XÁC ĐỊNH NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH HEMOPHILIA a BẰNG kỹ THUẬT MICROSATELLITE DNA

B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

TH HIN

XáC ĐịNH NGƯờI LàNH MANG GEN BệNH
HEMOPHILIA A
BằNG Kỹ THUậT MICROSATELLITE-DNA

LUN VN THC S Y HC


H NI 2016
B GIO DC V O TO

B Y T

TRNG I HC Y H NI

TH HIN

XáC ĐịNH NGƯờI LàNH MANG GEN BệNH
HEMOPHILIA A
BằNG Kỹ THUậT MICROSATELLITE-DNA
Chuyờn ngnh: Húa sinh
Mó s: 60720106
LUN VN THC S Y HC
Ngi hng dn khoa hc:

PGS.TS. Trần Vân Khánh

HÀ NỘI – 2016
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, thực hiện luận văn này, tôi đã nhận được rất
nhiều sự quan tâm, động viên quý báu từ các Thầy Cô giáo, đồng nghiệp, gia
đình và bạn bè.
Bằng tất cả sự kính trọng và tình cảm chân thành nhất, tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Vân Khánh, Phó Giám đốc Trung tâm
Nghiên cứu Gen-Protein, Trưởng Bộ môn Bệnh học phân tử, Khoa Kỹ thuật Y
học, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã hết lòng quan tâm giúp đỡ,
tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn tôi từ những ngày đầu làm luận văn. Cô
luôn khích lệ, động viên tôi những lúc tôi gặp khó khăn trong học tập cũng
như trong cuộc sống.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Tạ Thành Văn, Phó Hiệu
trưởng, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trưởng Bộ môn Hóa
sinh, Trường Đại học Y Hà Nội, người Thầy đã truyền đạt những kiến thức và
kinh nghiệm quý báu cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi để giúp tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô Bộ môn Hóa sinh,
Trường Đại học Y Hà Nội đã dạy dỗ và truyền đạt những kiến thức quý báu
trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến CN Trần Quốc Đạt, CN Nguyễn Quý
Hoài cùng toàn thể các anh, chị, em của trung tâm Trung tâm Gen-Protein,


Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập kỹ thuật, hoàn
thiện quy trình kỹ thuật nghiên cứu.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:
Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Y Hà Nội.
Ban Giám đốc, lãnh đạo Khoa Hóa sinh, cùng các cán bộ khoa của Bệnh
viện Đa khoa tỉnh Thái Bình đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Xin được gửi lời cảm ơn tới bệnh nhân Hemophilia A và các thành viên gia
đình bệnh nhân đã giúp được tôi có được số liệu trong luận án này.
Cuối cùng, tôi xin ghi nhớ công ơn sinh thành, nuôi dưỡng và tình yêu
thương của Cha mẹ tôi, cùng sự ủng hộ của gia đình, bạn bè, đồng nghiệp,
những người đã luôn ở bên cạnh động viên, ủng hộ, giúp đỡ và tạo điều kiện
cho tôi và giúp đỡ tôi hoàn thiện luận văn này.
Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2016
Học viên
Đỗ Thị Hiến


LỜI CAM ĐOAN
Kính gửi: Phòng quản lý đào tạo Sau Đại học-Trường Đại học Y Hà Nội.
Bộ môn Hóa Sinh- Trường Đại học Y Hà Nội.
Hội đồng bảo vệ Luận văn Thạc sỹ Y học năm 2016.

Tôi là Đỗ Thị Hiến, học viên cao học khóa 23 Trường Đại học Y Hà Nội,
chuyên ngành Hóa Sinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn
của PGS.TS. Trần Vân Khánh.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung
thực và khách quan.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này.

Hà Nội, ngày 1 tháng 11 năm 2016
Người viết cam đoan

Đỗ Thị Hiến


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HA
F8
DNA
cDNA
RNA
mRNA
NST
Kb
bp
dNTP
ddNTP
PCR
RT-PCR
EDTA
SDS
SNP
TE
STR
TBE

Hemophilia A
Gen tổng hợp protein yếu tố VIII

Deoxyribonucleic Acid
Complementary Deoxyribonucleic Acid
Ribonucleic Acid
Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin)
Nhiễm sắc thể
Kilo base
Base pair
Deoxyribonucleoside triphosphate
Dideoxyribonucleoside triphosphate
Polymerase Chain Reaction
Reverse Transcription PCR (PCR sao mã ngược)
Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Sodium dodecyl sulfate
Single Nucleotide Polymorphism
Tris – EDTA
Simple Tandem Repeat
Tris Borate EDTA

Phe (F): Phenylalanine
Arg (R): Arginine
Asn (N): Asparagine
Asp (D):Aspartic
Cys (C): Cysteine

