Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Nguyễn Khánh Hoàng Việt

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VÀ
VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ MODULE TRONG
CẤU TRÚC ENZYME THỦY PHÂN
CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT
TRONG DẠ CỎ CỦA DÊ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9.42.02.01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Người hướng dẫn khoa học 1: GS. TS. Trƣơng Nam Hải
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Đỗ Thị Huyền

Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ

cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ...,
ngày … tháng … năm 2020.

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng có ý nghĩa thực
tiễn vô cùng to lớn đối với loài người thông qua các ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực như là y học, nông nghiệp, công nghiệp, xử lý ô
nhiễm môi trường. Do đó, các nghiên cứu về sự đa dạng các trình tự
từ vi sinh vật nhằm phát hiện những gen mới để khai thác và ứng
dụng chúng vào phục vụ cuộc sống luôn là chủ đề quan trọng được
các nhà sinh học đặc biệt quan tâm. Mặc dù vậy, các phát hiện gần
đây cho thấy phần lớn (khoảng 99%) các loài vi sinh vật trong môi
trường là chưa nuôi cấy được. Do vậy, nghiên cứu dựa vào phương
pháp nuôi cấy thông thường sẽ không thể khai thác được toàn bộ
nguồn gen có tiềm năng của vi sinh vật. Trong giai đoạn gần đây,
thông qua kỹ thuật Metagenomics giải trình tự toàn bộ hệ gen của tất
cả các vi sinh vật được thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường, các gen
từ vi sinh vật, kể cả vi sinh vật không nuôi cấy đã được nghiên cứu,
đánh giá một cách tổng thể.
Tại nước ta, cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp
với qui mô sản xuất ngày càng lớn và tập trung như hiện nay, các phụ
phẩm nông nghiệp mà trong đó nguồn sinh khối lignocellulose chiếm

phần lớn đang chủ yếu bị đốt bỏ gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến
môi trường. Trong khi đó, nhân loại đang phải đối mặt với tình trạng
suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch cũng như các hệ quả nghiêm
trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính. Việc nghiên cứu sử dụng
nguồn năng lượng carbonhydrate từ nguyên liệu có khả năng tái tạo
với trữ lượng khổng lồ như lignocellulose là hết sức cấp thiết


2
để tạo ra các sản phẩm thay thế các nhiên liệu được sản xuất từ
nguyên liệu hóa thạch.
Lignocellulose nói chung hay cellulose nói riêng là sinh khối
có cấu trúc vững chắc, được chuyển hóa theo nhiều bước để tạo
thành sản phẩm cuối cùng mà trong đó giai đoạn đường hóa đóng vai
trò then chốt. Trong quá trình này, cellulase được xác định là nhân tố
chính quyết định tới hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm.
Do vậy, trong những năm gần đây trên thế giới có rất nhiều công
trình nghiên cứu tìm kiếm nguồn cellulase mới có hoạt tính cao, có ái
lực mạnh với cơ chất để chuyển hóa hiệu quả cellulose. Khác với
enzyme khác, phần lớn các cellulase có cấu trúc module, có nghĩa là
ngoài vùng có chức năng xúc tác, enzyme còn chứa thêm một số
module khác có cấu trúc độc lập và ít được nghiên cứu, điển hình
như module FN3, Ig, CBM. Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu về vai
trò của các module chưa biết chức năng đến hoạt tính xúc tác của
cellulase chưa được công bố nhiều. Nhiều giả thiết cho rằng, chúng
không chỉ tồn tại như một vùng nối liên kết các vùng hoạt tính mà
chúng còn thể hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng khác như ổn
định cấu trúc, làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất. Vì vậy, nghiên
cứu làm rõ vai trò sinh học của các module này trong cấu trúc của
cellulase là hết sức có ý nghĩa cho việc lựa chọn hoặc thiết kế các

enzyme để nâng cao hiệu quả thủy phân nguồn sinh khối cellulose.
Từ năm 2014 đến năm 2017, bằng nguồn kinh phí của Đề tài
độc lập cấp Nhà nước (Mã số: ĐTĐLCN.15/14), phòng Kỹ thuật di
truyền (Viện CNSH, Viện HLKH&CNVN) đã giải mã DNA đa hệ
gen của hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê chăn thả tự nhiên trên núi tại tỉnh
Ninh Bình và Thanh Hóa. Kết quả từ 8,6 Gb dữ liệu, đề tài đã khai


3
thác được 816 trình tự mã hóa cho cellulase. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi hướng tới việc đánh giá đa dạng các trình tự cellulase có
cấu trúc module, tìm ra cấu trúc module đặc thù mới cho nghiên cứu
vai trò của module đến hoạt tính của enzyme. Do đó, chúng tôi đã
thực hiện Luận án: “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của
một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu
hệ vi sinh vật trong dạ cỏ của dê”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu đánh giá đa dạng cellulase và cellulase có cấu
trúc module từ khu hệ vi sinh vật trong dạ cỏ dê bằng kỹ thuật
Metagenomics;
- Nghiên cứu vai trò của module chưa rõ chức năng (FN3
hoặc Ig) lên hoạt tính của cellulase.
3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã thực hiện các
nội dung nghiên cứu chính sau:
1. Phân tích, đánh giá đa dạng họ GH, nguồn gốc cellulase
và các cellulase có cấu trúc module được mã hóa từ các khung đọc
mở (ORF) trong dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật
dạ cỏ dê tại Việt Nam.
2. Phân tích lựa chọn trình tự có cấu trúc module điển hình

cho nghiên cứu biểu hiện và xác định vai trò của vùng chưa biết chức
năng.
3. Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế enzyme từ trình tự được
lựa chọn (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module (Fn3, XFn3, Egc,
Fn3Egc) dưới dạng dung hợp với SUMO.


