Luận văn thạc sĩ khoa học: Nghiên cứu xác định kháng sinh Meropenem bằng phương pháp quang học sử dụng dung dịch nano vàng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ HÀ THU

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội –Năm 2019

1


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ HÀ THU

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH KHÁNG SINH MEROPENEM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP QUANG HỌC SỬ DỤNG DUNG DỊCH NANO VÀNG

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số : 8440112.03

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội –Năm 2019
2


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Thị Ngọc Mai đã
giao đề tài, truyền thụ cho em nhiều kiến thức và tận tình hướng dẫn em trong suốt
quá trình làm luận văn tốt nghiệp.
Em cũng xin trận trọng cảm ơn các anh chị và các bạn Phòng Thử nghiệm 1Công ty Cổ phần Chứng nhận và Giám định Vinacert đã giúp đỡ tận tình và tạo mọi
điều kiện tốt nhất để em hoàn thành luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong khoa Hóa học, đặc biệt là các
thầy cô Bộ môn Hóa Phân tích lòng tri ân sâu sắc.
Luận văn được hoàn thành với sự hỗ trợ một phần từ đề tài 104.04-2017.12 của
Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia.
Hà Nội, tháng 09 năm 2019.
Học viên cao học

Nguyễn Thị Hà Thu

3


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
BẢNG KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG I- TỔNG QUAN ........................................................................................ 1
1.1.

Tổng quan về kháng sinh .................................................................................. 1

1.2.

Đại cương về nhóm kháng sinh carbapenem .................................................... 2

1.2.1. Cấu trúc hóa học . .......................................................................................... 2
1.2.2. Cơ chế tác dụng .............................................................................................. 3
1.2.3. Phổ tác dụng của carbapenem ........................................................................ 3
1.2.4. Đánh giá xu hướng sử dụng kháng sinh carbapenem .................................... 4
1.3.

Meropenem ........................................................................................................ 5

1.3.1. Cấu trúc hóa học ............................................................................................ 5
1.3.2. Dược lý và cơ chế tác dụng ............................................................................ 6
1.4.

Các phương pháp xác định meropenem. ........................................................... 9

1.4.1. Phương pháp sắc ký ....................................................................................... 9
1.4.2. Phương pháp điện hóa.................................................................................. 11
1.4.3. Phương pháp điện di mao quản .................................................................... 11
1.5.

Giới thiệu về vật liệu vàng nano và ứng dụng ................................................ 15

1.5.1. Vật liệu vàng nano ....................................................................................... 15
1.5.2. Tính chất quang của hạt nano vàng.............................................................. 16

1.5.3. Công nghệ sản xuất hạt nano vàng .............................................................. 20
1.5.4. Ứng dụng của hạt nano vàng ....................................................................... 23
CHƯƠNG II-THỰC NGHIỆM ................................................................................ 28
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ..................................................... 28
2.1.1. Mục tiêu ........................................................................................................ 28
2.1.2. Đối tượng...................................................................................................... 28
4


2.1.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 28
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ........................................................................... 29
2.2.1. Hóa chất ........................................................................................................ 29
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 29
2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 30
2.3.1. Phương pháp chế tạo hạt nano vàng ............................................................. 30
2.3.2 Phương pháp hấp thụ phân tử UV-Vis xác định hàm lượng meropenem sử
dụng hạt nano vàng ................................................................................................. 31
2.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM ..................................... 32
2.3.4. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp .......................................................... 33
2.4. Quy trình thực nghiệm ....................................................................................... 34
2.4.1 Chuẩn bị tổng hợp dung dịch nano vàng ....................................................... 34
2.4.2. Tối ưu hóa điều kiện phân tích ..................................................................... 35
2.4.3. Thẩm định phương pháp phân tích ............................................................... 35
2.4.4. Định lượng meropenem trong mẫu thực tế .................................................. 36
CHƯƠNG III-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 39
3.1. Khảo sát đặc trưng của dung dịch nano vàng..................................................... 39
3.1.1. Khảo sát hình thái bề mặt qua ảnh TEM ...................................................... 39
3.1.2. Khảo sát đặc tính hấp thụ cộng hưởng bề mặt bằng phổ hấp thụ phân tử UVVIS .......................................................................................................................... 40
3.2. Khảo sát các điều kiện xác định meropenem bằng dung dịch nano vàng. ......... 41
3.2.1. Ảnh hưởng của pH ....................................................................................... 42

3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl ............................................................ 43
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nano vàng. ............................................ 44
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian .............................................................................. 45
3.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ meropenem ........................................................... 46
3.3. Đánh giá phương pháp phân tích xác định meropenem bằng dung dịch nano vàng.
................................................................................................................................... 48
3.3.1. Xác định khoảng tuyến tính.......................................................................... 48
5


3.3.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn .......................................................... 49
3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) ............ 50
3.3.4.Xác định độ đúng và độ lặp lại ...................................................................... 51
3.4. Ứng dụng xác định meropenem trong mẫu thực tế ............................................ 53
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu................................................................. 53
3.4.2.Đánh giá phương pháp phân tích trên nền mẫu thuốc. .................................. 55
3.5. Ứng dụng xác định mẫu thực tế ......................................................................... 56
KẾT LUẬN ................................................................................................................. 60
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 60
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 67

6


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1

Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Bảng 1.2

Một số nghiên cứu xác định meropenem

Bảng 1.3

Kích cỡ các hạt nano vàng sử dụng hiện nay

Bảng 1.4.

