấn Độ và Đông Dương.
Quan điểm được nhiều người công nhận nhất là cây lúa có nguồn gốc từ
Đông Nam á. Vì đây là vùng có diện tích trồng lúa lớn nhất thế giới, có khí
hậu nhiệt đới nóng ẩm phù hợp với sự sinh trưởng của cây lúa. Đây cũng là
nơi trồng lúa sớm nhất.
Thông qua việc trao đổi, mua bán mà cây lúa ngày càng được phát tán
rộng rãi trên khắp thế giới như: Nhật Bản (năm 300 TCN), Triều Tiên (khoảng
850 - 500 TCN), Địa Trung Hải của châu Âu (khoảng năm 800 TCN), Nam
Mỹ (đầu thế kỉ 18) () [24]
1.1.2. Giá trị kinh tế và định hướng phát triển cây lúa ở Việt Nam.
Lúa là cây lương thực quan trọng thứ 2 trên thế giới sau cây ngô (Bùi
Mạnh Cường, 2007) [1], được gieo trồng ở 112 nước, cung cấp lương thực cho
hơn 65% dân số thế giới. ở Việt Nam, lúa gạo được sử dụng trong hầu hết các
bữa ăn của người dân.
Trong gần 30 năm trở lại đây sản xuất lúa gạo đã có bước tăng trưởng
mạnh (70%). Năm 2005, Việt Nam đã xuất khẩu 5,2 triệu tấn gạo thu về 1,4 tỉ
USD cho nền kinh tế quốc dân, đứng thứ 2 trên thế giới (sau Thái Lan) (Đào
Xuân Tân, 2003) [14]. Cây lúa đã góp phần giải quyết tình trạng thiếu đói sau
chiến tranh và hiện nay là đảm bảo an ninh lương thực trong nước.
Ngoài ra, những phụ phẩm thu được từ cây lúa như rơm, rạ, trấu, cám,
đã được ứng dụng triệt để trong chăn nuôi, trồng trọt, làm phân bón, chất
đốt giúp giảm chi phí trong nông nghiệp và bảo vệ môi trường.
Với sự phát triển của khoa học hiện đại, người ta đã tạo ra những giống
lúa mang nhiều đặc điểm tốt như chống lốp đổ, chín sớm, năng suất cao, chịu

Nguyễn Thị Huyền

10

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

hạn, chịu mặn, chống sâu bệnh, đặc biệt còn có khả năng mang các hợp
chất quý như vitamin, vácxin, sắt
Trong những năm sắp tới, để phù hợp với xu thế phát triển công nghiệp,
đô thị, các vùng trồng lúa chính của nước ta là đồng bằng sông Hồng và đồng
bằng sông Cửu Long ngày càng bị thu hẹp diện tích. Thực trạng đó đòi hỏi
chúng ta cần có quy hoạch và sử dụng hợp lý lượng đất canh tác của mình,
đồng thời tích cực khai phá những vùng đất mới nhằm tăng diện tích đất nông
nghiệp. Nghiên cứu, chọn tạo những giống lúa thích nghi điều kiện hạn, mặn,
phèn, nhằm đưa cây lúa tiến ra những vùng đất có điều kiện khắc nghiệt
(đồi núi, ven biển).
1.2. Chỉ thị phân tử và ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống
lúa
1.2.1. Cơ sở khoa học
a. Thành phần và cấu trúc hoá học của ADN .
Desoxyribonucleic acid (ADN) là một chất trùng hợp (Polynucleotide)
được tạo nên từ các đơn phân giống nhau là các nucleotide. Thành phần hoá
học của ADN gồm có: gốc phosphoric acid, đường 5- desoxyribose và các
base nitơ. Base nitơ ở ADN gồm 2 Purine là Adenine (A) và Guanine (G) và 2
Pyrimidine là Cytosine (C) và Thymine (T). Đường pentose (5C)
Desoxyribose gắn với base nitơ ở vị trí C1 tạo nên nucleoside. Nucleoside
được gắn thêm nhóm phosphate vào C5 của đường pentose thành nucleotide.
Tất cả các sinh vật đều có chung một cấu trúc ADN. Tính đặc trưng của ADN
của một loài chỉ biểu hiện ở trình tự sắp xếp các nucleotide dọc theo chiều dài
và số lượng của chúng.
Năm 1953 Watson- Crick đã xây dựng đúng đắn mô hình cấu trúc của

phân tử ADN hay còn gọi là chuỗi xoắn kép gồm 2 mạch polynucleotide bắt
cặp bổ sung tạo thành lò xo xoắn kép. Hai mạch được gắn với nhau bằng liên
kết hidro giữa các base đối diện với nhau theo nguyên tắc bổ sung trong từng

