PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH và CHẨN đoán TRƯỚC làm tổ BỆNH HEMOPHILIA a BẰNG kỹ THUẬT MICROSATELLITE DNA
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (12.15 MB, 183 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BÙI THỊ MINH PHƯỢNG
PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
BÙI THỊ MINH PHƯỢNG
PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH VÀ
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA
Chuyên ngành: Hóa sinh
Mã số: 62720112
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS.TS. Tạ Thành Văn
2. PGS.TS. Trần Vân Khánh
HÀ NỘI - 2019
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Tạ Thành
Văn, PGS.TS Trần Vân Khánh, là cán bộ hướng dẫn, đã tận tình chỉ bảo và
truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận
án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
Các cán bộ viên chức Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein trường Đại học
Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi thực hiện các kỹ thuật nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Bộ môn Hóa sinh
Trường Đại học Y Hà Nội.
Đảng ủy, Ban Giám hiệu, các Phòng chức năng, Bộ môn-khoa Hóa sinh,
Trường Đại học Y Dược Thái Bình đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các Nhà khoa học trong hội đồng đánh giá
luận án tiến sỹ cấp cơ sở, cấp trường đã đóng góp cho tôi nhiều ý kiến quý
báu để tôi hoàn thiện luận án được tốt hơn.
Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu
thương của cha mẹ tôi, cha mẹ chồng cùng sự ủng hộ, giúp đỡ, động viên của
chồng và hai con, người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn
động viên giúp đỡ tôi cả về tinh thần, vật chất để tôi có thể hoàn thành được
nhiệm vụ học tập, nghiên cứu của mình.
Trân trọng cám ơn!
Hà Nội, tháng 9 năm 2019
Tác giả
Bùi Thị Minh Phượng
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Bùi Thị Minh Phượng, nghiên cứu sinh khóa 34, Trường Đại học
Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của Thầy GS.TS. Tạ Thành Văn và Cô PGS.TS. Trần Vân Khánh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi
nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này./.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2019
NGƯỜI VIẾT CAM ĐOAN
Bùi Thị Minh Phượng
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BMD
Becker Muscular Dystrophy
BVSKTE
Bảo vệ sức khoẻ trẻ em
CK
Creatine Kinase
DMD
Duchenne Muscular Dystrophy
DNA
Deoxyribo Nucleic Acid
FISH
Fluorescent In Situ Hybridization
ICSI
Intracytoplasmic Sperm Injection
IVF
In Vitro Fertilization
KB
Kilo Base
MLPA
Multiplex Ligation Probe Amplification
NST X
Nhiễm sắc thể X
NST Y
Nhiễm sắc thể Y
PCR
Polymerase Chain Reaction
PGD
Preimplantation Genetic Diagnosis
RNA
Ribo Nucleic Acid
RT – RCR
Reverse Transcription PCR
STR
Short Tandem Repeat
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................4
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A.....................................4
1.1.1. Định nghĩa.........................................................................................4
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu............................................................................4
1.1.3. Dịch tễ bệnh học................................................................................4
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A.......................5
1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A....8
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A.................................................8
1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A..............................................9
1.3. NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA A......................14
1.3.1. Đặc điểm chung người mang gen bệnh...........................................14
1.3.2. Cơ chế di truyền của người mang gen bệnh hemophilia A.............14
1.3.3. Triệu chứng của người mang gen....................................................16
1.3.4. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh.................17
1.4. PHƯƠNG PHÁP THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM VÀ QUY
TRÌNH CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ...........................................23
1.4.1. Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm.........................................23
1.4.2. Quy trình chẩn đoán gen trước làm tổ.............................................25
1.4.3. Các phương pháp và kỹ thuật sinh học phân tử mới nhất áp dụng
trong việc chẩn đoán trước làm tổ.......................................................30
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾ GIỚI
VỀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ..................................................38
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam........................38
1.5.2. Tình hình nghiên cứu chẩn đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A. 42
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........46
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU...............................................................46
2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU......47
2.2.1. Dụng cụ và trang thiết bị.................................................................47
