Nghiên Cứu Ứng Dụng Cảm Biến Sinh Học Điện Hóa Để Phân Tích Dư Lượng Thuốc Bảo Vệ Thực Vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VŨ KHÁNH TÙNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CẢM BIẾN SINH HỌC
ĐIỆN HÓA ĐỂ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG
THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT TỪ RAU QUẢ

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VŨ KHÁNH TÙNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CẢM BIẾN SINH HỌC
ĐIỆN HÓA ĐỂ PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG
THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT TỪ RAU QUẢ
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số:60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Vân Anh

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn và chỉ bảo tận tình của TS. Nguyễn
Vân Anh trong suốt thời gian học tập vừa qua cũng như trong thời gian thực
hiện luận văn này.
Xin trân trọng ghi ơn các quí Thầy Cô, nhất là các Thầy Cô trong khoa
Hóa Trường Đại Học Khoa Học Thái Nguyên đã nhiệt tình dạy những kiến
thức, những phương pháp nghiên cứu căn bản và những công cụ hỗ trợ đắc lực
cho quá trình làm luận văn và nghiên cứu hiện tại cũng như trong tương lai của
những người đi sau chúng em.
Xin bày tỏ lòng biết ơn với gia đình, các anh chị em đồng nghiệp và thủ
trưởng cơ quan đã luôn động viên giúp đỡ, làm chỗ dựa tinh thần cho tôi trong
những ngày đi học và làm luận văn, cảm ơn các bạn. Cảm ơn các anh chị em
trong lớp Cao học Hóa Phân tích K9B đã tương trọ cho tôi tròn quá trình học
tập và nghiên cứu.
Luận văn được hỗ trợ kinh phí từ đề tài Bộ Giáo dục và Đào tạo mã số
B2014-01-65
Trântrọng cảm ơn
Học viên

Vũ Khánh Tùng

a


MỤC LỤC
Danh mục các ký hiệu viết tắt ............................................................................. a
Mục lục ................................................................................................................ b
Danh mục các bảng.............................................................................................. d
Danh mục các hình .............................................................................................. e

MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3
1.1. Vấn đề dư lượng thuốc BVTV trong nông sản ............................................ 3
1.2. Nhóm chất BVTV họ lân hữu cơ.................................................................. 5
1.3. Cảm biến sinh học điện hóa.......................................................................... 6
1.3.1. Cảm biến Enzyme .................................................................................... 10
1.3.2. Cảm biến miễn dịch (immunosensors) .................................................... 14
1.4. Polyme dẫn điện ......................................................................................... 16
1.4.1. Giới thiệu tổng quát về polyme dẫn điện ................................................ 16
1.4.2. Polyanilin (PANi) .................................................................................... 19
1.4.3. Polypyrrol (PPy) ...................................................................................... 21
1.4.4. Các phương pháp tổng hợp điện hóa polyme dẫn điện ........................... 23
1.5. Tính hình nghiên cứu trong nước về cảm biến điện hóa sinh học ............. 26
CHƯƠNG 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM.. 28
2.1. Thực nghiệm ............................................................................................... 28
2.1.1. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................... 28
2.1.2. Hóa chất sử dụng ..................................................................................... 29
2.1.3. Lựa chọn hệ cảm biến và nghiên cứu các đặc trưng cơ bản .................... 30
2.2. Các phương pháp nghiên cứu đặc trưng của cảm biến............................... 31
2.2.1. Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) [61].................. 31
2.2.2. Phương pháp kính hiển vi điện tử quét (SEM) ........................................ 32
2.2.3. Phương pháp điện hóa trong phân tích nồng độ chất .............................. 33
2.2.4. Các phương pháp phân tích ..................................................................... 35
a


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 39
3.1. Tổng hợp điện hóa màng PANi và đặc trưng tính chất .............................. 39
3.1.1. Biến tính bằng kỹ thuật von-apme vòng (CV) ........................................ 39
3.1.2. Đặc trưng cấu trúc màng PANi bằng phổ FT-IR .................................... 40

3.1.3. Hành vi điện hóa của điện cực PANi/SPE .............................................. 41
3.1.4. Phổ Raman của điện cực PANi-Gr/SPE.................................................. 41
3.2. Cố định điện hóa Enzym AChE trên màng PANi - Gr .............................. 43
3.3. Các đặc trưng bề mặt của cảm biến điện hóa trước/sau biến tính .............. 44
3.4. Ứng du ̣ng cảm biế n sinh ho ̣c điện hóa tích hơ ̣p xác đinh
̣ dư lươ ̣ng thuố c
BVTV ................................................................................................................ 46
3.4.1. Thử nghiệm hoạt tính của enzyme cố định trên điện cực ....................... 46
3.4.2. Xác định điểm hoạt động tối ưu của cảm biến ........................................ 46
3.4.3. Thử nghiệm xác định thuốc BVTV ......................................................... 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỊNH HƯỚNG .................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 53

b


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
AChE
ADC

Acetylcholinesterase
Direct current

BChE
BuChE

Butyrylcholinesterase
Butyrylcholinesterase

BVTV

ChE
CV

Bảo vệ thực vật
Cholinesterase
Vôn - ampe vòng (Cyclic voltammetry)

EIS
ELISA

Phổ tổng trở (Electrochemical Impedance Spectroscopy)
enzyme-linked immunosorbent assay

FE-SEM
FT-IR

Hiển vi điện tử quét trường phát xạ (Field Emission Scanning
Electron Microscope)
Fourier transform infrared spectroscopy

GA
GC
GPRS

Glutaraldehylde
Điện cực than thủy tinh (Glassy carbon)
General Packet Radio Service