Nguyễn Thị Huyền

11

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

cặp A- T; G- C. Hai mạch đơn ADN có số lượng A+T bằng nhau; G+ C cũng
bằng nhau. Cấu trúc như trên tạo nên cấu trúc đối song song của sợi ADN tức
là đầu sợi mạch này được bố trí đối diện với đuôi sợi kia. Mỗi mạch đơn có
một đầu mang nhóm P tự do gắn vào C5 của đường desoxyribose nên gọi là
đầu 5P, còn đầu kia có nhóm OH ở vị trí C3 nên gọi là đầu 3OH (Phạm
Thành Hổ, 2006) [6].
5P

-------------> 3OH

3OH <------------ 5P
b. Biến tính và hồi tính của ADN
Hai mạch ADN gắn với nhau nhờ các liên kết hydro. Nếu tác động vào
làm đứt các liên kết này hai mạch sẽ tách rời nhau. Khi đun nóng phân tử
ADN vượt quá nhiệt độ sinh lý (thường khoảng 80 95oC) các liên kết hydro
giữa hai mạch bị đứt và chúng tách rời nhau. Đó là hiện tượng biến tính của
ADN. Nhiệt độ làm hai mạch tách rời nhau gọi là điểm chảy của ADN. Nhiệt

độ này đặc trưng cho mỗi loại ADN, phụ thuộc vào số lượng các liên kết
hydro. ADN có tỷ lệ G + C cao sẽ có điểm chảy cao hơn. ADN có 60% là
G+C thì điểm chảy khoảng 95oC. Đoạn ADN càng dài bao nhiêu thì số lượng
liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó điểm chảy cũng càng
cao.
Sự biến tính của ADN có thể thuận nghịch. Nếu ADN đã được biến tính
được hạ nhiệt độ từ từ trở lại bình thường, chúng có thể gắn lại với nhau thành
mạch kép. Hiện tượng này được gọi là hồi tính. Sử dụng tính chất này của
ADN có thể tiến hành lai các ADN với nhau, đây là cơ sở cho các phương
pháp phân tử hiện đại sau này (Phạm Thành Hổ, 2006) [6].
c. Kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) do Karry Mullis và cs. phát minh năm
1985. Đây là phương pháp in vitro để nhân nhanh một đoạn ADN nào đó mà
chỉ cần một đoạn ADN nằm giữa 2 vùng trình tự ngắn đã biết.

Nguyễn Thị Huyền

12

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

* Nguyên tắc của phương pháp PCR: Kĩ thuật này dựa trên cơ sở phản
ứng tổng hợp ADN vì vậy nó cần sự tham gia của các enzym ADN
polymerase. Loại enzym thường được sử dụng trong phản ứng PCR là Taq
polymerase, là enzym chịu nhiệt tốt được tách chiết từ vi khuẩn Thermophilus
aquaticus sống ở suối nước nóng; và các yếu tố khác như: ADN mồi (primer),
ADN khuôn (template), dNTPs, MgCl2, buffer. Mồi là các đoạn ADN ngắn,

