XÁC ĐỊNH đột BIẾN GEN FGFR TRÊN BỆNH NHÂN u NGUYÊN bào THẦN KINH đệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ

..........***..........

PHẠM THỊ KIM HUYỀN

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN FGFR TRÊN BỆNH NHÂN
U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2012 - 2016

HÀ NỘI – 2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ


TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
..........***..........

PHẠM THỊ KIM HUYỀN

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN FGFR TRÊN BỆNH NHÂN
U NGUYÊN BÀO THẦN KINH ĐỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA
KHÓA 2012 - 2016

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. TRẦN VÂN KHÁNH

HÀ NỘI – 2016
LỜI CẢM ƠN


Trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận, em đã
nhận được rất nhiều sự hỗ trợ, giúp đỡ nhiệt tình từ các thầy cô, anh chị, gia
đình và bạn bè.
Trước hết em xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới
PGS.TS.Trần Vân Khánh, cô đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn chi tiết em thực
hiện đề tài nghiên cứu cũng như đưa ra những ý kiến góp ý, bài học quý báu,
giúp em sửa chữa và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn GS.TS. Tạ Thành Văn - Giám đốc Trung
tâm Nghiên cứu Gen-Protein, PGS.TS. Trần Vân Khánh - Phó Giám đốc
Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trưởng bộ môn Bệnh học phân tử,
là người thầy, người cô đã tạo cho em mọi điều kiện, quan tâm, giúp đỡ em và
các bạn trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận.
Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Trường Đại Học Y Hà
Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này.
Em xin cảm ơn các anh chị tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein,
Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ em rất nhiều để hoàn thành tốt khóa
luận. Đặc biệt, em xin cảm ơn CN. Trần Quốc Đạt, làm việc tại trung tâm
nghiên cứu Gen-Protein, anh là những người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình
cho em những kỹ thuật, chia sẻ cho em nhiều kinh nghiệm trong quá trình
thực hiện khóa luận.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới tất cả người thân trong gia
đình, những bạn bè đã quan tâm, động viên, chia sẻ mọi khó khăn với em

trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Phạm Thị Kim Huyền

MỤC LỤC



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DNA
A
T
G
C
dNTP
ddNTP
PCR
RFLP
OD
TE
Kb
MAPK
PI3K
PLC-γ
HPSGs
TACC3
FRS2
FGF

FGFR
EGFR
TMZ
NST
SDS
TBE
EDTA
PDGFR

Deoxyribose nucleic acid
Adenine
Thymine
Guanosine
Cytosine
Deoxyribonucleotid-5-triphosphat
Dideoxyribonucleotid-5-triphosphat
Polymerase Chain Reaction
Restriction Fragment Length Polymorphism
Optical Desity (Độ hấp thụ quang)
Tris EDTA
Kilo base
Mitogen Activated Protein Kinase
phosphoinositide-3-kinase
phospholipase C-gamma
heparin sulfate proteoglycan
Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3
FGFR substrate 2
Fibroblast growth factor
Fibroblast growth factor receptor
Epidermal Growth Factor Receptor

Temozolomide
Nhiễm sắc thể
Sodium Derecyl Sylfat
Tris- Boric acid-EDTA
Ethylen Diamin Tetra Acetic
Platelet-Derived Growth Factor Receptor

DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH


7

ĐẶT VẤN ĐỀ
U não là những khối u được hình thành do quá trình phân chia không
kiểm soát được của tế bào thần kinh trong não. Đây là căn nguyên gây tử
vong đứng thứ 2 ở trẻ em (sau bệnh bạch cầu cấp) và đứng thứ 3 ở người
trưởng thành. U não ác tính nguyên phát chiếm tỷ lệ thấp trong các loại u não
nhưng có tỷ lệ tử vong cao. U nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) là
dạng thường gặp nhất của u não nguyên phát và được xếp vào loại ác tính
nhất (độ IV) với tỷ lệ mắc mới khoảng 3.19/100.000 người.
Hiện nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các phương tiện chẩn
đoán hiện đại cho phép xác định được chính xác vị trí, kích thước khối u, mức
độ xâm lấn, chèn ép não… giúp cho các bác sỹ lâm sàng đưa ra được phác đồ
điều trị tối ưu nhất cho bệnh nhân. Các phương pháp điều trị glioblastoma phổ
biến bao gồm phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, miễn dịch… nhưng hiệu quả chưa
cao, thời gian sống sau điều trị còn ngắn. Với sự phát triển của y học hiện đại,
một phương pháp điều trị mới ra đời với mong muốn giúp kéo dài thời gian