Gly (G): Glycine
His (H): Histidine
Glu (E): Glutamic
Leu (L): Leucine
Lys (K): Lysine

Pro (P): Proline
Ser (S): Serine
Thr (T): Threonine
Trp (W): Tryptophan
Tyr (Y): Tyrorine


Gln (Q): Glutamine
Stop codon(X): mã kết thúc

Met (M): Methionine
Ala (A): Alanine

Val (V): Valine
Ile (I): Isoleucine

MỤC LỤC
MỤC LỤC............................................................................................................7
DANH MỤC BẢNG............................................................................................9
DANH MỤC HÌNH...........................................................................................11
ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................................1
Chương 1 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................................3
1.1. Đặc điểm bệnh Hemophilia A.....................................................................3
1.1.1. Những đặc điểm chung.........................................................................3
1.1.2. Chẩn đoán bệnh Hemophilia A.............................................................5
1.1.3. Điều trị bệnh Hemophilia A.................................................................9
1.1.4. Cơ chế phân tử bệnh Hemophilia A...................................................13
1.2. Người lành mang gen bệnh Hemophilia A...............................................21
1.2.1. Đặc điểm chung..................................................................................21

1.2.2. Đặc điểm chảy máu của người lành mang gen bệnh Hemophilia A. .22
1.2.3. Quản lý và điều trị dự phòng cho người lành mang gen bệnh
Hemophilia A......................................................................................24
1.2.4. Vai trò của việc phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A 24
1.3. Các phương pháp phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A...24
1.3.1. Dựa vào hoạt tính yếu tố VIII.............................................................24
1.3.2. Dựa vào phân tích phả hệ...................................................................25
1.3.3. Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử.....................................................25


1.4. Tình hình nghiên cứu về người lành mang gen bệnh Hemophilia A ở Việt
Nam.........................................................................................................32
Chương 2 35
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................35
2.1. Đối tượng nghiên cứu...............................................................................35
2.2. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu.................35
2.2.1. Trang thiết bị nghiên cứu....................................................................35
2.2.2. Dụng cụ nghiên cứu............................................................................36
2.2.3. Hóa chất nghiên cứu...........................................................................36
2.3. Phương pháp nghiên cứu..........................................................................38
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang................................................38
Sơ đồ nghiên cứu:........................................................................................38
2.3.2. Nội dung nghiên cứu..........................................................................39
2.3.3. Địa điểm nghiên cứu...........................................................................39
2.3.4. Quy trình và các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu..........................39
2.4. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu.............................................................47
Chương 3 47
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................................47
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số...............................................................48
3.2. Áp dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA để phát hiện người lành mang gen

bệnh Hemophilia A.................................................................................51
3.2.1. Phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật
Microsatellite-DNA trên các thành viên nữ gia đình bệnh nhân.........51
3.2.2. So sánh kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A
bằng phương pháp gián tiếp Microsatellite-DNA và phương pháp trực
tiếp.......................................................................................................61


3.2.3. Tỉ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A bằng kỹ
thuật Microsatellite-DNA....................................................................66
Chương 4 67
BÀN LUẬN........................................................................................................67
4.1. Về quy trình kỹ thuật tách chiết DNA tổng số..........................................67
4.2. Áp dụng quy trình kỹ thuật Microsatellite-DNA để phát hiện người lành
mang gen bệnh Hemophilia A.................................................................69
KẾT LUẬN........................................................................................................84
Bằng việc áp dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA, đã xác định được 24/37
thành viên nữ mang gen bệnh (chiếm 64,9%) và 13/37 thành viên
nữ không mang gen bệnh (chiếm 35,1%) trong 10 gia đình bệnh
nhân Hemophilia A.........................................................................84
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................1

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Chẩn đoán thể bệnh Hemophilia A theo nồng độ yếu tố VIII........7
Bảng 1.2. Nồng độ yếu tố đông máu cần đạt và thời gian điều trị khi có chảy
máu...................................................................................................11
Bảng 2.1.Trình tự mồi khuếch đại các STRs sử dụng trong nghiên cứu......37
- Hóa chất chạy điện di:....................................................................................38

Bảng 2.2. Thành phần và điều kiện của phản ứng PCR khuếch đại STR. . .45
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch các mẫu DNA tách từ máu
ngoại vi của các đối tượng nghiên cứu..........................................48
Bảng 3.2. Kết quả xác định người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
Microsatellite-DNA.........................................................................60
Như vậy sau khi kiểm tra ngẫu nhiên kết quả phát hiện người lành mang
gen bệnh Hemophilia A của 2 gia đình bằng phương pháp giải
trình tự gen trực tiếp và phương pháp gián tiếp MicrosatelliteDNA, kết quả của 2 phương pháp là tương đồng nhau (bảng 3.3).
...........................................................................................................64
Bảng 3.3. So sánh kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh bằng 2
phương pháp....................................................................................65
Bảng 3.4. Tỷ lệ phát hiện người lành mang gen bệnh bằng kỹ thuật
Microsatellite-DNA.........................................................................66