2.2.2. Hoá chất...........................................................................................48
2.2.3. Trình tự mồi cho phản ứng..............................................................51
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................................51
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu.........................................................................51
2.3.2. Địa điểm nghiên cứu........................................................................53
2.3.3. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.......................54
2.3.4. Quy trình xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng
kỹ thuật microsatellite DNA...............................................................57
2.3.5. Quy trình chẩn đoán trước làm tổ....................................................60
2.4. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU TRONG Y HỌC.......................................63
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................64
3.1. KẾT QUẢ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN F8 BỊ ĐỘT
BIẾN BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE DNA........................64
3.1.1. Kết quả xác định marker dị hợp tử gen F8 trên bệnh nhân và người
lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật microsatellite DNA.....................64
3.1.2. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ
thuật microsatellite DNA....................................................................68
3.2. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA
BẰNG KỸ THUẬT MICROSATTELITE DNA..................................90
3.2.1. Kết quả kích thích buồng trứng và thực hiện ICSI..........................90
3.2.2. Kết quả chẩn đoán tiền làm tổ của các gia đình hemophilia A........92
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN..........................................................................108
KẾT LUẬN..................................................................................................138
KHUYẾN NGHỊ..........................................................................................139
CÁC DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1.
Thành phần hóa chất sử dụng cho điện di mao quản..................62
Bảng 3.1.
So sánh kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng 2
phương pháp...............................................................................87
Bảng 3.2.
Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
microsatellite-DNA.....................................................................88
Bảng 3.3.
Kết quả đánh giá về tỷ lệ phôi phát triển sau khi thụ tinh..........90
Bảng 3.4.
Kết quả đánh giá sự phát triển của các phôi thu được ngày 3....91
Bảng 3.5.
Kết quả sinh thiết phôi chẩn đoán gen và đánh giá sự phát triển
phôi sau sinh thiết 3 ngày............................................................92
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1.
Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A.............5
Hình 1.2.
Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A.............6
Hình 1.3.
Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau............................8
Hình 1.4.
Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương. .10
Hình 1.5.
Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X............................10
Hình 1.6.
Cấu trúc gen và protein FVIII.....................................................11
Hình 1.7.
Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng...............................12
Hình 1.8.
Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường. .15
Hình 1.9.
Sơ đồ di truyền của người mẹ bình thường kết hôn với bố bị bệnh. .15
Hình 1.10.
Sơ đồ phả hệ của người mẹ mang gen kết hôn với bố bình thường 18
Hình 1.11.
Sơ đồ di truyền của người mẹ mang gen kết hôn với bố bị bệnh....19
Hình 1.12. Quy trình thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm..........................25
Hình 1.13.
Sinh thiết phôi bào giai đoạn blastomere cho chẩn đoán PGD......28
Hình 1.14. Ứng dụng của kỹ thuật FISH trong chẩn đoán xác định giới tính
và số lượng nhiễm sắc thể...........................................................32
Hình 1.15. Kết quả multiplex PCR sử dụng cặp mồi amel, SYR, FXS1108, DXS
9798, trên phôi bào sinh thiết chẩn đoán bệnh hemophilia A...........37
Hình 1.16. Sơ đồ phả hệ của một gia đình mang gen đột biến đảo đoạn
intron 22 gây bệnh hemophilia A................................................43
Hình 1.17. Hình ảnh các marker dị hợp tử xác định đột biến gen F8 gây
bệnh hemophilia A......................................................................44
Hình 1.18. Kết quả multiplex PCR sử dụng cặp mồi amel, SYR, FXS1108,
DXS 9798, trên phôi bào sinh thiết............................................45
Hình 2.1.
Kết quả STR lựa chọn marker dị hợp tử.....................................58
Hình 2.2.
Kỹ thuật Microsatellite DNA trong chẩn đoán đột biến gen gây
bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể giới tính X.................59
Hình 2.3.
Kết quả STR xác định giới tính..................................................62
Hình 3.1.
Kết quả đồng hợp tử và đồng hợp tử của STR...........................64
Hình 3.2.