Một số ứng dụng của hạt nano vàng trong phân tích

Bảng 2.1.

Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2.

Danh mục thuốc tiêm chứa meropenem được sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 3.1.

Ảnh hưởng của pH đến tỉ lệ độ hấp thụ quang

Bảng 3.2.

Ảnh hưởng của nồng độ muối đến tỉ lệ độ hấp thụ quang

Bảng 3.3.

Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AuNPs đến tỉ lệ độ hấp thụ quang

Bảng 3.4.

Nồng độ meropenem và tỉ lệ độ hấp thụ quang A660/A520

Bảng 3.5.

Giới hạn phát hiện của một số phương pháp xác định meropenem

Bảng 3.6.

Kết quả đánh giá độ đúng và độ lặp lại của phương pháp

Bảng 3.7.

Kết quả đánh giá ảnh hưởng của đường và Na2CO3 đến tỉ lệ độ hấp thụ
quang

Bảng 3.8.

Độ lặp lại trên nền mẫu thuốc trong ngày và khác ngày

Bảng 3.9.

Kết quả đánh giá độ đúng trên nền mẫu thuốc

Bảng 3.10. Kết quả phân tích meropenem trong một số mẫu dược phẩm

7

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1.

Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem

Hình 1.2.

Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem

Hình 1.3.

Màu sắc của các keo vàng nano theo kích thước hạt

Hình 1.4.

Hiện tượng cộng hưởng plasmon bề mặt

Hình 1.5.

Hiện tượng SPR của nano vàng dạng cầu

Hình 1.6.

Sự phân bố điện tích trên một thanh nano dưới kích thước của ánh sáng tới

Hình 2.1.

Phương pháp Turkevick tổng hợp hạt nano vàng

Hình 2.2.

Cơ chế phát triển mầm của phương pháp Turkevick

Hình 2.3.

Cơ chế của phương pháp xác định meropenem sử dụng nano vàng.

Hình 2.4.

Sơ đồ nguyên lý hoạt động của thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua TEM

Hình 3.1.

Dung dịch nano vàng ở điều kiện thường (màu đỏ) và khi có mặt meropenem
(màu xanh).

Hình 3.2.

Hình thái hạt nano vàng thông qua ảnh TEM

Hình 3.3.

Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng khi có mặt meropenem.

Hình 3.4.

Ảnh hưởng của pH

Hình 3.5.

Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl

Hình 3.6.

Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch AuNPs

Hình 3.7.

Ảnh hưởng của thời gian

Hình 3.8.

Ảnh hưởng của nồng độ meropenem

Hình 3.9.

Biểu đồ sự phụ thuộc giữa nồng độ meropenem và độ hấp thụ quang.

Hình 3.10.

Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính xác định meropenem.

Hình 3.11.

Đường chuẩn xác định meropenem.

Hình 3.12.

Phổ hấp thụ UV-Vis của một số mẫu thuốc chứa meropenem

Hình 3.13.

So sánh tương quan giữa hai phương pháp HPLC-DAD và UV-Vis.

8


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu

AuNPs

Tiếng Việt
Hiệp hội các cộng đồng phân
tích chính thức
Hạt nano vàng

Tiếng Anh
Association of Official Analytical
Communities
Gold nano particles

CZE

Điện di mao quản vùng

Capillary Electropherosis Zone

DAD

Detector mảng diot
Cơ quan quản lý Dược phẩm
Châu Âu

Diode array detector

AOAC

EMA

European Medicines Agency

FDA

Cơ quan quản lý thực phẩm và
dược phẩm Hoa Kỳ

Food and Drug Administration

HILIC

Sắc ký lỏng tương tác thân nước

Hydrophilic interaction liquid
chromatography

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

High Performance Liquid
Chromatography

HPLC-UV

Sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép
nối đầu dò UV

High Performance Liquid
Chromatography- Ultraviolet

LC

Sắc ký lỏng

Liquid Chromatography

LC-MS/MS

Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ
hai lần

Liquid Chromatography tandem
mass spectrometry.
Limit of Detection
Limit of Quantification

SWV

Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Hiện tượng cộng hưởng plasmon
bề mặt
Von-ampe sóng vuông