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các hình ảnh biểu hiện bệnh Hemophilia A.....................................6
Hình 1.2. Sơ đồ đông máu theo con đường nội và ngoại sinh [21]................14
Hình 1.3. Cấu trúc gen F8 và protein yếu tố VIII..........................................15
Hình 1.4. Kiểu gen và kiểu hình của bố mẹ và thế hệ con.............................19
Hình 1.5. Ảnh giải trình tự exon 8 gen F8 của bệnh nhân mã số HA42.......26
Hình 1.6. Cơ chế đột biến gen F8 do đảo đoạn intron22 [51]........................27
Hình 1.7. Cơ chế đột biến gen F8 do đảo đoạn intron1 [51]..........................29
Hình 2.1. Kết quả khuếch đại STR lựa chọn marker dị hợp tử....................46
Hình 3.1. Kết quả xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA trên máy.....48
Nano Drop của đối tượng nghiên cứu mã số C1.............................................48
Hình 3.2. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ máu ngoại vi............50
của các đối tượng nghiên cứu...........................................................................50
Hình 3.3. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân HA11 (trước phân tích gen)....51
Hình 3.4. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi DXS9901,

DXS9897 của gia đình mã số HA11...............................................52
Hình 3.5. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân HA11 (sau phân tích gen)........53
Hình 3.6. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân HA37 (trước phân tích gen)....54
Hình 3.7. Ảnh điện di vùng trình tự lặp lại sử dụng cặp mồi F8int13,
FXS7532 của gia đình mã số HA37...............................................55
Nhận xét: 55
Hình 3.8. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân HA37 (sau phân tích gen)........56
Hình 3.9. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân HA16 (trước nghiên cứu)........57


Hình 3.10. Kết quả phát hiện người lành mang gen bệnh HA bằng kỹ thuật
Microsatellite-DNA của gia đình bệnh nhân HA16.....................58
Nhận xét: 58
Kết quả trên cho thấy ở mỗi vùng trình tự lặp lại DXS1073, DXS9901 mẹ,
bác gái và chị họ của bệnh nhân HA16 xuất hiện 2 đỉnh, mỗi
đỉnh tương ứng với 1 allele. Trong đó đỉnh có kích thước 127bp,
202bp trùng với đỉnh của bệnh nhân đây chính là đỉnh của allele
đột biến Xb, tức là bệnh nhân sẽ nhận các allele đột biến này từ
người mẹ. Và chị họ, bác gái bệnh nhân là người lành mang gen
bệnh. Tương ứng với mỗi vùng trình tự lặp lại ở dì bệnh nhân có
2 đỉnh có kích thước không trùng với đỉnh của allele đột biến Xb
của bệnh nhân chứng tỏ dì của bệnh nhân không mang gen bệnh.
...........................................................................................................58
Hình 3.11. Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân HA16 (sau nghiên cứu)..........59
Hình 3.12. Ảnh giải trình tự gen F8 của bệnh nhân mã số HA37.................61
Hình 3.13. Ảnh giải trình tự gen F8 của gia đình bệnh nhân mã số HA37. .62
Hình 3.14. Ảnh giải trình tự gen F8 của bệnh nhân mã số HA11.................63
Hình 3.15. Ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số HA11........64