mồi được nối dài để tạo thành mạch mới. Với 2 mồi chuyên biệt bắt cặp bổ
sung với 2 đầu của đoạn khuôn sẽ tổng hợp được đoạn ADN nằm giữa 2 mồi.
Các đoạn ADN mới lại được sử dụng làm khuôn tổng hợp cho chu kì
tiếp theo. Sau một số chu kì nhất định số lượng đoạn ADN được nhân lên theo
cấp số nhân. Một gen trong một thời gian ngắn có thể được nhân lên hàng
triệu lần.
* Các bước tiến hành phản ứng PCR: phản ứng PCR là một chuỗi
phản ứng gồm nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước:
Bước 1: Giai đoạn biến tính (Denaturing) ADN được xử lý ở nhiệt độ cao,
thường là từ 92oC - 94oC trong 30 giây đến 1 phút. ở giai đoạn này chuỗi xoắn
kép của ADN được tách thành hai mạch đơn.
Bước 2: Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Nhiệt độ được hạ thấp xuống 36oC 60oC trong khoảng 20 giây đến 1 phút, các đoạn mồi sẽ bắt cặp với ADN
khuôn theo nguyên tắc bổ sung.
Bước 3: Giai đoạn tổng hợp (Extending): tăng nhiệt độ lên đến 72oC, tạo điều
kiện tối ưu cho hoạt động của enzym polymerase. Dưới sự xúc tác của ADN
polymerase những đoạn mồi đă được bắt cặp với ADN khuôn sẽ được kéo dài.
Giai đoạn kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Các bước này được lặp lại nhiều lần (nhiều chu kỳ) và số lượng bản sao
ADN sẽ tăng lên gấp bội. Sau mỗi một chu kỳ số lượng ADN sẽ tăng lên gấp
đôi và số lượng ADN lại trở thành khuôn mẫu cho chu kỳ tổng hợp tiếp theo.
Như vậy, sau n chu kỳ từ 1 đoạn ADN ban đầu số lượng ADN sẽ tăng lên 2n.

Nguyễn Thị Huyền

13

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Tuy nhiên, người ta thường không kéo dài thời gian PCR quá 30 chu kỳ vì sẽ
làm gia tăng các sai sót. Trong thực nghiệm người ta thêm một bước biến tính
đầu tiên làm biến tính hoàn toàn phân tử ADN trước khi bước vào chu kỳ lặp
lại. Khi kết thúc người ta thực hiện thêm một bước tổng hợp ở 72oC. Bước này
thường kéo dài từ 5 - 7 phút để tổng hợp những đoạn trình tự còn chưa hoàn
chỉnh.
Kỹ thuật PCR được ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: sản
xuất mẫu dò, phân lập gen, nhân bội ARN, nhận dạng ở mức độ phân tử, xác
định và chuẩn đoán bệnh di truyềnTrong phân tích đa hình di truyền có
nhiều phương pháp như: AFLP, RFLP-PCR, SSR, RAPDđều dựa trên kỹ
thuật này.
1.2.2. Phân loại
Hiện nay, nhờ sự phát triển của các phương pháp sinh học hiện đại khác
nhau, người ta có thể sử dụng chỉ thị phân tử theo hai hướng cơ bản sau:
a. Chỉ thị sinh hóa.
Chỉ thị sinh hóa được phát hiện nhờ phương pháp izozym, dựa trên cơ
sở gen quy định sự tổng hợp protein
Izozym là các enzym cùng xúc tác cho một phản ứng trong tế bào
nhưng do các locus gen khác nhau quy định. Các enzym có bản chất là protein
và là chất đa điện li nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực. Khi chịu tác
dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kích thước,
khối lượng phân tử, lực tĩnh điện, sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và
sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gel sau khi điện di.
Các phân tử protein enzym là do gen quy định. Trong quá trình tiến
hóa, dưới tác dụng của điều kiện môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể,
các gen biến đổi hình thành các allen khác nhau và nó mã hóa cho quá trình
tổng hợp các phân tử protein khác nhau (Trịnh Đình Đạt và cs., 1999) [2].
Có thể chia izozym thành 2 dạng:

Nguyễn Thị Huyền

14

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

- Izozym đơn gen: các izozym này chịu sự kiểm soát của 1 gen.
- Izozym đa gen: các izozym chịu sự kiểm soát của nhiều gen
(đa gen)
Việc phân tích izozym giúp chúng ta phát hiện những allen đồng trội và
đây là phương pháp tương đối rẻ tiền, dễ tiến hành hơn các phương pháp sử
dụng chỉ thị ADN. Tuy nhiên, với số lượng ít ỏi các izozym, chúng chỉ thể
hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể và thực tế nó
cũng chỉ là sản phẩm của gen nên chưa phản ánh được chính xác bản chất di
truyền của các cá thể. Do vậy, việc sử dụng chỉ thị izozym còn có những hạn
chế nhất định (Nguyễn Văn Đồng, 1998) [4].
b. Chỉ thị phân tử
Các chỉ thị được phát hiện thông qua phương pháp đánh dấu các đoạn
Oligonucleotide và đều có một số đặc điểm chung là:
+ Không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường.
+ Thường liên kết với các tính trạng trội hoặc siêu trội.
+ Mang tính ổn định và được di truyền qua các thế hệ.
Chỉ thị phân tử rất đa dạng, phong phú và được chia thành các nhóm
như sau:
+ Chỉ thị dựa trên cơ sở phương pháp lai ADN hay chỉ thị RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) [19]. Dựa vào các băng ADN
trên gel điện di có thể phát hiện được các thể đồng (hoặc dị) hợp tử trội (lặn).

+ Nhóm chỉ thị phân tử dựa trên nguyên lý khuếch đại gen mong muốn
bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction): RAPD, SSR, AFLP,
1.2.3. Các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR
Trong giới hạn nghiên cứu của khoá luận tốt nghiệp tôi xin được trình
bày một số chỉ thị phân tử như sau.
a. Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
* Nguyên lí của phương pháp RFLP.

Nguyễn Thị Huyền

15

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Phương pháp RFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt giới hạn) do
Botstein và cs. phát minh năm 1980. Nguyên lý của phương pháp dựa trên các
đặc tính cơ bản sau đây:
+ Tính chất cắt đặc trưng của các enzym cắt giới hạn (Restriction
enzym RE.
+ Tính chất bắt cặp tương đồng giữa các chuỗi ADN theo nguyên tắc bổ
sung.
Vậy nguyên lý của phương pháp RFLP là: ADN của bộ gen sau khi xử
lí bằng enzym giới hạn sẽ bị cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau.
Sau khi điện di, các đoạn này sẽ phân bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua
biến tính các đoạn này sẽ trở thành những sợi đơn và được chuyển lên màng
celulose hoặc nylon với vị trí không thay đổi. Trong quá trình lai ADN tiếp
theo trên mẫu dò (thực chất là một đoạn ADN) sẽ bắt cặp với những đoạn có

trình tự nucleotit tương đồng với nó trên màng lai - kĩ thuật lai Southern. Khi
phân tích đa hình di truyền, sự đa dạng của các cá thể được thể hiện qua sự
khác nhau của các băng trên màng lai.
* ứng dụng của RFLP: RFLP là chỉ thị được dùng phổ biến nhất và
nhiều nhất, có thể kể ra những ứng dụng đó là:
- Xác định con lai F1 trong quần thể con lai có lẫn các cá thể tự phối
(Sollor và Backman, 1983).
- Đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể sinh vật.
- Xác định các dòng giống khác nhau. Sollor và Backman (1983) đã
phân biệt các dòng nội phối của ngô và cà chua với 20 dấu chuẩn RFLP.
- Xác định biến dị sôma. Các biến dị này là do ảnh hưởng của các đột
biến không xác định và có thể xảy ra trong quá trình nuôi cấy in vitro (Brettell
và cs., 1996).
- Thiết lập bản đồ phân tử các gen cần quan tâm (Bùi Mạnh Cường,
2007) [1].

Nguyễn Thị Huyền

16

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

b. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
* Nguyên lý của phương pháp
AFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN được khuếch đại chọn lọc) là
phương pháp dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR. Nguyên lý của phương pháp
này là gắn các đoạn ADN ngắn (adapter) vào hai đầu của mạch ADN sau khi