TEM

Kính hiển vi điện tử truyền qua

Transmission electron microscopy

UHPLC

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

Ultra Performance Liquid
Chromatography

LOD
LOQ
SPR

9

Surface plasmon resonance
Square wave voltammetry

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự ra đời của kháng sinh peniciline vào thể kỷ 20 đã đánh dấu một kỷ nguyên mới
của y học về điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, từ đó đến nay đã có hàng trăm loại thuốc
và kháng sinh tương tự đã được phát minh và đưa vào sử dụng. Tuy nhiên việc lạm
dụng kháng sinh đã dẫn tới tỉ lệ kháng kháng sinh gia tăng và trở thành một thách thức
lớn trên toàn thế giới. Theo số liệu của Cơ quan quản lý Dược phẩm Châu Âu (EMA),
ước tính hàng năm có khoảng 25000 trường hợp tử vong do nhiễm khuẩn vi khuẩn đa
kháng thuốc và gánh nặng kinh tế của đề kháng kháng sinh lên đến 1,5 tỷ Euro mỗi năm
[35]
Trước tình trạng này, nhiều cơ sở y tế đã đưa các nhóm kháng sinh phổ kháng khuẩn
mạnh như carbapenem vào để chữa trị cho bệnh nhân có các triệu chứng kháng kháng
sinh quá mạnh, trong đó meropenem được sử dụng nhiều nhất vì có phổ tác dụng rộng
[47].
Meropenem hiệu quả trong điều trị một loạt các nhiễm trùng gây ra bởi trực khuẩn
Gram âm và Gram dương, các mầm bệnh hiếu khí mẫn cảm với thuốc. Meropenem hoạt
động bằng cách liên kết với các protein và phá vỡ sự toàn vẹn và thống nhất của thành
tế bào vi khuẩn. Meropenem được tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch và đã cho hiệu quả lâm
sàng trong điều trị một loạt các bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng do vi khuẩn như viêm
phổi, nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng ổ bụng, viêm phổi…[21]. Ngoài ra meropenem
là kháng sinh thuộc nhóm carbapenem duy nhất được chấp thuận sử dụng để điều trị
viêm màng não do ít gây nguy cơ động kinh và an toàn cho phụ nữ có thai [18].
Được coi là một trong các loại kháng sinh mạnh nhất hiện nay, việc định lượng
meropenem trong dược phẩm và dịch sinh học của bệnh nhân nhằm đánh giá hiệu quả
điều trị bệnh vì thế rất quan trọng. Hiện nay các phương pháp phổ biến để xác định hàm
lượng meropenem như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC [21,18,19],
phương pháp điện di mao quản [33,26] , phương pháp điện hóa[13] .v.v đều có chung
một số nhược điểm như thiết bị, hóa chất đắt tiền, vận hành phức tạp, do đó việc phát
triển một phương pháp phân tích mới có độ nhạy và độ chính xác cao nhưng lại đơn
10

giản và có chi phí thấp là hết sức cần thiết.
Nhận thấy dung dịch nano vàng có hiệu ứng plasmon bề mặt (SPR) với khả năng
thay đổi màu sắc từ đỏ sang xanh khi có mặt meropenem, chúng tôi đã lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu xác định kháng sinh meropenem bằng phương pháp quang học sử
dụng dung dịch nano vàng”.
Phương pháp này sẽ được áp dụng để phân tích hàm lượng meropenem trong một
số mẫu dược phẩm hiện có trên thị trường.

11


12


1.1.

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN
Tổng quan về kháng sinh

Sự ra đời của kháng sinh là một thành tựu lớn của thế kỷ 20, giúp giảm thiểu đáng
kể tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do nhiễm khuẩn, đặc biệt đối với Việt Nam, với đặc trưng
khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Đây là nhóm thuốc quan trọng vì
bệnh lý về nhiễm khuẩn nằm trong tốp những bệnh đứng đầu về tỷ lệ mắc bệnh cũng
như tỷ lệ tử vong [6].
Kháng sinh (antibiotics) được định nghĩa: “là những chất kháng khuẩn
(antibacterial substaces) đươc tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm,
Actinomycetes) có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác”.
Hiện nay, từ kháng sinh được mở rộng đến cả những chất kháng khuẩn có nguồn
gốc tổng hợp như các sulfonamide và quinolon [2].

Các nhóm kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học thành các nhóm như sau:
Bảng 1.1.Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học
STT

Tên nhóm

Phân nhóm
Các penicilin
Các cephalosorin

1

Các beta-lactam khác

Beta-lactam

Carbapenem
Monobactam
Các chất ức chế beta-lactamase

2

Aminoglycosid

3

Macrolid

4

Lincosamid

5

Phenicol

6

Thế hệ 1

Tetracyclin

Thế hệ 2
1


Glycopeptid

7

Peptid

Polypetid
Lipopeptid

8

Thế hệ 1

Quinolon

Các fluoroquinolon: Thế hệ 2,3,4

Các nhóm kháng sinh khác
9

Sulfonamid
Oxazolidinon
5-nitroimidazol

1.2.

Đại cương về nhóm kháng sinh carbapenem

Nghiên cứu biến đổi cấu trúc hóa học của peniciline và celphalosporin đã tạo thành
một nhóm kháng sinh beta-lactam mới, có phổ kháng khuẩn rộng, kháng β-lactamase
đặc biệt của vi khuẩn Gram âm, tác dụng mạnh trên trực khuẩn mủ xanh. Nhóm kháng
sinh này bao gồm: imipenem, meropenem, ertapenem, doripenem, lần lượt được cơ
quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) phê chuẩn đưa vào sử dụng vào các
năm 1985,1996,2001 và 2007. Imipenem và meropenem có phổ hoạt động rộng nhất
chống lại hầu hết các chủng Pseudomonas và các chủng β-lactamase; ertapenem và
doripenem có hoạt phổ hẹp hơn các carbapenem khác trên P.aeruginosa và
Acinetobacter [1,9,10].
Các kháng sinh nhóm này có vai trò nhất định trong điều trị bao vây cũng như điều
trị theo mục tiêu những trường hợp nhiễm khuẩn nặng nghi ngờ do vi khuẩn đa kháng
sinh, đặc biệt là những trường hợp đa đề kháng có liên quan đến trực khuẩn gram âm
hoặc trong trường hợp các phác đồ điều trị kháng sinh khác không còn hiệu quả [45].
1.2.1. Cấu trúc hóa học
Carbapenem thuộc nhóm β-lactamase bán tổng hợp, cấu trúc phân tử khác các
kháng sinh peniciline ở chỗ một nguyên tử cacbon thay thế cho nguyên tử lưu huỳnh

trong cấu trúc vòng thiazollidin và có liên kết đôi giữa C-2 và C-3, ngoài ra carbapenem

2


có thêm nhóm ethylhydroxyl liên kết với vòng beta-lactam, còn ở nhóm penicillin là
nhóm acylamino [13].