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hemophilia A là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X, gây
nên do đột biến gen F8. Gen bệnh nằm trên nhiễm sắc thể X không có allele
tương ứng trên nhiễm sắc thể Y, do vậy người mẹ mang gen bệnh có thể truyền
bệnh cho 50% con trai và truyền gen bệnh cho 50% con gái của họ [1]. Bệnh có
thể di truyền qua nhiều thế hệ và có nhiều người mắc bệnh trong cùng một gia
đình. Tại Việt Nam ước tính có khoảng 6000 người bị bệnh Hemophilia A, và
khoảng 30.000 người mang gen bệnh Hemophilia A [2]. Chẩn đoán chính xác và
điều trị sớm căn bệnh này có ý nghĩa quan trọng nhằm hạn chế tối đa tình trạng
chảy máu cũng như giảm thiểu khả năng bệnh nhân trở thành tàn tật, giảm bớt
gánh nặng cho gia đình và xã hội.
Người phụ nữ mang gen bệnh Hemophilia A là người mang một nhiễm sắc
thể X bị đột biến gen F8 và một nhiễm sắc thể X bình thường. H oạt tính yếu tố
VIII trong máu của người phụ nữ mang gen bệnh Hemophilia A thường giảm tuy
nhiên nhiều trường hợp hoạt tính yếu tố VIII không giảm hoặc giảm ít [2]. Việc
phát hiện người lành mang gen bệnh là cơ sở khoa học cho công tác tư vấn di
truyền, chẩn đoán trước sinh và chẩn đoán tiền làm tổ (PGD), giúp ngăn ngừa sinh
ra những đứa trẻ bị bệnh Hemophilia A, tăng hiệu quả trong tác phòng ngừa bệnh
tật đồng thời nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Cho đến nay, khoảng hơn 2000 đột biến trên gen F8 đã được báo cáo với
nhiều loại đột biến khác nhau như: đột biến điểm, đột biến xoá đoạn, đột biến
đảo đoạn…[3]. Ở Việt Nam, đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh
Hemophilia A như: nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, tần suất mắc
bệnh và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh bằng các chế phẩm thay thế [4], [5], [6].
Các nghiên cứu về đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh cũng đã
được triển khai một cách khá toàn diện như: nghiên cứu xác định đột biến gen
bệnh Hemophilia A của Lưu Vũ Dũng (2014) [7], nghiên cứu phát hiện người
lành mang gen bệnh Hemophilia A của Bùi Thị Thu Hương (2014) [8] ... Việc

2

phát hiện người lành mang gen bệnh thường được thực hiện bằng kỹ thuật phát
hiện đột biến trực tiếp trên gen F8 dựa vào đột biến chỉ điểm của bệnh nhân. Tuy
nhiên, chi phí cho việc phát hiện đột biến gen F8 khá cao và không phải bệnh
nhân nào cũng có điều kiện xét nghiệm gen, ngoài ra trong số những bệnh nhân
được xét nghiệm gen, vẫn còn một tỉ lệ nhất định (khoảng hơn 10%) bệnh nhân
chưa phát hiện được đột biến gen F8 [7]. Kỹ thuật phân tích gián tiếp
Microsatellite-DNA có thể phát hiện được người lành mang gen bệnh dựa vào
xác định allele đột biến, với thời gian phân tích nhanh hơn (chỉ 1-2 tuần so với
kỹ thuật phân tích trực tiếp 1-2 tháng) và giá thành phân tích rẻ hơn.
Microsatellite-DNA được phát triển dựa trên kỹ thuật PCR truyền thống, bằng
việc sử dụng các cặp mồi có gắn huỳnh quang để khuếch đại vùng trình tự lặp
lại ngắn STR (short tandem repeat), sản phẩm PCR được điện di trên hệ thống
máy giải trình tự gen để phát hiện allele đột biến. Trên thế giới, đã có một số
nghiên cứu sử dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA để phát hiện người lành mang
gen bệnh Hemophilia A. Ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào áp dụng kỹ thuật
này để phát hiện người lành mang gen bệnh Hemophilia A. Xuất phát từ thực tế
đó đề tài: “Xác định người lành mang gen bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật
Microsatellite-DNA” được tiến hành với mục tiêu sau:
Áp dụng kỹ thuật Microsatellite-DNA để phát hiện người lành mang gen
bệnh Hemophilia A trên các thành viên gia đình bệnh nhân.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Đặc điểm bệnh Hemophilia A
1.1.1. Những đặc điểm chung
1.1.1.1. Định nghĩa
Bệnh máu khó đông (Hemophilia) là một bệnh chảy máu di truyền do
thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của các yếu tố đông máu trong huyết
tương: thiếu hụt yếu tố VIII gây bệnh Hemophilia A; thiếu hụt yếu tố IX gây
bệnh Hemophilia B; thiếu hụt yếu tố XI gây bệnh Hemophilia C. Bệnh
Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền hay gặp nhất [9], [10].
1.1.1.2. Lịch sử nghiên cứu
 Từ thời kỳ cổ đại loài người đã biết đến bệnh máu khó đông, tuy nhiên
không có tên gọi chính thức cho nó. Hemophilia A đựợc ghi nhận lần đầu tiên từ
thế kỉ thứ 2 khi các giáo sĩ Do thái cắt bao qui đầu cho trẻ em và nhận thấy có một
số trẻ trai bị chảy máu lâu cầm. Bác sỹ người Ả rập - Albucasis cũng miêu tả những
đứa trẻ bị chết do chảy máu vì những vết thương nhỏ. Từ năm 1803 – 1837 các nhà
khoa học đã phát hiện cơ chế di truyền lặn, liên quan đến nhiễm sắc thể giới tính X
và nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho con
trai, người mẹ mang gen bệnh và truyền bệnh cho con trai mình.
 Bệnh hemoliphia A còn được biết đến như căn bệnh của hoàng gia vì nữ
hoàng Anh Victoria (1838-1901) mang và truyền gen bệnh này cho nhiều Hoàng
Gia khác [11].
 1872: William Leg mô tả chi tiết về đặc điểm lâm sàng bệnh Hemophilia A.
 1893: Xác định thời gian đông máu kéo dài ở bệnh nhân Hemophilia A.
 1937: Thiếu hụt yếu tố VIII được xác định là nguyên nhân bệnh Hemophilia A.