4
4. Nghiên cứu vai trò của module chưa biết chức năng đến
khả năng phân giải cellulose của enzyme.
5. Nghiên cứu, đánh giá một số tính chất của enzyme tái tổ
hợp được biểu hiện từ trình tự được lựa chọn có cấu trúc module.
4. Những đóng góp mới của luận án
1. Từ 816 ORF mã hóa cellulase của vi khuẩn dạ cỏ dê Việt
Nam, 243 ORF mã hóa cellulase được xác định có cấu trúc chứa
module chưa rõ chức năng là FN3 hoặc Ig. Trong số các cellulase
hoàn thiện chứa module FN3, 99,2% FN3 đi kèm với module xúc tác
betaglucosidase GH3 và chỉ có một FN3 đi kèm với module xúc tác
endoglucanase GH5. Toàn bộ module Ig đều đi kèm với module xúc
tác endoglucanase GH9. Cấu trúc mã hóa endoglucanase GH5 chứa
module FN3 là cấu trúc mới ít được phát hiện và nghiên cứu.
2. Đã tổng hợp và biểu hiện trình tự mã hóa endoglucanase
GH5 (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module khác nhau (Fn3, XFn3,
Fn3Egc, Egc) trong E. coli để nghiên cứu vai trò của FN3 trong cấu trúc
của enzyme. Module FN3 được xác định có khả năng làm tăng tính tan
và ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh thể trên bề
mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn
làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất tan là CMC.

3. SXFn3Egc hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 4. Enzyme ổn

định và bền ở nhiệt độ dưới 60 oC trong 90 phút. Km đạt 1,26 mg/ml
và Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml. Hoạt tính enzyme tăng 2 lần khi
sử dụng 40 mM Mn2+ và giảm khi bổ sung các ion kim loại (Ca 2+,
Mg2+, Ni2+, K+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+), và 6 loại hóa chất (SDS,
urea, 2-mercaptoethanol, EDTA, tween 80, triton X-100).


5
CHƢƠNG 1. TỔNG
QUAN 1.1. Tổng quan về cellulose
Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các đơn
phân β-D-glucose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật.
Sử dụng nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo như cellulose trong
một số ngành công nghiệp như chế biến thực phẩm, sản xuất các
nhiên liệu sinh học, hóa chất tinh khiết đang được xem là xu hướng
phát triển bền vững cả về mặt kinh tế và môi trường.
1.2. Cellulase
Cellulase là nhóm enzyme quan trọng, có khả năng cắt mối
liên kết -1,4-glycoside trong phân tử cellulose tạo thành sản cuối
cùng có giá trị là glucose. Cellulase thường được chia thành ba loại
chính (endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase) với cơ chế phân
cắt khác nhau. Cấu trúc của cellulase có thể chỉ gồm module xúc tác
hoặc bao gồm module xúc tác liên kết với module bổ sung như CBM
hoặc module chưa rõ chức năng (FN3, Ig).
1.3. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen
Metagenomics là thuật ngữ bao gồm các kỹ thuật sinh học
phân tử, tin - sinh học cho phép nghiên cứu đa hệ gen của tất cả các
vi sinh vật được thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường mà không
thông qua nuôi cấy. Metagenomics đã được chứng minh là phương
pháp hiệu quả để khai thác các enzyme, hoạt chất sinh học mới cho

nhiều ứng dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ khai thác các
cellulase mới, đặc biệt là cellulase có cấu trúc module (FN3, Ig) từ
bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase. Bộ dữ liệu này được phân
tích từ 164.644 ORF đã được lắp ráp từ 8,46 Gb dữ liệu giải trình tự
DNA đa hệ gen của vi khuẩn trong dạ cỏ dê Việt Nam.


6
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu hóa chất và thiết bị máy móc

Đối tượng nghiên cứu: Bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa
cellulase từ dữ liệu DNA đa hệ gen của vi khuẩn trong dạ cỏ dê.