Kết quả khuếch đại các marker DXS9901, FXS1108, F8int22 và
DXS9897....................................................................................65
Hình 3.3.
Tần suất alen của marker FXS 1108...........................................66
Hình 3.4.
Tần suất alen của marker DXS9897...........................................66
Hình 3.5.
Tần suất alen của marker F8int22...............................................67
Hình 3.6.
Tần suất alen của marker DXS9901...........................................67
Hình 3.7.
Sơ đồ phả hệ gia đình HA 61......................................................68
Hình 3.8.
Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA61.................69
Hình 3.9.
Hình ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS1108,
DXS9897 và F8int22 của gia đình HA61.....................................70
Hình 3.10. Sơ đồ phả hệ gia đình HA37 sau khi phân tích bằng hai phương pháp...72
Hình 3.11. Ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA37.........................73
Hình 3.12. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và
DXS9897 của gia đình mã số HA37...........................................74
Hình 3.13. Sơ đồ phả hệ gia đình HA50 sau khi phân tích bằng hai
phương pháp...............................................................................75
Hình 3.14. Hình ảnh giải trình tự gen gia đình HA50..................................76
Hình 3.15. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901,
DXS9897 và FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã
số HA50......................................................................................77
Hình 3.16. Sơ đồ phả hệ gia đình HA16.......................................................79
Hình 3.17. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình mã số HA16.................80
Hình 3.18. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và
DXS9897 của gia đình HA16.....................................................81
Hình 3.19. Sơ đồ phả hệ gia đình HA30 sau khi phân tích..........................83
Hình 3.20. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số HA3084
Hình 3.21. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901 và
FXS1108, của gia đình bệnh nhân hemophilia A mã số HA30....85
Hình 3.22. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi, F8in22,
DXS9897 và DXS9901 của gia đình mã số HA09.....................89
Hình 3.23. Kết quả khuếch đại các marker FXS1108, F8int22, và DXS9897. .94
Hình 3.24. Kết quả multiplex PCR khuếch đại 3 marker dị hợp tử FXS1108,
DXS9897 và F8int22 và 2 marker giới tính Amel và SRY trên
mẫu bệnh nhân HA61.................................................................95
Hình 3.25. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108, F8int22,
DXS 9897 xác định phôi nam bình thường của gia đình HA61.........96
Hình 3.26. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108,
F8int22, DXS 9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA61.97
Hình 3.27. Sơ đồ phả hệ phôi gia đình HA61...............................................98
Hình 3.28. Kết quả khuếch đại các marker FXS1108 và DXS9897...........99
Hình 3.29. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS1108 và
DXS9897 của người mẹ so sánh với bệnh nhân HA28............100
Hình 3.30. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108,
DXS 9897 xác định phôi nam bình thường gia đình HA28.....102
Hình 3.31. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108,
DXS 9897 xác định phôi nam bệnh lý gia đình HA28.............103
Hình 3.32. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108,
DXS 9897 xác định phôi nữ mang gen gia đình HA28............104
Hình 3.33. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi FXS 1108,
DXS 9897 xác định phôi nữ không mang gen gia đình HA28. 105
Hình 3.34. Sơ đồ phả hệ gia đình HA28.....................................................106
Hình 3.35. Tỷ lệ phôi bất thường và không bất thường về gen..................107
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội, tỷ lệ vô sinh ngày càng gia
tăng và là nỗi lo cho nhiều cặp vợ chồng. Ra đời vào những năm 1970 của thế
kỷ trước, có thể nói phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm “in vitro
fertilization - IVF” đã trở thành cứu cánh cho nhiều cặp vợ chồng vô sinh
mong muốn có đứa con [1]. Vào năm 2010 bác sỹ Robert G.Edwards đã vinh
dự trao giải thưởng Nobel về sinh lý và Y khoa cho những cống hiến to lớn và
hiệu quả mà phương pháp này mang lại [2]. Phương pháp này đã mang lại
niềm vui, niềm hạnh phúc cho bao cặp vợ chồng khắp nơi trên thế giới, tuy
nhiên không phải cặp vợ chồng nào cũng may mắn sinh được những đứa con
mong muốn bằng phương pháp này. Tỷ lệ thành công của phương pháp này chỉ
đạt hơn 35% tùy theo từng quốc gia [3]. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự
thành công của phương pháp này như: tuổi bố mẹ, tình trạng sức khỏe, tinh
thần tâm lý, chất lượng tinh trùng và trứng… và đặc biệt chất lượng phôi sau
khi thụ tinh. Các phôi có thể bất thường nhiễm sắc thể (NST) thường hay NST
giới tính đều làm giảm khả năng mang thai sau khi cấy phôi vào buồng tử cung,
có thể gây sảy thai hoặc sinh ra những đứa con không khỏe mạnh [4], [5], [6],
[7]. Để làm giảm tỷ lệ sinh ra những đứa con không khỏe mạnh và làm tăng tỷ
lệ thành công của phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm, thời gian gần đây
các nhà khoa học đã áp dụng quy trình sàng lọc phôi “Pre-Implantion Genetic
Diagnosis, PGD” còn gọi là “chẩn đoán di truyền trước làm tổ” nhằm có được
những phôi tốt nhất cho quá trình chuyển phôi [8],[9],[10].
