Xác Định Một Số Gen Mã Hóa Yếu Tố Quyết Định Kháng Nguyên Của Xoắn Khuẩn Leptospira Interrogans

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THANH HUỆ

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ
QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA
XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans
GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - NĂM 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN THỊ THANH HUỆ

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GEN MÃ HÓA YẾU TỐ
QUYẾT ĐỊNH KHÁNG NGUYÊN CỦA
XOẮN KHUẨN Leptospira interrogans
GÂY BỆNH LEPTOSPIROSIS TẠI VIỆT NAM
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Thị Bích Thủy

THÁI NGUYÊN, NĂM 2017


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân
thành và sâu sắc nhất của mình tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phòng Hệ
gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn trong quá trình nghiên cứu và
hoàn thành luận văn.
Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trong Ban giám hiệu Trường Đại
học Khoa học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Trường
Đại học Khoa học Thái Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ trong
suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học.
Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nghiêm Ngọc Minh, KS. Phạm
Thùy Linh và các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên
cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng
dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng yêu thương và biết ơn sâu sắc đến gia đình,
đồng nghiệp - những người đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, động viên tác giả trong
quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017
Tác giả

Trần Thị Thanh Huệ

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện

với sự giúp đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu
hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa
học của TS. Võ Thị Bích Thủy. Các tư liệu trích dẫn đều có nguồn gốc rõ ràng,
các kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố ở bất kỳ
công trình nào khác.
Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Huệ


i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 4
1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira ........................................................ 4
1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 6
1.2.1. Tình hình bệnh Leptospirosis .................................................................. 6
1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis ..................... 10
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước............................................................. 12
1.3.1. Tình hình bệnh Leptospirosis ................................................................ 12
1.3.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis ..................... 14

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 15
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 16
2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 16
2.2.2. Thiết bị................................................................................................... 17
2.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 18
2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 18


ii

2.4.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số ........................ 19
2.4.3. Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41,
LipL21, LigA, LigB .......................................................................................... 20
2.4.4. Kỹ thuật PCR......................................................................................... 20
2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rDNA ....................................... 21
2.4.6. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn .......................... 22
2.4.7. Phân tích và xây dựng sơ đồ hình cây phân loại 6 chủng Leptospira .. 23
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 24
3.1. Phân loại học phân tử 6 chủng Leptospira ............................................... 24
3.1.1. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số......................................................... 24
3.1.2. Trình tự các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41,
LipL21, LigA, LigB .......................................................................................... 26
3.1.3. Nhân gen với các cặp mồi của gen 16S rDNA...................................... 27
3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR gen 16S rDNA.............................................. 28
3.1.5. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn .......................... 29
3.1.6. Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn
khuẩn ............................................................................................................... 30
3.2. Xác định sự có mặt của các gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21,

LipL41 ............................................................................................................. 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 41
1. Kết luận ....................................................................................................... 41
2. Đề nghị ........................................................................................................ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 1
PHỤ LỤC


iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp

Base pair

dH2O

Nước khử ion

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

EMJH

Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris

EtBr

Ethidium Bromide

F-

Forward Primer : Mồi xuôi

R-

Reverse Primer: Mồi ngược

Kb

Kilobase

L.

Leptospira

MLST

Multilocus Sequence Typing

OMP

Protein ngoài màng (outer membrane protein)

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

TAE

Tris-acetate-EDTA


iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

2.1

Danh mục các thiết bị đã sử dụng

17

2.2

Thành phần phản ứng nhân gen

21

3.1
3.2
3.3

Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm
và 280nm của 6 chủng Leptospira
Trình tự cặp mồi dùng để nhân các đoạn gen
Các loài Leptospira quốc tế tham khảo từ cơ sở dữ
liệu GenBank

25
27
30


v

DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1

Leptospira interrogans

4

2

Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen

21

3.1

Hình ảnh điện di DNA tổng số của 6 chủng Leptospira

24

3.2

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S

28

3.3

3.4

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S
tinh sạch
Hình ảnh cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn khuẩn

