Luận văn sư phạm Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn khả năng sinh Cellulase từ đất tại Xuân Hoà - Phúc Yên - Vĩnh Phúc

TR

NG

I H C S PH M HẨ N I 2
KHOA SINH- KTNN

KHịA LU N T T NGHI P

PHỂN L P, TUY N CH N X KHU N
Cị KH N NG SINH CELLULASE T I
XUÂN HÒA- PHÚC YÊN- V NH PHÚC
Chuyên ngành: Vi sinh v t

Xuân Hòa- 2010


L IC M N
Em xin bƠy t lòng bi t n sơu s c t i PGS.TS.
Nhung đƣ t n tình ch b o, h

inh Th Kim

ng dƣn em trong su t quá trình h c t p

vƠ th c hi n đ tƠi.
Em c ng xin chơn thƠnh c m n toƠn th các th y cô trong t vi
sinh đƣ ch b o vƠ giúp đ đ em có th hoƠn thƠnh đ

c khóa lu n t t

nghi p nƠy.
Em c ng xin chơn thƠnh c m n ban ch nhi m khoa SinhKTNN vƠ ban giám hi u nhƠ tr
th hoƠn thƠnh đ

ng đƣ t o đi u ki n t t nh t đ em có

c khóa lu n t t nghi p nƠy.

Cu i cùng em xin chơn thƠnh c m n gia đình vƠ b n bè đƣ đ ng
viên giúp đ em trong su t th i gian th c hi n khóa lu n nƠy.
Em xin chơn thƠnh c m n!
Xuân Hòa , tháng 05 n m 2010
Sinh viên
Hoàng Mai Linh


L I CAM OAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên c u c a riêng tôi. Các k t
qu nghiên c u , s li u đ

c trình bày trong khóa lu n là trung th c và

không trùng v i k t qu c a tác gi khác.
Tác gi

Hoàng Mai Linh


CÁC T

VI T T T

VSV

: Vi sinh v t

ISP

: International Steptomyces Project

N

: Nit

C

: Cacbon

CFU

: Colony Forming Unit

HSKS

: H s i khí sinh

HSCC

: H s i c ch t

M CL C
Trang
M

U…………………………………………………………..........1

CH

NG 1. T NG QUAN TẨI LI U………………………………...4

1.1

V trí và phân lo i x khu n………………………………............4

1.2

c đi m sinh h c c a x khu n………………………………….9

1.3
1.4.

Cellulose và cellulase……………………………………………...12
Tình hình nghiên c u x khu n sinh cellulase

Vi t Nam và trên th gi i

…………………………………………………………………………….14
CH

NG 2. PH

NG PHÁP VẨ V T LI U NGHIểN C U………..15

2.1.

V t li u…………………………………………………………….15

2.2.

Ph

ng pháp nghiên c u…………………………………………..18

CH

NG 3. K T QU VẨ TH O LU N……………………………..20

3.1.

K t qu phân l p x khu n t đ t…………………………………..20

3.2.
3.3.

c đi m hình thái c a các ch ng đã phân l p đ

c……………….23

Xác đ nh kh n ng sinh cellulase c a x khu n…………………….30

K T LU N VẨ KI N NGH ……………………………………………..34
1.

K t lu n……………………………………………………………..34

2.

Ki n ngh ……………………………………………………………34

TẨI LI U THAM KH O…………………………………………………35


DANH M C B NG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LU N

B NG
B ng

Tên b ng

Trang

3.1

Các ch ng x khu n phân l p t đ t mùn

20

3.2

Các ch ng x khu n phân l p t đ t ru ng

21

3.3

c đi m khu n l c c a các ch ng x khu n nghiên c u

24

3.4

c đi m khu n l c c a các ch ng x khu n nghiên c u

26

3.5

Hình d ng cu ng sinh bào t c a các ch ng x khu n
28-29

nghiên c u
3.6

K t qu th ho t tính cellulase trên môi tr

ng ch a

30

ng ch a b t

31

CMC
3.7

K t qu th ho t tính cellulase trên môi tr
gi y


HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

3.1

22-23

3.2

M t s ch ng x khu n phân gi i cellulose phân l p t
đ t
Khu n l c x khu n

3.3

S c t tan c a m t s ch ng x khu n phân l p

27-28

3.4

Hình nh cu ng sinh bào t c a các ch ng x khu n
phân l p đ c

29-30

3.5

Hình nh ho t tính cellulase c a các ch ng x khu n
nghiên c u

32-33

25


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

M

U

1. Lý do ch n đ tƠi

X khu n c trú ch y u trong đ t, chúng đóng vai trò quan tr ng trong
quá trình hình thành và phát tri n c a đ t. X khu n tham gia tích c c vào các
quá trình chuy n hoá và phân gi i nhi u h p ch t h u c ph c t p và b n
v ng nh cellulose, ch t mùn, kitin, keratin, lignin…góp ph n khép kín các
vòng tu n hoàn v t ch t trong t nhiên. X khu n còn giúp tích l y ch t mùn
làm nên đ phì nhiêu c a đ t.
Ngày nay x khu n đ