đã được cắt bằng enzym giới hạn. Sau đó thiết kế mồi theo các đoạn ADN
ngắn đó có gắn thêm một hoặc một số nucleotit và tiến hành phản ứng PCR.
Sản phẩm PCR được phân tích trên gel poliacrylamit, kết quả thu được
thường là 50 - 100 băng ADN/1 mẫu thí ngiệm. Số lượng các đoạn phân tử
ADN được khuếch đại phụ thuộc vào lượng C và G có trong primer. C và G
càng nhiều các đoạn ADN được khuếch đại càng ít. Tương tự, nếu kích thước
genom càng nhỏ số đoạn phân tử được khuếch đại càng ít.
* ứng dụng: AFLP là phương pháp xác định được độ đa hình cao, xây
dựng được bản đồ có mật độ cao của genom, xây dựng bản đồ chỉ thị ADN có
hiệu quả nhất so với các chỉ thị khác tiết kiệm thời gian, dễ dàng lặp lại và có
thể sử dụng để phân tích ADN từ bất kỳ nguồn gốc nào hay bất kỳ mức độ
phức tạp nào (Trần Duy Quý, 1997) [17].
Tuy nhiên, AFLP là loại chỉ thị di truyền trội, giá thành rất đắt nên phần
nào hạn chế khả năng sử dụng của nó (Nguyễn Văn Đồng, 1998) [4].
c. Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat)
* Nguyên lý của phương pháp:

SSR (khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản) còn gọi là phương pháp vi
vệ tinh hay tiểu vệ tinh, là một chỉ thị phân tử dựa vào PCR bằng cách nhân
bản các chuỗi mã đơn giản (từ 2 6 cặp base nitơ) lặp lại phân tán trong
genom của sinh vật. Các đoạn ADN này sau đó được tách ra trên gel
polyacrylamide hoặc agarose và hiển thị nhờ phản ứng nhuộm bạc hoặc
Ethydium Bromide rồi chụp hình bằng tia UV.

Nguyễn Thị Huyền

17

K30C_Sinh_KTN N

Khóa luận tốt nghiệp

Thể đa hình chiều dài các chuỗi mã đơn giản lặp lại được xác định dựa
trên sự khác biệt về số lượng các đơn vị lặp lại tại vị trí mà chỉ thị đó định vị
và đánh dấu sự khác biệt ngay trên vật chất di truyền.
* ứng dụng:
SSR được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền ở lúa, ngô,
cũng như lập bản đồ gen của chúng và thu được những kết quả khá cao.
Chỉ thị SSR là chỉ thị đồng trội (codominant) có khả năng phát hiện đa
hình rất cao và có khả năng tự động hóa trong quá trình thực nghiệm. Chỉ thị
SSR là công cụ hữu hiệu của phân tích hệ gen và lập bản đồ di truyền ở thực
vật. Song, nó cũng có nhược điểm là quy trình thiết kế mồi rất đắt và mỗi loại
mồi chỉ đặc trưng cho một loài (Nguyễn Văn Đồng, 1998) [4].
d. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA).
* Nguyên lý của RAPD:
RAPD (đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) là một trong những
phương pháp nghiên cứu đa hình dựa trên cơ sở của kỹ thuật PCR do William
(1990), Wesh và cs. phát minh.
Nguyên lý của phương pháp là: sử dụng một đoạn oligonucleotit có kích
thước 8 12 (thông thường là 10) nucleotit không cần biết trước trình tự làm
mồi cho phản ứng PCR. Các đoạn oligonucleotit đó do vậy có thể làm mồi
xuôi, hoặc có thể là mồi ngược. Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu
nhiên vào ADN khuôn ở bất kì vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó. Theo
tính toán một mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotit thì xác suất bắt cặp của nó là:
1/410 = 1/1.048.576, có nghĩa là một đoạn ADN khuôn có 1.048.576 cặp nu thì
có 1 trình tự bắt cặp với mồi. Giả sử một hệ genom đơn bội của lúa có kích
thước 550.000.000 bp thì với loại mồi ngẫu nhiên trên có thể có 524 vị trí bắt
cặp với mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn ADN được nhân lên. Trong thực tế
số lượng các đoạn được nhân bội nhỏ hơn nhiều vì nó phụ thuộc vào độ dài

