NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH (Gymnema R.Br)

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT CƯỜNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY
SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ
LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH
(Gymnema R.Br)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VIỆT CƯỜNG
Mã sinh viên: 1501069

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÂN TAY
SẮC KÝ LỚP MỎNG CỦA MỘT SỐ
LOÀI THUỘC CHI DÂY THÌA CANH
(Gymnema R.Br)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Phạm Thị Linh Giang
Nơi thực hiện:
Bộ môn Thực vật
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2020


Lời cảm ơn
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân
thành tới ThS. Phạm Thị Linh Giang, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ
bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành
khóa luận này. Cô vừa là người thầy, vừa là người chị đi trước đã luôn động viên
và cho tôi những lời khuyên chân thành trong công tác nghiên cứu khoa học lẫn
trong cuộc sống, giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nhất có thể.
Bên cạnh đó, trong quá trình thực hiện khóa luận tôi còn nhận được sự
giúp đỡ và chỉ bảo của nhiều thầy cô, anh chị em khác. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn
tới:
PGS.TS Trần Văn Ơn, người thầy đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thu
mẫu tại xã Yên Ninh, huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên và cho tôi những lời
khuyên quý báu trong nghiên cứu; các thầy cô giảng viên tại Bộ môn Thực vật:
TS. Hoàng Quỳnh Hoa, TS. Phạm Hà Thanh Tùng, ThS. Nghiêm Đức Trọng,
ThS. Lê Thiên Kim cùng các chị kỹ thuật viên đã luôn giúp đỡ, chỉ bảo nhiệt tình
cho tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này.
Các em sinh viên nghiên cứu khoa học: Vương Thị Ngân Hà (A8K73),
Nguyễn Thị Ngọc Ánh (A3K72), Đinh Thùy Dương (A1K72) cùng các bạn thực
hiện khóa luận tốt nghiệp tại Bộ môn Thực vật, những người đã hỗ trợ tôi rất
nhiều trong thời gian nghiên cứu.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô và bạn bè tại Trường Đại
học Dược Hà Nội, những người tôi luôn học hỏi trong suốt 5 năm vừa qua.
Cuối cùng, tôi gửi lời tri ân đến gia đình tôi– nơi là chỗ dựa và nguồn động
lực mỗi khi tôi khó khăn.
Hà Nội, ngày 22 tháng 6 năm 2020

Nguyễn Việt Cường


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. Chi Gymnema R. Br. .............................................................................................2
1.1.1. Vị trí phân loại thực vật chi Gymnema R.Br. .................................................2
1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố và các loài trong chi trên thế giới ......................2
1.1.3. Tác dụng sinh học của một số loài thuộc thuộc chi Gymnema R.Br. .............3
1.2. Chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam ..........................................................................3
1.2.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult ..........................................4
1.2.2. Loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight .....................................................6
1.2.3. Loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne .......................................................8
1.2.4. Loài Gymnema yunnanense Tsiang ................................................................9
1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao .....................................................10
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng ...........................................................................................10
1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao ....................................................................10
1.4. Vân tay sắc ký thực vật .......................................................................................11
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ......................................................................................14
2.1.1. Mẫu nghiên cứu ............................................................................................14
2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu ..............................................................................15
2.2. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................16
2.2.1. Khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu
nghiên cứu...............................................................................................................16

2.2.2. Xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. ........16
2.2.3. Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký đồ) của các mẫu
nghiên cứu...............................................................................................................16
2.2.4. Ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên
thị trường ................................................................................................................17
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................17
2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích ................................................................................17
2.3.2. Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký ............................................................19
2.3.3. Tiến hành phân tích vân tay sắc ký các dịch chiết một số loài trong chi
Gymnema R.Br. theo quy trình đề xuất ..................................................................20
2.4. Phương pháp xử lý kết quả .................................................................................20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ..............................................................22
3.1. Kết quả khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu
nghiên cứu ..................................................................................................................22
3.1.1. Với dịch chiết toàn phần ...............................................................................22
3.1.2. Với dịch chiết sau thủy phân ........................................................................22
3.2. Kết quả xây dựng vân tay hóa học một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. ........23
3.2.1. Với dịch chiết toàn phần ...............................................................................23
3.2.2. Với dịch chiết sau thủy phân ........................................................................27
3.3. Kết quả xây dựng cây phân loại dựa trên kết quả sắc ký lớp mỏng của các mẫu
Gymnema nghiên cứu .................................................................................................31
3.4. Kết quả phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường
....................................................................................................................................34
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................37
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .........................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

H2SO4

Acid sulfuric

HCl

Acid hydroclorid

HPTLC

High performance thin-layer chromatography – Sắc ký lớp
mỏng hiệu năng cao

ITS

Internal Transcribed Spacer

KOH

Kali hydoxid

MeOH

Methanol

G. inodorum

Gymnema inodorum (Lour.) Decne.

G. latifolium

Gymnema latifolium Wall. ex Wight

G. reticulatum

Gymnema reticulatum (Moon) Alst.

G. sylvestre

Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult

G. yunnanense

Gymnema yunnanense Tsiang

GYM

Chất chuẩn gymnemagenin

Rf

Ratio frequency - Hệ số di chuyển

SKĐ

Sắc ký đồ

STT

Số thứ tự

TLC

Thin-layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng

TT

Thuốc thử

UPGMA

Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages

VIS

Visible – Ánh sáng thường

UV

Ultra violet – Ánh sáng tử ngoại

UV 366-TT
VIS-TT

Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 366nm sau khi phun thuốc
thử
Quan sát dưới ánh sáng trắng sau khi phun thuốc thử