c ng d ng r ng rãi trong các ngành công

nghi p lên men (s n xu t axit h u c nh lactat, axetat, glutamat…). Ch bi n
t o các s n ph m enzyme, ng d ng enzyme do m t s x khu n có kh n ng
sinh ra nhi u nh : cellulase, proteinase… H u h t các loài x khu n thu c
gi ng Actinomyces đ u có kh n ng hình thành kháng sinh (streptomicine,
oreomicine…), m t s vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12) chúng đ
d ng trong công nghi p d

c ph m, y h c…[1].

Cellulose là thành ph n ch y u t o lên b khung x
v t. Trung bình m i n m

c ng

ng t bào th c

c tính có kho ng 30 t t n ch t h u c đ

c cây

xanh t ng h p trên trái đ t trong đó có 30% là thành t bào th c v t, thành
ph n ch y u c a thành là cellulose. Hàng n m trái đ t ph i nh n v m t
l

ng ch t th i kh ng l (ch t th i sinh ho t, ch t th i th c v t nh lá, cành

…, ch t th i công nghi p), thành ph n ch y u c a các lo i ch t th i này là
cellulose.

phân gi i l

ng l n cellulose này khu h vi sinh v t trong đ t

đóng vai trò không nh , mu n làm đ

c đi u đó các vi sinh v t ph i s n sinh

ra cellulase, enzyme này đóng vai trò phân gi i cellulose.
Ngoài protenase ng d ng trong công nghi p ch bi n s a, amylase
trong công nghi p r

Hoµng Mai Linh

u, bia thì cellulase c ng là m t trong nh ng enzyme
-1-

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

đ

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

c ng d ng r t nhi u trong công nghi p s n xu t gi y, công nghi p may,

s i… Cellulase ng d ng s n xu t th c n cho gia súc, x lý ch t th i nông
nghi p, s n xu t các lo i đ

ng probiotin mà nguyên li u dùng

đây ch y u

là dùng vi sinh v t s ng.
T nh ng lí do trên v i m c đích tìm hi u, làm quen v i ph
nghiên c u vi sinh v t (VSV) nói chung, ph

ng pháp

ng pháp nghiên c u x khu n

có kh n ng sinh cellulase nói riêng, tôi ch n đ tài: “Phân l p, tuy n ch n
x khu n có kh n ng sinh cellulase t đ t t i Xuân Hòa- Phúc Yên- V nh
Phúc”.
2. M c tiêu c a đ tƠi
- Phân l p, tuy n ch n x khu n có kh n ng sinh cellulase

các đ sâu:

0cm, 5cm, 10cm, 15cm, 20cm, 25cm, 30cm t hai lo i đ t mùn và đ t ru ng

t i Xuân Hòa – Phúc Yên – V nh Phúc.
- Nghiên c u các đ c đi m hình thái: h s i khí sinh (HSKS), h s i c ch t
(HSCC), s c t tan, cu ng sinh bào t c a các ch ng x khu n phân l p đ c.
- Th ho t tính enzyme cellulase c a m t s ch ng x khu n phân l p đ c.
3. N i dung c a đ tƠi
tài “ Phân l p, tuy n ch n x khu n có kh n ng sinh cellulase t đ t
t i Xuân Hòa – Phúc Yên – V nh Phúc” đ tìm hi u:
-

c đi m s phân b c a x khu n và kh ng đ nh đ

c vai trò c a

chúng trong đ t.
-

Nghiên c u đ c đi m hình thái (HSKS, HSCC, s c t tan, cu ng sinh
bào t …).

-

Th ho t tính sinh cellulase c a x khu n phân l p t đ t.

Hoµng Mai Linh

-2-

K32D - Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

4. Ý ngh a c a đ tƠi
tài góp ph n t o c s khoa h c cho các ph
c i t o đ t, bón phân… theo h
c

ng th c canh tác, cày x i,

ng l i d ng VSV phân gi i cellulose, t ng

ng các quá trình phân gi i h p ch t h u c đ làm giàu dinh d

ng cho

đ t, t ng n ng su t cây tr ng.
M t khác đ tài còn cho phép tuy n ch n nh ng ch ng x khu n có kh
n ng sinh cellulase cao, t đó có th t o ra các ch ph m VSV ch các ch ng
x khu n này ph c v cho vi c x lí rác th i ( rác sinh h c), ch bi n th c n
gia súc probiotin…

Hoµng Mai Linh

-3-

K32D - Sinh

Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2
CH

NG 1

T NG QUAN TÀI LI U
1.1.