sống cho bệnh nhân, đó là liệu pháp điều trị đích. Liệu pháp điều trị đích này
có khả năng tác động đến thụ thể trên màng tế bào có hoạt tính tyrosin kinase
gây ức chế con đường tín hiệu nội bào, ngăn chặn quá trình tăng sinh, di căn
và xâm lấn của tế bào ung thư.
Gen FGFR là thụ thể yếu tố phát triển nguyên bào sợi mã hóa cho
protein nằm trên màng tế bào và có hoạt tính tyrosin kinase, protein này tham
gia vào hoạt hóa con đường tín hiệu nội bào và được điều hòa nhờ sự bắt cặp
phối tử đặc hiệu, kết quả là sự tăng sinh, xâm lấn, di căn và chết theo chương
trình của tế bào. Đột biến gen này liên quan đến cơ chế bệnh sinh của nhiều
loại ung thư như ung thư bang quang, ung thư vú, tuyến tiền liệt… trong đó
có glioblastoma. Việc xác định đột biến gen FGFR đóng vai trò quan trọng
quyết định tính đáp ứng với thuốc điều trị đích.


8

.Tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào xác định đột biến gen FGFR
quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị đích bệnh glioblastoma. Vì vậy
đề tài “ Xác định đột biến gen trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh
đệm” được thực hiện với 2 mục tiêu chính:
1. Hoàn thiện quy trình xác định đột biến gen FGFR trên mẫu bệnh
phẩm đúc paraffin.
2. Bước đầu xác định một số đột biến trên gen FGFR ở bệnh nhân u
nguyên bào thần kinh đệm.


9

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

1. Đại cương bệnh u nguyên bào thần kinh đệm.
U nguyên bào thần kinh đệm (glioblastoma) còn gọi là u tế bào hình
sao độ III- IV, có thể tiên phát nhưng cũng có thể chuyển biến từ độ I, II. Đó
là khối u ác tính, tại chỗ, không di căn xa, thường tái phát sau khi lấy toàn bộ
khối u [1].
1.1. Dịch tễ học
Glioblastoma đại diện cho khối u não ác tính phổ biến nhất trên thế giới
(độ IV) chiếm 60-70% các u thần kinh đệm ác tính, phổ biến ở độ tuổi từ 4670 và trẻ em, chẩn đoán cho thấy ở nam gặp nhiều hơn nữ [2]. Theo báo cáo
mới nhất của trung tâm ung thư não Hoa Kỳ tỷ lệ glioblastoma khoảng
3.19/100.000 người [3]. Mặc dù sử dụng các phương thức điều trị chuyên sâu
(phẫu thuật, hóa trị, xạ trị) nhưng tỷ lệ sống dưới 5 năm vẫn còn ở mức dưới
5%, thời gian sống trung bình của bệnh nhân glioblastoma khoảng 12-15
tháng [4]. Theo nghiên cứu của Baker và cộng sự năm 1976, tỷ lệ mắc u
nguyên bào thần kinh đệm ở Anh và Thụy Điển lần lượt là 7,53/100000 dân,
4,2/100000 dân.
Tại Việt Nam: Theo nghiên cứu của Lê Xuân Trung và Nguyễn Như
Bằng năm 1975, tỷ lệ glioblastoma chiếm 8% u não [5]. Theo nghiên cứu của
Hoàng Minh Đỗ(2009), tỷ lệ glioblastoma chiếm 17,2% u thần kinh đệm [6].
1.2. Yếu tố nguy cơ
Theo Hội ung thư não Hoa Kì, nguyên nhân của những khối u não chưa
được biết rõ. Các nhà khoa học cho thấy việc tiếp xúc với một số yếu tố làm
tăng nguy cơ mắc ung thư não như:


10

Yếu tố môi trường, nghề nghiệp: Nghiên cứu cho thấy việc tiếp xúc
với các hóa chất làm tăng nguy cơ ung thư não. Các chất trong một số nghề
nghiệp sản xuất nhựa, chất dẻo như formaldehyde, vinyl chloride,
acrylonitrile hoặc trong nông nghiệp do tiếp xúc với thuộc trừ sâu đều có

nguy cơ cao mắc bệnh ung thư não. Ngoài ra việc tiếp xúc với tia phóng xạ
trong ngành công nghiệp hạt nhân hoặc điều trị bằng xạ trị đều có khả năng
cao mắc ung thư não.
Yếu tố nhân khẩu học:
-Tuổi: Thường gặp ở người trưởng thành từ 46-74 tuổi và gặp ở trẻ em
với tỷ lệ cao.
- Giới: Ở nam gặp nhiều hơn nữ.
- Chủng tộc: nghiên cứu cho thấy người da trắng có tỷ lệ mắc
glioblastoma cao hơn những người thuộc chủng tộc khác.
Yếu tố di truyền: một số rối loạn di truyền làm tăng nguy cơ mắc ung
thư não như: bệnh Von Hippel-Lindau, xơ cứng củ, hội chứng Li-Fraumeni,
hội chứng Turcot, hội chứng Klinefelter… Những nghiên cứu gần đây cho
thấy một số biến đổi về gen như đột biến gen áp chế khối u P53 hoặc gen sinh
ung thư như EGFR, PDGFR, FGFR… làm tăng nguy cơ mắc glioblastoma so
với những người không mang đột biến [7].
1.3. Chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng
1.3.1 Chẩn đoán lâm sàng
Vì u nguyên bào thần kinh đệm là một dạng của u não nguyên phát, có
thể gặp ở mọi vị trí của não bộ, do đó triệu chứng lâm sàng nằm trong bệnh
cảnh chung của u não. Các u não nói chung có hai triệu chứng lâm sàng:
- Hội chứng tăng áp lực nội sọ.
+ Đau đầu: là triệu chứng phổ biến nhất của u não chiếm 50-60%, đau
đầu dai dẳng tăng dần, đôi khi có từng cơn ngắn, đặc biệt tăng về ban đêm và
gần sáng, đau có đáp ứng với thuốc giảm đau giai đoạn đầu nhưng sau đó đáp


11

ứng kém hoặc không đáp ứng. Đau đầu có thể khu trú hoặc toàn bộ đầu.
Nguyên nhân đau đầu là do sự chèn ép của u não với tổ chức vùng đáy sọ,

xoang tĩnh mạch và màng cứng [8].
+ Nôn hoặc buồn nôn: thường xuất hiện muộn hơn đau đầu, có khi xuất
hiện cùng với đau đầu. Nôn không liên quan đến yếu tố ăn uống hay sinh lý
khác. Do tăng áp lực nội sọ kích thích các thụ cảm ở não thất IV. Vì vậy u ở
thân não, tiểu não đè trực tiếp vào trung tâm nôn, biểu hiện bằng “nôn vọt”
thường gặp ở trẻ em [8].
+ Phù gai thị: là triệu chứng khách quan nhất của u não khi có sự tăng
áp lực trong sọ. Phù gai thị thường xuất hiện sau đau dầu và tùy theo vị trí của
u não 12 gây đè ép, xâm lấn ảnh hưởng đến lưu thông dịch não tủy mà phù
gai thị có sớm hay có muộn. Biểu hiện là mờ bờ gai, phù gai thị, xuất huyết
gai thị cuối cùng là teo gai thị gây mất thị lực. Phát hiện phù gai thị bằng soi
đáy mắt [8].
+ Động kinh: gặp khoảng 30% u não, chủ yếu u ở trên lều tiểu não.
Những cơn động kinh từng phần (cục bộ) hoặc toàn bộ [8]. Rối loạn tâm thần:
thay đổi tính tình, hay cáu gắt, trầm cảm, chậm chạp và giảm trí nhớ cũng
thường gặp trong u não [8].
-

Triệu chứng liên quan đến vị trí của khối u.