Gr
HPLC

ISFET
LNT

Graphen
High Performance Liquid Chromatography
Transito nhạy ion hiệu ứng trường (Ion Selective Field Effect Transistor)
Phòng thí nghiệm công nghệ nano (Laboratory of Nanotechnology

MEMS
MOSFET
MRL

Hệ vi cơ điện tử (Micro ElectroMechanical System)
Transitor hiệu ứng trường kim loại-oxit (Metal-Oxide-Semiconductor
Field Effect Transistor)
Mức giới hạn tối đa (Maximum Residue Limit)

MS
MWCNTs
OP
P(1,5DAN)
PANi
PBS
Ppy
PS

Khối phổ (Mass spectrometry)
Ống nano các bon đa vách (Multi-walled carbon nanotubes)
Lân hữu cơ (organophosphate)
Poly(1,5-Diaminonaphthalene)

Polyaniline
Phosphate Buffered Saline
Polypyrrole
Potential static

SEM
SWV
TCVN

Scanning electron microscope
Square wave voltammetry
Tiêu chuẩn Việt Nam

c


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các điều kiện phân ly MS/MS: ........................................................ 37
Bảng 3.1. Kết quả phân tích trên nền nước. ..................................................... 50
Bảng 3.2. Kết quả phân tích trên nền rau. ........................................................ 51

d


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Các phương pháp hiện được sử dụng để xác định thuốc bảo vệ
thực vật (giai đoạn 2005 - 2011) ....................................................... 6
Hình 1.2. Sơ đồ nguyên lý cấu tạo một cảm biến sinh học ............................... 7
Hình 1.3. Số các công bố khoa học liên quan đến chủ điểm cảm biến sinh
học xác định thuốc BVTV từ 1989 tới 2011 (theo thống kê của

Thomson Reuters Web of Science) .................................................. 8
Hình 1.4. Các mô hình cảm biến sinh học xác định chất BVTV đang
được nghiên cứu ............................................................................ 10
Hình 1.5. Mô hình ức chế xúc tác enzyme của thuốc BVTV. Hình phía trên:
khi không có chất BVTV; Hình phía dưới: khi có chất BVTV [13]11
Hình 1.6. Mô hình ức chế enzyme AChE trong xác định chất BVTV ........... 11
Hình 1.7. Mô hình chế tạo cảm biến enzym xác định chất BVTV ..................... 12
Hình 1.8. Cảm biến sinh học phân tích thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) ......... 14
Hình 1.9. Mô hình cảm biến ATZ dựa trên sự thay đổi tín hiệu signaloff/signal- on của màng poly(JUG-HATZ) [32] ............................. 16
Hình 1.10. Một số polyme dẫn điện tử điển hình.............................................. 17
Hình 1.11. Polyme oxy hóa khử ........................................................................ 17
Hình 1.12. Polyme trao đổi ion poly(vinylpyridin)........................................... 18
Hình 1.13. Cơ chế hình thành PANi từ Ani bằng phương pháp điện hóa [38]. 20
Hình 1.14. Công thức tổng quát của PANi ....................................................... 21
Hình 1.15. Cơ chế phản ứng trùng hợp PPy [38] .............................................. 22
Hình 1.16. Mô tả quá trình trùng hợp điện hóa PPy trong hệ ba điện cực........ 23
Hình 2.1. Hệ đo điện hóa Palmsen 3 và thiết bị tích hợp phần mềm đo
điện hóa ........................................................................................... 28
Hình 2.2. Hệ điện cực mạch in tích hợp thương mại của hãng Dropsens®
() ............................................................. 28
Hình 2.3. Đồ thị quét thế tuyến tính đa chu kỳ ............................................... 33
e


Hình 2.4. Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong phương pháp CV.......... 34
Hình 2.5. Sơ đồ quy trình chuẩn bị chất chuẩn trên nền nước. ....................... 35
Hình 2.6. Sơ đồ quy trình chuẩn bị chất chuẩn trên nền rau. .......................... 35
Hình 2.7. Khối phổ (MS) của mẫu Methamidophos ....................................... 37
Hình 3.1. Phổ trùng hợp điện hóa PANi theo phương pháp CV..................... 39
Hình 3.2. Phổ FT-IR của PANi tổng hợp theo phương pháp điện hóa ........... 40

Hình 3.3. Hành vi điện hóa của điện cực PANi/SPE tổng hợp theo kỹ thuật
(a) trong dung dịch HCl 1M ............................................................ 41
Hình 3.4. Phổ Raman của màng Graphene, PANi và PANi/Graphene .......... 42
Hình 3.5. Ảnh FE-SEM màng PANi/Graphene đã cố định AChE theo
phương pháp liên kết đồng hóa trị sử dụng glutaraldehyde (a)
phóng đại 10.000 lần và (b) phóng đại 50.000 lần .......................... 43
Hình 3.6. Phổ CV của vi điện cực điện hóa trong dung dịch K3[Fe(CN)6] .... 44
Hình 3.7. Phổ SWV của vi điện cực trước và sau khi cố định........................ 45
Hình 3.8. Ghi nhận phản ứng enzyme-cơ chất trên bề mặt điện cực bằng
phương pháp quét thế tại V = + 300 mV. ....................................... 46
Hình 3.9. Đường đáp ứng dòng của điện cực AChE/PANi-Gr/SPE trong
dung dịch PBS khi thêm cơ chất ATCh .......................................... 47
Hình 3.10. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc của tín hiệu .......................... 47
Hình 3.11. Phát hiện thuốc trừ sâu họ lân hữu cơ sử dụng cảm biến điện hóa
AChE bằng phương pháp áp thế. .................................................... 48
Hình 3.12. Đường chuẩn xác định dư lượng thuốc BVTV họ lân hữu cơ sử
dụng cảm biến điện hóa AChE bằng phương pháp áp thế .............. 49