V trí vƠ phơn lo i x khu n

1.1.1. V trí c a x khu n trong sinh gi i
Theo Krassinikov, x khu n đ

c tách thành l p riêng g m x khu n

b c cao có h s i phát tri n, có c quan sinh s n riêng và x khu n b c th p
có h s i không phát tri n, t bào hình que ho c hình c u.
Trong cu n “Bergey’s Manual” (1989) Bergey x p x khu n vào b
riêng (Actinomycetales). B x khu n thu c l p Thallobacteria, ngành
Firmicutes, gi i Bacteria, siêu gi i Prokaryota.
Theo h th ng phân lo i hi n nay, x khu n thu c nhóm VSV nhân
nguyên th y (Procaryota) thu c gi i kh i sinh (Monera) trong h th ng phân
lo i n m gi i hay b y gi i thì x khu n đ u thu c gi i vi khu n chu n
(Eubacteria), thu c siêu gi i nhân s .
B x khu n bao g m 10 h :
- Actinomycetaceae
- Actinoplanaceae
- Permatophilaceae

- Frankiaceae
- Micramonosporaceae
- Thermonosporaceae
- Mycobacteriaceae
- Norcarddiceae
- Streptomycetaceae

Hoµng Mai Linh

-4-

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

Trong đó Streptomycetaceae là lo i x khu n có h s i gi ng n m và đ

c

nghiên c u khá k .
1.1.2. Phơn lo i x khu n
1.1.2.1. L

c s phơn lo i x khu n

Krainki l n đ u tiên đ ra các ch tiêu m i trong vi c phân bi t các loài
khác nhau và đã s b phân lo i 17 ch ng thu c chi Actinomyces. Ông coi các

đ c đi m sinh lí, sinh hóa là m u ch t trong nguyên t c phân lo i [8].
Waksman và Cutis đã đ c p đ n d ng trung gian trong mô t phân lo i
c a mình và coi đ c đi m hình thái bào t là đ c tính quan tr ng nh t c a các
cá th và đ a ra m t s loài m i có ý ngh a [8].
Millard và Burr tìm ra 17 lo i, Jensen tìm ra 2 lo i m i, Dutche tìm ra
13 lo i m i [8].
1chi Streptomyces d a trên HSKS, HSCC và m t s đ c đi m trung gian
khác [8]
Waksman và Henrici đã đ a ra h thông phân lo i và đ n n m 1961 h
th ng phân lo i này đã đ
khu n đ

c s a đ i l i. Trong h th ng phân lo i này thì x

c x p thành 3 h , 10 chi và đã mô t đ

c h n 250 loài thu c chi

Streptomyces. H th ng phân lo i này d a vào màu s c HSKS, HSCC, hình
d ng bào t , chu i bào t …[8].
Krassinicov công b h th ng phân lo i n m tia m i d a tên h th ng
đã công b n m 1949, trong đó x khu n đ

c chia thành 6 h v i 26 chi [8].

Nh ng n m g n đây các h th ng phân lo i ngày càng nhi u, đ th ng
nh t trong cách mô t , ISP (International Streptomyces Project) đã nêu lên các
ph

ng pháp và môi tr

1.1.2.2. M t s ph

ng mô t [9].

ng pháp trong phơn lo i x khu n

Nh s phát tri n nhanh chóng c a khoa h c k thu t, s l ng x
khu n đ

c mô t ngày càng nhi u và chính xác d a trên c s s phát tri n

Hoµng Mai Linh

-5-

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

c a sinh h c phân t , hóa sinh h c, lí sinh h c…
và chính xác, ng

phân lo i nhanh chóng

i ta s d ng phân lo i s (Numberical taxonomy), nghiên

c u ch ng lo i phát sinh ( Phylogeny taxonomy).
Tuy nhiên hi n nay trong th c nghi m, ng

i ta v n ch y u d a vào

các đ c đi m hình thái, tính ch t nuôi c y, đ c đi m sinh lí, sinh hóa , mi n
d ch h c và sinh h c phân t .
1.1.2.2.1.

c đi m hình thái vƠ tính ch t nuôi c y

D a vào đ c đi m hình thái và tính ch t nuôi c y ng

i ta chia x khu n ra

làm 4 nhóm chính:
- Nhóm 1: G m các x khu n mang bào t rõ r t, sinh s n b ng bào t và
phân hóa thành HSKS, HSCC.
- Nhóm 2: G m các x khu n có bào t nang, h s i phân chia theo
h

ng vuông góc v i nhau tao thành c u trúc t

ng t nang bào t .

- Nhóm 3: G m các x khu n có d ng Norcadia, sinh s n b ng phân đ t
h s i.
- Nhóm 4: G m các x khu n có d ng Corynebacter và d ng c u, t bào
có hình ch T, V và th

ng không có h s i.