29
32

3.5.a Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigA

35

3.5.b Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL32

35

3.5.c Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigB

36

3.5.d Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OmpL1

36

3.5.e Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21

37

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL41

37

3.5.f


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là một trong những bệnh truyền
nhiễm cấp tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến trên thế giới, được
Tổ chức Sức khỏe động vật Thế giới (World Organisation for Animal HealthOIE) xếp vị trí thứ 2 trong nhóm bệnh nguy hiểm và được bổ sung vào nhóm
bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam. Nguyên nhân gây ra bởi một loại xoắn khuẩn
Leptospira interrogans.
Leptospira interrogans là loài gây bệnh thường kí sinh ở người và động
vật, bao gồm hơn 200 typ, được chia thành 23 nhóm (trong đó Leptospira
interrogans serovar Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất). Xoắn khuẩn này có
khả năng gây bệnh trên động vật và có thể lây sang người. Bệnh do xoắn khuẩn
gây ra còn gọi là bệnh vàng da, nó gây ảnh hưởng đến các cơ quan và có thể
gây sẩy thai ở thú nuôi. Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm sang người qua niêm mạc,
da, mắt hoặc các màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc
mẫu mô động vật mắc bệnh. Bệnh phát triển ở khắp mọi nơi trên thế giới, gây
thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của
con người. Do tính đa dạng về triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn
đoán và tỷ lệ tử vong cao. Việc điều trị bệnh này rất khó khăn nên đòi hỏi những
biện pháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phòng
bệnh do xoắn khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết.
Trong quá trình nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học đang tập trung
vào các loại vắc xin có khả năng phòng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ

vùng, an toàn, mức độ bảo hộ cao và lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe
cộng đồng và động vật. Đặc biệt quan tâm với loại vắc xin nhược độc được
thiết kế dựa trên cơ sở trình tự gen và các yếu tố độc lực của các tác nhân gây
bệnh để tối ưu hóa mức độ an toàn của các loại vắc xin. Đây là một bước đột


2

phá thực sự, ứng dụng công nghệ di truyền trong chế tạo vắc xin nói chung và
vắc xin Leptospirosis nói riêng.
Thực tế, nhiều protein ngoài màng của xoắn khuẩn Leptospira đã được
tìm thấy và sử dụng trong công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp. Quá trình tách
chiết, tái tổ hợp và tinh sạch các protein này đơn giản, hơn nữa protein tái tổ
hợp có giá trị tương tự như kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để phát
hiện xoắn khuẩn Leptospira. Kết quả thực nghiệm cho thấy vắc xin tái tổ hợp
phòng bệnh xoắn khuẩn có miễn dịch cao hơn so với các loại vắc xin thông
thường. Do đó, những nghiên cứu về các gen quyết định kháng nguyên tiềm
năng, công thức tối ưu, tá dược, liều lượng và liệu trình để phát triển các loại
vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn đạt hiệu quả cao, an toàn cho người và động
vật sử dụng là rất cần thiết. Việc cải thiện chất lượng vắc xin tái tổ hợp DNA
và vắc xin protein thực sự quan trọng đối với các ứng dụng thực tế. Hơn nữa,
việc nghiên cứu các protein màng sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu di truyền học,
có ý nghĩa thiết thực đối với các nhà khoa học và sản xuất liên quan đến vắc
xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định
một số gen mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn
Leptospira interrogans gây bệnh Leptospirosis tại Việt Nam” nhằm tạo cơ
sở cho việc nghiên cứu, sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn
Leptospira interrogans tại Việt Nam.
2. Mục tiêu nghiên cứu

- Định danh được 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh
Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam.
- Xác định được một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá
trị ứng dụng trong chế vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn
Leptospira interrogans tại Việt Nam.


3

3. Nội dung nghiên cứu
- Giải trình tự gen 16S rDNA và xây dựng sơ đồ phân loại hình cây của 6
chủng xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc
xin vô hoạt ở Việt Nam.
- Xác định sự có mặt của một số gen mã hóa kháng nguyên trên 6 chủng
xoắn khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô
hoạt ở Việt Nam.


4

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira
Đặc điểm sinh vật học: Xoắn khuẩn Leptospira có hình thể rất mảnh,
đường kính 0,1- 0,2μm, dài 5- 25μm. Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấy
vi khuẩn di động mạnh. Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc
Fontana -Tribondeau mới phát hiện được vi khuẩn, khi đó vi khuẩn nhìn thấy
mảnh như sợi tóc, hai đầu cong như móc câu và 2 tiêm mao quanh bào chất để
Leptospira có thể chui sâu vào mô vật chủ. Dưới kính hiển vi điện tử phóng đại
khoảng x 10.000 lần mới thấy các vòng xoắn nhỏ (15 - 30 vòng), sát nhau như

một sợi chỉ lóng lánh bạc, di động nhanh theo kiểu xoáy và bật thẳng như lò
xo. Xoắn khuẩn có khả năng xuyên qua da và niêm mạc, nhất là da bị xây xước.
Bắt màu Gram âm, ưa khí, mọc chậm ở các môi trường nuôi cấy, pH thích hợp
7,2-7,5; không thể phát triển trong điều kiện axít; nhiệt độ 28-300C (nhưng cũng
có thể nuôi cấy ở nhiệt độ tối đa là 390C và nhiệt độ tối thiểu là 13 - 150C)
( />
Hình 1. Xoắn khuẩn Leptospira interrogans
( />