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số tác dụng sinh học đã công bố của các loài thuộc chi Gymnema R.Br.
..................................................................................................................................3
Bảng 1.2. Khóa phân loại các loài của chi Gymnema ở Việt Nam [2] ............................4
Bảng 1.3. Tổng hợp sự khác biệt về cấu trúc khung chất chính của các loài trong chi
Gymnema R.Br........................................................................................................13
Bảng 2.1. Danh mục và ký hiệu các mẫu trong nghiên cứu (i và ii)…………………….14
Bảng 3.1. Sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ dịch chiết toàn phần mẫu nghiên cứu nhóm
1 khi quan sát ở bản mỏng sau phun thuốc thử………………………………..26
Bảng 3.2. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các
mẫu thuộc loài G. sylvestre quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT .........................28
Bảng 3.3. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các
mẫu thuộc loài G. latifolium quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT .......................29
Bảng 3.4. Tổng hợp Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân các
mẫu thuộc loài G. yunnanense và G. inodorum quan sát ở VIS-TT hoặc UV 366-TT
................................................................................................................................31
Bảng 3.5. Bảng hệ số tương đồng cặp đôi giữa các mẫu nghiên cứu, sử dụng chỉ số
Nei&Li ....................................................................................................................33


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52] .....................................................5
Hình 1.2. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid dạng C-4 gem-dimethylat olean
phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult nguồn gốc Việt Nam
[37] ............................................................................................................................6
Hình 1.3. Khung cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy oleaan triterpenoid phân lập
được từ Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [38] ..................................................7

Hình 1.4. Khung cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema inodorum
(Lour.) Decne [44]. ...................................................................................................8
Hình 1.5. Khung cấu trúc chung của các aglycon C21 phân lập được từ Gymnema
yunnanense Tsiang [28], [62]. ..................................................................................9
Hình 2.1. Quy trình chiết - thủy phân các mẫu nghiên cứu………………………….…18
Hình 3.1. Sắc ký đồ khai triển dịch chiết toàn phần của các mẫu Gymnema nhóm
1………………………………………………………………………………..24
Hình 3.2. Kết quả chồng phổ sắc ký dịch chiết toàn phần tại VIS-TT các mẫu thuộc
nhóm 1 ....................................................................................................................25
Hình 3.3. Sắc ký đồ dịch chiết sau thủy phân của các mẫu Gymnema nhóm 1 ............30
Hình 3.4. Cây phân loại dựa trên phân tích UPGMA hệ số tương đồng giữa sắc ký đồ
của các mẫu .............................................................................................................33
Hình 3.5. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ các mẫu GX2, GX3 và sắc ký đồ GS1 ...........34
Hình 3.6. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX4 và sắc ký đồ GI ..............................35
Hình 3.7. Kết quả chồng phổ sắc ký đồ mẫu GX1 và sắc ký đồ GS1, GL1 .................36


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ Ayurveda, Dây thìa canh (Gymnema sylvestre
(Retz) R. Br. Ex Schult) đã được sử dụng từ hơn 2000 năm nay để điều trị đái tháo
đường [56], [61]. Dựa trên kinh nghiệm này, hàng loạt các nghiên cứu đã được tiến hành
để chứng minh cơ chế tác dụng hạ đường huyết của cây và xác định các acid gymnemic
là nhóm hoạt chất chính liên quan đến tác dụng này [49], [53]. Dựa trên nguyên lý là
các loài cùng bậc taxon thực vật thường có các thành phần hóa học tương tự nhau do đó
có xu hướng có tác dụng sinh học giống nhau [3], một số nghiên cứu trên thế giới đã
chứng minh được tác dụng hạ đường huyết tương tự trên các loài cùng chi như:
Gymnema montanum Hook.f., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema
yunnanense Tsiang,…[18], [40], [46], [47], [58].
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết mới được thực hiện
trên chủ yếu 2 loài là Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult và Gymnema latifolium

Wall. Ex Wight [12], [16]. Bên cạnh một số sản phẩm thực phẩm chức năng như
Diabetna (Nam Dược), DK-betics (DK-Pharma),…còn rất nhiều trà thảo dược – dược
liệu khô của dây thìa canh được bán rộng rãi cùng một số sản phẩm có tên gọi “Dây thìa
canh” được sử dụng nhưng không thuộc hai loài đã nghiên cứu.
Vì vậy, việc nghiên cứu sự đa dạng vân tay sắc ký TLC của một số loài thuộc chi
Dây thìa canh giúp bước đầu phân biệt nhanh về hóa học, làm cơ sở cho việc kiểm
nghiệm và sử dụng đúng các loài trong chi Gymnema R.Br.; đề tài “Nghiên cứu xây
dựng vân tay sắc ký lớp mỏng của một số loài thuộc chi dây thìa canh - Gymnema
R.Br” được thực hiện với các mục tiêu sau:
-

Xây dựng dấu vân tay sắc ký của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br. bằng

phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao từ đó xây dựng cây phân loại dựa trên
thành phần hóa học (sắc ký đồ) của các mẫu nghiên cứu.
-

Ứng dụng kết quả nghiên cứu phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh

thu được trên thị trường.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Chi Gymnema R. Br.
1.1.1. Vị trí phân loại thực vật chi Gymnema R.Br.
Theo hệ thống phân loại của Armen Takhtajan trong “Flowering Plants” (2009),
chi Gymnema R.Br. được sắp xếp theo thứ tự phân loại như sau:
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae)
Bộ: Long đởm (Gentianales)
Họ: Trúc đào (Apocynaceae)
Phân họ: Thiên lý (Asclepiadoideae)
Chi: Gymnema R.Br [20].
1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố và các loài trong chi trên thế giới
Các loài thuộc chi Gymnema R.Br. là cây leo, không có rễ phụ trên thân. Lá mọc
đối, không nạc. Cụm hoa xim, dạng tán hoặc chùm. Hoa nhỏ. Thùy đài nhỏ, hình trứng,
đầu tù, gốc đài có tuyến, ít khi không có tuyến. Tràng hình bánh xe, thùy tràng không
gập trong nụ, tiền khai vặn phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ dính ở tràng,
thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, có phần
phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn,
khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi, khối phấn
hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh
bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị - nhụy hình ống nhọn đầu [21], [23].
Phân bố của chi Gymnema R.Br. khá rộng, ở vùng Tây châu Phi đến
Australia, châu Á [7]. Trong thực vật chí Trung Quốc, Tsiang và cộng sự đã mô tả và
xây

dựng

khóa

phân

loại

chi

Gymnema

R.Br

[21].

