Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại miền Bắc

Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 7: 475-484

Tp chớ Khoa hc Nụng nghip Vit Nam 2020, 18(7): 475-484
www.vnua.edu.vn

KT QU THIT LP PHN NG TRUNG HềA PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS (PEDV)
S DNG CHNG THC A PHN LP TI MIN BC
Nguyn Th Bớch1*, Trn Vn Khỏnh1, Nguyn Thanh Ba1, Chu Th Thanh Hng2
Cụng ty TNHH Dc Hanvet
Khoa Thỳ y, Hc vin Nụng nghip Vit Nam
1

2

*

Tỏc gi liờn h:
Ngy chp nhn ng: 23.06.2020

Ngy nhn bi: 18.05.2020
TểM TT

Nghiờn cu c thc hin nhm thit lp phn ng trung hũa s dng chng virus thc a lm cụng c
ỏnh giỏ kh nng bo h ca vacxin chng li cỏc chng PEDV gõy bnh lu hnh ti Vit Nam. Bng cỏch la
chn mụi trng DMEM khụng cha huyt thanh bo thai bờ (FBS), khụng cha trypsin pha mu phn ng, pha
hn dch virus, la chn mụi trng duy trỡ cha 8àg trypsin/ml ó ti u c quy trỡnh trung hũa virus, ti u cỏch
ỏnh giỏ khỏng th trung hũa bng phng phỏp nhum húa min dch trờn t bo mt lp, kt qu thớ nghim cho
thy phn ng trung hũa virus thc a cú nhy 87,46% v c hiu 98,18% khi so sỏnh vi phn ng ELISA
phỏt hin khỏng th c hiu lp IgG. ng dng phn ng trung hũa phỏt hin bin ng khỏng th trung hũa PEDV
mu sa u v huyt thanh ca ln nỏi v ln con theo m.
T khúa: Porcine epidemic diarrhea virus, phn ng trung hũa virus.

Establishing Virus Neutralizing Test Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV)
using Isolated Field Strains in the North of Viet Nam
ABSTRACT
The study aimed to establish a virus neutralization test for field isolated virus, create a tool for assessing the
protection of vaccines against pathogenic porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) strains in Vietnam. By using
DMEM medium free calf fetal serum (FBS) and without trypsin for dilution sample preparation/viral suspensions, and
the maintenance medium containing 8 àg of trypsin/ml, the virus neutralization test and evaluation of neutralizing
antibodies by immunochemical staining on monolayer cells were optimized. The results showed that the virus
neutralization test for field isolated virus with the sensitivity of 87.46% and specificity 98.18% with compared to ELISA
kit. It also pointed out that the virus neutralization test could be applicated to detect fluctuation of PEDV neutralization
antibody in colostrum and serum of mother and piglets.
Keywords: Porcine epidemic diarrhea virus, virus neutralizing test (VNT).

1. T VN
Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV)
thuỷc hừ Coronaviridae, giứng Alphacoronavirus
l nguyờn nhõn gõy tiờu chõy cỗp v mỗt nc
trổm trừng ln (Debouck & Pensaert, 1980;
Stevenson & cs., 2013). PEDV c phỏt hin lổn
ổu tiờn trờn th gii vo nởm 1971 tọi mỷt ự
dch tiờu chõy cỗp Anh. n nởm 1977 bnh
tiờu chõy trờn ln xõy ra nghiờm trừng tọi Bợ,
chỵng virus phõn lờp c vi tờn gừi CV777

(Pensaert & De Bouck, 1978). Dch tiờu chõy do
PEDV gõy ra xõy ra rỷng khớp chõu u trong
nhng nởm 1970 n nởm 1980. T nởm 1980
n nởm 1990, sứ ự dch giõm dổn chõu lc ny.
Nởm 2013 bnh lổn ổu tiờn bựng phỏt chõu

M vi bỏo cỏo dch ổu tiờn nc M (Wang &
cs., 2014), sau ũ dch lan nhanh cỏc nc cú biờn
gii vi M. Phõn tớch di truyn cho thỗy hổu ht
virus phõn lờp chõu v chõu M thuỷc nhúm
mi nựi G2b, nỡm nhỏnh khỏc hon ton vi
chỵng virus thuỷc nhũm G1 thng dựng ch

475


Kt qu thit lp phn ng trung hũa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) s dng chng thc a phõn lp ti
min Bc

vacxin trc ũ (Lee, 2015). Vit Nam l nc
xuỗt hin bnh PED muỷn so vi cỏc nc trong
khu vc. PED chớnh thc c phỏt hin t nởm
2008, c xỏc nh cú quan h gổn vi cỏc chỵng
Trung Quức (Toan & cs., 2011). Cú 2 nhúm di
truyn cỵa PEDV min Bớc v Bớc Trung Bỷ,
trong ũ nhũm mi nựi G2 chim u th (Nguyn
Trung Tin & cs., 2017)). PEDV l mỷt virus luụn
bin ựi, k t nởm 2010, ó cũ s bin ựi cỵa
PEDV tọi thc a so vi cỏc chỵng vacxin (Sun
& cs., 2012; Stevenson & cs., 2013; Lee & Lee,
2014; Bongkyun Park & Song, 2016). Do ũ, dỹ
chng trỡnh dỹng vacxin PED ổy ỵ trờn ln
cỏc c s chởn nuửi, nhng dch tiờu chõy do
PEDV vộn xõy ra. Vit Nam, cho n thi
im hin tọi, vacxin thng mọi chỵ yu l
vacxin vụ hoọt hoc nhc ỷc da vo cỏc chỵng