5

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu hoặc các môi trường thông
thường, nếu không bổ sung 5 - 10% huyết thanh thỏ, xoắn khuẩn không mọc
được. Ngoài ra, giống như các loài vi khuẩn khác, xoắn khuẩn cũng cần sắt để
phát triển. Hiện nay có nhiều loại môi trường bổ sung albumin huyết thanh bò
(bovine serum albumin - BSA) dùng để nuôi cấy, phân lập xoắn khuẩn, ví dụ
môi trường thạch bán cố thể (0,1 - 0,2 thạch) có BSA + Tween 80 (môi trường
EMJH - Ellinghausen McCullough - Johnson - Harris) hoặc môi trường có BSA
+ hỗn hợp Tween 80 và Tween 40. Để hạn chế tạp nhiễm cho thêm vào môi
trường các chất như 5 - fluorouracil, fosfomycin hoặc hỗn hợp gồm rifamycin,
polymycin, neomycin, 5 - fluorouracil, bacitracin và actidione; tuy nhiên các
loại môi trường này có thể gây khó khăn trong việc phân lập xoắn khuẩn nếu
số lượng xoắn khuẩn ít hoặc một số chủng xoắn khuẩn không mọc được trong
môi trường có nhiều kháng sinh. Có thể quan sát rõ các chủng xoắn khuẩn gây
bệnh mọc sau khi nuôi cấy 5 - 7 ngày; trong khi đó các loài sống hoại sinh có
thể mọc trong vòng 2 - 3 ngày. Thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào thời gian mọc
khác nhau của các serovar Leptospira, ví dụ L. interrogans serovar Pomona và
L. interrogans serovar Grippotyphosa cho kết quả sau 7 - 10 ngày nuôi cấy
nhưng các chủng khác như L. interrogans serovar Hardjo và L. interrogans
serovar Bratislava có thể lâu hơn, lâu nhất sau 26 tuần.

Xoắn khuẩn Leptospira có sức đề kháng yếu nhưng còn cao hơn so với
các loại xoắn khuẩn khác, bị diệt ở nhiệt độ 500C/10 phút. Ánh sáng và các
thuốc khử trùng thông thường như phenol, nước javen dễ diệt được Leptospira.
Tuy vậy, xoắn khuẩn Leptospira chịu được lạnh và sống được lâu ở nước tới 3
tuần; sống dai dẳng trong bùn lầy, nước đọng với pH bazơ (pH=7,7), tốt nhất
là nước cống, rãnh, ruộng đồng, khe suối.
( />

6

Về phân loại thì xoắn khuẩn Leptospira thuộc giới Monera, ngành
Spirochaetes, họ Leptospiraceae, giống Leptospira. Người ta phân ra thành các
loài gây bệnh, loài không gây bệnh và loài trung gian. Dựa vào cấu trúc kháng
nguyên mà phân loại thì Leptospira được chia ra làm 23 nhóm, bao gồm 230
typ huyết thanh; mỗi typ huyết thanh có các kháng nguyên đặc hiệu. Một typ
huyết thanh có thể gây nhiều bệnh cảnh khác nhau. Ngược lại, một bệnh cảnh
lâm sàng có thể do bất kỳ typ nào trong nhóm gây bệnh tạo nên. Các typ huyết
thanh có nhiều yếu tố kháng nguyên trùng chéo, gây khó khăn cho chẩn đoán.
Có ít nhất 5 typ huyết thanh có tầm quan trọng tại Mỹ và Canada, tất cả đều
gây bệnh ở chó (với các thuật ngữ Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona,
Grippotyphosa và Bratislava). Ở Việt Nam thường gặp 12 typ huyết thanh sau:
L. interrogans serovar Australis, L. interrogans serovar Canicola, L.
interrogans serovar Autumnalis, L. interrogans serovar Grippotyphosa, L.
interrogans serovar Bataviae, L. interrogans serovar Hebdomalis, L.
interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L. interrogans serovar Ponoma, L.
interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Saxkoebing 6, L. interrogans
serovar Poi, L. interrogans serovar Sejroe.Trong đó, 6 typ gây bệnh đang sử
dụng làm vắc xin vô hoạt ở Việt Nam là: L. interrogans serovar Pomona, L.
interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Mitis, L. interrogans
serovar Icterohaemorrhagiae, L. interrogans serovar Bataviae và L. interrogans

serovar Grippotyphosa.
( />1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.2.1. Tình hình bệnh Leptospirosis
Bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra, được phát hiện đầu
tiên vào năm 1850 trên chó tại Stuttgart (Đức). Khi đó, bệnh được gọi là bệnh