2
Cùng với sự phát triển của kỹ thuật chọc hút phôi và ứng dụng những
tiến bộ mới nhất của sinh học phân tử vào chẩn đoán, cho đến nay có rất
nhiều bệnh lý di truyền và hầu hết các bất thường trên NST, cả các đột biến
gen quan trọng gây ung thư đều có thể được sàng lọc bằng kỹ thuật PGD [11],
[12],[13],[14-15]. Trong số đó, bệnh hemophilia A (bệnh ưa chảy máu) là loại
bệnh có tỷ lệ mắc cao, bệnh cảnh lâm sàng nặng nề và thường gây ra những
sang chấn lớn về tâm lý cho gia đình và cho người bệnh. Vì vậy vấn đề đặt ra
là chúng ta phải làm sao giúp cho các cặp vợ chồng mang gen bệnh
hemophilia A sinh được những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh.
Hemophilia A là bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng
của các yếu tố đông máu VIII [16],[17]. Hemophilia A là bệnh di truyền alen
lặn trên NST X không có alen trên NST Y, nên người mẹ mang gen bệnh sẽ di
truyền cho con trai và biểu hiện bệnh trên lâm sàng [18]. Theo thống kê của tổ
chức hemophilia A thế giới, hiện nay có khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh
hemophilia A và chỉ có khoảng 50.000 được điều trị đặc hiệu [19]. Tại Việt
Nam, ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh hemophilia A và khoảng 30.000
người mang gen bệnh hemophilia A [20]. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là chảy
máu ở bất kỳ nơi nào trên cơ thể, và chảy máu kéo dài: chảy máu khớp, chảy
máu trong cơ, chảy máu não, chảy máu trong cổ và ngực… Mức độ biểu hiện
trên lâm sàng liên quan trực tiếp nồng độ yếu tố VIII trong huyết tương.
3
Việc tầm soát trước sinh bệnh hemophilia A là việc làm hết sức quan
trọng giúp cho việc sinh ra những đứa trẻ hoàn toàn khỏe mạnh. Việc xác định
đột biến gen gây bệnh, sàng lọc người lành mang gen bệnh và chẩn đoán
trước sinh bệnh hemophilia A đã được nghiên cứu khá nhiều ở Việt Nam.Việc
quản lý bệnh nhân và người mang gen của bệnh lý này là tiền đề vững chắc để
triển khai thành công quy trình chẩn đoán trước làm tổ trong sàng lọc phôi.