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của các kháng sinh nhóm carbapenem
1.2.2. Cơ chế tác dụng
Carbapenem có cơ chế tác dụng chung của kháng sinh họ β-lactamase .Chúng tiêu
diệt vi khuẩn bằng cách gắn PBPs (penicillin binding proteins) làm ức chế quá trình
tổng hợp vách tế bào vi khuẩn và gián đoạn quá trình sinh tổng hợp thành tế bào vi
khuẩn do đó vi khuẩn không có thành tế bào che chở sẽ bị tiêu diệt. Những protein này
thực tế là các enzyme tham gia vào quá trình tạo liên kết chéo peptidoglycan-thành phần
chính của vách tế bào vi khuẩn. Mỗi carbapenem có ái lực đặc biệt với một nhóm PBPs
khác nhau, vì vậy tác dụng của mỗi loại là khác nhau và khác với các β-lactamase khác
[10, 25,49]. Vì vậy, thuốc có phổ kháng khuẩn rộng và không bị kháng chéo với các
thuốc khác trong nhóm β-lactamase [14].
1.2.3. Phổ tác dụng của carbapenem
Carbapenem là nhóm kháng sinh phổ rộng, có tác dụng trên cả vi khuẩn Gram
dương và Gram âm hiếu khí và kị khí, bền với các vi khuẩn sinh β-lactamase [49]. Các
3


thuốc trong nhóm carbapenem có phổ tác dụng tương tự nhau.
Tất cả các thuốc trong nhóm đều tác dụng tốt trên cầu khuẩn Gram dương, có tác
dụng kém trên MRSA (Methine- resistant Staphylococcal aureus hay tụ cầu vàng kháng
Methiciline) và tràng cầu khuẩn (enterococcal infections) bởi khả năng đề kháng nội tại
của các loài vi khuẩn này.

Trên vi khuẩn hiếu khí Gram âm: carbapenem thể hiện hoạt lực in vitro mạnh, tất
cả các kháng sinh trong nhóm đều thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên các vi
khuẩn Gram âm [6].
Các thuốc thuộc nhóm kháng sinh carbapenem cũng có tác dụng khá tốt trên các vi
khuẩn kị khí và không có tác dụng với các vi khuẩn không điển hình, vì những loài vi
khuẩn này không có thành tế bào (vốn là đích tác động của kháng sinh carbapenem).
1.2.4. Đánh giá xu hướng sử dụng kháng sinh carbapenem
Trước tình hình vi khuẩn đa đề kháng như hiện nay, carbapenem là nhóm kháng
sinh được ưu tiên lựa chọn trong điều trị nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm sinh βlactamase phổ rộng, vi khuẩn Gram âm đa kháng, các nhiễm khuẩn nặng và trong các
trường hợp sốt giảm bạch cầu trung tính [9].
Kết quả khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh tại bệnh viện Bạch Mai trong giai
đoạn 2012-2016 cho thấy từ năm 2012, số liều xác định trong ngày DDD (Defined Dose
Daily) trong 100 ngày nằm viện của kháng sinh carbapenem tăng dần trong 5 năm, đạt
mức gấp đôi vào năm 2016 [7]. Trong đó meropenem là hoạt chất được sử dụng nhiều
nhất, sau đó đến imipenem, ertapenem, nguyên nhân có thể do ưu điểm về hiệu quả
cũng như độ an toàn của thuốc này trong lâm sàng. Đồng thời, một phân tích về các kết
quả nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra tỷ lệ đáp ứng lâm sàng, đáp ứng vi sinh của nhóm
dùng meropenem cao hơn nhóm dùng imipenem trong khi tỷ lệ gặp biến cố bất lợi của
nhóm sử dụng meropenem lại thấp hơn đáng kể.
Năm 2016 Doripenem được đưa vào sử dụng với số liều DDD/100 ngày nằm viện
thấp nhất. Kết quả phân tích tiêu thụ của từng đơn vị điều trị trong bệnh viện cho thấy,
nhóm kháng sinh này được sử dụng rộng rãi ở tất cả các Khoa lâm sàng, Trung tâm
4


hoặc Viện. Ba đơn vị có lượng tiêu thụ vượt trên 10 DDD/100 ngày nằm viện bao gồm
Khoa hồi sức tích cực, Trung tâm hô hấp và khoa truyền nhiễm [7].
Theo báo cáo của Nguyễn Thị Lệ Minh, tại khoa Hồi sức tích cực, Truyền nhiễm
và Huyết học, tỷ lệ giảm nhạy cảm của các chủng vi khuẩn phân lập đạt mức 64% với
imipenem và 62% với meropenem vào năm 2011 [7].

1.3.

Meropenem

1.3.1. Cấu trúc hóa học
Meropenem (tên IUPAC:(4R,5S,6S)-3-[(3S,5S)-5-(dimethylcarbamoyl)pyrrolidin3-yl]sulfanyl-6-[(1R)-1-hydroxyethyl]-4-methyl-7-oxo-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene2-carboxylic acid) là một axit hữu cơ có công thức phân tử là 𝐶15 𝐻25 𝑁3 𝑂5 𝑆, M=383,46
g/mol [37]. Meropenem có 𝑝𝑘𝑎1 = 2,9 và 𝑝𝑘𝑎2 = 7,4. Meropenem có chứa nhóm thio
có ái lực mạnh với kim loại như vàng, có thể hình thành liên kết S-Au thông qua liên
kết cộng hóa trị. Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem được cho trong
Hình 1.2.