f


MỞ ĐẦU
Ngày nay, hoạt động sản xuất nông nghiệp đòi hỏi một lượng lớn hóa
chất bảo vệ thực vật (BVTV) nhằm kiểm soát côn trùng, vi khuẩn, cỏ dại… bảo
vệ mùa màng. Một điều rõ ràng rằng, cùng với phân bón hóa học, thuốc BVTV
(bao gồm thuốc trừ cỏ, thuốc trừ bệnh, thuốc kích thích sinh trưởng và thuốc
trừ sâu) góp phần đảm bảo an ninh lương thực và sự phát triển ổn định của kinh
tế-xã hội. Tuy nhiên, tình trạng sử dụng thiếu kiểm soát và sai mục đích các
chất BVTV gây ra những ảnh hưởng tiêu cực tới môi trường sinh thái và sức
khỏe của con người. Hầu hết các loại thuốc BVTV đều là những hợp chất hữu

cơ khó phân hủy, có khả năng tích lũy sinh học, tham gia vào chuỗi thức ăn. Do
đó, vấn đề kiểm soát sử dụng thuốc BVTV đặc biệt trong các sản phẩm nông
sản đã trở thành một vấn đề có tính toàn cầu không chỉ ở trong nước.
Việc kiểm soát dư lượng thuốc BVTV bằng các phương pháp và dụng cụ
thích hợp không những góp phần đảm bảo an toàn cho sức khỏe con người mà
cũng góp phần thúc đẩy việc sử dụng thuốc hợp lý hơn. Về cơ bản, phương
pháp phân tích định lượng tiêu chuẩn được sử dụng hiện nay để xác định dư
lượng chất BVTV trong các sản phẩm nông sản là phương pháp phân tích sắc
ký khí hoặc sắc ký lỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp khối phổ (GC/MS,
LC/MS hoặc HPLC/MS-MS) sắc ký lỏng kết hợp UV-Vis. Tuy nhiên, các
phương pháp này có đặc điểm là thời gian phân tích lâu, phức tạp, đòi hỏi nhiều
kỹ năng khi phân tích, không thể thực hiện được ngoài hiện trường. Gần đây,
xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme - ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) đã được ứng dụng để xác định dư lượng các chất
BVTV dựa trên nguyên lý kháng nguyên - kháng thể. Kỹ thuật ELISA có độ
nhạy cao, thao tác tương đối đơn giản, thời gian phân tích nhanh nhưng nhược
điểm đó là kém chính xác trong các nền phức tạp, kém linh hoạt vì phải phụ
thuộc vào hóa chất của nhà sản xuất. Do vậy, việc tìm ra các phương pháp phân
tích mới thuận tiện hơn là mục tiêu của nhiều nghiên cứu trên thế giới. Các
1


thiết bị cảm biến nói chung và cảm biến sinh học nói riêng với kích thước nhỏ
gọn, có độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định cao ứng dụng trong phân tích Hóa
học và Sinh học đã và đang được kỳ vọng có thể thay thế một phần hay hoàn
toàn các phương pháp phân tích truyền thống.
Xuất phát từ nhu cầu đó, đề tài được lựa chọn:
“Nghiên cứu ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa để phân tích dư
lượng thuốc bảo vệ thực vật từ rau quả„
Nội dung của luận văn sẽ tập trung vào việc ứng dụng các cảm biến hiện

có trên cơ sở biến tính các hệ điện cực cơ sở để thực hiện các phép phân tích
hóa học và sinh học.
- Nội dung 1: lựa chọn cảm biến. Loại cảm biến được lựa chọn là cảm
biến điện hóa sinh học dựa trên sự ức chế enzyme Acetylcholinesterase được
chế tạo và biến tính.
- Nghiên cứu các đặc trưng cơ bản của hệ cảm biến này (đặc trưng bề
mặt, hình thái học, các đặc trưng điện hóa/đáp ứng điện hóa)
- Ứng dụng hệ cảm biến trong xác định các độc chất gây ức chế thần
kinh như các loại thuốc bảo vệ thực vật nhóm lân hữu cơ.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vấn đề dư lượng thuốc BVTV trong nông sản
Là một nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm mưa nhiều, Việt Nam có nhiều
điều kiện khí hậu thuận lợi cho sự phát triển của cây trồng nông nghiệp và công
nghiệp. Bên cạnh đó, các điều kiện khía hậu này cũng rất thuận lợi cho sự phát
sinh, phát triển của sâu bệnh, cỏ dại gây hại mùa màng. Do vậy việc sử dụng hóa
chất bảo vệ thực vật (BVTV) để phòng trừ sâu hại, dịch bệnh bảo vệ mùa màng,
giữ vững an ninh lương thực quốc gia là một biện pháp quan trọng. Tuy nhiên, có
một thực tế rằng việc sử dụng thuốc BVTV tràn lan, sai mục đích, không tuân thủ
các quy trình sử dụng an toàn đã gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường đất, nước,
không khí và trầm tích đáy với thời gian tồn dư lâu dài, ảnh hưởng đến hệ sinh
thái nông nghiệp và sức khỏe cộng đồng. Thuốc BVTV tồn dư, thậm chí được sử
dụng như một loại chất bảo quản trên các sản phẩm nông sản trong nước cũng như
nhập khẩu đang là vấn đề nhận được sự quan tâm của toàn xã hội. Nhiều thuốc
BVTV được cho là có khả năng gây ung thư, thậm chí gây đột biến gen, ảnh
hưởng đến chất lượng tăng trưởng và sức khỏe[1].
Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật, lượng thuốc BVTV được sử