Năm

2011,

Jingyun Fang và cộng sự đã công bố bản đồ phân bố của 7 các loài Gymnema
R.Br. tại Trung Quốc [29]. Các tài liệu thực vật, Thái Lan ghi nhận có 3 loài, Ấn Độ có
2 loài, Indonesia 2 loài và Lào [27], Đài Loan có 1 loài [32].
Theo dự án “The plant list” thực hiện bởi Royal Botanic Gardens, Kew và Missouri
Botanical Garden khởi động từ năm 2010 đã xác định được 120 loài thuộc chi Gymnema
R.Br. thu thập từ các cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới trong đó có 52 tên khoa học
được chấp nhận (43,3%), 50 tên được xác định là tên đồng nghĩa (41,67 %), và 18 tên
2


chưa xác định được chính xác thông tin (15,0 %) [64]. Danh sách 52 loài thuộc chi
Gymnema R.Br. đã được chấp nhận theo “The plant list” [64] được trình bày trong phụ
lục 2.
1.1.3. Tác dụng sinh học của một số loài thuộc thuộc chi Gymnema R.Br.
Nhiều loài thuộc chi Gymnema R.Br. đã được nghiên cứu về hoạt tính sinh học
bao gồm tác dụng của dịch chiết toàn phần, của cao phân đoạn và của các hoạt chất được
phân lập từ cây. Tác dụng sinh học nổi bật của các loài thuộc chi Gymnema R.Br. gồm
hạ đường huyết, chống béo phì, chống oxy hóa và bảo vệ gan. Các thống kê và tài liệu
đi kèm thể hiện trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số tác dụng sinh học đã công bố của các loài thuộc chi Gymnema

R.Br.
Loài

Tác dụng sinh học
Hạ đường huyết
Hạ lipid máu và chống

Gymnema sylvestre (Retz) R. Br.
Ex Schult

béo phì
Bảo vệ gan
Khả năng gây độc tế bào
khối u

Gymnema latifolium Wall. Ex
Wight
Gymnema

inodorum

Tài liệu tham khảo
[19], [43], [51], [14]
[19]
[55]
[22], [55], [59], [39]

Hoạt tính kháng khuẩn

[55]

Hạ đường huyết

[10], [14]

(Lour.) Hạ đường huyết

[14]

Decne

Bảo vệ gan

[54]

Gymnema yunnanense Tsiang

Hạ đường huyết

[14]

1.2. Chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam
Theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ (2000) [7], Võ Văn Chi (2004) [4], Trần Thế
Bách (2007) [2], chi Gymnema R.Br. phân bố ở Việt Nam có 6 loài là Gymnema
albiflorum Cost., Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall. Ex
Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema reticulatum (Moon) Alst. và Gymnema
sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult. Để xác định các loài này, TS. Trần Thế Bách (2007)
đã xây dựng khóa phân loại cho chi Gymnema R.Br. ở Việt Nam (bảng 1.2) sử dụng các
3

đặc điểm phân loại chính của quả và hạt, bao gồm: kích thước quả, kích thước mào lông
và độ dài hạt [2].
Bảng 1.2. Khóa phân loại các loài của chi Gymnema ở Việt Nam [2]
1A. Quả dài hơn 12 cm…………………………………………………1.G. inodorum
1.B. Quả ngắn hơn 10 cm
2.A. Mào lông ngắn hơn 2,6 cm……………………………….……..2.G. yunnanense
2.B. Mào lông dài hơn hay bằng 3 cm
3.A. Chiều dài hạt ngắn hơn 0,9 cm…………………..…..…………....3.G. sylvestre
3.B. Chiều dài hạt lớn hơn 1 cm
4.A. Chiều dài quả ngắn hơn 6 cm; mào lông ngắn hơn 3,5 mm………...4.G. latifolium
4.B. Chiều dài quả dài hơn 6 cm; mào lông dài hơn 3,5 mm………......5.G. reticulatum
Các đặc điểm thực vật của 4 loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult,
Gymnema latifolium Wall. Ex Wight, Gymnema inodorum (Lour.) Decne và Gymnema
yunnanense Tsiang cũng đã được mô tả chi tiết trong nghiên cứu của tác giả Phạm Hà
Thanh Tùng năm 2012 [15].
1.2.1. Loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult
1.2.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Thân leo tới 8m, có lỗ vỏ rải rác, toàn thân có nhựa mủ trắng. Thân non có lông
sau nhẵn, thân bánh tẻ ở gần gốc có vân dạng cánh. Cuống lá 3-12 mm; phiến lá hơi dày
có trứng, bầu dục hoặc trứng ngược, kích thước 3-8.5 × 1.5-5.5 cm, có lông tơ hướng
trục trừ những đường khía dọc ở gân giữa, chuyển từ có lông mịn đến nhẵn ở gân chính.
Gân bên 4-5 cặp, uốn cong về phía mép lá. Cụm hoa xim ở nách lá thường ngắn hơn rất
nhiều so với lá, có nhiều lông. Trục cụm hoa 2-5mm, cuống hoa rụng để lại những vết
sẹo xoắn ốc xếp sát nhau. Đài 5, rời, hình trứng, có lông tơ. Tràng 5 hàn liền hình chuông,
màu trắng, vàng kem hoặc đỏ. Thùy tràng hình trứng, nhẵn, thường có vành màu trắng
ở mép thùy tràng. Tràng phụ 5, dài nhô ra ngoài đính ở họng tràng ở gốc có 2 dãy lông
màu nâu. Đầu nhụy hình nón trắng nhô ra ngoài. Bầu 2 lá noãn rời, hình trứng, dài 1 x
0,3 mm [15].
Quả 2 đại thường bị rụng chỉ còn 1, có dạng hình mác rộng, 5-9 × 2 cm, nhẵn,