7

vàng da truyền nhiễm. Năm 1886, Adolf Weil ở Heidelberg (Đức) đã mô tả dấu
hiệu lâm sàng của bệnh này là sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuất hiện
đột ngột kèm theo lách to, vàng da và viêm thận. Đến đầu thế kỷ 20, những
thuật ngữ được sử dụng để mô tả bệnh Leptospirosis bao gồm sốt xuất huyết
Java, sốt bảy ngày, sốt mùa thu, bệnh Akiyama và sốt đầm lầy [9].
Năm 1915, Inada và cộng sự đã xác định Leptospira interrogans serovar
Icterohaemorrhagiae là tác nhân gây bệnh Weil ở Nhật Bản [32] và cũng được
Hiibener và Reiter xác nhận tại Đức [31]. Inada và cộng sự (1918) đã phát hiện
serovar L. interrogans serovar Hebdomadis gây sốt 7 ngày ở Nhật Bản [33].
Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm thấy hàng loạt các serovars khác nhau của
Leptospira như L. interrogans serovar Pyrogenes (1923), L. interrogans
serovar Bataviae (1926), L. interrogans serovar Grippotyphosa (1928) [12].
Đến nay, người ta đã phát hiện ra hơn 230 serovars khác nhau của Leptospira
interrogans ở khắp nơi trên thế giới [60].
Bệnh Leptospirosis lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc các
màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu mô động vật
mắc bệnh. Các triệu chứng thường gặp của bệnh Leptospirosis là cơ bắp chân
đau, sốt cao đột ngột, rét run, sốt liên tục hoặc kèm theo mạch nhanh, huyết áp
dao động, mệt nhiều, đau đầu, nhức mắt, buồn nôn và nôn, trường hợp nặng có
biểu hiện li bì, vật vã, mê sảng. Sau khi qua da và niêm mạc, xoắn khuẩn
Leptospira vào máu, gây nhiễm khuẩn huyết, giai đoạn khởi phát này kéo dài

khoảng 5-7 ngày. Sau đó, xoắn khuẩn khu trú và gây bệnh ở gan, thận, màng
não, tim, phổi, thượng thận. Bệnh nhân có triệu chứng vàng da do độc tố xoắn
khuẩn hủy diệt hồng cầu và gây viêm tổ chức trung diệp ở gan. Gan to ra, xung
huyết, xuất huyết vi thể, các bè gan đảo lộn, có thể có ổ hoại tử và xuất huyết
rải rác (có thể nhầm lẫn áp xe gan). Xoắn khuẩn cũng gây tổn thương ống thận,
dẫn đến thiểu niệu và vô niệu, tăng urê và creatinin máu - nguyên nhân chính
làm bệnh nhân tử vong. Thận bệnh nhân to ra, đôi khi có xuất huyết, các tế bào


8

phình lên và hoại tử, gây bít tắc, khe thận bị phù và xâm nhiễm tế bào đơn nhân
(dễ bị chẩn đoán nhầm với viêm gan virus, sốt xuất huyết dengue hoặc nhiễm
khuẩn huyết). Leptospira trong giai đoạn hoại huyết có thể đến cơ quan sinh
dục gây rối loạn sinh sản.Về mức độ nguy hiểm của nhiễm xoắn khuẩn
Leptospira, tuy ít ảnh hưởng trực tiếp đến tính mạng của người bệnh, song gây
ra các tổn thương ở nhiều cơ quan, trong đó đáng chú ý đến triệu chứng hoại tử
cơ, hoại tử ống thận cấp có thể gây suy thận cấp, tổn thương các mô, gan, viêm
và xuất huyết khu trú ở tim, phổi; gây tổn thương (không nguy hiểm lắm) ở não
và màng não. Đặc biệt trên cơ địa phụ nữ mang thai thì khi nhiễm xoắn khuẩn
Leptospira có thể gây ra sẩy thai [4].
Theo các chuyên gia nghiên cứu về Leptospira thì bệnh này có ở mọi nơi
trên thế giới, nhiều nhất ở Châu Phi, Nam Mỹ, Châu Á, gây thiệt hại đáng kể
cho ngành chăn nuôi và ảnh đến sức khỏe con người ở nhiều quốc gia, đặc biệt
là các nước vùng nhiệt đới [8], [9], [62].
Một số gia súc nhiễm Leptospira nhưng không thể hiện triệu chứng lâm
sàng và đây là nguồn truyền lây mầm bệnh. Một số loài gặm nhấm như chuột
là loài vật trung gian mang trùng nguy hiểm nhất [40]. Mặc dù, các loài chuột
là vật chủ chính quan trọng nhưng cũng có nhiều loại động vật có vú khác bao
gồm chó, hươu, nai, thỏ, nhím, bò, cừu, gấu trúc, thú có túi, chồn và một số

động vật có vú ở biển có thể mang và truyền bệnh như là vật chủ phụ. Ở châu
Phi, mèo Banded Mongooses đã được xác định là ổ chứa mang mầm bệnh,
ngoài ra còn có một số vật chủ hoang dã khác ở châu Phi cũng có khả năng
mang mầm bệnh. Chó có thể liếm nước tiểu của động vật bị nhiễm bệnh thải ra
cỏ hoặc đất hoặc uống nước bị nhiễm bệnh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng
loài “chó nhà” nhiễm Leptospirosis do thói quen liếm nước tiểu của chuột bị
nhiễm bệnh đi vào nhà. Tuy không lây lan mạnh và làm chết nhiều chó như
dịch Carre, Parvo, nhưng nếu mắc nhiễm sẽ bị viêm gan, báng bụng, vàng da,