Phương pháp này sẽ giúp giảm biến chứng và di chứng cho người mẹ khi
mang thai bệnh lý, giảm chấm dứt thai kỳ do phát hiện bệnh ở thai nhi khi
chẩn đoán tiền sản, mang lại niềm vui hạnh phúc cho các cặp vợ chồng mang
gen bệnh, đồng thời giảm tỷ lệ mắc bệnh ở cộng đồng. Cùng với sự phát triển
của sinh học phân tử phát hiện các đột biến gây bệnh hemophilia A, kỹ thuật
microsatellite DNA là kỹ thuật sử dụng các primer gắn huỳnh quang để
khuếch đại vùng trình tự lặp lại ngắn (short tandem repeat-STR) và phân tích
kích thước của chúng thông qua điện di mao quản trên máy giải trình tự gen
để xác định các alen đột biến. Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là dễ dàng phát
hiện alen đột biến mà không cần xác định các đột biến trực tiếp, vì vậy sẽ
giảm được chi phí cho gia đình bệnh nhân. Hiện nay kỹ thuật này còn khá
mới mẻ ở Việt Nam ứng dụng trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền. Xuất
phát từ thực tế đó đề tài: “Phát hiện người lành mang gen bệnh và chẩn
đoán trước làm tổ bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA”
được đưa vào nghiên cứu với mục tiêu:
1. Xác định người lành mang gen bệnh hemophilia A bằng kỹ thuật
microsatellite DNA.
2. Chẩn đoán trước làm tổ cho những người mẹ mang gen bệnh
hemophilia A bằng kỹ thuật microsatellite DNA.
4
5
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG BỆNH HEMOPHILIA A
1.1.1. Định nghĩa
Bệnh hemophilia A là một bệnh di truyền do thiếu hụt hoặc bất thường
chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết tương - thiếu hụt yếu tố VIII
gây bệnh hemophilia A, thiếu hụt yếu tố IX gây bệnh hemophilia B, thiếu hụt
yếu tố XI gây bệnh hemophilia C. Bệnh hemophilia A là bệnh rối loạn đông
máu di truyền hay gặp nhất [21-22].
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu
Sự di truyền của bệnh máu khó đông liên kết với giới tính được phát
hiện từ những năm 80 của thế kỷ 19. Vào thời điểm này, các nhà khoa học
nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho
con trai nhưng truyền gen bệnh cho con gái và người con gái này có thể
truyền gen bệnh cho con trai mình. Bệnh hemophilia A còn được biết đến như
căn bệnh của Hoàng Gia vì nữ hoàng Anh Victoria 1838-1901 mang gen bệnh
này và truyền nó cho nhiều thế hệ sau.
1.1.3. Dịch tễ bệnh học
Theo thống kê của tổ chức hemophilia thế giới (WFH), hiện nay có
khoảng 500.000 bệnh nhân mắc bệnh hemophilia và chỉ có khoảng 1/3 được
chẩn đoán [23]. Tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A gần giống nhau ở các vùng địa
lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30-100/1.000.000
dân.Tần suất mắc bệnh hemophilia A là 1/4000 1/5.000 trẻ trai [24]. Tại
Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000 bệnh
nhân hemophilia. Số liệu điều tra những năm 1994 1996 về tình hình bệnh
hemophilia ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh hemophilia là
6
25 60/1.000.000 dân. Tại mít tinh hưởng ứng ngày hemophilia thế giới (174-2016), hội rối loạn đông máu Việt Nam và Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương đã công bố có 6000 người bị bệnh chảy máu di truyền [25].
1.1.4. Đặc điểm lâm sàng và chẩn đoán bệnh hemophilia A
1.1.4.1. Đặc điểm chảy máu trong bệnh hemophilia A
Bệnh đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng nguy cơ chảy
máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có thể tự nhiên
hoặc sau chấn thương nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu dưới da,
tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp.
Chảy máu khớp thường gặp nhất ở bệnh nhân hemophilia A. Đây là loại
chảy máu nguy hiểm vì khi tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp
[26]. Chảy máu khớp có thể xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương. Nếu điều
trị muộn sau 4 giờ thì cảm giác đau có thể tăng lên, khớp sẽ sưng và việc điều trị
bị kéo dài tới vài ngày. Trẻ lớn có thể nhận biết được chảy máu khớp trước khi
đau và sưng xảy ra với cảm giác gai châm hoặc kiến bò trong khớp. Điều trị sớm
sẽ dự phòng được tình trạng đau mạn tính và biến dạng khớp.