thuỷc nhúm cự in nh: CV777, DR13, SM98.
Protein S cỵa PEDV cũ vai trủ kớch thớch c
th vờt chỵ sinh khỏng th trung hủa, ững thi
giỳp virus tip cờn v xõm nhờp vo t vo vờt
chỵ (Bosch & cs., 2003; D. Song & Park, 2012).
Do ũ, phõn ng trung hủa l phng phỏp giỏn
tip ỏnh giỏ tỡnh trọng min dch chứng lọi
PEDV (Oh & cs., 2005), vi ngng khỏng th
trung hũa 5 log2 cú khõ nởng bõo hỷ chứng lọi
cửng cng ỷc (Clement & cs., 2016). So vi
nhúm cự in, cỏc chỵng PEDV thuỷc nhúm mi
nựi c chng minh khỏng cao vi
interferon v khụng b trung hũa bi khỏng th
kớch thớch tọo ra bi chỵng PEDV cự in (Shin
& Park, 2019). Cỏc kt quõ nghiờn cu trờn cho
thỗy ỏp ng min dch tọo ra chợ cú khõ nởng
bõo hỷ ững chỵng. Do ũ tng quan gia bõo
hỷ v hiu giỏ khỏng th trung hũa cổn da trờn
chỵng virus hin lu hnh thc a. gúp
phổn xõy dng cụng c giỏm sỏt lu hnh huyt
thanh hừc v ỏnh giỏ khõ nởng bõo hỷ cỵa vớc
xin, phõn ng trung hũa PEDV vi chỵng virus
phõn lờp thc a cổn c thit lờp.

2. PHNG PHP NGHIấN CU
2.1. Vt liu nghiờn cu
- Chỵng PEDV 0118 phõn lờp t ln con
theo m mớc tiờu chõy cỗp do phũng thớ nghim

476

Cụng ty Hanvet cung cỗp. Chỵng virus ny ó
giỏm nh l PEDV, thuỷc nhúm di truyn G2
bỡng cp mữi c hiu genogroup (Zhao & cs.,
2014). Chỵng PEDV 0118 củn c khợng nh
khụng tọp TGEV, Rotavirus theo phng phỏp
v trỡnh t mữi mụ tõ trc ồy (Song & cs.,
2006). Mỷt sứ c tớnh sinh hừc cỵa chỵng
PEDV 0118 l: cú hiu giỏ 106,1 TCID50/ml, cú
ỷc lc khi gõy cht 5/5 ln 2 ngy tuựi vi liu
104,5 TCID50/ml/ con theo ng uứng. Chỵng
virus c chia nhú v bõo quõn -80C. Chuốn
ỷ ngc (back titration) mỳi lổn thc hin
phõn ng nhỡm õm bõo hiu giỏ virus thc
dỹng dao ỷng xung quanh 100 TCID50/100àl.
- Huyt thanh ln (nỏi, ln con theo m)
trọi ồm tớnh v dng tớnh PEDV, sa ổu cỵa
ln nỏi;
- Dũng t bo Vero (ATCC - CCL-81);
- Mửi trng: Dulbecco's Modified Eagle
Medium (DMEM- Gibco), huyt thanh bo thai
bũ (FBS-Gibco); Tryptose Phosphate Broth
(TBP-Merck); Yeast extract (YE-Merck);
Trypsin 1: 250 (Gibco);
- Sinh phốm, húa chỗt dựng nhuỷm IPMA:
antiPEDV
monoclonal
antibody
(Median Diagnostics Inc), HRP- conjugated goat
anti- mouse IgG (US Biological); N, NDimethylformamide (Sigma); c chỗt 3-amino9-ethylcarbazole (AEC- Sigma);

- PBS 1X, pH 7,2;
- Bỷ kớt tựng hp cDNA (MMLV reverse
transcriptase, Promega, M1705), kớt PCR
(GoTaq G2 Hot Start Master, Promega, M7423);
cỏc bỷ mữi c hiu giỏm nh genogroup
PEDV, phỏt hin TGEV, Rotavirus c lỗy
theo nghiờn cu trc ồy (Song & cs., 2006;
Zhao & cs., 2014);
- Bỷ kớt ELISA (c thit lờp theo tiờu
chuốn c s) phỏt hin khỏng th khỏng protein
S cỵa PEDV;
- Dng c v thit b: ùa nuửi t bo 96
ging, ùa lm phõn ng ELISA, tỵ nuụi ỗm 5%
CO2, kớnh hin vi soi ngc, mỏy ừc ELISA;
mỏy PCR.


Nguyn Th Bớch, Trn Vn Khỏnh, Nguyn Thanh Ba, Chu Th Thanh Hng

2.2. Phng phỏp nghiờn cu
2.2.1. Thit lp phn ng trung hũa PEDV
Phng phỏp trung hủa virus c thit lờp
vi s iu chợnh t cỏc ti liu ó mử tõ trc
ồy (Paudel & cs., 2014b; Collin & cs., 2015;
Clement & cs., 2016). Phõn ng c thit lờp
da trờn loọt huyt thanh ln dng tớnh v
huyt thanh õm tớnh vi khỏng th khỏng
PEDV. Cỏc mộu ny c chừn t bỷ huyt
thanh theo tiờu chuốn c s. C th, huyt
thanh c thu thờp ln t 2 trang trọi: mỷt