Các chủng vi sinh vật, plasmid của hãng Invitrogen (Mỹ),
mồi PCR được đặt tổng hợp tại GenScript (Mỹ); hóa chất của BioLab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức).
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp sinh học phân tử, vi sinh vật
Biến nạp DNA plasmid vào E. coli (Froger et al., 2007); tách
chiết DNA plasmid từ E. coli và điện di trên gel agarose (Sambrook
et al., 2001); tinh chế DNA từ gel agarose sử dụng bộ kit DNA
Qiagene – QIAquick Gel Extraction Kit; tối ưu mã bộ ba dựa trên
phần mềm trực tuyến của Genscript (Rare Codon Analysis Tool).
2.2.2. Các phương pháp hóa sinh protein
Tinh chế protein bằng cột sắc kí ái lực Ni-NTA (Invitrogen)
và xác định độ sạch bằng Quantity One (Bio-Rad); định lượng
protein bằng Bradford (Bradford, 1976); xác định hoạt tính
endoglucanase trên cơ chất CMC (Miller, 1959) và trên giấy lọc theo
phương pháp của Camassola và cộng sự (2012) với một số cải biển
nhỏ; xác định hoạt tính cellulase trên đĩa thạch agar-CMC (Teather et

al., 1982) và dựa vào phân tích zymogram (Champasri et al., 2015);
đánh giá tác động của enzyme lên bề mặt giấy lọc bằng chụp ảnh trên
kính hiển vi điện tử quét SEM (Kataeva et al., 2002).
2.2.3. Các phương pháp tin sinh học
Nghiên cứu Pfam của các trình tự dựa trên CSDL PFAM
( và vùng bảo thủ sử dụng BLASTP
( dự đoán cấu trúc bậc ba của
enzyme sử dụng phần mềm trực tuyến Phyre2 và Swiss model; khả
năng chịu kiềm/acid sử dụng phần mềm AcalPred và khả năng chịu
nhiệt của enzyme sử dụng phần mềm TBI.
2.2.4. Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp thống kê, Microsoft Excel để
tính toán và trình bày kết quả dưới dạng ±SE (Standard Error).


7
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đánh giá sự đa dạng GH và cấu trúc module của cellulase
suy diễn từ 816 khung đọc mở
3.1.1. Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc các họ GH cellulase
Từ 816 ORF mã hóa cellulase đã được chú giải chức năng
thuộc 11 họ GH khác nhau (Bảng 3.1). Trong đó, họ GH3 (400 ORF)
và GH5 (192 ORF) được xác định là họ GH phổ biến nhất chiếm tỷ
lệ lần lượt là 49% và 23,5%. Các trình tự hoàn thiện (297 ORF) được
phát hiện tồn tại ở dạng cấu trúc chỉ chứa vùng xúc tác hoặc chứa
thêm module chưa rõ chức năng (FN3, Ig). Trong đó, các ORF thuộc
họ GH3 có tới 90,9% các trình tự có chứa module FN3; 100% các
ORF họ GH9 chứa module Ig và chỉ 1 module FN3 đi kèm với GH5.
Do đó, các module FN3, Ig không chỉ đơn giản là các vùng nối mà
còn thể hiện một số chức năng sinh học chưa được xác định rõ ràng.

Họ
GH
GH1
GH3
GH5

GH8
GH9

Bảng 3.1. Tổng hợp các trình tự được chú giải mã hóa
cho các enzyme thủy phân cellulose dựa trên cơ sở dữ
liệu COG và KEGG
Số
Họ
Số
Module
Module
ORF
GH
ORF
GH1
16
GH16
GH16
33
GH3
198
GH16-CBM4
2
Fn3-GH3

202 GH44
GH44
2
GH5
189 GH48
GH48
1
Fn3-GH5
1
GH64
GH64-CBM6
1
GH5-CBM2
1
GH74
GH74
1
GH5-CBM37
1
GH94
GH94
50
GH8
48
CBM63 CBM63
1
GH9
11
FN3
FN3

10
GH9-Ig
30
14
GH9-CBM3
2
GH9-CBM37
1
GH9-dockerin
1


8
3.1.2. Đánh giá đa dạng cấu trúc của cellulase hoàn thiện có cấu
trúc module
Trong số 243 ORF mã hóa cellulase chứa cấu trúc module có
148 ORF có cấu trúc hoàn thiện (131 ORF chứa FN3, 17 ORF chứa
Ig). Trong đó, toàn bộ 17 ORF mã hóa endoglucanase GH9 có chứa
module Ig (Ig-GH9); 131 ORF hoàn thiện có chứa module FN3 thì
có 130 ORF (99,2%) mã hóa beta-glucosidase GH3 (GH3-Fn3) và
chỉ duy nhất 1 ORF mã hóa endoglucanase GH5 (Fn3-GH5). Module
FN3 đứng trước vùng xúc tác endoglucanase GH5 ở đầu N là cấu
trúc hiếm gặp cần được nghiên cứu để xác định vai trò của module
này đến hiệu quả thủy phân của enzyme.
3.1.3. Đánh giá đa dạng nguồn gốc các ORF mã hóa cellulase
Để hiểu rõ hơn về cộng đồng vi khuẩn và vai trò của chúng
trong quá trình tiêu hóa cellulose ở dạ cỏ dê Việt Nam, chúng tôi đã
xác định nguồn gốc của 816 ORF mã hóa cellulase. Trong đó, 221
ORF mã hóa cellulase đã được phân loại chủ yếu thuộc ngành
Bacteroidetes (153 ORF) và Firmicutes (53 ORF) với tỷ lệ tương