Hình 1.2: Công thức cấu tạo và cấu trúc phân tử của meropenem
Meropem thuộc họ kháng sinh β-lactamase, không ổn định về mặt vật lý và hóa
học. Cấu trúc phân tử của meropenem có vòng β-lactam dễ bị mở vòng bởi nhiều tác
nhân như axit-base, ion kim loại, tác nhân oxy hóa và thậm chí là các dung môi như

5


nước, ancol. Meropenem có điểm sôi 627 oC, điểm nóng chảy 191-201oC. Độ ổn định ở
nhiệt độ phòng (khoảng thời gian sự phân hủy dưới 10%) của meropenem là 9h, các
dung dịch chuẩn và mẫu trong các nghiên cứu sau khi pha có thể ổn định trong khoảng
24h khi bảo quản trong tủ lạnh (4oC). Meropenem thường tồn tại dưới dạng bột tinh thể
màu trắng đến vàng nhẹ, tan trong nước, methanol, thực tế không tan trong ethanol 95%
và diethyl ete...
1.3.2. Dược lý và cơ chế tác dụng
1.3.2.1.

Dược lực

Meropenem là một kháng sinh tổng hợp nhóm carbapenem, có cấu trúc và tác dụng
dược lý tương tự các thuốc trong nhóm như imipenem và ertapenem. Khác với
imipenem, meropenem bền vững với tác dụng thủy phân của dehydropeptidase (DHP1) có ở vi nhung mao của tế bào ống lượn gần thận, vì vậy không cần dùng cùng với
chất ức chế DHP-1[3].
1.3.2.2.

Cơ chế tác dụng

Thuốc có tác dụng diệt khuẩn thông qua sự ức chế sinh tổng hợp vách tế bào bằng
cách thấm qua thành tế bào của hầu hết vi khuẩn Gram âm và Gram dương, gắn vào các
protein liên kết penicillin (PBP) và làm bất hoạt các protein này. Thuốc có ái lực mạnh
nhất với PBP 2,3 và 4 của Escherichia và Pseudomanas aeruginosa, PBP 1,2 và 4 của
Staphylococcus aureus.
1.3.2.3.

Phổ kháng khuẩn

Phổ kháng khuẩn của meropenem tương tự imipenem bao gồm hầu hết các vi khuẩn
Gram dương, Gram âm và một số vi khuẩn kỵ khí. Tuy nhiên tác dụng của meropenem
có phần mạnh hơn imipenem trên Enterbacteriaceae và có phần kém hơn imipenem
trên vi khuẩn Gram dương. Nồng độ diệt khuẩn điển hình gấp một hoặc hai lần nồng
độ kìm khuẩn, ngoại lệ với Listeria monocytogenes, nồng độ diệt khuẩn chưa được xác
định. Meropenem bền vững với nhiều loại β-lactamase phổ rộng; nhưng không bền với
tác dụng thủy phân của metallo-beta lactamase [3].
Meropenem có phổ hoạt tính in vitro và trên lâm sàng với các vi khuẩn sau đây:
6


Vi khuẩn Gram dương và hiếu khí không bắt buộc: Streptococcus pneumonia
(chủng nhạy cảm penicillin), S.pyogenes, S. agalactiae, Staphylococcus aureus (kể cả

các chủng tiết β-lactamase, không bao gồm các chủng kháng oxacilin/methicillin),
Enterococcus faecalis (không bao gồm chủng kháng vancomycin) và S.viridans.
Vi khuẩn Gram âm hiếu khí và hiếu khí không bắt buộc: Escherichia coli,
Haemophilus ifnluenzae (kể cả chủng tiết β-lactamase), Klebsiealla pneumonia,
Neisseria meningitides, Proteus mirabilis và Pseudomonas aeruginosa.
Các

vi

khuẩn

kị

khí:

Bacteroides

fragilis,

B.

thetaiotaomicron

và

Peptostreptococcus.
Kháng chéo có thể xảy ra giữa meropenem và các kháng sinh carbapenem khác. Cơ
chế kháng thuốc có thể là: Giảm tính thấm của màng ngoài vi khuẩn gram âm( do giảm
sản xuất porin); giảm ái lực đối với PBP; tăng vận chuyển tích cực thuốc ra ngoài tế
bào vi khuẩn; sản xuất β-lactamase có thể thủy phân các carbapenem. Không có kháng

chéo giữa meropenem và các kháng sinh họ quinolone, aminosid, macrolid và
tetracyclin. Tuy nhiên, một số chủng vi khuẩn có thể kháng nhiều hơn một nhóm kháng
sinh do cơ chế giảm tính thấm màng tế bào và tăng vận chuyển thuốc ra ngoài.
1.3.2.4.