+ Vùng thái dương: rối loạn ngữ do u ở cùng tiếng nói (Broca, Wernicke)
+ Vùng trán: rối loạn tâm thần, thờ ơ, lạnh đạm,chậm chạp.
+ Vùng chẩm: hiện tượng bán manh.
+ Rối loạn vận động hoặc rối loạn cảm giác nửa người hoặc khu trú ở mặt, ở
cánh tay hay ở chân.
Khi có triệu chứng lâm sàng trên để khẳng định rõ và giúp cho việc điều
trị hiệu quả, chẩn đoán lâm sàng là bước quan trọng và quyết định hướng trị liệu.
1.3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng

12

a. Chẩn đoán hình ảnh
Chẩn đoán hình ảnh trong xác định u não đóng vai trò quan trọng hỗ trợ
cho việc chẩn đoán và điều trị khối u não, gồm một số kỹ thuật:
- Chụp động mạch não: Phương pháp này cho hình ảnh tốt, làm cơ sở
cho việc chẩn đoán và quyết định thái độ xử trí. Chụp mạch máu não cho thấy
những hình ảnh đặc biệt của một khối u choán chỗ, hình ảnh tăng sinh và xô
dẩy mạch mãu trong não.
- Chụp cắt lớp vi tính: là kỹ thuật dùng nhiều tia X – quang quét lên một
khu vực của cơ thể theo lát cắt ngang phối hợp với xử lý bằng máy vi tính để có
được hình ảnh 2 chiều hoặc 3 chiều của bộ phận cần chụp. Đây là phương pháp
cho phép chụp hàng loạt hình rõ và phát hiện chính xác các khối u.
- Chụp cộng hưởng từ (MRI): Phát hiện những tổn thương mà chụp cắt
lớp vi tính không phát hiện được, như những khối u có kích thước nhỏ hoặc
những vùng khó xác định như ở vùng hố sau hay những vùng tổn thương có
tỷ trọng không rõ ràng khó xác định trên chụp cắt lớp vi tính.
Tổn thương u nguyên bào thần kinh đệm trên MRI thường lan rộng
xâm lấn các tổ chức xung quanh, bờ u không rõ, dấu hiệu choán chỗ mạnh
hơn, tín hiệu có dạng tăng – giảm hỗn hợp trên cả T1 và T2. Tính hỗn độn của
tín hiệu tăng lên do những ổ hoại tử trong u gây ra, có thể gặp ổ kén trong u.
Trong u có thể thấy những ổ chảy máu với thời điểm khác nhau cho tín hiệu
khác nhau trên ảnh T1 và T2 [5].


13

Hình 1.1: Hình ảnh chụp cộng hưởng từ glioblastoma
( />
Giá trị của chụp cắt lớp vi tính, đặc biệt là cộng hưởng từ đóng vai trò

quyết định trong chẩn đoán u thần kinh đệm. Với độ chính xác 98,5% đối với
chụp cắt lớp vi tính và 100% đối với cộng hưởng từ trong việc xác định vị trí,
kích thước, ranh giới khối u trở nên dễ dàng. Hình ảnh u thần kinh đệm trên
phim chụp cắt lớp vi tính, cộng hưởng từ giúp các bác sĩ lâm sàng chỉ định
phẫu thuật và tiên lượng được mức độ ác tính của bệnh.
- Chụp cắt lớp tán xạ (PET-CT): Phương pháp này cho phép phát hiện
khối u ung thư cũng như theo dõi sự tái phát ung thư, đánh giá kết quả của các
phương pháp điều trị. Ghi hình khối u bằng PET-CT có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao hơn nhiều so với các phương pháp chẩn đoán hình ảnh khác, đặc biệt
là khả năng phát hiện các khối u ở giai đoạn rất sớm khi mà các phương pháp
chẩn đoán khác chưa phát hiện thấy..
b. Chẩn đoán mô bệnh học:
Phương pháp chẩn đoán mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng phát hiện sự
hiện diện của khối u và có thể cung cấp thông tin chẩn đoán trong khi phẫu
thuật trong vòng một giờ, nhưng thường được giới hạn ở số lượng mẫu xét
nghiệm. Nguyên lý của phương pháp này dựa vào sự thay đổi hình thái tế bào,
sự hiện diện của các mạch máu bất thường trong mô được chẩn đoán.