trang trọi ln khụng cú tin s bnh tiờu chõy
do virus, xột nghim virus hừc õm tớnh vi
PEDV; trang trọi cũn lọi ó tng mớc PED, cú
kt quõ xột nghim dng tớnh vi PEDV bỡng
phng phỏp RT-PCR vi cp mữi c hiu c
tõ trc ồy (Song & cs., 2006). Mộu huyt
thanh c bỗt hoọt 56C/30 phỳt v khợng
nh chớc chớn dng tớnh hoc õm tớnh khỏng
th khỏng PEDV bỡng phõn ng ELISA c s.
Huyt thanh cổn xỏc nh hiu giỏ khỏng
th trung hủa c pha loóng liờn tip theo c sứ
2. Mỳi ỷ pha loóng c trỷn vi th tớch virus
cứ nh (hiu giỏ 100 TCID50/100àl) theo t l
1:1. huyn dch huyt thanh: virus 37C/5%
CO2 trong vũng 1 gi 30 phỳt. Chuyn 100àl hỳn
dch huyt thanh: virus vo t bo Vero 1 lp
(ó c ra 3 lổn bỡng PBS- 1X). Sau thi gian
hỗp ph 1 gi 30 phỳt, hỳt bú dch huyn dch,
ra t bo 3 lổn v thờm 100àl DMEM duy trỡ
cú TPB (0,3%), YE (0,02%) v trypsin (8 àg/ml).
Xỏc nh ging cú khỏng th trung hũa
dng tớnh bỡng phng phỏp hũa min dch,
phõn ng min dch trờn t bo mỷt lp, cứ nh
thõm t bo bỡng dung dch PBS cha 10%
Formalin v 1% NP40, sau ũ thờm khỏng th
c hiu PEDV (anti- PEDV monoclonal
antibody - Median Diagnostics Inc), ra ùa
phõn ng, thờm khỏng th cỷng hp (HRPconjugated goat anti- mouse IgG (US
Biological), thờm c chỗt AEC. T bo nhim
virus c hiu khi quan sỏt qua kớnh hin vi soi

ngc nguyờn sinh chỗt cỵa t bo bớt mu ú
cỵa c chỗt AEC. ừc kt quõ trung hũa theo mụ
tõ trc ồy (Paudel & cs., 2014a), da vo mc
ỷ giõm 90% sứ t bo/sứ cm t bo nhim

virus so vi ứi chng õm. Hiu giỏ khỏng th
trung hũa l sứ nghch õo cỵa ỷ pha loóng cao
nhỗt m ỷ pha loóng ũ dng tớnh. Mộu
c coi dng tớnh khi hiu giỏ khỏng th
trung hũa 8 (Chen & cs., 2016). Nhng bỏo cỏo
khỏc thỗy rỡng 90% sứ ln nghiờn cu cú hiu
giỏ khỏng th trung hũa 20, nờn ngng dng
c xỏc nh hiu giỏ khỏng th 20 (Collin &
cs., 2015; Chen & cs., 2016).
2.2.2. Phng phỏp ELISA phỏt hin khỏng
th khỏng PEDV
lm c s tớnh ỷ nhọy v ỷ c hiu
cỵa phõn ng trung hũa, nghiờn cu ny chừn
phõn ng ELISA (phỏt hin khỏng th lp IgG)
lm tham chiu. Kớt ELISA ó thit lờp theo
tiờu chuốn c s (ELISA c s) c ỏnh giỏ ỷ
nhọy/c hiu vi kớt ELISA thng mọi
SwinecheckPED indirect, BioVet (khụng trỡnh
by). Cỏc bc thc hin túm tớt nh sau: chỵng
PEDV 0118 cng ỷc phỵ ùa hiu giỏ 104,2
TCID50/ml trong coating buffer (pH = 9,6) 4C
trong 12 gi; huyt thanh chốn oỏn c pha
1/200 trong sa tỏch b 3% - PBS - Tween 20
0,05%; khỏng th khỏng ln gớn enzyme c
pha 1/1.200 trong sa tỏch b 3% - PBS - Tween

20 0,05%. Gia cỏc bc, ỵ nhit ỷ 37C,
trong vũng 60 phỳt; ra 3 lổn bỡng dung dch
PBS - Tween 20 0,05% loọi bú cỏc thnh
phổn khửng c hiu. Mộu cú giỏ tr ngng
OD450 <0,225 c xỏc nh õm tớnh vi khỏng
th khỏng PEDV.
2.2.3. ỏnh giỏ nhy, c hiu ca
phn ng trung hũa virus
Phõn ng ELISA c dựng lm tiờu chuốn
ứi chiu kt quõ cỵa phng phỏp trung hủa
virus c thit lờp. C th, mỳi mộu huyt
thanh s c phõn tớch lổn lt bỡng phõn ng
ELISA c s v phõn ng trung hũa virus. Mứi
tng quan gia giỏ tr OD450 cỵa ELISA c s
v hiu giỏ trung hủa c xỏc nh bỡng giỏ tr
R (Pearson Correlation Coefficient), tớnh theo
dộn liu t nguữn: scistatistics.
com/tests/pearson/default2.aspx. Cỏch tớnh ỷ
nhọy v ỷ c hiu cỵa phng phỏp c
trỡnh by bõng 1.