ứng là 69,2% và 24,0%. Bacteroides uniformis (29 ORF), Prevotella
buccae (25 ORF) được xác định là 2 loài chiếm ưu thế nhất mang
các gen mã hóa cellulase; Ruminococcus flavefaciens (7 ORF) được
xác định là loài điển hình thuộc nhóm vi khuẩn sinh tổng hợp
cellulase có khả năng phân giải mạnh nguồn sinh khối cellulose.
3.1.4. Đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự axit amin suy
diễn từ ORF được chú giải mã hóa cho cellulase
Dựa trên cả 2 CSDL là NR và CAZy, 297 ORF hoàn thiện
mã hóa cellulase có độ tương đồng dưới 85% (trình tự mới) với tỷ lệ
lần lượt là 80,1% và 77,4%. Trong 148 ORF hoàn thiện mã hóa
cellulase có cấu trúc module có 17 ORF hoàn thiện mã hóa
endoglucanase chứa module Ig đều là trình tự mới; 131 ORF hoàn
thiện mã hóa cellulase chứa module FN3 có 90 trình tự mới chiếm
trên 68% (89 ORF mã hóa beta-glucosidase, 01 ORF mã hóa


9
endoglucanase). Từ bộ dữ liệu này hứa hẹn sẽ khai thác được nhiều
gen mới, đặc biệt là các trình tự hoàn thiện mã hóa cellulase có chứa
module như FN3, Ig.
3.1.5. Ước đoán một số tính chất của enzyme suy diễn từ trình tự
Ước đoán nhanh một số điều kiện tối ưu cho enzyme như
khoảng pH, nhiệt độ hoạt động, giá trị pI là công việc cần thiết để
sàng lọc nhanh các gen ứng viên cho nghiên cứu ứng dụng. 243 ORF
mã hóa cho cellulase có cấu trúc module được ước đoán phần lớn
bền ở khoảng nhiệt độ từ 55-65oC (130 ORF), hoạt động ở pH kiềm
(139 ORF) và giá trị pI từ trên 5-6 (146 ORF). Trong 148 trình tự
hoàn thiện chứa module FN3 và Ig xác định được 2 trình tự (1 trình
tự Ig-GH9 và 1 trình tự endoglucanase FN3-GH5) có pI cao hơn 9.
3.2. Nghiên cứu lựa chọn các trình tự có cấu trúc module điển

hình cho nghiên cứu vai trò của module
3.2.1. Khảo sát cấu trúc bậc 3 của trình tự chứa module FN3
Module FN3 trong cấu trúc của endoglucanase GH5 được phát
hiện là cấu trúc hiếm gặp so với cấu trúc phổ biến là module FN3 trong
beta-glucosidase GH3 được lựa chọn để nghiên cứu. Trình tự gen mã
hóa cho endoglucanase trưởng thành có kích thước 1545 nucleotit. Kết
quả so sánh tương đồng bằng BLASTN và phân loại bằng phần mềm
MEGAN cho thấy gen có nguồn gốc từ Ruminococcus bicirculans. Khi
so sánh trình tự amino acid của endoglucanase GH5 bằng BLASTP,
trình tự này có độ tương đồng 60% so với endoglucanase mã
CDC67342.1 của loài vi khuẩn phổ biến trong dạ cỏ dê là
Ruminococcus sp. CAG:57. Khảo sát vùng bảo thủ bằng SwissProt cho
thấy trình tự có độ tương đồng cao nhất (49%) so với khuôn của
endoglucanase 3pzt.1.A, với độ bao phủ là 53%, có cấu trúc monomer
và phối tử là Mn (Hình 3.7). Sử dụng công cụ Phyre2 cho thấy trình tự
có độ tương đồng cao nhất với khuôn


10
c3pzvB endoglucanase (độ tin cậy 100%), có vùng chức năng tách
biệt rõ ràng, vùng đầu N có cấu trúc FN3 tách biệt (Hình 3.8).

Mn

Hình 3.8. Khảo sát vùng bảo thủ
Hình 3.7. Khảo sát vùng
bảo thủ bằng SwissProt
bằng Phyre2
3.2.2. Khảo sát giá trị pI, pH của trình tự chứa module FN3
Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 chứa module FN3

được dự đoán hoạt động ở môi trường pH axit, có khả năng bền ở

dưới 55oC và có chỉ số pI tương đồng và luôn ở mức cao ở cả vùng
chưa biết chức năng (X domain, module FN3) và vùng hoạt tính
(Egc). Chỉ số pI trên toàn phân tử enzyme và của các module tương
đồng sẽ giúp cho việc nghiên cứu, biểu hiện và tối ưu một số điều
kiện thủy phân của enzyme trở lên thuận lợi hơn.
3.3. Tách dòng gen XFn3Egc
3.3.1. Phân tích tối ưu mã bộ ba của trình tự XFn3Egc
Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 (gen XFn3Egc)
được tối ưu có tỷ lệ các bộ ba có khả năng sử dụng tốt là 97% so với
46% trước khi tối ưu. Các mã bộ ba được tối ưu có tới 86% trình tự
có mức độ phù hợp từ 91-100% so với trước tối ưu chỉ có 49%. Trình
tự gen trước và sau khi tối ưu để biểu hiện trên E. coli được mô tả tại
Hình 3.10. Gen XFn3Egc sau khi được tối ưu đã được tổng hợp nhân
tạo và đưa vào pET22b(+) tại vị trí NcoI+XhoI. Vector mang gen
được đặt tên là pET22-XFn3Egc.