Dược động học

Hấp thu: Meropenem được sử dụng thông qua đường tiêm tĩnh mạch, không hấp
thu qua đường uống. Sau khi tiêm tĩnh mạch 0,5g và 1g meropenem trong 5 phút, nồng
độ đỉnh trong huyết tương đo được lần lượt là 50 và 112 microgam/ml. Nếu truyền trong
30 phút, nồng độ đỉnh thu được tương ứng là 23 và 49 mcirogram/ml [3,31].
Phân bố: Thuốc phân bố rộng rãi trong các tổ chức của cơ thể, bao gồm dịch não
tủy và mật, cơ, da, van tim, dịch phúc mạc, thể tích phân bố của người lớn 15-20 lit, trẻ
em 0,3-0,4 lit/kg. Thuốc liên kết với protein huyết tương khoảng 2%.
Chuyển hóa: Meropenem được chuyển hóa bởi phản ứng thủy phân vòng βlactamase tạo thành chất không có hoạt tính. Các thí nghiệm in vitro đã cho thấy
meropenem bền với enzyme DHP-1 so với imipenem vì vậy meropenem không cần
dùng kèm chất ức chế DHP-1 [3].
7


Thải trừ: Thời gian bán thải trong huyết thanh của thuốc khoảng 1h, kéo dài hơn ở
người suy thận. Độ thanh thải trung bình là 287 ml/phút với liều 250 mg và 205ml/phút
với liều 2g. Meropenem thải trừ chủ yếu nhờ bài tiết qua ống thận và lọc qua cầu thận.
Khoảng 70% liều dùng được tìm thấy ở dạng không đổi trong nước tiểu trong khoảng
12h. Khoảng 2 % liều dùng thải trừ qua phân. Thuốc có thể được loại trừ bởi thẩm tách
máu [3].
1.3.2.5.

Chỉ định

Meropenem được chỉ định cho các trường hợp nhiễm khuẩn gây ra bởi vi khuẩn
Gram âm và Gram dương nhạy cảm với thuốc ở người lớn và trẻ em từ 3 tháng tuổi trở
lên. Bao gồm:
 Viêm phổi (viêm phổi cộng đồng hoặc mắc phải tại bệnh viện)
 Nhiễm khuẩn đường tiết niệu có biến chứng
 Nhiễm khuẩn trong ổ bụng
 Nhiễm khuẩn phụ khoa, như niêm nội mạc tử cung và các bệnh lý viêm vùng
chậu
 Viêm phế quản-phổi ở bệnh nhân xơ hang
 Nhiễm khuẩn trong và sau khi sinh
 Nhiễm khuẩn da và tổ chức dưới da có biến chứng
 Viêm màng não nhiễm khuẩn cấp tính, bệnh nhân sốt do giảm bạch cầu.
 Nhiễm khuẩn huyết
Meropenem đơn hoặc phối hợp với các thuốc kháng khuẩn khác đã được chứng
minh là hiệu quả trong điều trị nhiễm khuẩn hỗn hợp. Chưa có kinh nghiệm sử dụng
thuốc ở trẻ em giảm bạch cầu trung tính hay suy giảm miễn dịch nguyên phát hoặc thứ
phát.
1.3.2.6.

Tác dụng phụ của meropenem

Tác dụng phụ không mong muốn của meropenem thường gặp nhất là chứng rối loạn
tiêu hóa như buồn nôn, nôn và tiêu chảy. Đôi khi xảy ra phản vệ, tăng bạch cầu ưa eosin,
8


nổi mề đay, viêm đại tràng. Động kinh hoặc co giật có thể xảy ra, đặc biệt ở người bệnh
đã từng có tổn thương hệ thần kinh trung ương và/hoặc người suy thận.
Phản ứng tại chỗ tiêm như đau hoặc viêm tĩnh mạch huyết khối có thể xả ra sau khi
tiêm. Người có bệnh dị ứng với những kháng sinh β-lactamase khác có thể có phản ứng

mẫn cảm khi dùng meropenem.
1.4.

Các phương pháp xác định meropenem

1.4.1. Phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký là một trong các phương pháp phổ biến để xác định các chất
có hoạt tính sinh học. Để xác định meropenem chủ yếu sử dụng phương pháp sắc ký
lỏng ghép nối với detector UV, DAD, hoặc MS,.v.v.
Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV,
Thomas Roth và nhóm cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định meropenem trong
huyết tương [38]. Meropenem được tách ra khỏi huyết tương bằng cách tủa protein bằng
methanol, sau đó được tách trên cột SPE sử dụng metanol/nước (7:3, v/v). Pha động sử
dụng đệm TRIS/HCl 100mM (pH 8,5) chứa 15% metanol. Thể tích bơm mẫu 20µl.
Meropenem được phát hiện ở bước sóng 300nm. Khoảng tuyến tính của meropenem
trong phương pháp này từ 10mg/l đến 200mg/l. Phương trình hồi quy tuyến tính có hệ
số r2 > 0,999. Đường cong hiệu chuẩn được xây dựng trong khoảng thời gian hơn 2 tuần
để xác định độ biến thiên của độ dốc đường chuẩn (slope) và hệ số chặn (intercept), kết
quả độ biến thiên là 2% cho thấy độ ổn định và độ chính xác cao. Giới hạn phát hiện
của phương pháp trong huyết tương là 1,06 mg/l.
Nhóm tác giả Liusheng Huang, Janus Haagensen, Davide Verotta, Patricia Lizak,
Francesca Aweeka và Katherine Yang đã xây dựng thành công mô hình mô phỏng
PK/PD cho nhiễm trùng qua màng sinh học và nghiên cứu tính ổn định của meropenem
đồng thời phát triển và xác nhận meropenem trong vi khuẩn bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ LC-MS/MS [24]. Phương pháp LC-MS/MS có
lợi thế là tính chọn lọc cao và thời gian phân tích ngắn, điều này đặc biệt có lợi cho các
thuốc không ổn định như meropenem, chỉ ổn định trong vài giờ tại nhiệt độ phòng. Thời
9