477


Kt qu thit lp phn ng trung hũa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) s dng chng thc a phõn lp ti
min Bc

Bõng 1. Cỏch tớnh nhy, c hiu ca phõn ng trung hũa
Kt qu phn ng trung hũa

Kt qu ELISA c s
S mu dng tớnh

S mu õm tớnh

S mu dng tớnh

TP

FP

S mu õm tớnh

FN

TN

Ghi chỳ: TP: dng tớnh thờt, FP: dng tớnh giõ, TN: õm tớnh thờt, FN: õm tớnh giõ

Bõng 2. Hiu giỏ trung hũa cỏc mụi trng b sung trypsin voiw nng khỏc nhau
Nng trypsin mi loi mụi trng
Loi huyt thanh

Mụi trng pha virus/ huyt thanh

Mụi trng duy trỡ
0 àg/ml

Huyt thanh dng

0 àg/ml

Huyt thanh õm
Huyt thanh dng

8 àg/ml

Huyt thanh õm
Huyt thanh dng

10 àg/ml

Huyt thanh õm

8 àg/ml

10 àg/ml

0

KX

KX

0

0

0

6 log2

KX

KX

0

(bong 10%)

(bong 30%)

6 log2

KX

KX

0

(bong 20%)

(bong 50%)

Ghi chỳ: KX: Khụng xỏc nh c hiu giỏ khỏng th do thõm t bo b co trũn v bong hoc CPE xuỗt hin
khụng theo quy luờt.

Xỏc nh ỷ nhọy (phỏt hin ýng khi cũ
khỏng th) theo cụng thc: Sn = TP/(TP + FN) ì
100; xỏc nh ỷ c hiu (khụng phỏt hin khi

khụng cú mt khỏng th) theo cụng thc Sp =
TN/(TN + FP) ì 100.

3. KT QU V THO LUN
3.1. Kt quõ ti u mụi trng ca phõn
ng trung hũa
Phõn ng trung hũa s dng chỵng PEDV
0118 phõn lờp thc a c thit lờp da trờn
c s cỏc thớ nghim: tứi u mửi trng pha
loóng virus, pha loóng huyt thanh; tứi u mửi
trng duy trỡ t bo Vero khi nhim hỳn dch
trung hũa. Bõng 2 trỡnh by kt quõ tứi u nững
ỷ trypsin cỵa mửi trng dựng trong phõn ng.
Kt quõ cho thỗy mửi trng dựng pha
virus/huyt thanh chốn oỏn cú trypsin (8 àg/ml
hoc 10 àg/ml) u dộn ti hin tng t bo
trong ging co trũn v bong t 10-50%. Ngc
lọi, mửi trng pha virus/huyt thanh khụng cú
trypsin, thõm t bo khụng bong, hiu giỏ trung
hũa virus cỵa mộu huyt thanh chuốn dng,

478

chuốn õm lổn lt l 6 log2 v 0. Bõng 2 cũn cho
bit lng trypsin trong mửi trng duy trỡ (8
àg/ml hoc 10 àg/ml) khụng lm thay ựi hiu
giỏ trung hũa cỵa mộu huyt thanh v thõm t
bo ựn nh. Hm lng trypsin ny phự hp vi
hm lng trypsin trong mửi trng phõn lờp
virus trờn t bo Vero m cỏc tỏc giõ trc ó s

dng (Chung & cs., 2015; Nguyn Th Hoa &
cs., 2018).
Nghiờn cu trc ồy ó khợng nh trong
mửi trng duy trỡ phõn lờp virus khụng th
thiu trypsin trong vủng 25 i ổu (Hofmann &
Wyler, 1988). Nhng t bo cú th b co v bong
vỡ s cú mt cỵa trypsin v khụng th giỳp virus
nhồn lờn. ó cũ nhiu cụng bứ khoa hừc ng dng
phõn ng trung hủa virus nhng khửng nờu rụ
thnh phổn mửi trng dựng cho mỳi bc cỵa
phõn ng (Paudel & cs., 2014a; Clement & cs.,
2016; Song & cs., 2016). Trong mỷt nghiờn cu
c cụng bứ, mửi trng DMEM bự sung 1 àg/ml
trypsin c dỹng chung pha virus/huyt
thanh v l mửi trng duy trỡ (Lee & cs., 2018).
Tuy nhiờn, chỵng virus dựng trong nghiờn cu
k trờn ó thớch nghi cao ỷ trờn mửi trng t


Nguyn Th Bớch, Trn Vn Khỏnh, Nguyn Thanh Ba, Chu Th Thanh Hng

bo (tip i 70 lổn), do ũ ớt ph thuỷc vo
trypsin. Ngc lọi, nghiờn cu ny dựng chỵng
PEDV cú sứ lổn tip i thỗp (i 7), nờn ủi húi
lng trypsin cao gỗp 10 lổn mi giýp xỏc nh
c kt quõ cỵa phõn ng mỷt cỏch rừ rng.
Khỏc vi cỏc virus khỏc thuỷc nhúm
Alphacoronavirus cỵa hừ Coronaviridae, trypsin
khửng ũng vai trủ hoọt hũa PEDV trc khi
virus gớn vo t bo vờt chỵ hoc t bo Vero, m

trypsin chợ cú vai trũ giỳp virus xõm nhờp khi
PEDV ó tip xỳc vi th th cỵa t bo (Park &
cs., 2011). Kt quõ thớ nghim cỵa nhúm tỏc giõ
Park & cs., 2011 cho thỗy, virus hỡnh thnh th
hp bo v tởng hiu giỏ virus khi virus hỗp ph
vo t bo Vero trong mửi trng khụng cú
trypsin m chợ cú trypsin bự sung trong mụi
trng duy trỡ (Park & cs., 2011). Mỷt lý do na
m trypsin khụng th bự sung vo mửi trng
pha virus v huyt thanh vỡ trypsin b kỡm ch,