11

Hình 3.10. Trình tự gen XFn3Egc trước (A) và sau tối ưu các mã bộ
ba để biểu hiện trong E. coli (B) (vùng màu vàng là trình tự FN3;
vùng màu xanh là vùng hoạt tính; chữ màu đỏ là trình tự được tối ưu)


12

3.3.2. Tạo vector biểu hiện pETSUMO mang gen Fn3, Egc,
Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc

Các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc được khuếch
đại bằng PCR từ khuôn là pET22-XFn3Egc, sau đó được cắt bằng
cặp enzyme hạn chế NcoI + XhoI và nối vào vector pET22b(+) tạo
vector tái tổ hợp tương ứng. Các gen sau khi được đưa vào vector
biểu hiện đã được giải trình tự để kiểm tra và đưa vào biểu hiện trong
E. coli. Tuy nhiên, lượng protein được biểu hiện quá thấp và chủ yếu
nằm ở pha tủa. Do đó, chúng tôi đã chuyển các gen từ vector
pET22b(+) sang vector pETSUMO bằng enzyme hạn chế NcoI và
XhoI. Sau khi được nối ghép, các vector pET22SUMO-Fn3,
pET22SUMO-Egc, pET22SUMO-Fn3Egc, pET22SUMO-XFn3Egc
và pET22SUMO-XFn3 được biến nạp vào tế bào E. coli DH10B để
tách dòng gen. Các khuẩn lạc biến nạp được nuôi cấy trên môi
trường LBA để chọn các dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp. Kết
quả cắt kiểm tra bằng các enzyme giới hạn đơn lẻ, các plasmid đã
được cắt mở vòng và khi cắt bằng cặp enzyme giới hạn thì các gen
tương ứng được cắt ra có kích thước như tính toán. Như vậy, các
vector biểu hiện mang gen đã được thiết kế thành công.
3.4. Biểu hiện các gen trong tế bào E. coli
Sau khi khảo sát các điều kiện thích hợp cho biểu hiện,
chúng tôi tiến hành biểu hiện các chủng E. coli BL21 (DE3) mang
các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc trong môi trường LB có
bổ sung Amp, nhiệt độ biểu hiện 25oC, nồng độ chất cảm ứng 0,5
mM IPTD, thu mẫu sau 5 giờ cảm ứng. Kết quả kiểm tra bằng điện
di trên gel polyacrylamide cho thấy, ở pha tổng số cả 5 loại protein
đều được biểu hiện tốt, đúng kích thước theo tính toán. Các gen có


13
protein được biểu hiện chủ yếu ở pha tan trừ gen Egc không chứa
FN3 chỉ biểu hiện protein nằm ở pha tủa (Hình 3.18).

Kết quả thử hoạt tính cellulase của các protein tái tổ hợp biểu
hiện ở pha tan trên đĩa thạch aga-CMC cho thấy chỉ có dịch pha tan
của SXFn3Egc thể hiện được khả năng thủy phân cơ chất CMC rõ
nhất. Kết quả thử hoạt tính zymogram cho thấy ở bản nhuộm
comassie, cả 4 loại protein (SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3)
mặc dù không được xử lý biến tính và chạy điện di trên gel không
biến tính nhưng đều di chuyển đúng vị trí trên bản gel. Ở bản gel
nhuộm congo red, xuất hiện 1 band sáng tương tự như đối chứng
dương ở vị trí của SXFn3Egc (Hình 3.19). Do đó, gen XFn3Egc biểu
hiện được enzyme đúng kích thước như tính toán và thể hiện hoạt
tính rõ ràng với cơ chất CMC. Module FN3 được xác định có tác
dụng làm tăng tính tan của vùng xúc tác. Vùng X cũng có vai trò
nhất định trong việc hỗ trợ cho vùng xúc tác thể hiện hoạt tính
cellulase mạnh hơn.

Hình 3.18. Điện di đồ protein SFn3, SEgc, SFn3Egc, SXFn3Egc,
SXFn3 ở pha tổng số, pha tan, pha không tan được biểu hiện trong
chủng E. coli BL21 (DE3) trên gel polyacrylamide 12,6% có SDS.
Đối chứng âm pETSUMO; Marker: protein chuẩn unstained


14

(A)

(B)

Hình 3.19. Phân tích protein pha tan bằng điện di không biến tính
(A) và zymogram (B); Marker: Thang protein chuẩn unstained
(Thermo scientific); cellulase: Đối chứng dương (Sigma)

3.5. Tinh chế protein tái tổ hợp tái tổ hợp và xác định hoạt tính
3.5.1. Tinh chế protein tái tổ hợp
Các protein tái tổ hợp được rửa ra hoàn toàn ở đệm thu mẫu
có nồng độ 400 mM imidazole. Kiểm tra bằng điện di đồ các phân
đoạn tinh chế protein cho thấy, trên bản gel chỉ xuất hiện duy nhất
băng có kích thước tương đương với protein đích cần tinh chế. Kết
quả đánh giá độ sạch bằng phần mềm Quantity One cho thấy các
protein tái tổ hợp sau tinh chế đều có độ sạch trên 99%.