14

.
Hình 1.2: Hình ảnh mô bệnh học glioblastoma
( />
1.4. Điều trị
Điều trị khối u trong não dựa trên 3 mục đích sau:
- Chống phù não do áp lực nội sọ.
- Dự phòng các cơn động kinh.
- Điều trị nguyên nhân, gồm 3 giai đoạn: phẫu thuật, hóa trị, xạ trị.
Phẫu thuật cắt bỏ khối u là tiêu chuẩn cho việc điều trị nhằm mục đích loại bỏ

khối u để giảm các triệu chứng lâm sàng [9]. Hóa trị là sử dụng thuốc chống
ung thư để tiêu diệt các tế bào ung thư hoặc ngăn chặn sự phân chia của
chúng. Xạ trị là phương pháp sử dụng bức xạ ion hóa và tia X có tia năng
lượng cao để diệt tế bào ung thư, làm cho các tế bào ung thư không còn khả
năng sinh sản. Điều trị u não có thể phẫu thuật đơn độc hoặc kết hợp xạ trị,
hóa trị giúp kéo dài thời gian sống thêm cho bệnh nhân [10],[11]. Ngày nay
xạ trị sau phẫu thuật cùng với kết hợp điều trị bằng TMZ là tiêu chuẩn vàng
cho điều trị glioblastoma [12],[13] . Mặc dù đã tối ưu hóa phương thức điều
trị nhưng thời gian sống 5 năm của bệnh nhân vẫn nhỏ hơn 5%.
Trong những năm gần đây, với sự phát triển của y học hiện đại nhiều
phương pháp mới trong điều trị ung thư đã được ứng dụng và đem lại hiệu
quả vượt trội. Một trong số đó là liệu pháp điều trị trúng đích, thế hệ thuốc


15

này có khả năng tác động đến các đích phân tử có vai trò quan trọng trong cơ
chế bệnh sinh ung. Phương pháp này được kỳ vọng có thể kéo dài thời gian
sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên để điều trị đích có hiệu quả, việc xác định đột
biến gen liên quan đến tính đáp ứng thuốc đóng vai trò quan trọng quyết định
thành công của phương pháp [14],[15].
1.2. Gen FGFR và đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
1.2.1. Vị trí và cấu trúc của gen FGFR
Gen FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor) mã hóa cho protein có
chức năng thụ thể màng tế bào có nguồn gốc biểu mô, trung mô. Các protein
này đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình phát triển và trưởng thành tế
bào. [16] [19]. Họ gen FGFR gồm bốn thành viên: FGFR1, FGFR2, FGFR3,
FGFR4. Trong đó, gen FGFR1 nằm trên nhánh ngắn của NST số 8, ở giữa vị
trí p11.22 và p11.23, dài 57 kb bao gồm 24 exon và mã hóa cho protein chứa
822 acid amin (Hình 1.2A). Gen FGFR3 nằm trên nhánh ngắn của NST số 4,

ở vị trí 4p16.3 dài 15kb bao gồm 19 exon, mã hóa cho protein chứa 806 acid
amin (Hình 1.2B). Gen FGFR1 và FGFR3 đều được xếp vào nhóm gen tiền
sinh ung thư (pro-oncogen).
A

B

Hình 1.3: A. Vị trí của gen FGFR1 trên NST
B. Vị trí của gen FGFR3 trên NST
(Nguồn: />

16

Mỗi gen FGFR gồm một vùng ngoại bào, một vùng xuyên màng và
một vùng nguyên sinh chất. Vùng ngoại bào chứa 3 immunoglobulin – Ig cụ
thể IgI, IgII và IgIII, giữa IgI và IgII chứa chiều dài của tám hộp acidic liên
tiếp nhau, vùng tận cùng của thụ thể chứa IgI và hộp acid có chức năng ức
chế thụ động, vùng IgII và IgIII cần thiết cho sự bắt cặp phối tử. Vùng nội
bào chứa một vùng tyrosine kinase và một đầu tận carboxy [16] (Hình 3A).Vùng ngoại bào chứa yếu tố phát triển nguyên bào sợi FGF, FGF tiết ra
glycoprotein làm ổn định sự tương tác lẫn nhau của phối tử với thụ thể FGF
nhờ protease [17].

Hình 1.4: Cấu trúc gen FGFR
(Nguồn: />
- TACC3 (Transforming, Acidic Coiled-Coil Containing Protein 3) là
một protein thuộc họ TACC. TACC3 nằm trên nhánh ngắn của NST số 4, dài
23 kb bao gồm 18 exon, mã hóa cho protein chứa 838 acid amin.