9

rối loạn toàn thân và tử vong. Nguy cơ lây bệnh Leptospirosis cho người rất
cao qua tiếp xúc với nước tiểu từ những con vật bị bệnh [61].
Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis hàng năm là khác nhau từ 0,02/100.000 dân
ở các quốc gia vùng khí hậu ôn đới và 100/100.000 dân ở vùng khí hậu nhiệt
đới. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính hàng năm trên thế giới có từ
7 đến 10 triệu người nhiễm xoắn khuẩn vàng da. Do tính đa dạng của các triệu
chứng, bệnh do xoắn khuẩn Leptospira khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong tại một
số vùng có thể lên đến 20%-25% [44]. Ở các nước đang phát triển, những người
mắc bệnh chủ yếu là nông dân và người nghèo ở các thành phố. Ở các nước
phát triển, những người thường phải làm việc ngoài trời ở những nơi ấm và ẩm
thấp thường có nguy cơ nhiễm bệnh [7]. Người mắc bệnh ngẫu nhiên chứ không
phải là nguồn bệnh. Tuy nhiên một số tác giả cho rằng, có sự lây truyền từ
người sang người do thải xoắn khuẩn qua đường nước tiểu của người bệnh hoặc
lây qua đường tiêu hóa: qua thức ăn, nước uống không đun sôi, nấu chín, bị ô
nhiễm. Cá biệt, bệnh có thể lây qua đường hô hấp do hít phải các giọt nước
nhiễm khuẩn ở dạng khí dung.
Xoắn khuẩn Leptospira rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm,
như động vật ở ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật nuôi trong gia

đình, đồng thời xoắn khuẩn Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong môi trường
tự nhiên. Hơn nữa, bệnh này càng khó kiểm soát ở những nước nông nghiệp
phát triển (do có đàn gia súc đông) và tình trạng vệ sinh môi trường kém (tạo
điều kiện mầm bệnh phát triển) [65]. Bệnh xoắn khuẩn có thể lây sang người
qua tiếp xúc với thú bệnh khi da, niêm mạc bị trầy xướt hay da nguyên lành
nhưng bị ngâm nước lâu làm giãn nở các lỗ chân lông, xoắn khuẩn có thể chui
qua da và gây bệnh. Sự truyền lây còn xảy ra do sự vấy nhiễm của động vật
nhiễm bệnh với các nguồn nước, thực phẩm hay ngay cả chỗ nằm ô nhiễm, chó
tiếp xúc với môi trường bị vấy nhiễm này cũng lây bệnh. Nước tù đọng hay
chảy chậm là môi trường sống thích hợp cho xoắn khuẩn Leptospira tồn tại lâu.


10

Có thể chẩn đoán bệnh bằng cách tìm kháng thể chống lại vi khuẩn hoặc
tìm DNA của vi khuẩn trong máu hay nước tiểu bệnh nhân, động vật mang
mầm bệnh [35]. Chẩn đoán huyết thanh học là phương pháp phổ biến được sử
dụng để chẩn đoán bệnh do xoắn khuẩn gây ra. Các phương pháp chẩn đoán
khác như sử dụng kính hiển vi tụ quang nền đen, phản ứng miễn dịch huỳnh
quang, PCR, phương pháp nuôi cấy, chẩn đoán biến đổi vi thể cũng được sử
dụng. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR dùng để phát hiện chuỗi DNA của Leptospira
chỉ thực hiện ở các trung tâm lớn. Có nhiều cặp mồi (primer) khác nhau đã
được thiết lập, trong đó một số đặc hiệu ở mức giống Leptospira nhưng một số
loại đặc hiệu ở mức serovar.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis
Các nỗ lực phòng bệnh bao gồm trang bị bảo vệ để không tiếp xúc với
động vật có nguy cơ nhiễm bệnh, vệ sinh sạch sẽ sau khi tiếp xúc và tiêu diệt
các loài gặm nhấm ở những khu dân cư [52]. Việc sử dụng kháng sinh để ngừa
bệnh không đem lại hiệu quả rõ ràng [7]. Một số vắc xin dùng cho động vật để
phòng vài loại xoắn khuẩn vàng da có thể làm giảm nguy cơ lây lan sang người.