4


đáy tròn, đầu nhọn . Hạt hình trứng, mép dạng màng, 8 × 4 mm; mào lông màu trắng
mượt, dài khoảng 3.5 cm [15].
Tên thường gọi: Dây thìa canh, dây muôi, lõa ti rừng. Cây thường mọc hoang dại
ở bờ bụi, hang rào nhiều tỉnh như Hải Dương, Hưng Yên, Bắc Giang, Quảng Bình,
Quảng Trị,…[4], [15].
1.2.1.2. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu sâu về thành phần hoá học của chi Gymnema R.Br chủ yếu được
tập trung vào loài Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult với các nhóm chất
triterpen saponin thuộc 2 nhóm olean và dammaran. Saponin khung olean có các acid
gymnemic và các gymnemasaponin [60], [63], trong khi đó các saponin khung
dammarane là các gymnemasid [25]. Trong lá Dây thìa canh lá nhỏ còn có resine,
albumin, chlorophyll, carbonhydrat, acid tartric, acid formic, acid butyric, anthraquinon,
alkaloid inositol, acid hữu cơ (5,5%), paraben, calci oxalat (7,3%), lignin (4,8%) và
cellulose (22%) [48], [49], [50].
Thành phần có tác dụng hạ đường huyết được xác định là các acid gymnemic, là
tên chung của các acid hữu cơ thuộc nhóm saponin triterpenoid [24], [33], [34], [49].
Các acid gymnemic là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylrol,…) của acid
deacylgymnemic tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-beta-glucoronid của gymnemagenin
[42]. Cấu trúc chung phần aglycon của gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic được
minh họa trong hình 1.1 và phụ lục 6.

R

R

6

5

R

4

1

R O
OR

2

Hình 1.1. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid gymnemic phân lập được từ
Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult [52]
Tuy nhiên, trong một nghiên cứu mới công bố vào năm 2018 của Phạm Hà Thanh
Tùng và cộng sự cho thấy loài G. sylvestre thu tại hai khu vực địa lý khác nhau là Ấn
5


Độ và Việt Nam có sự khác biệt về thành phần hóa học chính [37]. Thành phần hóa học
trong Dây thìa canh lá nhỏ Việt Nam gồm các acid dạng C-4 gem-dimethylat olean bao
gồm myrtillogen, chichipegenin, sitakisogenin, maniladiol, gymnemagenol, và 3b, 16b,
28-trihydroxyolean-12-en-29,22b-olid (hình 1.2). Kết quả này tương tự với một số
nghiên cứu về Dây thìa canh lá nhỏ tại Trung Quốc và khác biệt với các công bố đã có
về cây Dây thìa canh lá nhỏ có nguồn gốc Ấn Độ [37].
R

3

R

4

R
H

R

5

2

OH
R1

H

Hình 1.2. Khung cấu trúc phần aglycon của các acid dạng C-4 gem-dimethylat
olenan phân lập được từ Gymnema sylvestre (Retz) R. Br. Ex Schult nguồn gốc
Việt Nam [37]
1.2.2. Loài Gymnema latifolium Wall. Ex Wight
1.2.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Thân leo tới 6m. Thân có lỗ vỏ, các nhánh có nhiều lông tơ. Cuống lá 1,5 - 4 cm,
có lông tơ dày đặc; phiến lá 8-13 × 5-8 cm, lông dày đặc, càng xa trục càng dày đặc, gốc
tròn, ngọn nhọn, gân bên 6-7 cặp. Cụm hoa xim dạng đầu thành từng đôi ở mấu, có lông
dày. Một cụm mang rất nhiều hoa, mùi thơm. Cuống cụm hoa 1-1,5 cm, cuống hoa 3-8
mm. Đài hình trứng, phủ lông măng. Tràng hoa vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài.
Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, khoảng 1,2 ×
1,2 mm, phủ lông dày đặc hướng trục, ngắn hơn so với ống tràng. Khối nhị nhụy dạng

hình trụ, phần phụ nhị dạng màng ngắn hơn so với đầu núm nhụy. Khối phấn hình thuôn.
Đầu núm nhụy hình nón, đỉnh phân đôi [15].
Quả đại hình mác nhọn, 4,5-5,5 × 1,5-2 cm. Hạt hình trứng thuôn, dài khoảng
1,1 cm × 5 mm, mép dạng màng; mào lông dài 3 cm [15].
Tên thường gọi: Dây thìa canh lá to, lõa ti lá rộng. Loài Gymnema latifolium
Wall. Ex Wight được phân bố ở đảo Andaman và Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc
6


(Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala,
Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thailand [57], Việt Nam (Gia Lai, Tây Ninh,
Tuyên Quang, Hoà Bình, Thái Nguyên) [15].
1.2.2.2. Thành phần hóa học
Tại Việt Nam, bằng các phản ứng hóa học định tính xác định được trong lá cây
G. latifolium có mặt của các nhóm chất chính như: saponin, flavonoid, coumarin, tanin,
chất béo, đường khử, acid amin và acid hữu cơ. Trong đó, saponin và flavonoid là 2
nhóm chất chính của dược liệu [5], [11]. Hàm lượng saponin trung bình trong dược liệu
là: 5,60% ± 0,11 [11].
Dịch chiết G. latifolium sau khi thuỷ phân bằng acid và kiềm cho thấy có pic
tương ứng với pic của chất chuẩn gymnemagenin trên sắc ký đồ sau khi triển khai bằng
kỹ thuật HPTLC [15]. Điều này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Trần Thị Oanh năm
2014 với 2 acid gymnemic đã phân lập được là acid gymnemic I và acid gymnemic IV
(2 chất có cùng khung cấu tạo như khung hình 1.1) [11].
Bên cạnh đó, các nhóm hợp chất khác đã được chiết xuất, phân lập và xác định
cấu trúc trong Dây thìa canh lá to bao gồm 3 hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat là:
stigmasterol, lupeol acetat và 3β-acetoxy – 22,23,24,25,26,27 – hexanordammaran – 20
– one [10]. Gần đây nhất, năm 2020, Phạm Hà Thanh Tùng và cộng sự đã phân lập được
các 3β-hydroxy olean triterpenoid với khung aglycon là gynemagenin và
longispinogenin [38] (chi tiết trong phụ lục 6).