Hình 1.5: Vị trí của TACC3 trên NST số 4
(Nguồn: />

17

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng TACC3 đóng một vai trò quan
trọng trong việc duy trì cấu trúc vi ống [18]. Những biến đổi cấu trúc của gen
TACC3 được biết đến là nguyên nhân gây bệnh glicosarcoma và
glioblastoma.
1.2.2. Chức năng, cơ chế gây bệnh của gen FGFR.
a. Chức năng
Gen FGFR mã hóa cho protein FGFR có hoạt tính tyrosine kinase,
hoạt tính này đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển phôi, sự tăng sinh,
hình thành mạch, sự di căn và chu quá trình chết tự nhiên của tế bào [16].
Nhiều nghiên cứu cho thấy sự biến đổi gen FGFR có liên quan đến cơ chế
bệnh sinh gây ung thư não, trong đó có glioblatoma. Vì vậy FGFR trở thành
đích nhắm trong điều trị đích glioblastoma [13].
b. Cơ chế
Hoạt động của gen FGFR kích thích nhiều con đường tín hiệu nội bào
phức tạp, được điều hòa và hoạt hóa nhờ sự bắt cặp của phối tử đặc hiệu. Hai
con đường tín hiệu chính được kích hoạt bởi FGFR là RAS/MAPK và
PI3K/AKT, ngoài ra còn có PLC-γ , PKC. Ngay sau khi được hoạt hóac, vùng
nội bào FGFR sẽ tự phosphoryl hóa, khởi đầu một dòng thác tín hiệu lan tỏa
khắp tế bào gây kích thích quá trình tăng sinh, sự hình thành thành mạch, sự
di căn và ức chế quá trình chết của tế bào. Trong tế bào bình thường, sự hoạt
hóa FGFR cần thiết cho nhiều chức năng quan trọng của tế bào như quá trình
tăng sinh và sự biệt hóa tế bào. Tuy nhiên, sự hoạt hóa FGFR quá mức không
phụ thuộc vào sự hiện diện của phối tử vẫn có thể dẫn đến sự tăng sinh bất
thường cũng như sự chuyển dạng ác tính [16] (Hình 1.3-). Có nhiều cơ chế
dẫn đến sự bất thường của gen FGFR như sự khuếch đại quá mức của gen
FGFR, đột biến điểm, sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể dẫn đến sự dung hợp
gen… Khi có sự bất thường về gen FGFR thì các quá trình trên bị mất kiểm

18

soát, dẫn đến sự hình thành các khối u như ung thư vú, ung thư cổ tử cung,
ung thư tyến tiền liệt, ung thư dạ dày… trong đó có gliobastoma. Do FGFR
đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung thư nên FGFR trở thành đích
nhắm tiềm năng cho các thế hệ thuốc điều trị mới ung thư [19].
1.2.3. Đột biến gen FGFR gây bệnh u nguyên bào thần kinh đệm
1.2.3.1. Đột biến gen FGFR1
Gen FGFR khi đột biến sẽ mã hóa cho protein mới có khả năng kích
hoạt con đường tín hiệu xuôi dòng bất kể có hay không có sự hoạt hóa của thụ
thể FGF. Đột biến gen FGFR xảy ra tại vùng tyrosine kinase được chứng
minh đóng một vai trò quan trọng trong quá trình tiến triển của ung thư và tạo
nguy cơ kháng thuốc ức chế FGFR của khối u [19]. Theo nghiên cứu của
Vikki Rand và cộng sự đã xác định hai đột biến soma mã hóa thay đổi miền
kinase trong glioblastoma. Hai đột biến trên gen FGFR1 là đột biến điểm xảy
ra trên exon 12 tại vị trí N546K thay thế acid amin Asparagine (AAC) thành
Lysin (AAA) và exon 13 tại vị trí R576W thay thế Arginine (CGG) thành
Tryptophan (TGG) [20].