Hình 1.1. Hình ảnh chảy máu khớp gối ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
Chảy máu trong cơ bao gồm 10-25% các trường hợp xuất huyết nặng
trong hemoglobin. Huyết khối cơ được coi là nguyên nhân chính gây ra tình
trạng khuyết tật trong chứng chảy máu. Chảy máu trong cơ cũng thường gặp
7
và xuất hiện tự nhiên hoặc sau chấn thương. Những cơ hay bị chảy máu là:
cơ cẳng chân, cơ đùi, cơ cánh tay. Chảy máu cơ gây ra sưng đau trong vài
ngày. Một dấu hiệu quan trọng và kín đáo trong chảy máu cơ là cảm giác
đau, nóng, ngứa ran hoặc tê bì. Nếu không được điều trị sớm cơ sẽ bị phá
huỷ và có thể gây liệt [23].
Hình 1.2. Hình ảnh chảy máu trong cơ ở bệnh nhân hemophilia A
(Nguồn: )
Ngoài ra bệnh nhân có thể bị chảy máu não, chảy máu ở các vị trí khác
nhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da. Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da có
thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị. Chảy máu miệng,
lợi và mũi cũng hay gặp. Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu.
1.1.4.2. Các xét nghiệm cận lâm sàng để chẩn đoán bệnh
Những thay đổi về huyết học ở bệnh nhân hemophilia A:
- Thời gian máu chảy kéo dài, thời gian đông máu kéo dài có thể hơn 1
giờ; chất lượng cục máu đông kém; thời gian Howell kéo dài…
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm hoặc không có.
+ Yếu tố Von - Willebrand trong máu bình thường.
+ Số lượng tiểu cầu trong máu bình thường.
8
1.1.4.3. Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán xác định [21]
- Dựa vào lâm sàng: Có vết bầm tím, tụ máu, chảy máu.
- Dựa vào tiền sử gia đình
- Dựa vào xét nghiệm máu:
+ Số lượng tiểu cầu bình thường, PT (Prothrombin Time: thời gian
prothrombin) bình thường, fibrinogen bình thường, APTT (Activated Partial
Thromboplastin Time: thời gian thromboplastin một phần hoạt hóa) kéo dài
> 1,5 giá trị bình thường.
+ Hoạt tính yếu tố VIII huyết tương giảm dưới 40%.
+ Yếu tố Von Willebrand bình thường
+ Các xét nghiệm khác: Mixtest xác định kháng thể kháng yếu tố VIII.
Chẩn đoán mức độ bệnh
Nồng độ yếu tố VIII
Mức độ
(%) (hoạt tính
Biểu hiện chảy máu
(UI/ml))
Nặng
(Chiếm 70%)
Trung bình
(Chiếm 15%)
Nhẹ
(Chiếm 15%)
Chảy máu tự nhiên không liên
<1% (<0,01)
quan đến chấn thương, thường
chảy máu ở khớp và cơ.
Chảy máu tự nhiên hoặc liên
1-5% (0,01-0,05)
> 5-40% (0,04-0,4)
quan đến chấn thương nhỏ.
Chảy máu nặng sau chấn
thương, phẫu thuật.
Chảy máu sau chấn thương
lớn hoặc phẫu thuật.
1.2. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ HEMOPHILIA A
1.2.1. Cơ chế di truyền bệnh hemophilia A
9
Đây là một bệnh di truyền liên kết với giới tính: Ở nam chỉ có một NST
giới tính X nên nếu NST giới tính X mang gen bệnh thì lượng yếu tố VIII tạo
ra không đủ và người đó bị bệnh hemophilia A [27]. Đối với nữ giới nhờ có
hai NST giới tính X nên nếu một NST giới tính X mang gen bệnh thì gen bình
thường trên NST còn lại vẫn tổng hợp yếu tố VIII bình thường. Người phụ nữ
không bị bệnh nhưng mang một gen bị bệnh sẽ truyền cho con trai và người
con trai sẽ bị bệnh, nếu truyền cho con gái thì người con gái sẽ trở thành
người mang gen bệnh.