R

4

H
R
R
R
R1

2
5

6

H
R3

Hình 1.3. Khung cấu trúc phần aglycon của các 3β-hydroxy olean triterpenoid
phân lập được từ Gymnema latifolium Wall. Ex Wight [38]

7


1.2.3. Loài Gymnema inodorum (Lour.) Decne
1.2.3.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Dây leo tới 10m. Thân nhẵn, các nhánh non có màu nâu nhạt, có lỗ vỏ, phủ lông
măng. Cuống lá 2-6 cm; bề mặt lá nhẵn, hình trứng thuôn hoặc hình trứng rộng, 4-13 ×
2-9 cm, nhẵn hoặc phủ lông măng ở dọc gân lá. Gốc lá tròn hoặc hình tim nông, ngọn
lá nhọn hoặc nhọn kéo dài, 4-6 cặp gân bên. Cụm hoa xim dạng chùm xếp giống như

đầu, xếp xoắn ốc, tới 4 cm; Cuống cụm hoa 1-2 cm. Cuống hoa 1-1.5 cm. Đài thuôn, 23 × 1.4 mm, ngắn hơn ống tràng, có lông măng hoặc lông mịn. Tràng hoa màu vàng, 67 mm, có lông mịn dày đặc phía ngoài. Ống tràng dạng hình trụ, nhẵn trừ các dãy lông
dọc theo phần kẽ ống tràng, xen kẽ với các thùy tràng; Thùy tràng hình chữ nhật, 3-4 ×
1.6-1.8 mm, chóp nhọn, nhẵn trừ mép có lông tơ. Khối phấn hình chữ nhật. Đầu núm
nhụy có hình mái vòm, thò lên trên ống tràng [15].
Quả hai đại, hình mác, dài 16x3 cm, vỏ quả dày và hơi có sợi. Vỏ quả nhẵn. Hạt
khoảng 1.5x1 cm; mào lông khoảng 4 cm [15].
Tên thường gọi: Lõa ti không mùi, Lõa ti nhuộm, Rau mỏ, Dây thìa canh lá to.
Phân bố ở Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Vĩnh Phúc,...mọc
rộng khắp trên đất rừng, cạnh suối và lùm bụi [15].
1.2.3.2. Thành phần hóa học
Năm 2001, từ lá của G. inodorum, tác giả Kazumasa Shimizu đã phân lập được
4 hợp chất thuộc nhóm olean triterpenoid với một nhóm thế methyl anthranilat đặc trưng
gồm GiA-1, GiA-2, GiA-5 và GiA-7 [44]. Công thức khung chung của các chất này
minh họa trong hình 1.4 và phụ lục 6.
CH 2R

4

R

2

R3

HOOC

OH

O
HO

O
CH 2R
OR

6

OR

1

5

Hình 1.4. Khung cấu trúc của một số chất phân lập được từ loài Gymnema
inodorum (Lour.) Decne [44].
8


1.2.4. Loài Gymnema yunnanense Tsiang
1.2.4.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
Thân bụi leo, cao tới 8m. Thân bánh tẻ phình lên thành các rãnh sâu, thân non có
nhiều lỗ vỏ, bề mặt phủ lông dày đặc màu vàng sét. Toàn thân có nhựa mủ vàng. Lá đối,
cuống lá 0,8-1,5 cm. Phiến lá hình trứng, bầu dục hoặc trứng ngược, kích thước lá 6-13
× 2,5-6 cm, 5-6 cặp gân lông chim. Toàn bộ bề mặt phiến lá và gân lá có phủ lông sét
nâu. Mép lá nguyên, gốc lá tù hoặc tròn, ngọn lá nhọn. Cụm hoa xim mọc đối xứng nách
lá, mỗi cụm 12-20 hoa. Cuống 3- 4mm. Lá đài 5,2x2 mm rời, hình trứng, có lông dày
đặc. Tràng hàn liền màu vàng, mép thùy tràng có vành màu vàng kem nhạt. Ống thùy
hình trứng, 4x4mm, có phần phụ ở họng tràng mang lông dày màu vàng nâu. Phần phụ
của nhị rộng, thò cao lên trên ống tràng nhưng vẫn thấp hơn đầu núm nhụy. Khối phấn
hình khối chữ nhật, thẳng đứng, Đầu núm nhụy hình cầu, thò ra ngoài. Bộ nhụy gồm 2

lá noãn rời nhau. Hạt hình trứng thuôn dài 1,3-1,5 cm x 6 mm, mép dạng màng, mào
lông dài 2,5 cm [15].
Tên thường gọi: Lõa ti Nam Vân hay Dây thìa canh Vân Nam. Phân bố ở Kiên
Giang, Kom Tum, Gia Lai và Đắc Lắc [2], [4], [7].
1.2.3.2. Thành phần hóa học
Theo các tài liệu tham khảo, từ dịch chiết sau thủy phân của Dây thìa canh Vân
Nam đã xác định được các saponin có 4 khung aglycon C21 steroidal là penupogenin,
20- O-cinnamoylsarcostin, sarcostin và metaplexigenin. Bên cạnh đó, một loại aglycon
mới được phát hiện gymnemarsgenin [28].
Năm 1991, từ dịch chiết toàn phần của lá Gymnema yunnanense Tsiang, Zhang
và cộng sự đã phân lập được hai glycosid C21 mới có tên là gymnemarosid A và B [62].
Các khung này (hình 1.5 và phụ lục 6) có cấu trúc khác biệt so với các loài Dây thìa
canh khác (hình 1.3).
OR 1

OR 2
OH

OR
OH
R3O

Hình 1.5. Khung cấu trúc chung của các aglycon C21 phân lập được từ Gymnema
yunnanense Tsiang [28], [62].
9