19

Hình 1.6: Đột biến FGFR1 trong glioblastoma
(Nguồn: />
1.2.3.2. Dung hợp gen FGFR3-TACC3
Sự dung hợp của gen FGFR3 với gen TACC3 đã được mô tả trong cơ
chế bệnh học của glioblastoma, ung thư biểu mô bàng quang, ung thư phổi và
ung thư cổ tử cung… Sử dụng kỹ thuật PCR để khuếch đại các vùng trên gen

trên NST số 4 cho thấy sự dung hợp gen tại vị trí 1,808,966 của FGFR3 và
1,737,080 của TACC3. Sự xóa đoạn của exon 17 trên gen FGFR3 và intron 7
trên gen TACC3 dẫn đến sự thay đổi trong quá trình ghép nối, trong đó exon
16 của gen FGFR3 được ghép nối với exon 8 của gen TACC3.
Theo nghiên cứu của Devendra Singh và cộng sự trên một nhóm nhỏ
bệnh nhân cho thấy khoảng 3,1% glioblastoma là do sự hợp nhất gen FGFR
và TACC [21].


20

Hình 1.7: Dung hợp gen FGFR3-TACC3 trên NST số 4
(Nguồn: />
3. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen FGFR
3.1. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại
nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp
PCR được Kary Mullis phát minh năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988,
kỹ thuật này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu Y- Sinh
học. Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính và hồi
tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA
polymerase. Với nguyên liệu là bốn loại nucleotide,enzyme DNA polymerase
xúc tác tổng hợp một mạch DNA mới từ DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi sự có
mặt của mồi xuôi, mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự
DNA khuôn.
Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi
chu kỳ gồm 3 giai đoạn: bến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi.


21

* Giai đoạn biến tính: Trong một phản ứng bao gồm các thành phần cần
thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm
(nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94-95ºC trong vòng 30 giây – 1
phút. Bước này DNA sợi kép tách thành DNA sợi đơn.
* Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp
với khuôn dao động khoảng 40-70ºC, tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng
và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút.
* Giai đoạn kéo dài chuỗi: Nhiệt độ được tăng lên 72ºC để cho DNA
polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase,
Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. thời gian phụ thuộc vào trình
tự DNA cần khuếch đại, thường từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ, các đoạn DNA được tổng hợp sẽ dùng làm khuôn cho
sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo. Như vậy sản phẩm của phản
ứng tăng theo cấp số nhân sau mỗi chu kỳ, sau n chu kỳ số lượng DNA thu được
sẽ là bản copy. Tuy nhiên, thông thường hiệu suất sẽ không đạt 100% vì vậy
chúng ta tiến hành chạy 25-40 chu kỳ tùy nồng độ và mục đích cần khuếch đại
DNA.
Kết quả là từ một lượng nhỏ DNA khuôn ban đầu, ta thu được một
lượng lớn DNA. Song điều đó cũng có nghĩa trong quá trình tiến hành chỉ cần
nhiễm một lượng nhỏ DNA ngoại lai cũng dẫn đến sự thất bại của phản ứng.


22

Hình 1.8: Các bước cơ bản của kỹ thuật PCR
(Nguồn: />
3.2. Kỹ thuật scorpion ARMS
Kỹ thuật scorpion ARMS ( Scorpion Amplification Refractory
Mutation System) là sự kết hợp đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ

Scorpion trong phản ứng real-time PCR để phát hiện cac đột biến. Trong đó
nguyên lý khuếch đại đặc hiệu alen đột biến là dựa vào đặc tính Taq DNA
polymerase chỉ khuếch đại hoàn chỉnh một phân tử DNA một khi đầu 3’ của
mồi và khuôn bổ sung hoàn toàn với nhau. Khi đầu 3’ của mồi không bổ sung
với sợi khuôn phản ứng PCR bị ức chế hoàn toàn. Dựa trên nguyên lý này, kỹ
thuật cho phép khuếch đại đặc hiệu một trình tự đột biến ngay cả trong trường
hợp alen đột biến chiếm một tỷ lệ nhỏ (1%) trong tổng số sợi khuôn DNA.
Scorpion là phân từ có một đầu mang trình tự của đoạn mồi đặc hiệu
với alen đột biến cần khuếch đại, đầu trình tự này được nối với một đầu dò.
Phần kích thích phát tín hiệu huỳnh quang của đầu dò được gắn với phần ức
chế có nhiệm vụ dập tắt tín hiệu huỳnh quang của phần kích thích. Trong phản
ứng PCR khi đầu dò bám với trình tự khuếch đại phần kích thích phát tín hiệu