Hình 1.3. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ sau
1/ Bố bị bệnh, mẹ bình thường: 100% con gái là người mang gen bệnh
(XHXh) và 100% con trai bình thường (XHY).
2/ Mẹ mang gen bệnh, bố bình thường: trong một gia đình có bố bình
thường (XHY), mẹ mang gen bệnh (XHXh) (người truyền bệnh) thì 50% số con
gái sẽ là người mang gen bệnh (XHXh), 50% con gái bình thường (XX), 50%
con trai bị bệnh (XhY) và 50% con trai bình thường (XHY).
3/ Bố bị bệnh, mẹ mang gen bệnh: 50% con gái bị bệnh (X hXh) đồng
hợp tử, 50% con gái mang gen bệnh (XHXh), 50% con trai bị bệnh và 50% con
trai bình thường (XHY). Như vậy nữ mắc bệnh khi mang đồng hợp tử gen
10
bệnh (cả 2 thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XhXh), nữ mang gen bệnh khi mang
dị hợp tử gen bệnh (một thể nhiễm sắc X bị thương tổn: XHXh).
4/ Do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử từ người bố hoặc
từ người mẹ: thường chiếm khoảng 1/3 các trường hợp hemophilia A. Tỉ lệ đột
biến gây bệnh hemophilia xẩy ra là 3 x 106 trên gen và trên một giao tử trong
một thế hệ [31]. Tỷ lệ đột biến mới xảy ra ở tế bào mầm sinh dục của nam cao
hơn 5 lần so với ở tế bào mầm sinh dục của nữ. Gần đây, người ta đã chứng
minh rằng tần suất đột biến theo giới tùy thuộc vào loại đột biến. Đột biến đảo
đoạn intron 22 ở tế bào mầm sinh dục nam nhiều hơn 15 lần so với ở tế bào
mầm sinh dục nữ. Hiện tượng này giải thích cho sự vắng mặt nhiễm sắc thể
thứ hai tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình đảo đoạn trong giai đoạn phân
bào giảm nhiễm ở nam.
1.2.2. Cơ sở phân tử học bệnh hemophilia A
Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho thấy những hiểu
biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein FVIII, mở đường cho
các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh hemophilia A và các dạng đột biến gen
F8 gây bệnh.
Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồng
yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) với sự có mặt của Ca 2+ và phospholipid
tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thành
thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ
fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu tố
thành mạch. Việc thiếu hụt hoặc bất thường chức năng yếu tố VIII làm ngừng
trệ dòng thác đông máu theo con đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu
kéo dài, không cầm ở bệnh nhân hemophilia A.
11
Hình 1.4. Vai trò của yếu tố VIII trong quá trình đông máu huyết tương
1.2.2.1. Vị trí và cấu trúc của gen mã hóa yếu tố VIII
Gen quy định tổng hợp yếu tố VIII nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính
X, là một trong những gen lớn nhất của người, có kích thước 186 Kb gồm 26
exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62bp đến 262bp và 2 exon lớn nhất là
exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp), mã hóa 9 Kb mRNA. Người đột biến
gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá trình
đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A [28].
Hình 1.5. Vị trí của gen mã hóa yếu tố VIII trên NST X
(Nguồn: www.hemophilia.com)
12
Gen mã hóa yếu tố VIII có chuỗi nặng với đầu cuối là N, gồm các
domain A1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là C, gồm các domain A 3-C1-C2 và
vùng B. Khi thủy phân hoàn toàn domain B tạo thành asparagin, serin và
threonin. Vùng B không cần cho chức năng của yếu tố VIII và sau quá trình
dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của yếu tố VIII.