Từ lâu, các nhà khoa học đã mong muốn tìm được một loại vắc xin hiệu quả để
ngăn ngừa bệnh do xoắn khuẩn Leptospira thông qua tiêm chủng cho người và
động vật có nguy cơ lây nhiễm cao. Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu với chi phí
hàng triệu đô la, các nhà khoa học đã tìm được một số loại vắc xin phòng bệnh
Leptospirosis. Tuy nhiên cho đến nay, các loại vắc xin để phòng bệnh này vẫn
còn hạn chế và chưa đạt hiệu quả cao trong ứng dụng lâm sàng [64].
Một số loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis như: vắc xin sống [41], [15],
vắc xin lipopolysaccharide (LPS) [22], [54], vắc xin lipoprotein [16] [37], [58],
vắc xin protein màng ngoài (OMPs), [25], [46] và vắc xin các yếu tố độc lực
tiềm năng [55], [68]. Hiện nay, ở một số nước như Nhật Bản, Cuba và Trung
Quốc đã có vắc xin phòng chống bệnh Leptospirosis cho người tuy nhiên chưa


11

được cấp phép sử dụng rộng rãi do cần phải tiếp tục nghiên cứu về độ an toàn
của vắc xin này. Vắc xin áp dụng ở động vật chỉ có một vài chủng.
Vắc xin protein tái tổ hợp là loại vắc xin có tiềm năng lớn trong phòng
bệnh do xoắn khuẩn Leptospira. Vắc xin protein tái tổ hợp được xây dựng với
phương pháp công nghệ sinh học hiện đại [49], [58], [59] nhưng trong đó vắc
xin OMPs tái tổ hợp, vắc xin lipoprotein và vắc xin các yếu tố độc lực tái tổ
hợp được quan tâm hơn cả. Những đặc trưng bảo vệ của vắc xin tái tổ hợp đã
được kiểm nghiệm, bao gồm: OmpL1, LipL41 [18], [29], hemolysis-associated
protein 1 (Hap1) [14], và protein miễn dịch (Lig) [48]. Năm 1993, lần đầu tiên
OmpL1 được báo cáo [27]. Sáu năm sau đó, nghiên cứu trên chuột mô hình đã
chứng minh tác dụng gây miễn dịch của 2 loại vắc xin OmpL1 và LipL41 [29].
Vào năm 2002, LigA được mô tả như một globulin miễn dịch giống protein
[48], sau đó các phản ứng miễn dịch của protein LigA, LigB cũng được xác
nhận [37], [49], [59]. Hơn nữa, gen Lig đã được chứng minh là hữu ích trong
việc phát hiện bệnh xoắn khuẩn [47]. Một số protein ngoài màng khác như

LAg42, Loa22 [36], Lk73.5 [10] cũng được công nhận là nguyên liệu trong
việc tạo vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira, tuy nhiên chúng vẫn
chưa được tiến hành thử nghiệm trong các mô hình động vật để phát triển thành
vắc xin.
Lipoprotein là protein quan trọng trong Leptospira, những protein có
nhiều ở màng ngoài và chúng được gắn thông qua các axit béo. Mặc dù khó
khăn trong việc sản xuất lipoprotein do hệ thống biểu hiện dị hợp, nhưng một
số loại lipoprotein như LipL41 [26], LipL32 [28], LipL45 [43] và LipL21 [17]
đã được khẳng định là nguồn nguyên liệu thích hợp cho việc tạo ra vắc xin
lipoprotein tái tổ hợp. Ngoài ra, glucoproteins (GPLs) cũng được dự đoán là
một trong những gen tiềm năng, do khả năng sản xuất ra các yếu tố hoại tử khối
u, interleukin-10 và CD69 [21]. Loại GPLs này xuất hiện trong cả chủng gây
bệnh L. interrogans hoặc chủng không gây bệnh L. biflexa. Trong một vài công


12

trình nghiên cứu trước đây đã có báo cáo về yếu tố độc lực của Leptospira, bao
gồm FlaA, FlaB [52], Hsp58 [51], SphH [38], [39] và ChpK [53] đều có thể
được coi là nguồn nguyên liệu để sản xuất vắc xin phòng bệnh Leptospirosis.
Gen mã hóa yếu tố độc lực FlaB (gen flab) có thể được khuếch đại từ hệ gen
DNA của nhiều chủng. Tuy nhiên, một số kết quả nghiên cứu đã chỉ ra hàng
loạt các protein ngoài màng (LAg42, Loa22, Lk73.5), lipoprotein (LipL32,
LipL45, LipL21 và GLP) và các yếu tố độc lực mới được phát hiện (Hsp58,
flaA, Flab, SphH và ChpK) có thể giúp chúng ta tìm thấy vắc xin phù hợp hơn
[44], [50], [67]. Bởi vì hệ gen của L. interrogans chủng Icterohaemorrhagiae
Lai [55] và L. interrogans chủng Copenhageni [45] có biểu hiện dị hợp của
OMPs, điều này mở ra một tiềm năng mới cho việc phát triển vắc xin [70].
Do vậy, vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn nói riêng cũng như các loại vắc xin
khác nói chung đã, đang và sẽ được nghiên cứu xa hơn để tạo một bức tường