1.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng
Quá trình tách hỗn hợp các chất bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) xảy ra khi cho pha

động chuyển qua pha tĩnh. Trong TLC pha tĩnh được rải thành lớp mỏng trên giá đỡ
phẳng. Dưới tác động của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất
phát – nơi mẫu được đưa lên bản mỏng. Trong quá trình di chuyển của pha động qua
pha tĩnh, nhờ quá trình hấp phụ và giải hấp phụ được lặp lại nhiều lần và hệ số phân bố
khác nhau mà những chất khác nhau sẽ di chuyển theo hướng của pha động với tốc độ
khác nhau. Kết quả mỗi chất phân tích sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên
bản mỏng [13].
1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
HPTLC là dạng nâng cao và tự động hóa của TLC và cho phép phun mẫu lên bản
mỏng chính xác hơn và đánh giá định lượng các vết được tách. Sự cải tiến về kỹ thuật
này làm tăng hiệu lực tách và giảm thời gian phân tích. Sự khác nhau giữa TLC và
HPTLC ở chỗ kích thước và mức độ đồng đều hạt của chất hấp phụ. TLC thường có
phạm vi kích thước hạt từ 10-15µm, trung bình khoảng 20µm nhưng với HPTLC phạm
vi kích thước hạt nhỏ hơn và kích thước hạt trung bình khoảng 5µm. Phương pháp đưa
mẫu lên bản mỏng cũng được cải tiến với thiết kế dụng cụ phun mẫu chính xác làm giảm
đường kính vết phun ban đầu. Những cải tiến này làm giảm đáng kể thời gian và tăng
hiệu lực tách của peak [1], [31].
HPTLC là một kỹ thuật đơn giản, trực quan và thực dụng, có khả năng mang lại
kết quả đáng tin cậy và có thể tái tạo, dựa trên phương pháp được tiêu chuẩn hóa và sử
dụng SST cho chất lượng tấm. Những cải tiến được giới thiệu trong Dược điển, đặc biệt
là trong Dược điển Châu Âu và Dược điển Mỹ, cùng với thiết bị và phần mềm cho phép
ghi lại hình ảnh điện tử chuẩn hóa của sắc ký đồ (dấu vân tay) và sự biến đổi của chúng
thành cấu hình đỉnh (PPI), mở ra cánh cửa để lấy thông tin định lượng từ phân tích được
thực hiện để nhận dạng. Dựa vào đó, khái niệm về dấu vân tay HPTLC toàn diện đã
được giới thiệu. Nó cho phép đơn giản hóa các quy trình kiểm soát chất lượng đối với
thuốc/ chế phẩm/ sản phẩm thảo dược, bởi vì từ một phân tích HPTLC duy nhất, có thể
thu được thông tin về nhận dạng, độ tinh khiết và đặc tính [41].

10

1.4. Vân tay sắc ký thực vật
Khái niệm dấu vân tay hóa học được đề cập trong phụ lục 12.23 Dược điển Việt
Nam V như sau: dấu vân tay hóa học là các thông tin hóa học của dược liệu được biểu
thị dưới dạng sắc ký đồ, các phổ và các đồ thị… được ghi bằng các kỹ thuật phân tích
(kỹ thuật sắc ký) hay còn được gọi là sắc ký đồ dấu vân tay [8].
Nói cách khác sắc ký đồ dấu vân tay là một hồ sơ sắc ký bao gồm tất cả các vết
sắc ký của các thành phần đặc trưng từ dược liệu hoặc thuốc từ dược liệu được nghiên
cứu. Hồ sơ sắc ký sẽ cung cấp thông tin như tính toàn vẹn, độ đậm nhạt, sự giống hay
khác nhau của các chất đặc trưng cho loài. Do đó, với dấu vân tay sắc ký thu được có
khả năng xác thực cũng như xác định các loài dược liệu một cách hiệu quả ngay cả khi
số lượng và/hoặc nồng độ các thành phần đặc trưng hóa học là không giống nhau giữa
các mẫu khác nhau [30].
Như vậy, dấu vân tay có khả năng cung cấp thông tin cho ba cấp độ kiểm soát
chất lượng phân tích. Những mức độ kiểm soát chất lượng là:
-

Xác định thực vật (xác thực loài, tuổi và nguồn gốc);

-

Định lượng hoạt chất;

-

Phát hiện tạp chất, chất gây ô nhiễm hoặc chất pha trộn [17].
Theo hướng dẫn của WHO về việc lựa chọn các chất đánh dấu của dược liệu để

kiểm soát chất lượng thuốc thảo dược [35], tiêu chí lựa chọn các chất tham chiếu và
kiểm soát chất lượng thuốc thảo dược nên tính đến các thành phần khác nhau có thể có

mức độ ảnh hưởng khác nhau đến chất lượng, an toàn và hiệu quả cuối cùng. Do đó, thứ
tự lựa chọn các chất để xác định và định lượng phải tuân theo các quy tắc được trình bày
dưới đây:
-

Nếu các thành phần có tác dụng đã biết và đã được xác định, chúng nên được sử
dụng làm vết đánh dấu.

-

Nếu không phải là trường hợp 1 nhưng thành phần được công nhận tác dụng dược
lý nên được sử dụng làm vết đánh dấu.

-

Nếu các trường hợp trên không được áp dụng, danh tính của nguyên liệu thảo
dược, chế phẩm và thuốc có thể được xây dựng bằng cách phân tích (các) chất
đánh dấu là các thành phần đặc trưng khác.