Trong nh ng n m g n đây, d a vào nghiên c u x khu n trên các môi
tr

ng khác nhau, ng

i ta chia hình d ng chu i bào t x khu n thành 6

ki u:
- Ki u S: Type “Sprina” – chu i bào t xo n.
- Ki u SRA: Type “Sprina- Rectinaculum- Apertum” – chu i bào t
xo n có d ng móc câu hay xo n không hoàn toàn.
- Ki u SRF: Type “Spirina- Rectus- Flexibilis” - chu i bào t xo n, cong
đ n th ng.
- Ki u RA: Type “Rectinaculum- Apertum” - chu i bào t có móc, có
khóa.

Hoµng Mai Linh

-6-

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

- Ki u RA- RF : Type “Rectinaculum Apertum- Rectus Flexibilis” –

chu i bào t có d ng móc hay xo n không hoàn toàn.
- Ki u RF : Type “Rectus- Flexibilis” – chu i bào t th ng đ n l n
sóng.
Hi n nay có r t nhi u khóa phân lo i x khu n nh ng có th g p thành hai
h th ng sau đây :
1. H th ng phân lo i ch y u gi a vào đ c đi m hình thái đ phân lo i
nhóm l n nh h , gi ng. Các phân lo i th p h n loài thì dùng đ c đi m
nuôi c y, sinh lí, sinh hóa đ phân lo i [8]
2. H th ng phân lo i ch y u gi a vào các đ c đi m sinh lí nh màu s c
h s i… đ phân nhóm, sau đó dùng các đ c đi m nuôi c y đ phân
lo i đ n loài. Nhóm h th ng này c a Waksman, Gause… các tác gi
đ u th ng nh t l y đ c đi m s d ng ngu n nit , cacbon làm y u t b
sung cho phân lo i đ n loài.
1.1.2.2.2.
Ph

c đi m hóa phơn lo i

ng pháp hóa phân lo i d a vào các d li u v đ nh tính, đ nh l

ng

các thành ph n hóa h c trong t bào VSV đ phân lo i, ch y u là các đ c
đi m sau :
- Type thành t bào
- Type peptidoglucan
- Axit mycolic
- Axit béo
- Menaquinon
- Type photpholipit

Trong type thành t bào, ng i ta phân thành t bào x khu n thành 4 d ng :
+ Type I: Thành t bào có L- ADP và glixin
+ Type II: Thành t bào có m- ADP và glixin

Hoµng Mai Linh

-7-

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

+ Type III : Thành t bào có m- ADP
+ Type IV : Thành t bào có m- ADP, đ
Trong type peptidoglucan ng

ng arabinose, galactose

i ta chia x khu n thành :

Type ph

Type

A (3-4)

B (2-4)

C u liên k t

A1

- Liên k t peptide tr c ti p

A2

- Chu i peptide bên

A3

- Glycerol ho c axit monocacboxylic

A4

- Axit dicacboxylic

B1

- Axit đ

B2

- Các axit amin đ

c diamine hóa
c diamine hóa

1.1.2.2.3. Phơn lo i s
Ph

ng pháp này d a trên s đánh giá v m c đ gi ng nhau gi a các

VSV trong m t s l n các đ c đi m ch y u là các đ c đi m hình thái, sinh
hóa, sinh lí đ so sánh các ch ng v i nhau t ng đôi m t theo công th c sau :
SAB = nS*100/ ( nS + nd )
Trong đó :
- SAB: m c đ gi ng nhau gi a hai cá th
- nS: t ng s các đ c đi m d
- nd: t ng s các đ c đi m d

ng tính c a 2 ch ng so sánh
ng tính c a ch ng này mà âm tính c a

ch ng kia
K t qu này đ
nhau mà các VSV đ

c bi u hi n trên s đ nhánh và tùy thu c m c đ gi ng
c x p vào các nhóm.

1.1.2.2.4. Nghiên c u v phát sinh ch ng lo i
Nh s s p x p phát sinh ch ng lo i mà các sinh v t đ

c x p vào h

th ng phân lo i g n t nhiên h n.
Các nghiên c u v di truy n phân t nh m xây d ng cây phát sinh

ch ng lo i b ng cách ti n hành so sánh các cao phân t ADN, ARN, protein

Hoµng Mai Linh

-8-

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

mà quan tr ng h n c là s s p x p các nucleotit c a rARN 16S. M c đ
gi ng nhau gi a hai cá th so sánh th hi n m i quan h gi a chúng.
1.2.

c đi m sinh h c c a x khu n

1.2.1.