bảo vệ con người và động vật khỏi những tác nhân gây bệnh.
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước
1.3.1. Tình hình bệnh Leptospirosis
Tại Việt Nam, bệnh được Ragiot và Souchard phát hiện lần đầu tiên trên
người năm 1931. Tiếp đó, dịch bệnh bùng phát ở Lai Châu (1964) gây thiệt hại
nhiều gia súc và nhiễm cho cả người [3]. Bệnh Leptospirosis trên gia súc được
nghiên cứu từ rất sớm (1968-1978), đã có nhiều tác giả nghiên cứu về bệnh,
như Đào Trọng Đạt (1966), Lê Đại (1972), Phạm Quân (1976), Vũ Đình Hưng
(1979), Nguyễn Thị Nhân (1999) và gần đây là Vũ Đạt, Lê Huỳnh Thanh
Phương (2001). Các tác giả đã tập trung nghiên cứu tình hình nhiễm Leptospira
ở một số loài gia súc, trong đó có bệnh xảy ra ở lợn. Theo một số tác giả, các
loại gia súc và người chăn nuôi nhiễm xoắn khuẩn Leptospira với tỷ lệ 21 56%. Các serovar Leptospira interrogans thường gặp ở gia súc là
Grippotyphosa, Australis, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Hebdomadis [5].


13

Nguồn lây là các súc vật mang xoắn khuẩn Leptospira và nước tiểu của
chúng. Xoắn khuẩn Leptospira bài tiết từ cơ thể gia súc ra bên ngoài cùng với
nước tiểu làm ô nhiễm môi trường xung quanh, trong đó có nguồn nước. Trong
nước, xoắn khuẩn Leptospira không chỉ tồn tại mà còn sinh sản và giữ nguyên
đặc tính gây bệnh. Ổ chứa mầm bệnh thường là các loài gặm nhấm (chuột),
chúng luôn đào thải xoắn khuẩn Leptospira hoặc gia súc (trâu, bò, ngựa…). Ở
nước ta, bệnh hay gặp ở những người làm việc trong rừng và gần rừng như bộ
đội (biên giới), công nhân địa chất, lâm nghiệp, hầm mỏ, công nhân chăn nuôi
và nông dân qua da bị xây xát, qua vết thương hoặc qua niêm mạc do tiếp xúc
trực tiếp hay gián tiếp với nguồn lây.
Bệnh xoắn khuẩn vàng da cũng lưu hành rộng rãi ở nông thôn, thành thị,
miền núi, đồng bằng, ven biển... Các vùng sinh thái khác nhau có tỷ lệ nhiễm
Leptospira khác nhau và dao động từ 19,45% đến 31,31%. Khoảng 20 năm

trước đây, nhiều nơi có dịch xoắn khuẩn vàng da ở súc vật nuôi, nhất là lợn
trong các trại chăn nuôi và lây sang người. Trong những năm gần đây, nguy cơ
bùng phát dịch bệnh nhiễm xoắn khuẩn Leptospira có chiều hướng ngày càng
gia tăng do tình hình vệ sinh môi trường thấp kém, úng ngập thường xuyên,
kéo dài và hệ thống kiểm soát bệnh gia súc còn yếu kém. Bệnh gây thiệt hại
nặng về kinh tế, đặc biệt ở những đàn gia súc sinh sản. Trên các đàn sinh sản,
bệnh là nguyên nhân gây giảm khả năng sinh sản, sẩy thai; lợn con sau khi sinh
ra chậm lớn, còi cọc.
Ở người, theo bác sĩ Lê Công Tảo, Phó trưởng khoa Sốt rét, Ký sinh trùng
động vật (Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội) cho biết, Leptospirosis vốn được
coi là bệnh ở các vùng núi, đầm lầy, nông thôn, nhưng hiện nay đã tràn xuống
vùng địa hình dân cư đông đúc, nghèo nàn tại các thành phố lớn [4]. Mỗi năm
ở Hà Nội có 10 - 15 người mắc. Từ tháng 4/1999 đến 12/2002, tại thành phố có
28 ổ dịch trên người. Tại các khu dân cư, bến xe, bến tàu (nơi cư ngụ lý tưởng
của chuột) nguy cơ bùng phát dịch nhiễm xoắn khuẩn Leptospira là rất lớn. Do