b ngởn cõn bi hoọt ỷng cỵa huyt thanh chốn
oỏn khi nững ỷ pha loóng mộu thỗp (Oh & cs.,
2005; Paudel & cs., 2014b). Nhng iu ny lý
giõi vic chợ cổn cũ trypsin trong giai oọn duy trỡ
t bo nhim m khụng cổn bự sung trypsin
trong giai oọn tng tỏc gia virus v khỏng th
c hiu l phự hp.
3.2. Kt quõ thit lp phng phỏp c kt
quõ phõn ng trung hũa
PEDV tọo ra bnh tớch khú quan sỏt bỡng
kớnh hin vi soi ngc cỏc lổn tip i thỗp.
Nhỡm tởng tớnh chớnh xỏc, thay vỡ quan sỏt
bnh tớch t bo, nghiờn cu dựng k thuờt húa
min dch trờn t bo 1 lp (IPMA) xỏc nh
ging cú/khửng cũ virus nhồn lờn v lm cởn c
xỏc nh hiu giỏ trung hũa (da vo mc ỷ
giõm 90% sứ t bo/sứ cm t bo nhim virus
so vi ứi chng õm).

Ghi chỳ: Huyt thanh õm chuốn (a-c) v huyt thanh dng chuốn (d-f) pha loóng tởng dổn t 32, 64 v 128
lổn. T bo nhim PEDV bớt mu ca c chỗt (mi tờn). pha loóng huyt thanh cao nhỗt cú khõ nởng c ch
90% s t bo nhim virus (so vi i chng) c xỏc nh l hiu giỏ trung hũa (e).

Hỡnh 1. Kt quõ c phõn ng trung hũa PEDV bng phng phỏp IPMA

479


Kt qu thit lp phn ng trung hũa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) s dng chng thc a phõn lp ti
min Bc

Kt quõ hỡnh 1 cho thỗy cỏch ừc phõn
ng bỡng phng phỏp nhuỷm IPMA phõn bit
rừ gia mộu khụng cú khỏng th trung hũa (a-c)
v mộu cú khỏng th trung hủa dng tớnh (de). mộu huyt thanh õm chuốn, sứ lng t
bo nhim PEDV (mi tờn) khửng cũ s khỏc
bit ỏng k gia cỏc ỷ pha loóng. mộu
huyt thanh dng chuốn, theo chiu tởng cỵa
ỷ pha loóng huyt thanh (tng ng vi hm
lng khỏng th trung hũa giõm dổn), sứ lng
t bo nhim virus (mi tờn) tởng dổn.
Trong quỏ trỡnh nhõn lờn cỵa virus trong
mửi trng t bo Vero, PEDV gõy bnh tớch
in hỡnh l th hp bo (Hofmann & Wyler,
1988). Dự vờy, do lng virus dựng cho phõn
ng trung hủa tng ứi nhú (30-300
TCID50/ging) vic ừc kt quõ cỵa phõn ng
thụng qua bnh tớch t bo gp khũ khởn. Hổu
ht cỏc tỏc giõ ừc phõn ng bỡng cỏch nhuỷm

min dch hunh quang giỏn tip (De Arriba &
cs., 1995; Song & cs., 2016) hoc nhuỷm húa
min dch (Paudel & cs., 2014a).

3.3. Xỏc nh nhy v c hiu ca
phõn ng trung hũa
ỷ nhọy v ỷ c hiu cỵa phõn ng
trung hũa mi c thit lờp v tứi u c
tớnh toỏn trờn c s so sỏnh vi kt quõ cỵa
phõn ng ELISA c s. Kt quõ biu din mứi
tng quan gia hiu giỏ trung hũa v giỏ tr
OD450 c trỡnh by hỡnh 2. Kt quõ cho
thỗy mỷt hiu giỏ trung hũa cứ nh, giỏ tr
OD450 cú khoõng bin ỷng ln, vớ d giỏ tr
OD450 dao ỷng t 0,21-0,74 ứi vi nhúm gữm
30 mộu cú hiu giỏ trung hủa l 6 log2 (mi
tờn, Hỡnh 2). chiu ngc lọi, phõn ng
trung hũa (liờn quan ti khõ nởng bõo hỷ chứng
lọi cửng cng ỷc) th hin u im hn so vi
phõn ng ELISA. Vớ d, phõn ng trung hũa
cho bit nhúm mộu huyt thanh cú giỏ tr
OD450 = 0,6 khửng cũ tớnh ững nhỗt v hiu
giỏ trung hũa, bin ỷng t 5 log2 n 9 log 2
(vỹng ũng khung, Hỡnh 2).

Ghi chỳ: Mi mộu huyt thanh (biu din bi 1 chỗm trũn) c xột nghim bỡng phõn ng trung hũa v ELISA
xỏc nh hiu giỏ trung hũa v giỏ tr OD450. Mộu c ỏnh giỏ l cú khỏng th trung hũa nu cú hiu giỏ ti
thiu l 5 log2 (gii họn bi ng nột t).

Hỡnh 2. Tng quan gia hiu giỏ trung hũa v giỏ tr OD

480


Nguyn Th Bớch, Trn Vn Khỏnh, Nguyn Thanh Ba, Chu Th Thanh Hng

Bõng 3. nhy, c hiu ca phõn ng trung hũa
Kt qu ELISA
Kt qu trung hũa

Dng tớnh

Tng hng
m tớnh

Dng tớnh ( 5 log2)*

125

1

126

m tớnh (< 5 log2)

18

54

72

Tng ct

143

55

198

Ghi chỳ: (*) mộu huyt thanh pha loóng >1/20 lm giõm 90% s t bo nhim PEDV
giõm so i chng ồm c xỏc nh l cú khỏng th trung hũa (Clement v cs., 2016).
Trong nghiờn cu ny lỗy giỏ tr ngng dng tớnh khỏng th trung hũa l 5 log2.