Hình 3.20. Điện di đồ kiểm tra
sản phẩm trong các phân đoạn
tinh chế SFn3 (F1-F9)

Hình 3.22. Điện di đồ kiểm tra
sản phẩm trong các phân đoạn
tinh chế SFn3Egc (F1-F7)


15

Hình 3.24. Điện di đồ kiểm tra
sản phẩm trong các phân đoạn
tinh chế SXFn3Egc (F1-F10)

Hình 3.26. Điện di đồ kiểm tra
sản phẩm trong các phân đoạn
tinh chế SXFn3 (F1-F8)

3.5.2. Đánh giá hoạt tính của các protein sau tinh chế
3.5.2.1. Đánh giá hoạt tính riêng rẽ trên cơ chất CMC

Kết quả đánh giá hoạt tính riêng rẽ trên cơ chất CMC của
protein SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 sau tinh chế cho thấy chỉ
có SXFn3Egc và SFn3Egc thể hiện được khả năng thủy phân cơ chất
CMC rõ nhất. Vòng hoạt tính thủy phân cellulose của SXFn3Egc có
kích thước lớn hơn (hoạt tính mạnh hơn) so với SFn3Egc.
3.5.2.2. Đánh giá khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính của
enzyme trên CMC
Khi phối trộn các protein chưa biết chức năng (SFn3,
SXFn3) và enzyme chứa vùng hoạt tính, khả năng thủy phân cơ chất
CMC của hỗn hợp đều tăng. Phối trộn SFn3 và SXFn3 với SFn3Egc
đều làm tăng hoạt tính lên lần lượt là 74,5% và 49,9%. Phối trộn
SXFn3 và SFn3 với SXFn3Egc hoạt tính đều tăng khoảng 27%
(Hình 3.29). Kết quả cho thấy, module FN3 khi phối trộn có tác dụng
làm tăng hoạt tính của enzyme trên cơ chất CMC lên đáng kể so với
thử nghiệm chỉ với enzyme riêng rẽ. Từ kết quả này có thể đưa ra giả
thuyết là do module FN3 có khả năng phản ứng với CMC, làm tăng
ái lực của enzyme với cơ chất.


16

Hình 3.29. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein
tái tổ hợp sau tinh chế trên cơ chất CMC; ĐC +: Cellulase (Sigma)
3.5.2.3. Đánh giá khả năng của SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính
enzyme trên giấy lọc
Trên cơ chất giấy lọc, SFn3 và SXFn3 có khả năng làm cho
hoạt tính của SXFn3Egc tăng lên tương ứng là 86,8% và 13,6% so
với khi thử nghiệm riêng rẽ chỉ có SXFn3Egc. SFn3Egc khi phối
trộn với SFn3 và SXFn3 cũng đều có hoạt tính tăng so với khi thử
nghiệm phản ứng chỉ có SFn3Egc nhưng sự sai khác không có ý

nghĩa thống kê. Kết quả này chứng tỏ, SFn3 và SXFn3 khi được phối
trộn đã có tác dụng làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose của
enzyme trên cơ chất giấy lọc. Vì SFn3 và SXFn3 không thể hiện
được hoạt tính cellulase nên các protein này chỉ có tác dụng hỗ trợ
giúp enzyme SXFn3Egc, SFn3Egc tăng khả năng thủy phân cơ chất.
Khả năng làm tăng hoạt tính enzyme trên cơ chất giấy lọc
của protein chứa module FN3 có thể do hai giả thiết sau: (1) module
FN3 có khả năng làm nới lỏng cấu trúc cellulose tinh thể của giấy
lọc, giúp enzyme tiếp cận dễ dàng hơn với sợi cellulose để thực hiện


17
phản ứng thủy phân; (2) module FN3 làm tăng ái lực với cellulose,
giúp enzyme bám dính tốt với cơ chất.

Hình 3.30. Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ và phối trộn của các protein
sau tinh chế trên cơ chất giấy lọc; ĐC +: Cellulase (Sigma)
3.5.3. Đánh giá khả năng FN3 tăng ái lực của enzyme với cơ chất
3.5.3.1. Cơ chất CMC
Hoạt tính cellulase của SXFn3Egc, SFn3Egc đều tăng trên
cơ chất CMC được xử lý hấp phụ trước với SFn3 và SXFn3 (Hình
3.31).Trên cơ chất được hấp phụ với SFn3 hoặc SXFn3, hoạt tính
của SXFn3Egc đều tăng mạnh hơn so với SFn3Egc. Hoạt tính của
SXFn3Egc và SFn3Egc trên cơ chất CMC được phản ứng hấp phụ
trước SFn3 tăng lần lượt là 31,5% và 23,8%. Tuy nhiên, hoạt tính
của 2 enzyme này trên cơ chất CMC được hấp phụ với SXFn3 chỉ
tăng lần lượt là 7,3% và 5,9%. Như vậy, SFn3 và SXFn3 có khả năng
thúc đẩy phản ứng của enzyme với cơ chất lên rõ rệt thông qua việc
làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất CMC.
Quan sát hình dạng của các băng protein trên bản gel không

biến tính sau phản ứng có cơ chất CMC, SFn3 và SXFn3 đều thể
hiện khả năng liên kết, phản ứng với cơ chất CMC. SFn3 và SXFn3
có khả năng làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất, làm cho phản