c đi m hình thái c a x khu n
Tùy lo i môi tr

ng mà x khu n có hình thái khác nhau. Trên môi

tr

ng đ c, x khu n phát tri n thành nh ng khu n l c. Tùy theo loài, môi

tr

ng nuôi c y mà kích th

c màu s c khu n l c có th khác nhau nh : đ ,

da cam, vàng, nâu, h ng, xám… Khu n l c x khu n th
d ng nhung t , hay d ng màng d o và th

ng ch c, xù xì, có

ng có c u trúc 3 l p : l p ngoài có

c u trúc s i b n ch t, l p gi a có d ng c u trúc t ong và l p trong cùng có
c u trúc t
trong môi tr

ng đ i x p. C u trúc khu n l c x khu n v i h
ng t o ra HSCC và m t ngoài môi tr

ng sinh tr

ng t o ra HSKS.

kính h s i x khu n thay đ i trong kho ng 0,2-1,0µm đ n 2,0-3,0µm .

ng
ng
as

các x khu n có h s i phân nhánh m nh, không có vách ng n. Màu s c h
s i đa d ng, có th g p các màu tr ng, vàng, da cam, nâu, tím, đen… HSCC
có th sinh ra các s c t tan trong n
HSKS

t n cùng th

c ho c tan trong dung môi h u c .

ng là các chu i bào t có d ng xo n, l

n sóng, th ng,

vòng… ây là đ c đi m khá quan tr ng đ phân lo i x khu n [1]
Các bào t x khu n có th có hình tròn, b u d c, hình que, hay hình
tr … C u trúc b m t bào t có th có d ng nh n (Smooth), có gai (Spinny),
kh i u (Warty), n p nh n (Rugose) hay d ng tóc (Hairy). Hình d ng, kích
th

c, c u trúc b m t bào t c ng là m t trong nh ng ch tiêu quan tr ng đ

đ nh lo i x khu n [1].
Khi nuôi c y x khu n trong môi tr

ng d ch th , x khu n có th m c

thành d ng màng hay d ng vòng trên thành bình nuôi c y, trên b m t môi
tr

ng hay thành d ng b t ho c k t t a ki u vi khu n. Khi nuôi c y chìm trên

máy l c ho c n i lên men đ

Hoµng Mai Linh

c khu y đ o thì x khu n phát tri n thành d ng

-9-

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

s i bông ho c c n x p. Nh ng th
nh ng qu c u nh ch a đ y môi tr

ng g p h n c là x khu n phát tri n thành
ng, kích th

c t 0,1mm đ n 2-3mm.

1.2.2. C u t o c a x khu n
X khu n có c u t o t

ng đ i gi ng vi khu n g m có thành t bào,

màng t bào ch t, v t ch t nhân s và các h t d tr . X khu n thu c nhóm

VSV Gram (+). Thành t bào dày kho ng 20nm có vai trò duy trì hình d ng
h s i và b o v t bào, đ

c c u t o ch y u g m các l p glucopeptit, các

g c N-Acetylglucosamine liên k t v i N-Acetylmuramic (ho c NGlycolylmuramic, ví d nh chi Micromonospora).
C n c vào k t c u hóa h c có th chia thành t bào x khu n thành 4
nhóm sau :
- Nhóm 1 (Type I): có ch a L-ADP (L-Diaminopimelic) và glixin. G m
có các chi Streptomyces, Norcardioider…
- Nhóm 2 (Type II): có ch a m-ADP (meso- Diaminopimelic) và glixin.
G m các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella…
- Nhóm 3 (Type III): có ch a m-ADP (meso- Diaminopimelic). G m có
Actinomadura, Actinobigfida , Micronobispora…
- Nhóm 3 (Type III):có ch a m-ADP (meso- Diaminopimelic) ,
đ

ng arabinose, galactose. G m có Norcadia, Pseudonocardia ,

Mycrobacterium…
1.2.3.

c đi m sinh lí , sinh hóa c a x khu n
X khu n là m t nhóm c th d d

ng, chúng s d ng đ

ng, r

u,

axit h u c , lipid, protein và nhi u h p ch t h u c khác làm ngu n cacbon.
Còn nitrat, nitrit, mu i amon, ure, pepton, cao th t… đ làm ngu n nit .

các

loài khác nhau thì kh n ng h p th các h p ch t này là khác nhau. Ph n l n
x khu n là VSV hi u khí, a m, nhi t đ thích h p cho sinh tr
tri n là 25-300C.

Hoµng Mai Linh

a s x khu n phât tri n t t trong môi tr

- 10 -

ng và phát

ng ki m.