T cụng thc tớnh (Pearson Correlation
Coefficient Calculator), ó xỏc nh cũ tng
quan t l thuờn gia giỏ tr OD450 v hiu giỏ
khỏng th trung hũa (giỏ tr Pearson's R = 0,61).
Kt quõ ny l phự hp vi mỷt sứ nghiờn cu
trc ồy khi u xỏc nh c tng quan
gia kt quõ phỏt hin khỏng th khỏng PEDV
bỡng phõn ng trung hũa v phõn ng ELISA
(Oh & cs., 2005; Paudel & cs., 2014b; Hao & cs.,
2017). Mc dỹ cũ nghùa thứng kờ (P <0,00001)
nhng tng quan k trờn chợ mc trung bỡnh.
iu ny c giõi thớch l do trong thnh phổn
huyt thanh cỵa ln cú nhiu lp khỏc th trung
hũa PEDV (vớ d nh IgG, IgA) nhng phõn ng
ELISA dựng trong nghiờn cu ny chợ phỏt hin
c lp khỏng th IgG (Oh & cs., 2005). Trong
cỏc nghiờn cu tip theo nhỡm hon thin phõn

ng trung hũa virus, cổn s dng thờm cỏc k
thuờt phỏt hin c lp khỏng th c hiu
IgG v IgA (hoc sIgA tit qua sa), vớ d nh
k thuờt alphaLISA (Kimpston-Burkgren & cs.,
2020). So sỏnh kt quõ phỏt hin mộu õm
tớnh/dng tớnh vi khỏng th khỏng PEDV
c túm tớt bõng 3.
Bõng 3 cho bit phổn ln cỏc mộu (125/198
mộu dng tớnh, 54/198 ồm tớnh) u cú kt quõ
phỏt hin giứng nhau gia hai phng phỏp.
Da vo cụng thc tớnh, ỷ nhọy cỵa phõn ng
trung hũa so vi phõn ng ELISA c s l
87,46% v ỷ c hiu l 98,18%. S khụng phự
hp hon ton gia kt quõ cỵa phõn ng trung
hũa v phõn ng ELISA ó c chợ ra mỷt
vi nghiờn cu tng t (Oh & cs., 2005; Okda
& cs., 2015). c im ny cng quan sỏt c
nghiờn cu ny: cú 18 mộu c xỏc nh l õm
tớnh giõ (kt quõ phỏt hin khỏng th trung hũa
so vi kt quõ phỏt hin khỏng th lp IgG tựng

sứ bỡng ELISA). S khỏc bit trờn cú th do mỷt
sứ nguyờn nhõn. Th nhỗt, phõn ng trung hũa
phỏt hin khỏng th lm mỗt hoọt tớnh nhim
cỵa virus (khỏng th trung hủa). Trong khi ũ,
protein b mt cỵa virus (vớ d nh protein S)
lọi bao gữm cỏc epitope kớch thớch sõn sinh
khỏng th trung hũa v khỏng th khụng cú khõ
nởng trung hủa virus (Song & cs., 2016). Ngoi
ra, thi im xuỗt hin khỏng th trung hũa v

ọt hiu giỏ cao nhỗt thng chờm hn so vi
khỏng th khụng cú tỏc dng trung hũa virus
(Okda & cs., 2015; Thomas & cs., 2015).
3.4. Kt quõ ng dng phõn ng trung hũa
vi mu thc a
Kt quõ ng dng phõn ng trung hũa
trong khõo sỏt khỏng th cỵa cỏc cp ln nỏi ln con (sau bỳ sa ổu) mỷt sứ trang trọi
c trỡnh by hỡnh 3. Hỡnh 3A cho bit phõn
ng trung hũa cú th phỏt hin c khỏng th
trung hũa 2 loọi mộu khỏc nhau (huyt thanh
- sa ổu). Trong cựng nhúm ln, cú th thỗy
khỏng th trong sa non cao hn hợn so khỏng
th trong huyt thanh m (P <0,05). c im
trờn phự hp vi kt quõ ó cửng bứ (Clement &
cs., 2016) v phõn ỏnh c im sinh lý tit sa
vi hm lng IgG, IgM v IgA sa ổu luụn
cao hn tứi thiu 2 lổn so vi hm lng trong
mỏu ln nỏi (Porter, 1969). Khi tựng hp kt
quõ theo nhúm ln, d dng thỗy phõn ng
trung hũa mi thit lờp cũn phỏt hin c s
bin ỷng v hiu giỏ khỏng th trung hũa mỳi
nhúm ln (Hỡnh 3B), c bit l nhúm ln con
theo m vi khoõng bin ỷng t 5 log2- 10 log2.
ồy cũ th do ln nỏi cũ hm lng khỏng th
thỗp v/hoc mc tip nhờn khỏng th truyn
qua sa ổu khửng ững u gia cỏc ln con.