dụng ở nước ta tăng nhanh trong những năm gần đây đặc bệt về cả số lượng và
chủng loại. Trong đó, nhiều loại thuốc nhóm lân hữu cơ thuộc danh mục những
loại thuốc cấm sử dụng trên rau vẫn được sử dụng tràn lan như: Monitor,
Azodrin, Endosulfan, Monocrotophos, Methamidophos, Methyl parathion. Đây
là những loại thuốc có độ độc rất cao thời gian phân hủy kéo dài nếu tồn lưu
trong rau thì cần phải trải qua thời gian dài mới phân hủy hết được. Những sản
phẩm này khi bán ra thị trường sẽ ảnh hưởng trược tiếp đến sức khỏe của cộng
đồng. Cũng theo một báo cáo tổng hợp của Tổng cục Môi trường (Bộ Tài
nguyên & Môi trường), nếu như những năm 1960, chỉ có 0,48% diện tích đất
canh tác sử dụng thuốc BVTV thì nay là 100% diện tích đất canh tác đều có sử
dụng thuốc BVTV. Theo cục Y tế dự phòng và Môi trường (Bộ Y tế), năm
3


2009, các bệnh viện đã tiếp nhận 4.515 người bị nhiễm độc thuốc BVTV, trong
đó 138 người đã tử vong do nhiễm độc quá nặng. Ba vấn đề nổi cộm nhất liên
quan đến sự ô nhiễm môi trường và gây nhiễm độc thuốc BVTV gồm:
Hệ thống xử lý chất thải tại các cơ sở sản xuất, chế biến thuốc BVTV
không được quan tâm thích đáng. Nhiều cơ sở vì lợi nhuận đã không thực hiện
khâu xử lý chất thải mà xả thẳng vào môi trường.
Hiện tượng lạm dụng và sử dụng sai quy trình, quy cách thuốc BVTV
trong nông dân như sử dụng thuốc trừ sâu vượt ngưỡng cho phép, hoặc không
thực hiện thời gian cách ly đến lúc thu hoạch như quy định. Bên cạnh đó, người
nông dân hầu như chưa có kiến thức trong xử lý dụng cụ, bao gói thuốc BVTV.
Việc sử dụng sai mục đích các thuốc BVTV làm chất bảo quản, chất kích
thích tăng trưởng và phát triển cây trồng, vật nuôi.
Bên cạnh việc quản lý chặt chẽ các loại thuốc BVTV thì công tác phân
tích, kiểm nghiệm thuốc BVTV trong nông sản và môi trường là một giải pháp
quan trọng giúp có một cái nhìn tổng quan về hiện trạng sử dụng thốc BVTV.
Đồng thời hỗ trợ các cơ quan nhà nước đưa ra các giải pháp ứng phó phù hợp,

đồng thời cảnh báo sớm nguy cơ góp phần đảm bảo an toàn thực phẩm và sức
khỏe cộng đồng[2].
Như trên đã nói, phương pháp thông thường đang được áp dụng để phân
tích hàm lượng chất BVTV trong các sản phẩm nông sản và trong môi trường
nước đó là phương pháp sắc ký kết hợp với khối phổ. Phương pháp có độ nhạy
và độ chọn lọc cao tuy nhiên thời gian phân tích thường trải qua nhiều giai
đoạn và tốn nhiều thời gian, vận hành thiết bị phức tạp, phân tích phải được
thực hiện tại phòng thí nghiệm. Thông thường, kể từ khi lấy mẫu đến khi có kết
quả phân tích thời gian thường mất từ 1 tới 2 ngày. Đối với xuất-nhập khẩu
nông sản: việc kéo dài thời gian phân tích đối với các sản phẩm nông sản tươi
dẫn đến những phản ứng của doanh nghiệp xuất nhập khẩu do những thiệt hại
về kinh tế gây ra.

4


Trước tình hình thời sự về vấn đề sử dụng tràn lan, thiếu kiểm soát các
loại thuốc BVTV trong trồng trọt và bảo quản nông sản việc tìm ra các phương
pháp khác bổ sung/thay thế phương pháp truyền thống là tất yếu. Yêu cầu của
phương pháp thay thế là có thể xác định nhanh, dễ dàng dư lượng các thuốc
BVTV nhằm phát hiện và ngăn chặn kịp thời các chất BVTV độc hại trong
nông phẩm phù hợp với việc đo đạc ở hiện trường cũng như giám sát tại chỗ và
trực tuyến các chất độc hại. Đây là một nhu cầu thực tế có ý nghĩa kinh tế-xã
hội cao. Do vậy, nghiên cứu ứng dụng cảm biến sinh học (biosensor) quan trắc
các chất gây ô nhiễm môi trường (hợp chất hữu cơ, kim loại nặng và vi sinh vật
gây bệnh) là một trong các nhiệm vụ ưu tiên triển khai. Với việc tận dụng các
nguồn lực về con người và cơ sở vật chất đã được nhà nước đầu tư tại các đơn
vị phối hợp cho thấy việc chế tạo hệ cảm biến sinh học đo tại thực địa nhằm
kiểm soát dư lượng một số thuốc bảo vệ thực vật trong nông sản và môi trường
nước là nội dung có tính cấp thiết cho định hướng nghiên cứu này.