4

 Năm 1944, Pavlosky nghiên cứu ở Buenos Aires cho thấy máu của một
bệnh nhân Hemophilia A có thể điều trị triệu chứng rối loạn đông máu của bệnh
nhân Hemophilia khác và ngược lại khi tình cờ ông gặp hai bệnh nhân bị thiếu

hụt hai protein khác nhau: yếu tố VIII và yếu tố IX [12].
 1971: Hemophilia A được phân biệt với bệnh von Willebrand.
 1982: Trình tự của gen yếu tố VIII được xác định.
Những phát hiện này cho phép chẩn đoán chính xác và xây dựng cơ sở
khoa học cho việc điều trị bệnh rối loạn đông máu di truyền.
1.1.1.3. Dịch tễ học bệnh Hemophilia A
Theo thống kê của tổ chức Hemophilia thế giới (WFH), hiện nay có
khoảng 250.000 bệnh nhân mắc bệnh Hemophilia và chỉ có khoảng 50.000 được
điều trị đặc hiệu [13]. Tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia A gần giống nhau ở các vùng
địa lý, các nước, các chủng tộc, tần suất mắc bệnh chung khoảng 30100/1.000.000 dân [14]. Tần suất mắc bệnh Hemophilia A là 1/4000 ÷ 1/5.000
trẻ trai [15], [16]. Tỉ lệ khoảng 0,2-1/1 triệu người /năm ở Mỹ. Tỉ lệ tử vong cao
9 - 22% [17].
Tại Việt Nam, theo những thống kê không đầy đủ hiện tại có khoảng 6000
bệnh nhân Hemophilia A. Số liệu điều tra những năm 1994÷ 1996 về tình hình
bệnh Hemophilia A ở miền Bắc Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh Hemophilia A là
25÷ 60/1.000.000 dân [15].
Hiện nay trên toàn quốc mới có khoảng 2.200 (chiếm gần 40%) bệnh nhân
được phát hiện và chăm sóc thường xuyên. Như vậy, tỷ lệ bệnh nhân chưa được
chẩn đoán và điều trị vẫn còn ở mức cao [5]. Tại Trung tâm Hemophilia viện Huyết
học - Truyền máu Trung Ương đang quản lý và điều trị khoảng 1.200 bệnh nhân,
trong đó bệnh Hemophilia A chiếm 85%, bệnh Hemophilia B chiếm 13,16% và còn
lại là những bệnh nhân bị các bệnh rối loạn đông máu khác. Trung bình mỗi ngày
có từ 80 đến 100 bệnh nhân tới điều trị nội và ngoại trú [5].


5

1.1.2. Chẩn đoán bệnh Hemophilia A
1.1.2.1. Chẩn đoán xác định bệnh Hemophilia A
- Tiền sử gia đình có người nam giới liên quan họ mẹ bị chảy máu lâu cầm.

- Triệu chứng lâm sàng:
Bệnh Hemophilia A đặc trưng bởi thời gian đông máu kéo dài và tăng
nguy cơ chảy máu. Biểu hiện lâm sàng chủ yếu là xuất huyết. Xuất huyết có thể
tự nhiên hoặc sau chấn thương nhẹ. Đặc điểm xuất huyết là các đám bầm máu
dưới da, tụ máu trong cơ, chảy máu ở các khớp [9], [18], [19].
Người mắc bệnh Hemophilia A thường bị chảy máu khó cầm ở nhiều bộ
phận của cơ thể với các hình thức:
 Máu chảy khó cầm ở vết thương: đứt tay, chân, nhổ răng, bầm tụ máu
khi bị ngã.
 Khối máu tụ ở khớp, ở cơ: thường xuất hiện nhiều lần có tính lặp lại ở
một cơ, một khớp.
 Chảy máu ở niêm mạc: đái máu, đi ngoài ra máu, chảy máu chân răng,
chảy máu mũi.
+ Vị trí chảy máu:
− Nhiều nhất là tụ máu khớp trong đó khớp gối là hay gặp nhất rồi đến
khớp khuỷu, khớp cổ chân và khớp háng. Đây là loại chảy máu nguy hiểm vì khi
tái phát nhiều lần gây ra viêm khớp, biến dạng khớp.
− Khối máu tụ trong cơ và dưới cũng thường gặp và xuất hiện tự nhiên
hoặc sau chấn thương. Những cơ hay bị chảy máu như: cẳng chân, đùi, cánh tay.
Nếu không được điều trị sớm có thể gây hoại tử cơ hoặc gây liệt.
− Chảy máu vị trí khác: Bệnh nhân Hemophilia A rất dễ bị chảy máu
nhưng hiếm gặp xuất huyết dưới da. Chảy máu từ vết cắt sâu hoặc xước da có
thể kéo dài và hồi phục sau vài ngày mà không cần điều trị. Chảy máu miệng,
lợi và mũi cũng hay gặp. Có thể xuất huyết tiêu hoá và đái máu.