481

Kt qu thit lp phn ng trung hũa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) s dng chng thc a phõn lp ti
min Bc

Ghi chỳ: Hiu giỏ khỏng th trung hũa nhúm ln nỏi v ln con ca chỳng (A). Mộu huyt thanh v
sa ổu c lỗy cựng nhúm ln nỏi. Mộu huyt thanh ca ln con thu thờp 2 ngy sau khi bỳ sa
ổu (D2). Hiu giỏ khỏng th trung hũa biu din cho tng nhúm mộu (B).
Hỡnh 3. Bin ng hiu giỏ khỏng th trung hũa cỏc nhúm mu
Nh vờy, cỏc kt quõ nờu trờn ó chng tú
phõn ng trung hủa c thit lờp thnh cụng.
Nghiờn cu v huyt thanh hừc, nghiờn cu trc
ồy ó bỏo cỏo, ng dng phõn ng trung hũa
ỏnh giỏ khõ nởng khỏng chộo gia huyt thanh
khỏng dũng mi nựi cũ ỷc lc thỗp (S- INDEL)
vi virus ững chỵng cao hn hiu giỏ khỏng th
trung hũa vi virus d chỵng dũng mi nựi cũ ỷc
lc cao (non- S INDEL) 4 lổn, trong khi ũ, gia
huyt thanh khỏng PEDV cỵa dũng CV777 cự
in vi virus ững chỵng cao hn hiu giỏ khỏng
th trung hũa d chỵng (dũng mi nựi) 16 lổn
(Chen & cs., 2016). Mc dự vờy, cổn ng dng

482

phõn ng trung hũa vi mỷt dung lng mộu ln
hn tip tc ỏnh giỏ chỗt lng cng nh
hon thin cỏc im yu cú th c phỏt hin
trong quỏ trỡnh thc hin.

4. KT LUN
ó thit lờp c phõn ng trung hũa dựng

chỵng PEDV thc a vi ỷ nhọy 87,46% v ỷ
c hiu l 98,18%. Phõn ng trung hủa ó phỏt
hin c v phõn ỏnh ýng c im hiu giỏ
khỏng th trung hũa trong sa ổu luửn cao hn
huyt thanh cỵa ln nỏi.


Nguyễn Thị Bích, Trần Văn Khánh, Nguyễn Thanh Ba, Chu Thị Thanh Hương

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bosch B.J., Van Der Zee R., De Haan C.A. & Rottier
P.J. (2003). The coronavirus spike protein is a
class I virus fusion protein: structural and
functional characterization of the fusion core
complex, Journal of virology. 77(16): 8801-8811.
Clement T., Singrey A., Lawson S., Okda F., Nelson J.,
Diel D., Nelson E.A. & Christopher-Hennings J.
(2016). Measurement of neutralizing antibodies
against porcine epidemic diarrhea virus in sow
serum, colostrum, and milk samples and in piglet
serum samples after feedback, Journal of Swine
Health and Production. 24(3): 147-153.
Chen Q., Thomas J.T., Giménez-Lirola L.G., Hardham
J.M., Gao Q., Gerber P.F., Opriessnig T., Zheng Y.,
Li G. & Gauger P.C. (2016). Evaluation of
serological cross-reactivity and cross-neutralization
between the United States porcine epidemic diarrhea
virus prototype and S-INDEL-variant strains, BMC
veterinary research. 12(1): 70.
Chung H.C., Nguyen V.G., Moon H.J., Lee J.H., Park

S.J., Lee G.E., Kim H.K., Noh Y.S., Lee C.H.,
Goede D. & Park B.K. (2015). Isolation of Porcine
Epidemic Diarrhea Virus during Outbreaks in
South Korea, 2013-2014, Emerg Infect Dis.
21(12): 2238-40.
De Arriba M., Carvajal A., Lanza I., Rubio P. &
Blanchard P. (1995). Development of an ELISA
for the detection of antibody isotypes against
porcine epidemic diarrhoea virus (PEDV) in sow’s
milk, Proc. 3rd Congr. ESVV. pp. 222-225.
Collin E.A., Anbalagan S., Okda F., Batman R., Nelson
E. & Hause B.M. (2015). An inactivated vaccine
made from a US field isolate of porcine epidemic
disease virus is immunogenic in pigs as
demonstrated by a dose-titration, BMC veterinary
research. 11(1): 62.
Debouck P. & Pensaert M. (1980). Experimental
infection of pigs with a new porcine enteric
coronavirus, CV 777. Am J Vet Res. 41(2): 219-23.
Kimpston-Burkgren K., Mora-Diaz J.C., Roby P.,
Bjustrom-Kraft J., Main R., Bosse R. & GimenezLirola L.G. (2020). Characterization of the
humoral immune response to porcine epidemic
diarrhea virus infection under experimental and
field conditions using an AlphaLISA platform,
Pathogens. 9(3).
Hao J., Zhang Y., Fang S., Wen Z., Zhang X., Xue C.
& Cao Y. (2017). Evaluation of purified
recombinant spike fragments for assessment of the
presence of serum neutralizing antibodies against a
variant strain of porcine epidemic diarrhea virus,

Virol Sin. 32(4): 307-316.
Hofmann M. & Wyler R. (1988). Propagation of the
virus of porcine epidemic diarrhea in cell culture, J
Clin Microbiol. 26(11): 2235-9.

Lee C. (2015). Porcine epidemic diarrhea virus: An
emerging and re-emerging epizootic swine virus,
Virol J. 12(1): 193.
Lee S. & Lee C. (2014). Outbreak-related porcine
epidemic diarrhea virus strains similar to US
strains, South Korea, 2013, Emerg Infect Dis.
20(7): 1223-6.
Lee S.H., Yang D.K., Kim H.H. & Cho I.S. (2018).
Efficacy of inactivated variant porcine epidemic
diarrhea virus vaccines in growing pigs, Clin Exp
Vaccine Res. 7(1): 61-69.
Nguyễn Thị Hoa, Nguyễn Thị Lan, Trương Quang
Lâm, Trịnh Đình Thâu & Ngô Thị Hạnh (2018).
Nghiên cứu phân lập và xác định một số đặc điểm
sinh học của virus PED (Porcine epidemic diarrhea
virus), Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam.
16(3): 257-267
Nguyễn Trung Tiến, Vũ Thị Thu Hằng, Huỳnh Thị Mỹ
Lệ, Nguyễn Bá Hiên & Lê Văn Phan (2017). Một
số đặc điểm sinh học phân tử của virus gây ra dịch
tiêu chảy cấp ở lợn (porcine epidemic diarrheaPED) tại Quảng Trị, Thái Nguyên và Thái Bình từ
năm 2013-2014, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp
Việt Nam. 13(7): 1089-1100.
Oh J.S., Song D.S., Yang J.S., Song J.Y., Moon H.J.,
Kim T.Y. & Park B.K. (2005). Comparison of an