Nguyễn Thị Huyền

18

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

đoạn được nhân và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên ADN của bộ
gen.
Khi phân tích đa hình di truyền bằng phương pháp RAPD, nếu hai cá
thể có bộ gen hoàn toàn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR-RAPD
với bất kỳ mồi nào cũng cho các băng ADN giống nhau. Nếu chúng ít nhiều
có sự khác nhau về bộ gen thì với một số mồi sẽ cho những băng khác nhau
giữa chúng. Sự khác nhau này thể hiện sự đa hình di truyền của các cá thể cần
nghiên cứu. Do đó, nó được sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm về di
truyền phân tử.
* ứng dụng của phương pháp: Ngoài ứng dụng trong phân tích đa
hình di truyền, RAPD còn được sử dụng cho các mục đích sau:
- Phân tích con lai F1 gĩưa bố mẹ đa hình với một mồi nào đó. Khi đó
con lai F1 sẽ có tất cả các băng ADN của bố và mẹ.
- Lập bản đồ gen liên kết.
- In dấu vân tay ADN.
- Phân tích di truyền của các quần thể.
1.2.4. ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa
Chỉ thị phân tử với nhiều ưu điểm của nó như thực hiện nhanh, dễ làm,
cho kết quả chính xác; đã và ngày càng trở thành công cụ hữu hiệu cho nghiên
cứu đa dạng di truyền của thực vật.

Trên đối tượng cây lúa, thông qua việc phân tích đa hình di truyền, các
nhà khoa học đã tìm ra nhiều tổ hợp gen khác nhau quy định những tính trạng
khác nhau quyết định đến năng suất và chất lượng lúa gạo.
Có thể kể ra những thành tựu đã đạt được nhờ việc ứng dụng của chỉ thị
phân tử trên đối tượng cây lúa đó là.
a. Đối với tính trạng amylose
Nhiều nghiên cứu cho thấy, hàm lượng amylose có liên quan mật thiết đến
độ hoá hồ. He và cs., (1999), sử dụng chỉ thị CT 201- RZ 450 để nghiên cứu

Nguyễn Thị Huyền

19

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

hệ di truyền độ hoá hồ trên con lai F1 ZY Q8 (O.indica) và JX 17
(O.japonica) kết quả cho thấy cả gen chính và gen phụ của độ hoá hồ đều nằm
trên nhiễm sắc thể số 6. Thực tế về kiểu hình cho thấy, khả năng hoá hồ quyết
định rất lớn đến hàm lượng amylose (Trương Bá Thảo, 2006) [16].
b. Đối với tính trạng hàm lượng protein
Đặc điểm di truyền về hàm lượng protein do đa gen kiểm soát phân bố trên
các nhiễm sắc thể số 1, 2, 4, 6, 9, 12, (các thành phần của glutein) nhiễm sắc
thể 7, 11, (protein dự trữ trong nội nhũ) nhiễm sắc thể 5, 7, 12 (các thành phần
của prolamin). Hàm lượng protein biến động mạnh mẽ do tác động của môi
trường, qua nhiều năm nghiên cứu cho thấy hệ số tương quan với môi trường
từ 0,130 đến 0,372. Kết quả nghiên cứu của Shenoy và cs., (1991), chứng tỏ
rằng hệ số di truyền hàm lượng protein đạt 71%. Một số cặp lai nghiên cứu

cho thấy hệ số di truyền hàm lượng protein rất thấp 11,1%. Từ những biến
động đó cần phải phân nhóm di truyền trên các nhóm khác của các giống lúa
địa phương, xem như là nguồn vật liệu lai phục vụ cho chương trình chọn
giống lúa tốt hơn.
c. Đối với tính trạng mùi thơm
Ahn và cs. [19] báo cáo chỉ thị RG 28 liên kết với gen điều khiển mùi
thơm cây lúa fgr nằm trên nhiễm sắc thể số 8 của giống lúa Della và Basmati
370.
Theo Lorieux và cs., (1995) [21] có 4 loại chỉ thị phân tử (RFLP,
RAPD, STS, izozym) được sử dụng lập bản đồ chỉ thị phân tử cho gen điều
khiển mùi thơm, kết quả xác định, có nhiều chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 8 liên
kết rất chặt với gen điều khiển sự hiện diện của AP (2- axetyl - 1- pyrroline),
hợp chất chính tạo ra mùi thơm của lúa. Jin và cs., (1996) [20] dùng 300
RAPD điều tra đa hình tính trạng thơm của con lai từ giống bố mẹ Khao
Dawk Mali 105 (thơm) và CT 9993 (không thơm), kết quả cho thấy tính đa
hình giữa hai giống khá cao (64,1%).