6

Hình 1.1. Các hình ảnh biểu hiện bệnh Hemophilia A
(Nguồn:www.hemoviet.org.vn)

a. Biến dạng khớp do Hemophilia A

b. Tụ máu ở cơ và dưới da

c. Tụ máu khớp khủy tay.

d. Xuất huyết niêm mạc

- Dựa vào xét nghiệm cận lâm sàng:
APTT kéo dài.
Định lượng yếu tố VIII (FVIII) giảm dưới 40%.
Xét nghiệm DNA phát hiện đột biến gen F8.
Số lượng tiểu cầu, PTTT, fibrinogen, định lượng yếu tố Von- Willebrand
bình thường.
1.1.2.2. Chẩn đoán thể bệnh Hemophilia A theo mức độ yếu tố VIII
Bình thường nồng độ FVIII ở người là 200 ng/ml. Trường hợp bị bệnh,
lượng yếu tố VIII giảm dưới 40% [2].


7

Bảng 1.1. Chẩn đoán thể bệnh Hemophilia A theo nồng độ yếu tố VIII
Mức độ

Nồng độ yếu tố

Biểu hiện chảy máu

FVIII (ng/ml)

Chảy máu trong cơ, khớp (gối, khuỷu,
Nặng

<1

(Chiếm 70%)

mắt cá).
Chảy máu 1-2 lần/ tuần
Chảy máu không cần lý do.
Chảy máu sau mổ, vết thương nặng, nhổ

Trung bình

1-5

(Chiếm 15%)
Nhẹ
(Chiếm 15%)

> 5-40

răng.
Chảy máu 1 lần/ tháng.
Hiếm khi chảy máu mà không lý do
Thường không chảy máu, trừ khi mổ hay
vết thương nặng.

1.1.2.3. Chẩn đoán phân biệt
- Bệnh Von-Willebrand:

+ Lâm sàng: Gặp ở cả hai giới, biểu hiện chính là chảy máu niêm mạc, ít
gặp chảy máu xương khớp.
+ Thời gian máu chảy kéo dài.
+ Định lượng yếu tố VIII (FVIII): giảm.
+ Định lượng yếu vWF:Ag: giảm.
+ Định lượng yếu vWF:Act: giảm.
+ Thời gian có nút tiểu cầu: kéo dài.
+ Co cục máu đông: co không hoàn toàn.
+ Ngưng tập tiểu cầu với Ristocetin giảm, còn với các chất kích tập khác
bình thường.
- Hemophilia A mắc phải:


8

+ Cơ chế bệnh sinh: do cơ thể người trưởng thành sinh ra tự kháng thể

gây bất hoạt yếu tố FVIII.
+ Bệnh gặp ở độ tuổi trung niên, gặp cả ở nam và nữ.
+ Biểu hiện chính là xuất huyết ở da và mô mềm; có thể đái ra máu, xuất

huyết dạ dày-ruột, xuất huyết hậu sản kéo dài; ít gặp xuất huyết ở khớp.
+ Xét nghiệm: APTT kéo dài, FVIII thấp hơn 30%, có chất ức chế FVIII

theo thời gian; số lượng tiểu cầu bình thường.
- Những rối loạn di truyền khác gây kéo dài APTT:
• Do thiếu hụt các yếu tố tham gia con đường đông máu nội sinh:
+ Thiếu hụt yếu tố XI bẩm sinh: Gặp ở cả nam và nữ; lâm sàng không có biểu
hiện chảy máu bất thường sau can thiệp, phẫu thuật; định lượng yếu tố XI giảm.
+ Thiếu hụt yếu tố XII, prekallikrein hoặc kininogen trọng lượng phân tử