gian chạy trên mỗi mẫu là 6,6 phút. Trên hệ thống API5000, sử dụng chuẩn nội
ceftazidime và thời gian chạy được rút ngắn 1,4 phút. 100µl dịch mẫu được trộn với
dung dịch chuẩn nội ceftazidime, sau đó lọc. Dịch lọc được bơm trực tiếp lên cột C 18
(50x2, 1mm).
Đệm A: dung dịch NH4FA 10mM ở pH=4,0
Đệm B: MeCN trong 0,1% axit formic.
Chương trình Gradient: 7% dung môi B (0-1 phút), từ 7-90% dung môi B (1-2,5 phút),
90% dung môi B ( 2,5-3,5 phút), 90% đến 7% dung môi B( 3,5-6 phút) và 7% dung môi
B ( 3,6-6,6 phút), rửa giải bằng amoni formate (10mM, pH=4) và acetonitrile (chứa
0,1% axit formic), tốc độ dòng 0,3ml/phút. Khoảng tuyến tính xây dựng từ 50-25000
ng/ml, độ chính xác và phần trăm độ lệch chuẩn đều dưới 15% chứng tỏ phương pháp
có độ tin cậy cao, giới hạn định lượng của phương pháp là 50ng/ml.
Trong các phương pháp sắc ký phổ biến hiện nay, sắc ký siêu hiệu năng (UHPLC)
với detector mảng diode là một phương pháp ít tốn kém hơn khối phổ đồng thời cải
thiện được độ phân giải, thông lượng và độ nhạy so với phương pháp HPLC-UV thông
thường. Dựa trên những ưu điểm đó, nhóm nghiên cứu của Gregori Casals đã xây dựng
quy trình định lượng meropenem trong huyết tương người bằng phương pháp sắc ký
lỏng siêu hiệu năng UHPLC sử dụng detector mảng diode [15]. Pha động : dung dịch
đệm chứa Na2HPO4.2H2O 0,1M, chỉnh pH=7 bằng H3PO4 85%, hòa trộn với methanol
(chiếm 13% pha động). Tốc độ dòng 0,25ml/phút, nhiệt độ cột được đặt 30oC. Hiệu quả
của cột tách được theo dõi bằng một detector mảng diode trong khoảng 270-320nm,
định lượng meropenem ở bước sóng 295nm. Dung dịch làm việc được chuẩn bị bằng
cách hòa tan dung dịch trung gian trong đệm MES (MES 1M, pH=6) và 20 µg/ml chuẩn
nội ceftazidime. Tương tự đối với dung dịch mẫu 100µl chuẩn nội (20 µg/ml) được
thêm vào hỗn hợp chứa 100 µl đệm MES với 100 µl mẫu huyết tương. Sau đó thêm 500
µl acetonitrile, ly tâm 13000 vòng trong 5 phút, phần dịch nổi phía trên được chuyển
sang lọ thủy tinh hình nón và bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ ở 37oC. Phần dư được
hoàn nguyên trong 200 µl dung dịch đệm MES, ly tâm 1000 vòng trong 10 phút. Chất
10

nổi trên bề mặt được chuyển sang vial thủy tinh, tiêm 7 µl vào cột. Đường chuẩn được
xây dựng từ 0,5-100 µg/ml. Giới hạn dưới của định lượng là 0,5 µg/ml và giới hạn trên
của định lượng là 100 µg/ml. Độ lệch chuẩn tương đối không vượt quá 15%.
Jens Martens Lobenhoffer và nhóm nghiên cứu của mình đã nghiên cứu ứng dụng
phương pháp HILIC- khối phổ để định lượng meropenem trong huyết tương người [28].
Chuẩn bị mẫu chỉ bao gồm thêm đệm, bổ sung chất nội chuẩn, kết tủa protein và ly tâm.
Do đó thời gian phân tích rất nhanh, nhờ độ nhạy cao của khối phổ, có thể phân tích
mẫu huyết tương thấp cỡ 10 μl. Cột sắc ký Hypersil GOLD HILIC được áp dụng trong
phương pháp là vật liệu trên nền silica với lớp phủ polyethylenimide, cho thời gian lưu
của meropenem là 4,17 phút. Khoảng nồng độ tuyến tính của meropenem thu được là
khoảng 1 μg/ml – 50 μg/ml; hệ số tương quan R = 0.9997, giá trị LOQ là 1 μg/ml.
1.4.2. Phương pháp điện hóa
Ali K.Attia và cộng sự đã phát triển và xây dựng phương pháp vonampe sóng vuông
(SWV) sử dụng điện cực biến đổi hóa học để xác định nồng độ meropenem trong mẫu
huyết tương [13]. Điện cực biến đổi hóa học này được điều chế từ 15mg MWVNTs 3%,
485mg than chì, 0,3 ml dầu prafin. Khi sử dụng điện cực làm việc này với điều kiện độ
rộng xung 50ms, độ cao xung 25mV, tốc độ quét 50mVs, khoảng nồng độ tuyến tính
thu được của meropenem nằm trong khoảng từ 2,5.10-8 mol/l đến 8,0.10-6 mol/l, giới
hạn phát hiện (LOD) đạt 2,9.10 -9 mol/l. Với phương pháp này có thể xác định được
đồng thời linezolid, meropenem, theophylline trong mẫu huyết tương. Phương pháp này
đã được sử dụng để đo mẫu huyết tương của các tình nguyện viên sau khi sử dụng thuốc
60 phút, cho kết quả với độ lặp lại và độ chính xác cao, hàm lượng linezolid đạt
3,58.10-5 mol/l, meropenem: 2,83.10-5 mol/l, theophylline: 3,41.10-5 mol/l.
1.4.3. Phương pháp điện di mao quản
Phương pháp điện di mao quản là một phương pháp mới để phân tích meropenem.
Phương pháp có ưu điểm hơn so với phương pháp sắc ký lỏng (LC) trong việc chuẩn bị
mẫu. Thông thường, để xác định meropenem trong huyết tương bằng LC đều phải kết
tủa thành phần protein trước khi đo. Hơn nữa, phương pháp này có độ lặp lại, độ nhạy
11