enzyme-linked immunosorbent assay with serum
neutralization test for serodiagnosis of porcine
epidemic diarrhea virus infection, J Vet Sci.
6(4): 349-52.
Okda F., Liu X., Singrey A., Clement T., Nelson J.,
Christopher-Hennings J., Nelson E.A. & Lawson
S. (2015). Development of an indirect ELISA,
blocking
ELISA,
fluorescent
microsphere
immunoassay and fluorescent focus neutralization
assay for serologic evaluation of exposure to North
American strains of Porcine Epidemic Diarrhea
Virus, BMC Vet Res. 11(1): 180.
Park B. & Song, D. (2016). Recent outbreaks and
emergence of mutants of porcine epidemic diarrhea
viruses (PEDV) in Korea, Japanese Journal of
Veterinary Research. 64(Supplement 1): S25-S32.
Park J.E., Cruz D.J. & Shin H.J. (2011). Receptorbound porcine epidemic diarrhea virus spike
protein cleaved by trypsin induces membrane
fusion, Arch Virol. 156(10): 1749-56.
Paudel S., Park, J.E., Jang H., Hyun B.H., Yang D.G.
& Shin H.J. (2014a). Evaluation of antibody
response of killed and live vaccines against porcine
epidemic diarrhea virus in a field study, Vet Q.
34(4): 194-200.
Paudel S., Park J.E., Jang H. & Shin H.J. (2014b).
Comparison of serum neutralization and enzymelinked immunosorbent assay on sera from porcine
epidemic diarrhea virus vaccinated pigs, Vet Q.

34(4): 218-23.

483


Kết quả thiết lập phản ứng trung hòa Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV) sử dụng chủng thực địa phân lập tại
miền Bắc

Pensaert M. & De Bouck P. (1978). A new
coronavirus-like particle associated with diarrhea
in swine, Archives of virology. 58(3): 243-247.
Porter P. (1969). Transfer of immunoglobulins IgG,
IgA and IgM to lacteal secretions in the parturient
sow and their absorption by the neonatal piglet,
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein
Structure. 181(2): 381-392.
Shin H.J. & Park J.E. (2019). Newly isolated porcine
epidemic diarrhea virus resistance to interferon and
neutralizing antibody, The Journal of Immunology.
202(1 Supplement): 73.12.
Song D. & Park B. (2012). Porcine epidemic diarrhoea
virus: a comprehensive review of molecular
epidemiology, diagnosis, and vaccines. Virus
Genes. 44(2): 167-75.
Song D.S., Kang B.K., Oh J.S., Ha G.W., Yang J.S.,
Moon H.J., Jang Y.S. & Park B.K. (2006).
Multiplex reverse transcription-PCR for rapid
differential detection of porcine epidemic diarrhea
virus, transmissible gastroenteritis virus, and
porcine group A rotavirus. J. Vet Diagn Invest.

18(3): 278-81.
Song Q., Stone S., Drebes D., Greiner L.L., Dvorak
C.M.T. & Murtaugh M.P. (2016). Characterization
of
anti-porcine
epidemic
diarrhea
virus
neutralizing activity in mammary secretions. Virus
Res. 226: 85-92.
Stevenson G.W., Hoang H., Schwartz K.J., Burrough
E.R., Sun D., Madson D., Cooper V.L., Pillatzki
A., Gauger P. & Schmitt B.J. (2013). Emergence

484

of porcine epidemic diarrhea virus in the United
States: clinical signs, lesions, and viral genomic
sequences. Journal of veterinary diagnostic
investigation. 25(5): 649-654.
Sun R.Q., Cai R.J., Chen Y.Q., Liang P.S., Chen D.K.
& Song C.X. (2012). Outbreak of porcine epidemic
diarrhea in suckling piglets, China. Emerg Infect
Dis. 18(1): 161-3.
Toan N.T., Puranaveja S. & Thanawongnuwech R.
(2011). Genetic characterization of porcine
epidemic diarrhea virus (PEDV) isolates from
southern Vietnam during 2009-2010 outbreaks,
The Thai Journal of Veterinary Medicine.
41(1): 55-64.

Thomas J.T., Chen Q., Gauger P.C., Gimenez-Lirola
L.G., Sinha A., Harmon K.M., Madson D.M.,
Burrough E.R., Magstadt D.R., Salzbrenner H.M.,
Welch M.W., Yoon K.J., Zimmerman J.J. & Zhang
J. (2015). Effect of porcine epidemic diarrhea virus
infectious doses on infection outcomes in naive
conventional neonatal and weaned pigs. PLoS One.
10(10): e0139266.
Wang L., Byrum B. & Zhang Y. (2014). New variant
of porcine epidemic diarrhea virus, United States.
Emerg Infect Dis. 20(5): 917-9.
Zhao P.D., Bai J., Jiang P., Tang T.S., Li Y., Tan C. &
Shi X. (2014). Development of a multiplex
TaqMan probe-based real-time PCR for
discrimination of variant and classical porcine
epidemic diarrhea virus. J. Virol Methods.
206: 150-5.