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

X khu n là nhóm vi khu n Gram (+), đ c bi t khác v i các sinh v t
khác c a nhóm nhân s có t l (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó vi khu n
khá th p (25-45%). M t trong nh ng đ c đi m đáng l u ý c a x khu n là

chúng không b n v ng v m t di truy n và th
phân t ADN.

ng x y ra s s p x p l i trong

i u này gây ra tính đa d ng c a hình thái, tính ch t, sinh lí,

sinh hóa c a x khu n (kh n ng đ ng hóa ngu n cacbon, nit , ho t tính
kháng sinh, tính kháng thu c, kh n ng phân gi i cellulose…).
1.2.4. Phơn b c a x khu n
X khu n là nhóm vi sinh v t phân b r ng rãi trong t nhiên. X
khu n có th phân l p t đ t, n

c, không khí, bùn, rác th i…

c bi t

trong đ t x khu n chi m s l ng r t l n. Theo Waksman thì trong đ t x
khu n chi m 9-45% t ng s các VSV. Và trong 1g đ t có ch a t i 29.00024.000.000 m m x khu n. Tuy nhiên tùy vùng đ t khác nhau trên th gi i
mà có s bi n đ i l n v s l

ng x khu n trong đ t, s l

ng x khu n

nam bán c u bao gi c ng cao h n b c bán c u. Ngoài ra s

l

ng x

khu n trong đ t còn ph thu c vào m c đ canh tác, đ phì nhiêu c a đ t,
m c đ che ph c a th c v t…

t giàu dinh d

nhi u x khu n h n so v i đ t nghèo dinh d

ng. Trong 1g đ t canh tác có

th phân l p đ

c 5.000.000 CFU/g x khu n.

nghèo dinh d

ng có s

l

ng, h u c , khoáng thì có
t vùng sa m c khô nóng,

ng x khu n ít h n, không dao đ ng trong

kho ng 10.000 – 100.000 CFU/g.
X khu n là nhóm VSV a trung tính hay ki m y u, do đó s phân b c a
x khu n trong đ t ph thu c vào đ pH c a đ t.

các đ t có đ pH trung tính

ho c h i ki m thì có m t đ x khu n cao h n so v i các vùng đ t có đ pH ki m
ho c axit.

ng th i s l ng x khu n còn ph thu c vào các th i đi m trong

n m. Do đó khi l y m u đ t nghiên c u c n ph i chú ý t i các đi u ki n nh thành
ph n l p đ t, sinh c nh, th i đi m l y m u, đ

Hoµng Mai Linh

- 11 -

m, nhi t đ …

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

1.2.5. Vai trò c a x khu n
X khu n là m t trong nhi u lo i VSV có ý ngh a trong t nhiên b i
vai trò tích c c tham gia vào quá trình chuy n hóa nh ng h p ch t trong đ t,
n

c…
X khu n có kh n ng sinh ch t kháng sinh, có 60-70% x khu n phân

l p t đ t nh Streptomyces, Actinomyces… có kh n ng này, các ch t kháng
sinh do chúng sinh ra đ

c s d ng r ng rãi trong y h c.

Ngoài ra x khu n còn có kh n ng phân gi i cellulose trong bã th i
nông nghi p, công nghi p th c ph m đ ch bi n th c n gia súc probiotin,
phân bón h u c , x lí rác th i…
1.3. Cellulose và cellulase
1.4.1. Cellulose
Cellulose là m t polysaccharite m ch th ng g m t 1400- 12.000 g c
-D-glucose liên kêt v i nhau b i các liên k t -1,4-glucoside. Trong phân t
cellullose các phân t

-D-glucose có c u trúc không gian d ng gh bành. Hai

phân t khác nhau quay góc v i nhau 1800. Cellulose là lo i h p ch t h u c
d i dào trong t nhiên chi m t i 40-50% hydratcacbon. Cellulose có c u trúc
không gian d ng s i song song, dài kho ng 5µm , đ

ng kính 3nm. . Các s i

này liên k t v i nhau b i các liên k t hidro và các liên k t vandervan t o
thành các bó s i nh có đ

ng kính 10-40nm g i là vi s i (microfibrin). Các

vi s i có c u trúc không đ ng nh t t o nên c u trúc mixen c a cellulose [8]
Cellulose d ng mixen g m 2 vùng :
- Vùng k t tinh (Crystolline regions) : Có các h s i ch t ch , đ m đ c

ng n c n s h p th n

c và ít ch u tác đ ng phân gi i. Vùng này

chi m 3/4 c u trúc cellulose.
- Vùng vô đ nh hình (Amorphous regions) : Có c u trúc kém ch t ch , d
b tr

ng lên và d b phân gi i.