-

Ngoài ra cũng có thể dùng dược liệu chuẩn để đối chiếu.
Tổ chức Y tế Thế giới WHO cũng đã đưa ra định nghĩa về chất đặc trưng như
11


sau: “Một thành phần chất tự nhiên có trong một bộ phận của cây có thể được dùng để
đảm bảo cho sự nhận biết hoặc đảm bảo chất lượng chế phẩm của cây thuốc đó, không
nhất thiết là hoạt chất” [35].
Các phương pháp sắc ký xác định dấu vân tay đang được sử dụng là TLC,

HPTLC, HPLC, GC, hoặc sắc ký kết hợp đo phổ LC-MS, GC-MS, HPLC-DAD…[30].
Phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có nhiều ưu điểm so
với các phương pháp khác là:
-

Có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu, tiết kiệm chi phí, dung môi và thời gian

-

Có thể vừa định tính vừa định lượng

-

Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được phun trên cùng một bản mỏng sắc ký,
khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên có thể so
sánh trực tiếp đối chứng nhau, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần
phân tích.

-

Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý dung môi trước (lọc hay siêu âm).

******
Như vậy, theo các tài liệu ghi nhận được, có 04 loài thuộc chi Gymnema R.Br. là
G. sylvestre, G. latifolium, G. inodorum và G. yunnanense ở Việt Nam hiện đang được
nghiên cứu đều có tác dụng hạ đường huyết ở các mức độ khác nhau. Bên cạnh những
đặc điểm tương đối khác biệt về hình thái, các aglycon trong khung cấu trúc saponin của
thành phần hóa học bốn loài Dây thìa canh này cũng có sự khác biệt nhất định (bảng
1.3). Chính sự khác biệt về cấu trúc sẽ dẫn đến sự khác biệt về các vết sắc ký trên sắc
ký đồ của từng loài Dây thìa canh.

Mặt khác, trên thị trường, khi các chế phẩm đã sử dụng dạng dược liệu khô cắt
nhỏ hoặc dạng cao chiết từ Dây thìa canh nên rất khó có thể nhận biết được sự có mặt
của loài Dây thìa canh nào trong chế phẩm nhờ cảm quan. Do đó, nghiên cứu dự kiến
sử dụng các vết sắc ký điển hình là cơ sở quan trọng để có thể bước đầu phân biệt được
các loài trong chi dựa trên bằng chứng hóa học đơn giản.

12


Bảng 1.3. Tổng hợp sự khác biệt về cấu trúc khung chất chính của các loài trong
chi Gymnema R.Br.
R

R

R

3

6

R

5

4

R

R

4

H

R

5

2

OH
1

R1

R O
OR

H

2

Khung saponin chính trong loài G.

Khung saponin chính trong loài G.

sylvestre nguồn gốc Ấn Độ

sylvestre nguồn gốc Việt Nam

R

OR 1

4

H
R
R
R
R1

OR 2
OH

2

OR

5

6

OH
R3O

H
R3

Khung saponin chính trong loài G.

Khung saponin chính trong loài G.

yunnanense

latifolium
CH 2R

4

R

2

R3

HOOC

OH

O
HO

O
CH 2R
OR

6

OR

1

5

Khung saponin chính trong loài G. inodorum

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1. Mẫu nghiên cứu
- Mẫu nghiên cứu xây dựng vân tay sắc ký theo loài (nhóm 1): Các mẫu thuộc
chi Gymnema R.Br. thu hái ở Hòa Bình, Quảng Bình, Nam Định và vùng trồng Dây thìa
canh ở Phú Lương, Thái Nguyên; được thu hái trong thời gian gần nhau vào tháng 5 và
đầu tháng 6 năm 2020. Các mẫu nghiên cứu đều được giám định tên khoa học và lưu
mẫu tại phòng tiêu bản của Trường Đại học Dược Hà Nội (phụ lục 1).
Tên loài, địa điểm, thời điểm thu mẫu, dạng mẫu lúc thu và ký hiệu trong nghiên
cứu của từng mẫu được thể hiện trong bảng 2.1-i.
- Mẫu nghiên cứu để so sánh sắc ký đồ và xác định loài (nhóm 2): Là các mẫu
thu mua trên thị trường, thông tin mẫu thể hiện trong bảng 2.1-ii.
Bảng 2.1. Danh mục và ký hiệu các mẫu trong nghiên cứu (i và ii)
i) Mẫu xây dựng vân tay sắc ký
STT

Loài

Tên thường

Thời gian, địa điểm

Dạng mẫu

Ký

gọi

thu mẫu

lúc thu

hiệu

Lá tươi

GS1a

Dược liệu

GS3

16/5/2020, Yên Ninh,
Phú Lương, Thái

1

Nguyên
Dây thìa canh

lá nhỏ

2
3

G. sylvestre

T6/2020, Hải Hậu,
Nam Định
T6/2020, Quảng Bình
T6/2020, Quảng Bình

4
Dây thìa canh

5

nhập nội

6

và lá

GS4
GS5

16/5/2020, Yên Ninh,
Phú Lương, Thái

Lá tươi

GS2

Nguyên

Thái Nguyên

GL1a

7

G. latifolium

Giống gốc

16/5/2020, Yên Ninh,

8

(Dây thìa

Thái Lan

Phú Lương, Thái

9

canh lá to)

Cuống ngắn

Nguyên

10

khô lẫn cành

Cuống dài

GL2a
Lá tươi

GL3a
GL4a
GL5a

14


STT

11

12

Loài

Tên thường

Thời gian, địa điểm

Dạng mẫu

Ký

gọi

thu mẫu

lúc thu

hiệu

Lá tươi

GYa

Lá tươi

GIa

G.