1.2. Nhóm chất BVTV họ lân hữu cơ
Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus) đều là các este, là các dẫn xuất
hữu cơ của acid photphoric. Nhóm này có thời gian bán phân huỷ ngắn hơn so
với nhóm Clo hữu cơ và được sử dụng rộng rãi hơn. Nhóm này tác động vào
thần kinh của côn trùng bằng cách ngăn cản sự tạo thành men Cholinestaza làm
cho thần kinh hoạt động kém, làm yếu cơ, gây choáng váng và chết.
Có thể coi việc sử dụng hóa chất BVTV trong sản xuất nông nghiệp là
một thành tựu khoa học giúp đảm bảo an ninh lương thực, an sinh xã hội. Tuy
nhiên ngày nay việc sử dụng tràn lan chất BVTV và không tuân thủ quy trình
sản xuất an toàn khiến tồn dư các chất BVTV trong các sản phẩm nông sản gây
nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Việc kiểm soát dư lượng chất BVTV
bằng các phương pháp và dụng cụ thích hợp không những góp phần đảm bảo
an toàn cho sức khỏe con người mà cũng góp phần thúc đẩy việc sử dụng thuốc
hợp lý hơn. Về cơ bản, phương pháp phân tích định lượng tiêu chuẩn được sử
dụng hiện nay để xác định dư lượng chất BVTV trong các sản phẩm nông sản

5


là phương pháp phân tích sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng, sắc ký lỏng hiệu năng
cao kết hợp khối phổ (GC/MS, LC/MS hoặc HPLC/MS-MS) [3, 4] sắc ký lỏng
kết hợp UV-Vis [5]. Tuy nhiên, các phương pháp này có đặc điểm là thời gian
phân tích lâu, phức tạp, đòi hỏi nhiều kỹ năng khi phân tích, không thể thực
hiện được ngoài hiện trường.

Hình 1.1.Các phương pháp hiện được sử dụng để xác định thuốc bảo vệ thực vật
(giai đoạn 2005 – 2011)

Gần đây, xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme - ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) đã được ứng dụng để xác định dư

lượng các chất BVTV dựa trên nguyên lý kháng nguyên – kháng thể [6, 7]. Kỹ
thuật ELISA có độ nhạy cao, thao tác tương đối đơn giản, thời gian phân tích
tương đối nhanh nhưng nhược điểm đó là kém chính xác trong các nền phức
tạp, kém linh hoạt vì phải phụ thuộc vào hóa chất của nhà sản xuất. Do vậy,
việc tìm ra các phương pháp phân tích mới thuận tiện hơn là mục tiêu của nhiều
nghiên cứu trên thế giới. Thêm vào đó, để gia tăng tiện ích các nhà khoa học
liên ngành đã và đang hướng tới chế tạo một bộ thiết bị phân tích hoàn chỉnh có
khả năng đo trực tiếp tại hiện trường đồng thời truyền dẫn dữ liệu về trung tâm
tạo lập hệ thống quan trắc tức thời tại mọi thời điểm.
1.3. Cảm biến sinh học điện hóa
Cảm biến được coi là kỹ thuật nền tảng cho sự phát triển của khoa học và
công nghệ hiện đại, được đánh giá là một trong mười công nghệ làm thay đổi
cuộc sống[8]. Bên cạnh sự có mặt của các loại cảm biến trong các ngành công
nghiệp, cảm biến ứng dụng trong đời sống như một thiết bị dân dụng, đã và
đang hiện diện ngày một nhiều hơn trong cuộc sống. Đó có thể là các cảm biến

6


gia tốc, cảm biến ánh sáng, cảm biến khoảng cách, cảm biến lực và con quay
hồi chuyển… trong các thiết bị di động thông minh; cảm biến lưu lượng, cảm
biến áp suất, cảm biến nhiệt độ… trong ôtô; cảm biến báo cháy, cảm biến
chuyển động, cảm biến quang học trong văn phòng và gia đình v.v… Có thể
thấy rằng, cảm biến đo lường các đại lượng vật lý đã có những bước phát triển
mạnh mẽ với độ tin cậy cao, nhỏ gọn và giá thành ngày càng giảm. Trong khi
đó, cảm biến sinh học vẫn còn ở những bước nghiên cứu khởi đầu, đòi hỏi sự
đầu tư, nghiên cứu để biến các ý tưởng thành các sản phẩm ứng dụng, phục vụ
đời sống[8, 9].
Năm 1962, lần đầu tiên khái niệm về cảm biến sinh học đã được L.C.
Clark và C. Lyons đề cập đến trong báo cáo về chế tạo điện cực dùng enzym

glucozơ oxidaza để định lượng glucozơ [10]. Từ đó tới nay, lĩnh vực cảm biến
sinh học đã và đang tiếp tục thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều
nhà khoa học liên ngành (hóa học, vật lý, sinh học, khoa học vật liệu, cơ học,
điện tử...) trên toàn thế giới. Cảm biến sinh học đã cho thấy tiềm năng có thể
trở thành phương pháp phân tích mới, có triển vọng thay thế một phần hay toàn
bộ cho các thiết bị và phương pháp phân tích truyền thống vốn có giá thành
cao, tốn nhiều thời gian, vận hành phức tạp, sử dụng nhiều dung môi, hóa chất.
Lĩnh vực ứng dụng của cảm biến sinh học đa dạng, nổi bật là trong chẩn đoán
y-sinh học, kiểm soát môi trường, an toàn thực phẩm, an ninh, quốc phòng.

Hình 1.2. Sơ đồ nguyên lý cấu tạo một cảm biến sinh học

7


Cảm biến sinh học ứng dụng trong xác định dư lượng chất BVTV là một
nội dung đang nhận được rất nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa
học cũng như các doanh nghiệp phát triển công nghệ. Mặc dù còn là chủ đề còn
nhiều mới mẻ, nhưng các nghiên cứu gần đây đều cho thấy cảm biến sinh học
ứng dụng trong dư lượng chất BVTV có độ nhạy rất cao cỡ picomol thậm chí là
femtomol, thời gian phân tích nhanh, về mặt nguyên lý có thể tạo được các
thiết bị phân tích nhỏ gọn, thao tác và hoạt động đơn giản. Với những bước
phát triển mạnh mẽ của nhiều ngành khoa học như sinh học phân tử, hiện nay
đã có thể chế tạo được các đầu do sinh học như các kháng thể đơn dòng đặc
hiệu với từng loại hoạt chất cho phép phân tích rất chọn lọc trong các nền mẫu
phức tạp, đặc biệt là các loại hoạt chất có độc tính cao và bị cấm sử dụng.
Số lượng công bố khoa học liên quan đến cảm biến sinh học xác định
thuốc bảo vệ thực vật (pesticide biosensors) tăng rất nhanh qua các năm
(Hình 1.3).