Hoµng Mai Linh

- 12 -

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

Trong t nhiên cellulose khá b n v ng, không tan và b tr
th n

ng lên khi h p

c. Cellulose b phân h y khi đun nóng v i axit hay ki m

nhi t đ

khá cao ho c b phân gi i b i các cellulose sinh ra t nhi u lo i sinh v t.
1.4.2. Cellulase
Enzyme cellulase xúc tác cho qua trình chuy n hóa cellulose thành các s n
ph m hòa tan d s d ng. H thông cellulase g m 3 lo i chính sau:
- Endo- -glucanase hay 1,4- -D-glucanhydronase, cellobiohydrolase
(CBH), CMC-ase: Enzyme này t n công vào các đi m khác nhau trên
chu i

cellulose

c a

CMC,

cellulose

tr

ng

ph ng,

các

celloligosaccharide. Chúng phân c t các chu i cellulose m t cách ng u
nhiên, s n ph m t o thành là glucose và các oligosaccharide (có th t
3-6C ho c nhi u h n). S phân c t này hình thành các đ u kh t do,
t o đi u ki n cho exoglucanase ho t đ ng. B i v y cellulose vùng k t
tinh đ

c phân gi i tri t đ , hi u qu .

- Exo- -glucanase hay 1,4-

-D-glucan cellobiohydronase, avicelase:

enzyme này t n công vào đ u không kh c a cellulose và k t qu t o ra
các cellobinose.
-

-glucosidase hay cellobinose: Th y phân cellobinose và m t vài
celloligosaccharit thành glucose. Ho t tính c a

-glucosidase m nh

nh t trên cellobinose và gi m d n theo chi u dài chu i.
1.4.3. H enzyme phơn gi i cellulose
M t s nhóm VSV phân gi i đ

c cellulose là nh ph c h enzyme

cellulose g m 4 enzyme khác nhau tác d ng v i các m i liên k t c a
cellulose.
u tiên enzyme cellobihydrolase có tác d ng c t đ t liên k t hidro,
bi n cellulose t nhiên có c u hình không gian thành d ng cellulose vô đ nh
hình không có c u trúc l p.

Hoµng Mai Linh

- 13 -

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

Enzyme th hai là endoglucanase có kh n ng c t đ t kiên k t -1,4glucozit t o thành nh ng chu i dài.
Enzyme th

ba là exoglucanase ti n hành phân gi i các chu i trên

thành disaccharite g i là cellobinose.
Enzyme th t là -glucosidase ti n hành th y phân cellobinose thành
glucose.
1.4. Tình hình nghiên c u x khu n sinh cellulase

Vi t Nam và

trên th gi i
Hàng n m ho t đ ng trong ngành nông nghi p đã th i ra môi tr

ng

hàng ngàn t n ph ph m và đang là m t trong nh ng nguyên nhân gây ô
nhi m môi tr

ng. N u l ng ph ph m này đ

c x lý làm th c n gia súc

ho c phân bón vi sinh thì đó s là m t ngu n l i l n. Vì v y trên th gi i và
Vi t Nam đã có nh ng ngiên c u v kh n ng sinh cellulase c a các VSV
trong đ t đ phân gi i cellulose t các ph ph m nông nghi p.

c bi t x

khu n là m t loài VSV có kh n ng sinh cellulase khá m nh và có th cho
ngu n enzyme d i dào ph c v cho vi c x lý rác th i, ch bi n th c n gia
súc probiotin…
Vi t Nam, vi c nghiên c u v
cellulase c a nó v n còn khá m i.

x

khu n và kh

n ng sinh

ã có nhi u nghiên c u v cellullase

ng d ng trong th c n ch n nuôi nh ng đ i t

ng nghiên c u ch y u l i

là n m m c, n m men… nh : Nguy n Lân D ng (1991) đã lên men x p
s n b ng cách s

d ng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger s n

ph m dùng làm th c n cho trâu, bò. Chu Th Thanh Bình và c ng s
(2002) đã

ng d ng các ch ng n m men trong bã th i hoa qu giàu

cellulose làm th c n gia súc… Tuy nhiên Vi t Nam là đ t n

c s n xu t

nông nghi p là ch y u nên vi c nghiên c u v kh n ng sinh cellulase
c a x khu n có tri n v ng r t l n.

Hoµng Mai Linh

- 14 -

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2
NG 2

CH

PH

NG PHÁP VÀ V T LI U NGHIÊN C U

2.1. V t li u
2.1.1. Nguyên li u
Các m u đ t l y t các lo i đ t thu c ph

ng Xuân Hòa – Phúc Yên –

V nh Phúc.
2.1.2. Hóa ch t
Các hóa ch t : K2HPO4, MgSO4.7H2O, NH4Cl, KNO3, NaNO3,
(NH4)2SO4, NaCl, FeSO4…..
Tinh b t tan, Sacharose, th ch agar, CMC (Cacboxyl Methyl
Cellulose), b t gi y…
2.1.3.D ng c vƠ thi t b nghiên c u
- D ng c : H p petri, ng nghi m, bàn trang, que c y, đèn c n, bình
tam giác, giá đ ng ng nghi m.
- Thi t b : T