14

vậy, dịch bệnh xoắn khuẩn Leptospira vẫn là một vấn đề sức khỏe cấp thiết cần
quan tâm tại Việt Nam [2].
Hiện nay, Việt Nam vẫn nằm trong vùng dịch tễ học cao của bệnh xoắn
khuẩn [6]. Nghiên cứu dịch tễ học mô tả sử dụng số liệu hồi cứu cho thấy, tổng
số ca mắc xoắn khuẩn được ghi nhận tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011 là 369
ca và không có trường hợp tử vong. Người mắc bệnh mang tính chất nghề nghiệp
rõ: công nhân làm vệ sinh cống rãnh, công nhân chăn nuôi, cán bộ địa chất, lâm
nghiệp hay mắc bệnh. Mặc dù bệnh này luôn tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm cao cho
người và động vật, nhưng lâu nay ít được chú ý cả về mặt pháp luật cũng như về
nhận thức của nhân dân. Việc mua bán gia súc bừa bãi không được kiểm tra chặt
chẽ về mặt thú y làm cho nguy cơ nhiễm bệnh ở gia súc ngày một tăng, đồng

thời nguy cơ lây nhiễm sang người cũng tăng theo [1].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis
Như đã nói ở trên, việc điều trị bệnh này là rất khó khăn chính vì vậy cần
có những biện pháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao. Do đó, sản xuất vắc xin
phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết. Tại Việt Nam
hiện có một số cơ sở đã sản xuất các loại vắc xin Leptospirosis, như vắc xin
Leptospira vô hoạt của Công ty cổ phần thuốc thú y Trung ương (Vetvaco).
Kháng nguyên là vi khuẩn Leptospira được vô hoạt bằng methiolat bao gồm 6
chủng: L. interrogans serovar Pomona, L. interrogans serovar Canicola, L.
interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L.
interrogans serovar Bataviae và L. interrogans serovar Grippotyphosa. Chúng
tương đồng về mặt kháng nguyên với đa số các chủng gây bệnh Leptospirosis
đang lưu hành tại Việt Nam. Với 2 lần tiêm cho gia súc, nhưng thời gian tạo
miễn dịch bảo hộ chỉ trong vòng 6 tháng. Hoặc vắc xin vô hoạt
PALATO.VACL của Công ty cổ phần Nanovet, có thể phòng 3 bệnh: khô thai,
sẩy thai truyền nhiễm và Leptospirosis. Tương lai của việc phát triển vắc xin


15

phòng bệnh Leptospirosis là tìm ra một loại có khả năng phòng bệnh cho một
số lượng lớn người khỏe mạnh và động vật để làm tăng khả năng kháng bệnh,
như vậy, vắc xin phải có độ an toàn cao [19], [24]. Tuy nhiên, hiện nay tại Việt
Nam chỉ đang lưu hành 2 loại vắc xin Leptospirosis vô hoạt và nhược độc phòng
bệnh cho gia súc. Trong đó, các vắc xin nhược độc được thực hiện bằng cách
tiêm truyền các xoắn khuẩn đã được giảm độc lực vào vật chủ với hi vọng giúp
vật chủ tạo kháng thể chống lại bệnh xoắn khuẩn nhưng không kích thích sự
phát triển của các loại xoắn khuẩn này đủ để gây bệnh cho cơ thể đó. Vắc xin
vô hoạt Leptospirosis đã được nghiên cứu rộng rãi trong thập kỷ 70-80 của thế
kỷ 20. Những năm gần đây, việc sử dụng kết hợp cả vắc xin nhược độc và vô

hoạt trong phòng bệnh cho hiệu quả phòng bệnh cao hơn nhưng để đảm bảo an
toàn cho vật nuôi cũng như cho con người, chúng ta cần đầu tư nhiều hơn nữa
cho lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất vắc xin Leptospirosis.

CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
6 chủng xoắn khuẩn đang được sử dụng chế vắc xin vô hoạt phòng bệnh
xoắn khuẩn Leptospirosis tại Việt Nam được nuôi cấy trong môi trường EMJH


16

tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y, bao gồm: L.
interrogans serovar Pomona, L. interrogans serovar Canicola, L. interrogans
serovar Mitis, L. interrogans serovar Icteroheamorrhagiae, L. interrogans
serovar Bataviae và L. interrogans serovar Grippotyphosa.
2.2. Hóa chất, thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Hóa chất tách DNA tổng số: gồm có đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8,NaCl
5M, EDTA 0,5M, CTAB 4% H2O), đệm rửa (Tris HCl 1M , EDTA 0,5M,
pH=8, H2O), dung dịch phenol-chloroform-isoamyl 25:24:1, dung dịch
Isopropanol,...
- Hóa chất điện di: Đệm TAE 50X: 57,1 ml CH3COOH, 100ml 0,5M
EDTA, 242g TRIS - BASE, đệm TAE 1X, agarose, loading dye, ethidium
bromide (EtBr).
- Các hóa chất phục vụ nhân gen: Taq polymerase (Fermentas). Cặp mồi
đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự gen đã được công bố trên ngân hàng
gen quốc tế.
- Bộ kit dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR GeneJETTM PCR Purification

Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA),…và một số hóa chất khác.