cao bẩm sinh: Gặp ở cả nam và nữ, lâm sàng không có biểu hiện chảy máu bất
thường; định lượng một trong các yếu tố XII, prekallikrein hoặc kininogen trọng
lượng phân tử cao giảm.
• Do có chất ức chế:
+ Hemophilia A mắc phải: Không có tiền sử chảy máu bất thường, hay
gặp ở người lớn tuổi, mắc bệnh tự miễn hoặc ung thư, phụ nữ sau sinh, thường
xuất huyết dưới da, tụ máu trong cơ nhiều hơn là chảy máu khớp. Xét nghiệm
APTT kéo dài, chất ức chế đông máu nội sinh dương tính, yếu tố VIII hoặc IX
giảm, có chất ức chế VIII/ IX.
+ Kháng thể kháng phospholipid: Lâm sàng thường có biểu hiện tắc mạch
(ở người trẻ), sảy thai liên tiếp hoặc thai lưu, sinh non, tiền sản giật. Xét nghiệm
APTT kéo dài; ức chế đông máu nội sinh không phụ thuộc thời gian và nhiệt độ:
dương tính; có kháng thể kháng phospholipid dương tính như: LA, anticardiolipin, anti-β2glycoprotein...
1.1.2.4 Các biến chứng do chảy máu trong bệnh Hemophilia A


9

Việc chảy máu khó cầm và kéo dài hay tái phát sẽ để lại hậu quả nặng nề
gây biến dạng các mô và cơ quan như:
- Ở khớp: Gây phá huỷ các bao khớp, sưng khớp, hạn chế vận động, cứng
khớp và teo cơ.
- Ở cơ lớn gây tê liệt các cơ, mạch máu và thần kinh bị chèn ép dẫn đến
hoại tử, xơ hoá, teo cơ.
- Các tạng gây tụ máu lớn, chảy máu không cầm mất máu nặng dẫn đến tử vong.
- Nhiễm trùng, hoại tử khối máu tụ.
1.1.3. Điều trị bệnh Hemophilia A
1.1.3.1. Nguyên tắc:
- Mục tiêu chính là dự phòng chảy máu.
- Ngay khi nghi ngờ có chảy máu cần áp dụng RICE để hỗ trợ cầm máu

(RICE là chữ viết tắt của các từ tiếng Anh: Rest = Nghỉ ngơi, Ice = chườm đá,
Compression = băng ép, Elevation = nâng cao chỗ tổn thương).
- Bổ sung yếu tố VIII đủ để cầm máu cho bệnh nhân càng sớm càng tốt khi
có chảy máu. Nếu nghi ngờ chảy máu cần điều trị ngay.
- Yếu tố VIII là chế phẩm sinh học có từ các nguồn từ:
Huyết tương tươi, huyết tương tươi đông lạnh, tủa lạnh, yếu tố VIII cô đặc
nguồn gốc huyết tương người, yếu tố VIII cô đặc tái tổ hợp, yếu tố VIII có
nguồn gốc từ lợn, yếu tố VIII tác dụng kéo dài.
- Nồng độ yếu tố VIII cần đạt phụ thuộc vào vị trí chảy máu, mức độ chảy
máu và mục đích điều trị (để cầm máu hay phòng chảy máu, phòng chảy máu
khi mổ…)


10

- Nên sử dụng xét nghiệm Rotem phối hợp với định lượng yếu tố đông máu
để xác định nguy cơ chảy máu và theo dõi hiệu quả điều trị khi sử dụng yếu tố
đông máu.
- Không dùng thuốc ảnh hưởng đến chức năng tiểu cầu, hạn chế tiêm bắp
tối đa.
1.1.3.2 Cách tính liều yếu tố đông máu
Yếu tố VIII cần dùng (ui) = (VIIIcd – VIIIbn) % x P(kg)/2
Chú thích:
- VIIIcd: Là nồng độ yếu tố VIII cần đạt (%).
- VIIIbn: Là nồng độ yếu tố VIII ngay trước khi điều trị của bệnh nhân (%).
- P: Là cân nặng của bệnh nhân (kg).
Thời gian bán hủy của yếu tố VIII từ 8 – 12 giờ vì vậy trường hợp chảy
máu nặng vị trí nguy hiểm cần bổ sung yếu tố VIII mỗi 8 – 12 giờ.
Đối với loại yếu tố VIII có tác dụng kéo dài thì tùy thuộc vào từng chế
phẩm và mục đích điều trị mà khoảng cách giữa các lần dùng có thể thay đổi.

1.1.3.3 Điều trị chảy máu
Căn cứ vào vị trí, mức độ chảy máu và mục đích điều trị mà tính liều yếu tố
VIII cần bổ sung theo hướng dẫn ở bảng 1.2.