Hình 1.3. Số các công bố khoa học liên quan đến chủ điểmcảm biến sinhhọc
xác định thuốc BVTV từ 1989 tới 2011(theo thống kê của Thomson Reuters
Web of Science) [11]
Từ các nghiên cứu cơ bản đến một sản phẩm công nghệ cụ thể đòi hỏi
những đầu tư một cách bài bản và là sự kết hợp của nhiều lĩnh vực. Nếu theo dõi
các công bố trong vòng vài năm trở lại đây chúng ta sẽ tìm được trên 10.000 công

8


trình thuộc hệ thống ISI, có nội dung liên quan đến cảm biến sinh học. Các nghiên
cứu này phát triển theo hai xu hướng tạm gọi là “phần cứng” (hardware) và “phần
mềm” (software): (1) Chiến lược phát triển “phần mềm” tập trung chủ yếu vào
quá trình cô lập (isolation), nhận biết (recognition) và khuếch đại cả về độ chọn
lọc và cường độ của các tín hiệu (do các phản ứng sinh hóa đặc trưng giữa enzymcơ chất; kháng nguyên-kháng thể… gây nên). (2) Sự phát triển “phần cứng” bao
gồm việc thiết kế các vi thiết bị hiệu quả hơn, đồng thời tối ưu hóa quá trình chế
tạo và tích hợp các thiết bị này trên các vật liệu tương sinh. Song song với quá
trình này là việc cải tiến phương pháp đóng gói (packaging) các hệ này cũng như
giao thức tương tác với thiết bị bên ngoài.
Từ những qua thử nhanh đơn giản có tính định tính hoặc bán định lượng,
việc phát triển các bộ công cụ hiệu quả có khả năng phân tích định lượng chính
xác với độ chính xác, đặc hiệu cao là nhu cầu tất yếu. Việc kết hợp sử dụng các kỹ
thuật khác nhau nhằm tạo ra một bộ thiết bị hoàn chỉnh có khả năng định lượng
chất BVTV trong môi trường và thực phẩm là một yêu cầu vừa có tính khoa học
và thực tiễn. Những thành công của bộ đo đường huyết theo nguyên lý điện hóa
đang được bán rộng rãi trên thị trường là một kết quả vô cùng khích lệ cho các nhà
nghiên cứu cũng như phát triển công nghệ hướng tới một thị trường tiềm năng, gia
tăng tiện ích, góp phần cho cuộc sống ngày một bền vững hơn.
Nếu dựa trên sự phân loại phần tử nhận biết sinh học (bio-recognition
elements) thì cảm biến sinh học gồm[8]: cảm biến với đầu dò enzyme, cảm

biến với đầu dò tế bào, cảm biến với đầu dò kháng thể (cảm biến miễn dịch) và
cảm biến với đầu dò ADN (Hình 1.4). Trong đó, cảm biến với đầu dò enzyme
và cảm biến miễn dịch được quan tâm nhiều hơn cả, với khoảng 40-50% số
nghiên cứu dựa trên cơ chế ức chế enzyme [12]. Đây là các dạng đầu dò có khả
năng tiến tới các sản phẩm thương mại trong thời gian gần. Một số các kỹ thuật
mới gần đây như kỹ thuật tạo khuân phân tử MIP, cảm biến aptame cũng đã
được báo cáo.

9


Hình 1.4. Các mô hình cảm biến sinh học xác định chất BVTVđang được
nghiên cứu [12]
Có nhiều nguyên lý đo các tín hiệu được tạo ra do sự tương tác giữa
thành phần sinh học và hoạt chất BVTV như nguyên lý quang học với các kỹ
thuật có độ nhạy cao như cộng hưởng plasmon bề mặt SPR, phổ raman tăng
cường bề mặt SERS; hay nguyên lý điện hóa với các kỹ thuật đo phổ tổng trở,
con-ampe xung vi phân, sóng vuông, hay ứng dụng nguyên lý transito hiệu ứng
trường... Hiện nay, phần tử chuyển đổi tín hiệu theo nguyên lý quang học và
điện hóa được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu, phát triển và ứng dụng
cảm biến sinh học. Lợi thế của nguyên lý quang học trong chế tạo cảm biến đó
là độ nhạy cao và có khả năng nghiên cứu sâu về các quá trình sinh học phân tử.
Tuy nhiên giá thành kỹ thuật quang học còn khá đắt do kỹ thuật chế tạo còn phức
tạp, việc thu gọn kích thước gặp nhiều trở ngại; thêm vào đó, việc bảo quản các
hệ quang học trong điều kiện thời tiết nhiệt đới như ở Việt Nam có nhiều khó
khăn. Do đó sử dụng phần tử chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa đã được chúng
tôi lựa chọn để chế tạo cảm biến sinh học.
1.3.1. Cảm biến Enzyme
Nguyên tắc hoạt động dựa trên sự ức chế mạnh một số loại enzyme khi
có mặt một số loại thuốc BVTV, trên cơ sở sự giảm hoạt tính của enzyme, xác

định được hàm lượng chất BVTV trong đối tượng phân tích (Hình 1.5).