cao, lượng mẫu yêu cầu thấp với thời gian phân tích tương đối ngắn.
Nhóm nghiên cứu của Yahya Mrestani thực hiện nghiên cứu ứng dụng phương pháp
điện di mao quản có độ nhạy cao (CZE) sử dụng detector UV để xác định meropenem
trong dung dịch nước và mẫu sinh học (nước tiểu, huyết tương) [33].
Khi xác định meropenem trong nước bằng cách sử dụng mao quản tiêu chuẩn và
mao quản có độ nhạy cao, kết quả cho thấy rằng, việc sử dụng mao quản độ nhạy cao
cải thiện giới hạn phát hiện khoảng 10 lần so với mao quản tiêu chuẩn.
Với mẫu huyết tương, meropenem được xác định ở pH = 7,2 và được phân tích định
lượng ở hai bước sóng là 200nm và 303nm. Các thành phần của huyết tương hấp thụ
UV ở 200nm vì thế meropenem có thể được xác định trực tiếp ở bước sóng 303nm. Để
đo meropenem trong huyết tương, các mẫu được pha loãng trong nước với tỉ lệ 1:4. Ở
bước sóng này, kết quả của điện di đồ cho thấy meropenem được tách hoàn toàn ra khỏi
các thành phần của huyết tương. Khoảng tuyến tính của phương pháp từ 0,5200µg/ml,giới hạn phát hiện trong huyết tương thông qua đo trực tiếp ở bước sóng
303nm là 4µg/ml, độ lệch chuẩn tương đối của thời gian di chuyển là 5% và của vùng
cực đại là 4% ở nồng độ 10µg/ml. Đường chuẩn có phương trình tuyến tính (y = 10.1x
+ 20.1) với hệ số tương quan là 𝑅 2 = 0,999. Độ thu hồi trung bình từ các mẫu là 98,6%
(n = 4) ở nồng độ meropenem là 5 mg/ml và 97,8% (n = 4) ở nồng độ 50 mg ml so với
các dung dịch chuẩn meropenem có nồng độ tương đương.
Đối với mẫu nước tiểu, mẫu được pha loãng trực tiếp trong dung dịch đệm và được
tiêm mà không cần chuẩn bị mẫu phức tạp. Giới hạn phát hiện trong mẫu nước tiểu là
0,3µg/ml, độ lệch chuẩn tương đối là 2,0%.
Toshihiro Kitahashi và Itaru Furuta đã phát triển phương pháp xác định meropenem
trong huyết thanh bằng cách tiêm trực tiếp huyết thanh vào mao quản mà không cần các
bước tiền xử lý [26]. Meropenem được phát hiện ở bước sóng 297nm. Dung dịch đệm
được sử dụng là natritetraborate 25mM, NaOH 0,1M chứa natridodecyl sulphate
90mM, pH=10. Thời gian di chuyển của meropenem là 7,2 phút; LOD=2,0mg/l. Độ
lệch chuẩn tương đối giữa các ngày và độ chính xác lần lượt : 3,43-8,87 % và 4,2812

8,54%. Hiệu suất thu hồi đạt 94-111% và 92-105%.
Phương pháp cho phép phân tích nhanh chóng, kết quả đáng tin cậy và tính kinh tế
cao, giảm lượng máu cần thu gom và giảm đáng kể chất thải lỏng phát sinh từ quá trình
phân tích. Hệ thống phân tích hoạt động dễ dàng vì được thực hiện hoàn toàn tự động,
hầu như không có sự sai số giữa các phép đo vì không cần trải qua bước tiền xử lý mẫu.
Các phương pháp xác định meropenem cùng với các thông tin về điều kiện xử lý
mẫu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện được cho trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2.Một số nghiên cứu xác định meropenem
Tên phương

Điều kiện xử lý

pháp

mẫu

Khoảng tuyến tính

LOD

TLTK

10 mg/l-200mg/l

1,06 mg/l

[38]

Meropenem được

tách

khỏi

huyết

Sắc ký lỏng

tương bằng cách

hiệu năng cao

tủa protein sử dụng

detector

metanol,

sau

đó

UV(HPLC/UV) được chiết trên cột
SPE bằng metanol/
nước (7:3,v/v).
100µl

dịch

mẫu

được ly tâm với
Sắc ký lỏng
ghép nối khối
phổ (LCMS/MS)

100µl chuẩn nội
(ceftazidime)
10000

vòng/phút

50-2500 ng/ml

trong 4 phút. Dịch
sau ly tâm được
bơm vào hệ LCMS/MS.

13

15,2
ng/ml

[24]