Dây thìa canh

yunnanense

Vân Nam

G. inodorum

16/5/2020, Yên Ninh,
Phú Lương, Thái
Nguyên
T6/2020, Kim Bôi,
Hòa Bình

ii) Mẫu nghiên cứu để so sánh sắc ký đồ và xác định loài
Thời gian, địa điểm thu mẫu

STT

13
14
15

16

Dạng mẫu lúc
thu mua

T6/2020, sản phẩm Trà dây thìa canh đặc

T5/2020, sản phẩm từ công ty Dược liệu
Indochina Herb, Hà Nội

trong nghiên
cứu
GX1

biệt của công ty DK natura, Thái Nguyên
T6/2020, chợ thuốc Lãn Ông, Hà Nội

Ký hiệu

Dược liệu khô
gồm cành và lá

T6/2020, mua tại chợ ở Kim Bôi, Hòa
Bình

GX2
GX3

GX4

2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu
2.1.2.1. Hóa chất, dung môi
- Hóa chất, dung môi và thuốc thử được sử dụng đều đạt tiêu chuẩn phân tích
theo Dược điển Việt Nam V: KOH, toluen, aceton, methanol, ethanol 96%, ethylacetat,
acid formic, HCl đặc, H2SO4 đặc, nước cất, thuốc thử hiện màu vanillin-acid sulfuric
(pha theo phụ lục 2.1.1 Dược điển Việt Nam V tập 2: Trộn đồng lượng dung dịch vanilin
1% trong ethanol 96% và dung dịch acid sulfuric 5% trong ethanol 96%; pha trước khi
dùng [8]),…
- Chất chuẩn: Gymnemagenin (thông số mẫu: lot PRF9072601, cas 22467-07-8,
độ tinh khiết 99,4%), cân 5.32mg hòa tan trong vừa đủ 5.0ml MeOH, lắc đều, bảo quản
trong ngắn mát tủ lạnh. Nồng độ dung dịch chuẩn 1.064 mg/ml (pha sẵn do Viện kiểm
nghiệm thuốc trung ương cung cấp).
- Bản mỏng chạy TLC Silica Gel GF254 (Merck).
15

2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị dùng trong thí nghiệm
-

Các dụng cụ thí nghiệm thường quy (bình nón nút mài, giấy lọc, cốc có mỏ, bình
gạn, ống đong, ống ly tâm, pipet…) và các dụng cụ khác (mao quản, bình khai
triển sắc ký…)

-

Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ)

-

Cân kỹ thuật Sartorius, độ chính xác 0,01 g (Đức)

-

Cân phân tích Shimadzu, độ chính xác 0,0001g (Nhật Bản)

-

Tủ sấy Memmert (Đức)

-

Bể siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức)

-

Máy li tâm lạnh Centrifuge (Trung Quốc)

-

Hệ thống HPTLC CAMAG gồm: bàn tiêm mẫu tự động LIMONAT V, bình khai
triển bản mỏng tự động ADC2, buồng chụp sắc ký TLC Visualizer, máy nhúng
thuốc thử, máy vi tính với phần mềm điều khiển winCATS và phần mềm phân
tích VideoSan (Thụy Sỹ).

2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Khảo sát một số thông số của quy trình phân tích vân tay sắc ký các mẫu nghiên
cứu
- Khảo sát điều kiện chạy sắc ký cho dịch chiết toàn phần và dịch chiết phân đoạn
ethyl acetat sau thủy phân gồm: hệ dung môi pha động, thể tích tiêm mẫu nhằm lựa chọn
được điều kiện ra được sắc ký đồ tách biệt rõ nét nhất khi hiện màu bằng UV 254nm,
UV 366nm và thuốc thử vanilin-acid sulfuric.
- Xây dựng quy trình tối ưu từ các yếu tố đã nghiên cứu cho phân tích HPTLC
bằng hệ thống CAMAG.
2.2.2. Xây dựng vân tay hóa học của một số loài thuộc chi Gymnema R.Br.
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng và phân tích sắc ký đồ dịch chiết trước và
sau thủy phân của các mẫu nghiên cứu từ đó xây dựng vân tay sắc ký điển hình của mỗi
loài.
2.2.3. Xây dựng cây phân loại dựa trên thành phần hoá học (sắc ký đồ) của các mẫu
nghiên cứu.
Tiến hành phân tích sự đa dạng về thành phần hóa học giữa các loài trong chi
Gymnema dựa trên các thông tin vân tay sắc ký thu được từ đó xây dựng cây phân loại
đến loài theo sự xuất hiện các vết trên sắc ký đồ ở các mẫu nghiên cứu.
16

2.2.4. Ứng dụng phân tích sắc ký đồ của một số mẫu Dây thìa canh thu được trên thị
trường
Tiến hành sắc ký và so sánh sắc ký đồ của các mẫu Dây thìa canh trên thị trường
với sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu để có kết luận ban đầu về sự xuất hiện của các
loài Gymnema trong các mẫu Dây thìa canh thu được trên thị trường.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích
Các mẫu nghiên cứu được chiết đồng thời bằng 2 phương pháp để thu được dịch
chiết toàn phần và dịch chiết sau khi thủy phân. Trong đó, mẫu GS1a được lựa chọn làm
mẫu khảo sát quy trình phân tích.
2.3.1.1. Chuẩn bị dược liệu
- Với các mẫu thu được lá tươi: Mẫu được rửa sạch, sấy khô ở 55oC đến hàm ẩm
dưới 12%. Với các mẫu dược liệu khô: Chọn lấy phần lá làm nguyên liệu nghiên cứu.
- Các mẫu sau đó được xay đến bột thô và rây qua rây 0,71mm bảo quản trong
túi nilon kín.
2.3.1.2. Chuẩn bị dịch chiết toàn phần
Cân chính xác khoảng 2g bột dược liệu vào bình nón nút mài 250ml. Tiến hành
chiết siêu âm 3 lần, mỗi lần với 50ml ethanol 70% trong 30 phút. Lọc, gộp dịch, cô đến
cắn. Cắn này hòa tan trong 10ml methanol rồi đi ly tâm lấy dịch làm mẫu chấm sắc ký.
2.3.1.3. Chuẩn bị dịch chiết sau thủy phân
Dược liệu được thủy phân các liên kết glycosid trong môi trường acid rồi làm
lạnh để tủa xuống aglycon dạng muối; kiềm hóa tủa này thu được aglycon dạng base.
Chiết đồng lượng lỏng-lỏng bằng ethyl acetat (lắc trong bình gạn) dịch nước chứa
aglycon base này thu được phân đoạn các aglycon tan trong ethyl acetat, lấy tất cả các
chất trong phân đoạn này làm dịch phun sắc ký. Quy trình chi tiết thể hiện trong hình
2.1.

17