m vi sinh (Heraeus –

c ), t s y (Heraeus –

c ),

n i h p (Tomy – Nh t B n), cân Sartorius, t c y vô trùng, t l nh.
2.1.4. Môi tr

ng phơn l p x khu n

- Môi tr

ng 1 : Gause I , pH = 7,0
Hóa ch t

Kh i l

Tinh b t tan

20g

KH2PO4

0,5g

KNO3
MgSO4.7H2O
NaCl

1g
5g
0,5g

H2 O

1000ml

FeSO4

Vt

Th ch agar

20

Hoµng Mai Linh

ng

- 15 -

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H
- Môi tr

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

ng 2 : Czapeck- tinh b t , pH =7,2- 7,4
Hóa ch t

- Môi tr

Kh i l

Tinh b t tan

20g

KH2PO4

1g

NaNO3

3g

ng

MgSO4.7H2O

0,5g

KCl

0,1g

NaCl

0,1g

H2 O

1000ml

FeSO4

Vt

Th ch agar

20

ng 3 : Czapeck ( nguyên g c) , pH = 7,2
Hóa ch t

Kh i l

Sacharose

20g

K2HPO4

1g

NaCl

30g

MgSO4.7H2O

0,5g

H2 O

1000ml

FeSO4

Vt

Th ch agar

20g

Hoµng Mai Linh

ng

- 16 -

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

ng th ho t tính phơn gi i cellulose c a x khu n

2.1.5. Môi tr
- Môi tr

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

ng 1 : 1% CMC
Hóa ch t

Kh i l

ng

NaNO3

1,5g

KH2PO4

0,5g

MgSO4.7H2O

0,5g

KCl

0,5g

NaCl

10g

Th ch agar

20g

CMC

10g

H2O

1000ml

- Môi tr

ng 2 : 1% b t gi y
Hóa ch t

Kh i l

ng

NaNO3

1,5g

KH2PO4

0,5g

MgSO4.7H2O

0,5g

KCl

0,5g

NaCl

10g

Th ch agar

20g

B t gi y

10g

H2 O

1000ml

+ Chu n b n

c chi t đ t :

1kg đ t + 1l n

c s ch

H p kh trùng trong n i h p 30 phút
B sung thêm 1g CaCO 3
R il c l yn

c trong

Hoµng Mai Linh

- 17 -

K32D - Sinh


Khãa luËn tèt nghiÖp §H

2.2. Ph

Tr- êng §HSP Hµ Néi 2

ng pháp nghiên c u

2.2.1. Ph

ng pháp l y m u [3]

Trên m i lo i đ t dùng d ng c l y đ t
15cm, 20cm, 25cm, 30cm.

các đ sâu 0cm, 5cm, 10cm,

m i đ sâu thì l y kho ng 10g cho vào túi nilon,

trên túi có ghi đ sâu l y m u, n i l y m u, lo i đ t, sau đó bu c túi l i đ
tránh bay h i n

c và tránh các VSV l xâm nh p vào. M u đ t sau khi đ

thu th p c n ph i ti n hành phân l p ngay. N u ch a phân l p đ

b o qu n m u trong t l nh
2.2.2. Ph

c

c thì ph i

nhi t đ 4-50C.

ng pháp phơn l p x khu n t m u đ t [3]

L y 1g đ t cho vào ng nghi m ch a s n 10ml n

c c t vô trùng l c

đ u r i dùng pipet hút 1ml dung d ch đ t này cho sang ng nghi m có ch a
s n 9ml n

c c t vô trùng l c đ u thu đ

c d ch đ t v i đ pha loãng 10 -1

c ti p t c nh v y v i ng nghi m ti p theo ta có dung d ch đ t v i đ
pha loãng 10-2, 10-3,.... 10-10. Tùy theo m t đ phân b c a x khu n trong
m u đ t mà ta ch n d ch đ t có đ pha loãng thích h p.

đây tôi ch n d ch

đ t có đ pha loãng 10-5, 10-7. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml dung d ch đ t
có đ pha loãng 10-5, 10-7 nh lên b m t th ch trong h p petri, l y bàn

trang th y tinh trang đ u kh p b m t th ch. V i m i m u đ t
trên c y lên 3 môi tr
nuôi trong t

các đ sâu

ng: Gause I, Czapeck- tinh b t, Czapeck . Sau đó

m 3-5 ngày

nhi t đ 30oC, theo dõi các khu n l c x khu n

m c trên b m t th ch. C y truy n nh ng khu n l c x khu n m c riêng
bi t không b nhi m sang các ng th ch nghiêng có ch a môi tr
I. Các gi ng này đ

c đ a vào t

m và gi

ng Gause

nhi t đ 30 oC sau 3- 4 ngà y

mang ra ki m tra l i n u th y ng nghi m nào không m c ho c b nhi m thì
lo i b c y truy n l i đ cu i cùng ta đ

c các ng nghi m có các ch ng x

khu n thu n ch ng.

Hoµng Mai Linh

- 18 -

K32D - Sinh