Nguyễn Thị Huyền

20

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Neelu Jain và cs., (2003) [22] sử dụng 15 chỉ thị SSR đã được sắp xếp
trên nhiễm sắc thể số 8. Garland và cs., (2000) phân tích sự đa dạng về chất
lượng gạo của 12 loại giống lúa Basmati trên thị trường sử dụng các chỉ thị
SSR cho mật độ đa hình cao giữa giống Basmati thơm và không thơm.

d. Nghiên cứu đối với một số tính trạng có liên quan đến chất lượng lúa
gạo
Hiện tại có hơn 2300 chỉ thị ADN (RFLP) do đại học Cornell của Mỹ
công bố và có hơn 600 chỉ thị AFLP do Nhật Bản công bố trong chương trình
Rice genome (Nguyễn Thị Lang và cs., 2005) [10]. Với số lượng chỉ thị
phân tử lớn như trên các nhà chọn giống có được cơ hội tốt để nghiên cứu đa
dạng di truyền trong phân nhóm các giống lúa và nghiên cứu xác định gen
mục tiêu trong quần thể con lai. Việc áp dụng các tiến bộ kỹ thuật chỉ thị phân
tử (izozym marker, ADN marker) để lập bản đồ liên kết đã được phát triển
trong chọn giống lúa chống chịu sâu bệnh hại, giống lúa kháng mặn, chịu hạn,
gen kháng bệnh đạo ôn, gen kháng bệnh bạc lá.
1.2.5. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới
a. Tình hình nghiên cứu trong nước.
- Bùi Mạnh Cường và cs., Viện Nghiên cứu ngô đã sử dụng chỉ thị
RAPD với 60 mồi ngẫu nhiên trên 29 dòng thuần để nghiên cứu đa dạng di
truyền của tập đoàn giống ngô lai [1].
- Nguyễn Thị Dung, Viện Công nghệ sinh học đã phân tích mối tương
đồng di truyền của 11 cây vải ở các độ tuổi khác nhau dựa trên cơ sở phân tích
đa hình ADN bằng phương pháp RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên [15].
- Trần Nhân Dũng và cs., Viện Nghiên cứu và Phát triển công nghệ sinh
học trường Đại học Cần Thơ, nghiên cứu tính đồng dạng di truyền trên dòng
cam xoàn, sầu riêng và măng cụt tại tỉnh Bến Tre bằng kỹ thuật sinh học phân
tử và chuyển giao kỹ thuật PCR trong chuẩn đoán bệnh Greening.

Nguyễn Thị Huyền

21

K30C_Sinh_KTN N

Khóa luận tốt nghiệp

- Phan Ngô Hoàng và cs., 2004,2005) nghiên cứu độ đa dạng di truyền
bằng kỹ thuật PCR-RAPD ở khoai mì dòng cuống trầu.
- Nguyễn Văn Khiêm và cs., Viện Di Truyền Nông Nghiệp đã sử dụng
kỹ thuật RAPD với 17 đoạn mồi ngẫu nhiên để đánh giá mối quan hệ di
truyền của 20 mẫu khác nhau thuộc loài Boswellia sacraflueck (Trương Bá
Thảo, 2006) [16].
b. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
- Ann Lai J. và cs., đã sử dụng kỹ thuật RAPD và ISSR để đánh giá
tính đa hình của 37 giống chè Camellia sinensis (L) O.Kuntze ấn Độ.
- Jena S., Sahoo P., Mohanty S., Das AB., (2004), nhận dạng chỉ thị
RAPD trong xác định tính đa dạng cấu trúc DNA cây họ đậu trong rừng đước
ở Orissa.
- Yang và Quios, đã sử dụng 28 đoạn mồi ngẫu nhiên để nghiên cứu sự
khác biệt của 23 giống cần tây và được chia làm 3 nhóm.
- Orozco và cs., (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối
quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống cà phê được lai tạo từ các loài bố,
mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục
đích tạo con lai có đặc điểm quý để lai tạo giống cà phê mới.