23

huỳnh quang được giải phóng khỏi phần ức chế, phát tín hiệu đến bộ phận
cảm biến của máy real-time PCR.
Kỹ thuật Scorpion ARMS cho phép xác định được đột biến điểm tại
exon 12 và exon 13 gen FGFR, kỹ thuật này có độ nhạy cao, thời gian ngắn
tuy nhiên chỉ phát hiện được những đột biến đã biết trước và chi phí thực hiện
tốn kém.
3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen
Kỹ thuật giải trình tự gen do F.Sanger, Smith và Coulson phát hiện vào
năm 1977, là phương pháp xác định vị trí sắp xếp của các nucleotide A, T, G,
C trên phân tử DNA. Hiện nay, người ta sử dụng phương pháp giải trình tự
dideoxynucleotide bằng máy tự động. Đoạn trình tự đã biết kết quả sẽ được
đem so sánh với trình tự trên ngân hàng GenBank sẽ cho ta biết được biến đổi
trên phân tử DNA.
Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự gen: dideoxynucleotide (ddNTP) là

một phân tử nhân tạo, cấu trúc của nó tương tự như phân tử deoxynucleotid
(dNTP), tuy nhiên ở cacbon số 3 của đường deoxyribose không có nhóm chức
hydroxyl (-OH) mà là gốc hydro (-H). Thông thường, trong quá trình tổng hợp
mạch đơn bổ sung, một dNTP tự do gắn vào chuỗi đang tổng hợp bằng liên kết
phosphodieste giữa 5’-phosphate với nhóm 3’-hydroxyl của nucleotide cuối
cùng của chuỗi. Tuy nhiên, nếu một ddNTP gắn vào đầu 3’ của chuỗi đang tổng
hợp thì sự tổng hợp DNA sẽ dừng lại do không hình thành được liên kết
phosphodieste với nucleotide tiếp theo. Hỗn hợp sau phản ứng bao gồm nhiều
đoạn DNA với kích thước khác nhau, hơn kém nhau 1 nucleotid, và có đầu tận
cùng là phân tử ddNTP. Dựa vào các tín hiệu huỳnh quang gắn trên các phân tử
ddNTP, người ta có thể xác định được trình tự gen. Phương pháp giải trình tự
gen có độ nhạy không cao tuy nhiên cho phép xác định được tất cả các đột biến
trên đoạn gen được khuếch đại, chi phí thực hiện thấp. Do đó phương pháp


24

enzym của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở Việt Nam lẫn thế giới. Các phòng
thí nghiệm đều giải trình tự theo phương pháp này, nhưng khi làm giải trình tự
thì người ta dùng máy tự động chứ không dùng kỹ thuật ký xạ tự như trước đây.
Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác
nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện
chỉ trong một ống nghiệm.


25

CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm bệnh (n=20): 20 bệnh nhân được chẩn đoán xác định và được
theo dõi tại bệnh viện Việt Đức
- Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: những bệnh nhân được chẩn đoán u
nguyên bào thần kinh đệm.
- Tiêu chuẩn loại trừ: Chẩn đoán chưa rõ ràng, bệnh nhân có các khối u ở
các cơ quan khác. Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.2. Thời gian và địa điểm
Thời gian thực hiện khóa luận từ ngày 1/11/2015-31/5/2016.
Địa điểm: Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein, trường Đại học Y Hà Nội.
2.3. Đạo đức trong nghiên cứu
Trước khi tiến hành thu thập thông tin, mẫu bệnh phẩm phải có sự đồng
ý của đối tượng nghiên cứu: tham gia tự nguyện vào nghiên cứu.
Bệnh nhân được giải thích rõ ràng về mục tiêu nghiên cứu, được tư vấn và
điều trị như mọi bệnh nhân khác. Các thông tin riêng của bệnh nhân được
đảm bảo giữ kín bí mật. Nghiên cứu đảm bảo tuân thủ các quy định đạo đức
trong nghiên cứu Y sinh học
2.4. Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu
2.4.1. Dụng cụ và trang thiết bị
− Tủ lạnh: 4°C, -30°C.
− Pipet định mức và đầu côn các loại 1000μl, 200μl, 100μl, 20μl, 10μl, 2,5μl.
− Ống Eppendorf loại 1500μl, 500μl, 200μl.
− Găng tay, giấy thấm vô trùng.
− Tủ sấy, tủ ấm.
− Khay đổ gel, lược tạo giếng.