18
ứng diễn ra mạnh hơn so với phản ứng chỉ có enzyme. SXFn3Egc
khi phối trộn với SFn3 hầu như đã phản ứng hết với cơ chất CMC và
không còn quan sát được rõ trên bản gel so với khi được phối trộn
với SXFn3 (Hình 3.32). Điều này có thể giải thích lý do enzyme
được phối trộn với SFn3 thường cho có hiệu quả thủy phân cơ chất
tốt hơn so với khi được phối trộn với SXFn3.

Hình 3.31. Đánh giá vai trò của SFn3 và SXFn3 khi hấp phụ trên cơ
chất CMC đến hoạt tính của SFn3Egc và SXFn3Egc

Hình 3.32. Kiểm tra khả năng SFn3, SXFn3 làm tăng ái lực của
enzyme với cơ chất CMC; M: Thang protein chuẩn (Thermo
Scientific)


19
3.5.3.2. Cơ chất giấy lọc
Kết quả đánh giá khả năng hấp phụ của SFn3 và SXFn3 làm
tăng ái lực của enzyme trên cơ chất giấy lọc cho thấy hoạt tính của
SXFn3Egc cũng đều tăng trên cơ chất được hấp phụ trước với SFn3
và SXFn3. Khi thử nghiệm hấp phụ SFn3 với giấy lọc, SXFn3Egc có
hoạt tính mạnh hơn so với khi được xử lý hấp phụ trước với SXFn3
(Hình 3.33). Tuy nhiên, hoạt tính của SFn3Egc trên giấy lọc được
hấp phụ SFn3 và SXFn3 không khác nhiều so với trên giấy lọc

không được xử lý hấp phụ. Từ kết quả này cho thấy, SFn3 và SXFn3
đã có quá trình hấp phụ trên bề mặt giấy lọc (đặc biệt là SFn3) làm
tăng hoạt tính của SXFn3Egc.

Hình 3.33. Đánh giá vai trò của SFn3 và SXFn3 khi hấp phụ trên cơ
chất giấy lọc đến hoạt tính của các protein SFn3Egc, SXFn3Egc; FP:
Giấy lọc (Whatman No. 1)
3.5.3.3. Đánh giá khả năng nới lỏng cấu trúc tinh thể trên bề mặt
giấy lọc
Trên ảnh chụp bề mặt giấy lọc ở độ phóng đại 500 lần và
1000 lần có thể quan sát thấy các sợi cellulose được nới lỏng và
không còn liên kết chặt chẽ với các sợi lân cận so với đối chứng âm
là mẫu không được xử lý với SFn3 hoặc SXFn3 (Hình 3.34). Ở độ


20
phóng đại 5000 lần, trên mẫu giấy lọc được xử lý với FN3, bề mặt
các sợi cellulose được phát hiện không còn nhẵn, trơn như mẫu
không xử lý. Như vậy, SFn3 và SXFn3 đã có tác động làm nới lỏng
bề mặt giấy lọc giúp cho phản ứng thủy phân cơ chất của enzyme
được thực hiện dễ dàng hơn.

Hình 3.34. Ảnh SEM cấu trúc và bề mặt các sợi cellulose của giấy
lọc (Whatman No. 1) không xử lý bởi SFn3 hoặc SXFn3 (hàng 1),
xử lý với SFn3 (hàng 2), xử lý với SXFn3 (hàng 3) ở các độ phóng
đại 500 lần (dãy A), 1000 lần (dãy B) và 5000 lần (dãy C)
3.5.3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên sự hấp phụ của SFn3 và
SXFn3 với cơ chất
Để nghiên cứu tăng khả năng hấp phụ của FN3 lên cơ chất
giấy lọc, qua đó làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose của enzyme,

chúng tôi đánh giá ảnh hưởng của pH, nhiệt độ tới sự hấp phụ. Phản
ứng hấp phụ của SFn3 và SXFn3 với cơ chất giấy lọc được xác định
hiệu quả nhất ở điều kiện pH4, sau đó giảm dần ở pH6 và pH8. Hiệu
quả thủy phân cellulose của SXFn3Egc và SFn3Egc đều mạnh hơn
khi SFn3 và SXFn3 được hấp phụ với cơ chất giấy lọc ở nhiệt độ
40oC và 60oC so với khi thực hiện ở nhiệt độ 20oC.