Nguyễn Thị Huyền

22

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

Chương 2: Vật liệu, thời gian, địa điểm và
Phương pháp nghiên cứu
2.1.Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu này là 16 giống lúa nằm trong
bộ sưu tập lúa đột biến thế hệ thứ 6 của Th.s Nguyễn Như Toản,
Gồm các giống thứ tự như sau:
stt Tên

stt Tên

stt

Tên

stt Tên

1

D52N

5

D51

9

HD-01

13 XH-1

2

A20

6

CL8-1

10

HD-02

14 XH-3

3

D53

7

HD-1DB

11

BT-7

15 XH-5

4

D52

8

HD-1LM

12

CL-9

16 IR-64

2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
a. Thời gian nghiên cứu
Từ 01/ 02/ 2007 đến 15/ 02/ 2008.
b. Địa điểm nghiên cứu
Mẫu vật thực vật được chúng tôi thu thập tại khu ruộng thí nghiệm ở xã
Cao Minh, thị xã Phúc Yên, Vĩnh Phúc.
Mẫu đã thu thập được bảo quản và tiến hành các thí nghiệm tại Viện Di
truyền Nông nghiệp.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu
Cắt ngang phần ngọn thân cây lúa từ lá thứ nhất đến lá thứ ba, rửa sạch
mẫu cho vào bao giấy, giữ trong nitơ lỏng sau đó bảo quản ở -70oC làm
nguyên liệu cho quá trình tách chiết ADN.

Nguyễn Thị Huyền

23

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

2.3.2. Phương pháp tách chiết ADN từ lá lúa
* Nguyên tắc của phương pháp tách chiết ADN tổng số từ thực vật
Phá vỡ thành tế bào thực vật bằng biện pháp cơ học và các chất tẩy
mạnh. ADN được giải phóng và được làm sạch tạp chất nhờ enzym proteinaza
K, dung dịch phenol. Nhờ etanol kết tủa ADN tại -200C, thu kết tủa đó bằng
biện pháp ly tâm.
* Quy trình tách chiết ADN
Gồm các bước như sau:
1. Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60oC. Thành phần đệm chiết
gồm có:
+ 2% (W/v) CTAB
+ 100 mM Tris - HCl (pH = 8,0)
+ 20 mM EDTA
+ 1,4 M NaCl
+ 10% SDS
+ 2% PVP
2. Nghiền 1g mẫu lá lúa bằng cối và chày sứ trong Nitơ lỏng thành dạng
bột mịn.
3. Chuyển toàn bộ bột lá lúa vào ống ly tâm sạch và thêm 4 ml dung
dịch đệm chiết (extraction buffer).
4. Trộn đều và ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút.
5. Làm nguội hỗn dịch xuống nhiệt độ phòng, bổ sung 8 ml dung dịch
chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1), lắc nhẹ tới khi thành dạng nhũ sữa.

6. Ly tâm hỗn dịch với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C.
7. Lấy dịch ở pha lỏng cho vào ống mới và chiết lần 2 bằng hỗn hợp
CHCl3 IsoA (24: 1) thu dịch chiết chứa ADN.
8. Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C.

Nguyễn Thị Huyền

24

K30C_Sinh_KTN N


Khóa luận tốt nghiệp

9. Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa. Làm khô kết tủa ở nhiệt độ
phòng trong khoảng 30 phút sau đó hoà tan kết tủa trong 2ml TE (gồm 10 mM
tris; 1mM EDTA).
10. Xử lý ADN bằng 8l RNase (10mg/ml stock) trong 1giờ ở 370C để
loại ARN.
11. Chiết lại bằng 1 thể tích tương ứng phenol : chloroform (24 : 1).
12. Chuyển pha trên sang ống mới, thêm 2 lần thể tích tương ứng
ethanol (đã làm lạnh) và giữ ở -20 0C trong 1giờ.
13. Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C.
14. Rửa bằng ethanol 70%.
15. Làm khô trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
16. Hoà tan ADN đã tinh sạch trong 200l TE (hoặc nước khử trùng)
17. Bảo quản ở -200C.
2.3.3. Kiểm tra nồng độ ADN tổng số
ADN tổng số sau khi tách chiết được xác định nồng độ, độ tinh sạch, độ
nguyên vẹn bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% với thang chuẩn

Lamda DNA.
2.3.4. Tiến hành phản ứng PCR
Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendorf 0,2 ml và được thực
hiện trên máy Master cycle 5330. Thành phần của phản ứng được liệt kê như
sau:

Nguyễn Thị Huyền

25

K30C_Sinh_KTN N