1.2.2.2. Protein yếu tố VIII
Hình 1.6. Cấu trúc gen và protein FVIII [29]
Bản chất yếu tố VIII là polypeptid có cấu trúc A1-A2-B-A3-Cl-C2,
gồm hai chuỗi: chuỗi nặng là đoạn A1-A2-B có kích thước 200 kD, chuỗi nhẹ
là đoạn A3-C1-C2 có kích thước 80 kD. Cấu trúc của phức hợp này được giữ
ổn định nhờ sự tương tác giữa các liên kết ưa nước và kỵ nước với yếu tố von
Willebrand (vWF - là một kháng nguyên liên quan đến yếu tố VIII) và Ca 2+.
Chuỗi nặng có đầu cuối là N, gồm các vùng A 1-A2-B, chuỗi nhẹ có đầu cuối là
13
C, gồm các vùng A3-C1-C2. Vùng B được mã hóa bởi một exon lớn và không
có sự tương đồng với bất kỳ gen nào đã biết. Khi thủy phân hoàn toàn domain
B tạo thành asparagin, serin và threonin. Vùng B không cần cho chức năng
của yếu tố VIII và sau quá trình dịch mã, domain B bị cắt khỏi chuỗi nặng của
yếu tố VIII.
Hình 1.7. Protein yếu tố VIII với các vùng chức năng
(Nguồn w.w.w. nature.com/revieus/genetics)
Vùng A (A1, A2, A3) là nơi bám của các ion Ca2+, Cu2+ và các yếu tố IX, X
trong quá trình đông máu. Vùng C (C1, C2) là vị trí bám cho yếu tố vWF, X
và của các phân tử phospholipid một khi FVIII được hoạt hóa. Vùng B chứa
vị trí cắt của thrombin đã được loại bỏ trong phân tử FVIII trong quá trình
hoạt hóa FVIII
1.2.2.3. Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A
Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A. Nghiên cứu
của Oldenburg và cộng sự đã chỉ ra rằng các dạng đột biến điểm (thay thế
nucleotid gây đột biến sai nghĩa hoặc vô nghĩa) chiếm tỷ lệ cao nhất (47,5%)
tiếp đến là dạng đột biến đảo đoạn gồm đảo đoạn intron 1 và intron 22
(36,7%), còn lại là đột biến xóa đoạn gen chiếm khoảng 10 – 15%. Tùy
thuộc vào kiểu và vị trí đột biến trên gen F8 mà gây ra các thể bệnh nặng
nhẹ khác nhau nhau [16].
14
Đột biến điểm
Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen. Nghiên
cứu của Shima và cộng sự chỉ ra rằng đột biến thay thế Arginin thành
Histidin tại vị trí 372 gây biến đổi vị trí cắt của thrombin và làm quá trình
hoạt hóa yếu tố VIII bị rối loạn, hoạt tính yếu tố VIII giảm mạnh còn 3 5%
[30]. Năm 2000, Jacquemin và cộng sự đã chứng minh đột biến thay thế
Serin thành Tyrosin tại vị trí 2119 (vùng C 2) làm giảm đột ngột khả năng
tương tác giữa yếu tố VIII và yếu tố vWF, dạng đột biến này thường gặp ở
thể nhẹ và trung bình [31].
Theo thống kê, khoảng gần 60% các đột biến điểm ảnh hưởng tới acid
amin arginin, phần lớn các bệnh nhân mang đột biến này đều ở thể nặng [16-19].
Đột biến đảo đoạn
Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trình
hoạt hóa yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chính gây
ra các dạng đột biến đảo đoạn ở bệnh nhân hemophilia A thể nặng [32].
Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm hơn
50% các thể bệnh nặng. Cách gen F8 một đoạn 500kb về phía đầu mút
telomere, nhiễm sắc thể X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tự
tương đồng đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1).
Quá trình tái tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1 và một trong hai vùng
int22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2 đoạn (exon 1-22 và exon 23-26)
cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tố VIII [32].
Đột biến mất đoạn và thêm đoạn của gen yếu tố VIII
Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng.
Có thể mất 1 exon hoặc mất toàn bộ gen. Cơ chế phân tử của dạng đột biến
này đã được kết luận là do quá trình tái tổ hợp dẫn đến hiện tượng lặp lại Alu
[17]. Đột biến chèn đoạn lớn và hiện tượng Alu làm đứt gãy gen F8 và gây