21
3.6. Đánh giá một số tính chất của enzyme SXFn3Egc
3.6.1. Ảnh hưởng của pH
Hoạt tính tối ưu của SXFn3Egc đạt cao nhất ở pH 4. Enzyme
đều thể hiện hoạt tính mạnh khi pH phản ứng nằm trong khoảng từ 35; ở pH 3 và pH 5, hoạt tính của enzyme đạt khoảng 80% so với ở
pH 4. Enzyme này có hoạt tính yếu hơn và giảm dần ở pH từ 7 đến 9.
3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong khoảng nhiệt độ từ 30 oC đến 60oC, enzyme có mức độ
hoạt động khác nhau: Từ 30oC đến 40oC, hoạt tính của enzyme tăng
dần và đạt cao nhất tại 40 oC; ở 45oC đến 50oC, enzyme vẫn thể hiện
hoạt tính mạnh (đạt từ 84-88% so với hoạt tính ở nhiệt độ tối ưu).
Tuy nhiên, hoạt tính SXFn3Egc giảm dần ở nhiệt độ 55-60oC.
3.6.3. Đánh giá độ bền nhiệt
SXFn3Egc có hoạt tính còn lại cao nhất sau khi ủ 30 phút và
giảm dần sau 60 phút đến 90 phút ở các khoảng nhiệt độ thử nghiệm
từ 30oC đến 60oC.
3.6.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại, hóa chất
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của một số ion kim loại (Ca
2+

2+

+

2+

2+

2+

2+

2+

,

3+

Mg , Ni , K , Co , Cu , Mn , Zn , Fe ) và 6 loại hóa chất
thường sử dụng là SDS (1%), urea (1 µM), 2-mercaptoethanol (1
µM), EDTA (1 µM), tween 80 (1mM), triton X-100 (1 µM) cho thấy
chỉ có Mn2+ ở nồng độ 10 mM làm tăng hoạt tính của enzyme nhưng
không đáng kể (108%). Khi tăng nồng độ Mn 2+ lên 20 mM, 30 mM,
40 mM thì hoạt tính tương đối của enzyme tăng tương ứng so với đối
chứng là 202%, 215%, 222%.
3.6.5. Đặc điểm động học của XFn3Egc
Kết quả động học của enzyme SXFn3Egc được xác định có
giá trị Km đạt 1,26 mg/ml và Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml.


22
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN
1. Từ bộ dữ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase của hệ vi
khuẩn dạ cỏ dê Việt Nam đã xác định các trình tự thuộc 11 họ GH
khác nhau (GH1, 3, 5, 8, 9, 16, 44, 48, 64, 74, 94) và được chú giải
chủ yếu có hoạt tính beta-glucosidase họ GH3 và endoglucanase họ
GH5, GH8, GH9. Các trình tự được xác định có nguồn gốc chủ yếu
thuộc ngành Bacteroidetes và Firmicutes với 2 loài chiếm ưu thế nhất
là Bacteroides uniformis, Prevotella buccae.
2. Đã xác định được 243 ORF (148 ORF hoàn thiện) mã hóa
cellulase có cấu trúc module, chứa module Ig hoặc FN3. Trong đó,
100% endoglucanase GH9 có chứa module Ig (17 ORF). Trong tổng
số 131 ORF hoàn thiện mã hóa cellulase chứa module FN3 phát hiện
được tới 99,2% module FN3 đi kèm với module xúc tác betaglucosidase GH3 và chỉ có một module FN3 đi kèm với
endoglucanase GH5. Cấu trúc endoglucanase GH5 chứa module FN3
là cấu trúc mới ít được phát hiện và nghiên cứu.
3. Đã tổng hợp và biểu hiện trình tự mã hóa cellulase GH5
(XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module khác nhau (Fn3, XFn3,
Fn3Egc, Egc) trong E. coli để nghiên cứu vai trò của module FN3
trong cấu trúc của enzyme. Module FN3 được xác định có khả năng
làm tăng tính tan và ổn định cấu trúc vùng xúc tác của enzyme, nới
lỏng cấu trúc cellulose tinh thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme
tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn làm tăng ái lực của
enzyme lên cơ chất CMC.


23
4. Enzyme SXFn3Egc hoạt động tối ưu ở 40 oC, pH 4.
Enzyme ổn định và bền ở dưới 60oC trong 90 phút. Các thông số
động học của enzyme là Km đạt 1,26 mg/ml và Vmax đạt 148,12
µmol/min/ml.

5. Hoạt tính endoglucanase của SXFn3Egc tăng lên 2 lần
khi sử dụng 40 mM Mn 2+ và giảm khi bổ sung các ion Ca 2+, Mg2+,
Ni2+, K+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+ với nồng độ cuối cùng là 10 mM và
6 loại hóa chất thường sử dụng là SDS (1%), urea (1 µM), 2mercaptoethanol (1 µM), EDTA (1 µM), tween 80 (1mM), triton X100 (1 µM).
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu đánh giá vai trò của các module FN3 và
các module chưa rõ chức năng khác như Ig, X trong cấu trúc của
cellulase có cấu trúc module để tiến tới sản xuất hỗn hợp các enzyme
phù hợp với loại từng loại cơ chất và mục đích sử dụng nhằm ứng
dụng trong xử lý môi trường và sản xuất nhiên liệu sinh học.