11

Bảng 1.2. Nồng độ yếu tố đông máu cần đạt và thời gian điều trị khi có chảy máu

Triệu chứng

Khớp, chảy máu răng miệng
Cơ (không có tổn thương thần
kinh đi kèm, trừ cơ đái chậu)
Cơ đái chậu
hoặc cơ ở sâu có
tổn thương thần
kinh đi kèm

Tấn công

Đầu thần kinh
trung ương

Tấn công
Duy trì
Củng cố
Tấn công
Duy trì

Duy trì

Xuất huyết tiêu
hóa
Đái máu
Vết thương sâu
Tấn công
Cổ và ngực
Duy trì
Trước mổ
Phẫu thuật nhỏ
Sau mổ
Trước mổ
Phẫu thuật lớn

Sau mổ

Hemophilia A
Nồng độ cần đạt
Thời gian duy trì
(%)
(ngày)
1-2 ngày, có thể lâu
15-30
hơn nếu chưa đáp ứng
hoàn toàn
2-3 ngày, có thể lâu
15-30
hơn nếu chưa đáp ứng
hoàn toàn

40-60
1-2
3-5, có thể kéo dài hơn
20-30
đến khi hồi phục chức
năng
60-80
1-5
30-50
6-10
20-30
11-21
40-60
1-7
20-40
8-14
30-50
3-5
30-50
5-7
60-80
1-7
30-50
8-14
40-60
1-5 ngày, tùy thuộc vào
30-40
loại phẫu thuật
60-80
50-80

1-3
30-50
4-6
15-30
7-14

- Đối với những trường hợp chảy máu nặng, ở các vị trí nguy hiểm, trong
và sau phẫu thuật cần làm định lượng yếu tố đông máu để theo dõi hiệu quả
điều trị và kịp thời điều chỉnh liều. Nếu sử dụng yếu tố có thời gian bán hủy


12

kéo dài thì khoảng cách giữa các lần dùng sẽ cách xa nhau hơn tùy thuộc vào
từng chế phẩm.
1.1.3.4. Điều trị hỗ trợ
- Thuốc ức chế tiêu fibrin.
- Desmopressin.
- Corticoid.
- Giảm đau.
- Chườm đá, băng ép, nâng cao vị trí tổn thương, nghỉ ngơi.
- An thần.
1.1.3.5. Điều trị biến chứng
- Điều trị thiếu máu: Bổ sung sắt, truyền khối hồng cầu.
- Điều trị các triệu chứng miễn nhiễm trùng nếu có bằng kháng sinh.
- Điều trị viêm khớp bằng Ytrium 90 tiêm trong khớp theo phác đồ
chuyên khoa.
- Điều trị viên gan B, viên gan C, HIV (nếu có) theo phác đồ.
- Điều trị các biên chứng khác (nếu có).
- Điều trị các bệnh đi kèm (nếu có).

1.1.3.6. Điều trị khi bệnh nhân cần phẫu thuật
- Các phẫu thuật, thủ thuật có xâm lấn như nhổ răng, nội soi, lấy khí máu,
chọc dịch màng phổi… cần được bổ sung yếu tố đông máu để đảm bảo an toàn
cho bệnh nhân.
- Các can thiệp ngoại khoa cần được tiến hành tại cơ sở y tế có đủ điều kiện
chẩn đoán và điều trị Hemophilia A, hoặc có phối hợp với trung tâm Hemophilia
A và được sử dụng chế phẩm yếu tố đông máu như điều trị tại trung tâm
Hemophilia A.


13

1.1.4. Cơ chế phân tử bệnh Hemophilia A
Bệnh Hemophilia A (còn gọi là bệnh máu khó đông) là một bệnh di truyền
do thiếu hụt hoặc bất thường chức năng của yếu tố đông máu huyết tương - yếu
tố VIII. Từ năm 1984, nghiên cứu của Vehar và cộng sự đã cho thấy những hiểu
biết đầy đủ về cấu trúc phân tử gen F8 tổng hợp protein yếu tố VIII, mở đường
cho các nghiên cứu về cơ chế phân tử bệnh Hemophilia A và các dạng đột biến
gen F8 gây bệnh.
1.1.4.1. Vai trò yếu tố VIII trong đông cầm máu
Trong con đường đông máu nội sinh, yếu tố VIII đóng vai trò là đồng
yếu tố với yếu tố IX hoạt hóa (IXa) cùng sự có mặt của Ca 2+ và phospholipid
tiểu cầu hoạt hóa yếu tố X thành Xa, từ đó tác động nên sự hình thành
thrombin từ prothrombin, giúp cho quá trình tạo và cố định fibrin từ
fibrinogen, hoàn thiện quá trình tạo cục máu đông cùng với tiểu cầu và yếu tố
thành mạch [9].
Thiếu hụt hoặc bất thường chức năng yếu tố VIII làm ngừng trệ dòng thác
đông máu theo con đường nội sinh, dẫn đến tình trạng chảy máu kéo dài, không
cầm ở bệnh nhân Hemophilia A [20].