10


Hình 1.5. Mô hình ức chế xúc tác enzyme của thuốc BVTV. Hình phía trên:
khi không có chất BVTV; Hình phía dưới: khi có chất BVTV [13]
Tiêu biểu có thể kể đến nhóm lân hữu cơ (organophosphorus), carbamate
gây ức chế mạnh men Cholinesterase (ChE), Acetylcholinesterase (AChE) [1416], Butyrylcholinesterase (BChE) [17, 18], Enzyme Tyrosinase bị ức chế bởi
các chất BVTV như Carbamate và Atrazine [19-21]. Một loại enzyme khác là
organophosphorus hydrolase có khả năng thủy phân một số hoạt chất thuộc
nhóm lân hữu cơ như paraoxon, parathion, methyl parathion cũng đã được
nghiên cứu [22, 23].
a. Cảm biến sinh học dựa trên sự ức chế enzyme Cholinesterase và
Acetylcholinesterase
Mặc dùđộđặc hiệu của cảm biến enzyme này còn hạn chế, nhưng đây
đượccho là công cụ mạnh mẽkhi phát hiện nhanh và nhạy nhóm lân hữu cơ
(OP) và carbamate (CM).

Hình 1.6. Mô hình ức chế enzyme AChE trong xác định chất BVTV
11


Các nghiên cứu đáng chú ý đưa ra giới hạn phát hiện hoạt chất
Trichlorfon trên điện cực màng Nylon và xenlulo nitrat là 0,038 µM [17,
18]; trên điện cực PbO 2/TiO2/Ti là 0,1.10 -3 µM[24]… Với hoạt chất
Diazinon; giới hạn phát hiện 0,147 ppb trên cơ sở điện cực vàng biến tính
bởi polyanilin [25].
Giới hạn phát hiện hoạt chất Carbaryl trên điện cực in (SPE) biến tính bởi Prussian
xanh (PB) là 0,124 µM [26], trên điện cực than thủy tinh biến tính bởi chitosanPrussian xanh đạt 3.10-3µM [15], hay trên điện cực than thủy tinh biến tính bởi

TiO2-Graphene là 1,4.10-3µM [27]…

Hình 1.7. Mô hình chế tạo cảm biến enzym xác định chất BVTV
theo nguyên lý điện hóa
Một nhóm nghiên cứu đa ngành của Brazil mới đây đã phát triển một
loại cảm biến sinh học giúp đo hàm lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm, nước
và đất. Công nghệ hiện vẫn đang trong giai đoạn phát triển nhưng nếu trở thành
một sản phẩm thương mại, công nghệ có thể mang lại một giải pháp di động,
giá cả phải chăng để giám sát loại hóa chất độc hại này. Nhóm nghiên cứu đã
sử dụng enzyme acteylcholinesterase (AChE) - một loại enzyme hoạt hóa cao
có trong các nút giao thần kinh cơ và khớp thần kinh não cholinergic của nhiều
loài côn trùng, động vật như lươn, cá, động vật có vú và kể cả não người.

12


Enzyme AChE hoạt động với chất dẫn truyền xung thần kinh acetylcholine
(ACh) liên quan đến các chức năng nhận thức như suy nghĩ và ghi nhớ. Khi
tiếp xúc với phân tử methamidophos, hoạt động của enzyme AChE bị ức chế
khiến nó sản sinh ra ít proton hơn so với bình thường. Sự chênh lệch về lượng
proton sẽ được hiển thị trên một thiết bị nhỏ được tích hợp một tấm phim siêu
mỏng có chức năng khuếch đại tín hiệu, qua đó cho biết hàm lượng thuốc trừ
sâu. Thiết bị trông giống như dụng cụ thường dùng để đo nồng độ đường trong
máu. Do có kích thước nhỏ bé, những người nông dân có thể thực hiện các
phép đo và lấy kết quả ngay. Nhóm nghiên cứu ước tính chi phí sản xuất cảm
biến sẽ vào khoảng từ 46 đến 92 USD.
b. Cảm biến sinh học dựa trên sự ức chế enzyme Tyrosinase
Trongsinh học phân tử, Tyrosinase (Tyr) coi là mộtoxidase, một loại
enzyme giới hạn tốc độ nhằm kiểm soát quá trình sản sinh melanin. Quá trình
này gồm hai bước liên tiếp nhau: đầu tiên, enzyme tyrosinase xúc tác cho quá

trình hydroxyl hóa monophenol thành o-diphenol tương ứng. Trong giai đoạn
thứ hai, hợp chất o-diphenol này tiếp tục bị oxy hóa thành o-quinone, và sau
đó, qua nhiều phản ứng tạo thànhmelanin:

Tyrbị ức chế bởicác hợp chấtthuốc BVTV khác nhau như nhóm
Carbamate, lân hữu cơ. Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng cảm biến Tyrtheo
nguyên lýđiện hóa để phát hiện nhiều dạng độc chất khác nhau trong môi
trường [20, 21, 28, 29]. Cảm biến sinh học trên cơ sở enzyme Tyr tuy có độ đặc
hiệu thấp và bị ảnh hưởng bởi điều kiện nền phức tạp [12] nhưng ưu điểm của
Tyr làcó thể chịu đựng được nhiệt độcaovà chịu được cácdung môi hữu cơ
thường được dùng đểhòa tanthuốc BVTV.

13


Nghiên cứu của Xuejiang Wang và cộng sự cho biết cảm biến Tyr có
giới hạn phát hiện với hoạt chất Diazinon là 0,05 µM và Carbaryl là 0,2 µM
[30]; hay nghiên cứu của Edith Kuusk cho biết giới hạn phát hiện carbaryl là
0.2 mg/l[31].
1.3.2. Cảm biến miễn dịch (immunosensors)
Sử dụng kháng thể để nhận biết và liên kết đặc hiệu với từng nhóm chất
BVTV giúp khắc phục các nhược điểm về độ đặc hiệu của cảm biến enzyme.
Hơn nữa, phức hợp kháng-nguyên kháng thể có thể phân ly khi sử dụng tác
nhân thích hợp. Vì vậy, giống như enzyme, thành phần sinh học của cảm biến
có thể phục hồi, cho phép giám sát môi trường liên tục theo thời gian thực.
Nguyên lý hoạt động của cảm biến miễn dịch trong phân tích chất BVTV là dựa
trên cơ chế chọn lọc hoặc thay thế, trong đó các phân tử chất BVTV tự do sẽ cạnh
tranh hoặc thế chỗ các cơ chất khi tương tác với kháng thể. Một số kết quả nghiên
cứu gần đây liên quan đến cảm biến miễn dịch phân tích thuốc BVTV đó là phân
tích thuốc diệt cỏ atrazine [32-34], hoạt chất paraoxon [35], chlorpyrifos [36],

carbaryl [37],… Mặc dù có nhiều ưu điểm, nhưng việc tạo ra các chế phẩm sinh
học (phần tử dò) đặc hiệu với phần tử đích là các hoạt chất thuốc BVTV còn gặp
nhiều khó khăn nên hạn chế nhiều khả năng ứng dụng của phương pháp.

Hình 1.8. Cảm biến sinh học phân tích thuốc bảo vệ thực vật (BVTV)
dựa trên mô hình transit hiệu ứng trường (FET) [13].

14


Gần đây, cảm biến miễn dịch xác định chất trừ cỏ atrazin đã được báo
cáo với nhiều kết quá rất đáng chú ý. Atrazin, (2-clo-4 (ethylamino) -6 (isoprophylamino)-s-triazin) (viết tắt là ATZ, TLPT = 215 Da) là một loại
thuốc diệt cỏ vẫn còn được sử dụng tại nhiều quốc gia. Các nghiên cứu cho
thấy ATZ là nguyên nhân khiến cho một số loài động vật lưỡng cư, có vú và cá
bị huỷ diệt, gây chuyển đổi giới tính và ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của
nhiều loài động vật. Phụ nữ tiếp xúc với ATZ thì khả năng sinh sản giảm do tổn
thương tử cung và những đứa trẻ sinh ra từ những phụ nữ này có cân nặng thấp
hơn bình thường và kèm theo một loạt rối loạn. ATZ hoạt hóa một gen quyết
định đến cân nặng thai nhi khiến cho trẻ đẻ ra nhẹ cân đồng thời tác động lên
một gen khác ảnh hưởng đến tử cung gây giảm khả năng sinh sản. Hiện nay,
ATZ đã bị cấm sử dụng tại châu Âu; các nước khác như Hoa Kỳ, Nhật, Canađa
đã đặt mức yêu cầu dư lượng ATZ trong nước sinh hoạt với nồng độ an toàn là
3ppb (tương đương 14.10-9 M).
Cảm biến miễn dịch điện hóa xác định chọn lọc siêu vết ATZ được thiết
kế trên màng poly[N-(6-(4-hydroxy-6-isopropylamin-1,3,5-triazin-2-ylamino)hexyl)5hydroxy-1,4-naphthoquinon-3-propionamid] [32]. Điểm nổi bật trong cảm biến
này đó là sử dụng phản ứng tổng hợp hữu cơ để tổng hợp một loại monome
mới từ 5-hydroxy-1,4-naphthoquinon(JUG) và hydroxyatrazin. Monome mới
này,

với

tên

gọi

N-(6-(4-hydroxy-6-isopropylamino-1,3,5-triazin-2-

ylamino)hexyl)-5-hydroxy-1,4-naphthoquinon-3-propionamid] (viết tắt là JUGHATZ), có chứa ba nhóm chức: nhóm hydroxyl cho trùng hợp, nhóm quinon là
tác nhân chỉ dấu điện hóa nội và nhóm hydroxyatrazin có vai trò như đầu dò
sinh học.
Mô hình cảm biến ATZ trên cơ sở màng poly(JUG-HATZ) được đưa ra
dưới đây.

15


Hình 1.9. Mô hình cảm biến ATZ dựa trên sự thay đổi tín hiệu signaloff/signal- on của màng poly(JUG-HATZ) [32]
Cảm biến miễn dịch có giới hạn phát hiện rất thấp, khoảng 1 pM tức
khoảng 0,2 ng/l, thấp hơn nhiều lần ngưỡng cho phép trong thực phẩm và đồ
uống của Liên minh châu Âu (0,1 g/l). Tuy nhiên, phần tổng hợp hữu cơ
monome khá phức tạp là hạn chế khá lớn khi ứng dụng cảm biến trong kiểm
soát và định lượng ATZ trên thực tế.
1.4. Polyme dẫn điện
1.4.1. Giới thiệu tổng quát về polyme dẫn điện
Từ những nghiên cứu ban đầu của H. Shirakawa (Viện Công nghệ
Tokyo, Nhật Bản) vào những năm 70 của thế kỷ trước, polyme dẫn điện ngày
càng chứng tỏ tiềm năng phát triển và ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác
nhau. Năm 2000, giải Nobel Hóa học đã được trao cho A.G. MacDiarmid, A.J.
Heeger và H. Shirakawa do những công lao khám phá và có nhiều đóng góp
trong việc phát triển polyme dẫn [38].

Polyme dẫn được phân ra làm ba loại chính:
- Các polyme dẫn điện tử (electrically conducting polymer): là polyme
có mạch chứa các liên kết đôi liên hợp, không có sự tích tụ điện tích một cách
16