Khóa luận tốt nghiệp: Nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết polysaccharide từ quả thể trồng nấm cordyceps militaris

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
============

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE TỪ QUẢ
THẾ NẤM CORDYCEPS MILITARIS

Người hướng dẫn

: ThS. VŨ DUY NHÀN

Sinh viên thực hiện : HOÀNG THỊ NHÀN
Lớp

: 13.01 – K20

Hà Nội - 2017


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
====== ======

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT POLYSACCHARIDE TỪ QUẢ
THỂ NẤM CORDYCEPS MILITARIS

Người hướng dẫn

: ThS. VŨ DUY NHÀN

Sinh viên thực hiện

: HOÀNG THỊ NHÀN

Lớp

: 13.01- K20

Hà Nội - 2017


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Th.S Vũ
Duy Nhàn, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong quá
trình nghiên cứu và thực tập để thực hiện đề tài “ “Nghiên cứu tách chiết
polysaccharide từ quả thể nấm Codyceps militaris”
Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện Hóa học-Vật liệu/Viện Khoa học và
Công nghệ quân sự cùng các anh chị Phòng Hóa sinh, đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập và làm đề tài tại đây.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Viện Đại học
Mở Hà Nội, các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại
trường và thực hiên luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 05 năm 2017
Sinh viên

Hoàng Thị Nhàn

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

MỤC LỤC
Danh mục các chữ cái viết tắt
Danh mục hình
Danh mục bảng
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU ......................................................... 4
1.1. Giới thiệu về nấm Codyceps militaris ..................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm của nấm Codyceps militaris .................................................. 4
1.1.2. Thành phần hóa học trong Codyceps militaris ...................................... 6
1.1.2.1.Adenosine........................................................................................... 6
1.1.2.2 Cordycepin ......................................................................................... 7
1.1.2.3. Sterols................................................................................................ 8
1.1.2.4 Nucleotides ......................................................................................... 8
1.1.2.5 Protein và các amino acid ................................................................... 8
1.2.6 Acid béo ................................................................................................ 9
1.1.2.7. Polysaccharide ................................................................................... 9

1.1.2.8. Acid cordyceptic.............................................................................. 10
1.1.2.9.Ergosterol ......................................................................................... 11
1.1.3 Các ứng dụng từ quả thể nấm Codyceps militaris ................................ 11
1.1.3.1 Tăng cường khả năng miễn dịch ....................................................... 11
1.1.3.2 . Điều trị bệnh ung thư ...................................................................... 11
1.1.3.3 Giải độc thận .................................................................................... 12
1.1.3.4. Điều trị bệnh phổi ............................................................................ 12
1.1.3.5. Điều trị bệnh tim mạch .................................................................... 12
1.1.3.6. Tăng sức bền ................................................................................... 13
1.1.3.7 Làm giảm LDL-Cholesterol trong máu ............................................. 13
1.2. Giới thiệu về Polysaccharide từ quả thể nấm Cordyceps militaris ......... 13
1.2.1. Đặc điểm Polysaccharide từ quả thể nấm Cordyceps militaris ............ 13

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

1.2.2. Hiện trạng tách chiết và tinh sạch Polysaccharide từ quả thể nấm
Cordyceps militaris ...................................................................................... 14
1.2.3. Tác dụng dược lý của polysaccharide ................................................. 17
1.3. Tình hình nghiên cứu tách chiết Polysaccharide từ quả thể nấm Cordycep
militaris ........................................................................................................ 18
1.3.1 Tình hình nghiên cứu Polysaccharide trên thế giới .............................. 18
1.3.2. Tình hình nghiên cứu nuôi trồng Cordyceps militaris ở Việt Nam...... 20
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu ......................................................... 23
2.1.1 Nguyên liệu ......................................................................................... 23
2.1.2 Thiết bị và hóa chất ............................................................................. 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu. ...................................................................... 24
2.2.1 Phương pháp tách chiết Polisaccharide từ Quả thể nấm Cordyceps
militaris ........................................................................................................ 25
2.2.2. Xác định hàm lượng Polysaccharide theo phương pháp phenol-sunfuric
của Milchel.DuBois, K.A.Gilles và cs, 1956. ............................................... 25
2.2.3. Thu nhận Polysaccharide bằng phương pháp kết tủa .......................... 28
2.2.4. Phân tích nhóm chức của Polysaccharide bằng IR .............................. 28
PHẦN 3: KẾT QUẢ .................................................................................... 30
3.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết ....................................... 30
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng tỉ lệ mẫu/ dung môi dùng để tách chiết.............. 31
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu suất tách chiết ................... 32
3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng về thời gian chiết ........................................... 32
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết ........................................... 34
3.4. Xây dựng quy trình tách chiết ................................................................ 35
3.5. Kết quả đo phổ ...................................................................................... 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 45

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nội dung

CP

Cordyceps Polysaccharide

C.Militaris

Nhộng trùng hạ thảo

C. sinensis

Đông trùng hạ thảo

Sp.

Species- Một loài

Spp.

Species plural- Nhiều loài

P1

Polysaccharide thu được từ dịch sau khi chiết với nước.

P2

Polysaccharide thu được từ phần bã đã bổ sung NaOH 4%

P3

Polysaccharide thu được sau khi kết tủa

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cordyceps militaris ......................................................................... 5
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Adenosine ..................................................... 6
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Cordycepin ................................................... 7
Hình 1.4: Công thức cấu tạo polysaccharide................................................. 10
Hình 2.1: Cordyceps militaris nuôi cấy tại Viện Khoa học và công nghệ quân
sự - BQP....................................................................................................... 23
Hình 2.2: Mẫu dùng để tách chiết ................................................................. 23
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tách chiết và tinh sạch Cordyceps polysaccharide 25
Hình 2.4: Mẫu đo đường chuẩn .................................................................... 27
Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn glucose( ߤ݃/݈݉) .......................................... 27
Hình 2.6: Máy ép thủy lực Specac ................................................................ 29
Hình 2.7: Máy đo phổ Spectrum two ............................................................ 29
Hình 3.1: Ảnh hưởng của phương pháp chiết tới hàm lượng polysaccharide

trong dịch chiết............................................................................................. 30
Hình 3.2: Ảnh hưởng của phương pháp chiết tới khối lượng Polysaccharide
thu được ....................................................................................................... 30
Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi trong dung dịch chiết ............ 31
Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỉ lệ mẫu/dung môi lên khối lượng polysaccharide
thu được ....................................................................................................... 32
Hình 3.5: Ảnh hường thời gian chiết lên hàm lượng polysaccharide thu được .......33
Hình 3.6: Ảnh hưởng thời gian chiết đối với khối lượng polysaccharide thu
được ...................................................................................................... 33
Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới hàm lượng polysaccharide thu
được ...................................................................................................... 34
Hình 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới khối lượng polysaccharide thu
được ...................................................................................................... 34
Hình 3.9: Sơ đồ quy trình tách chiết Polysaccharide ................................ 36

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 3.10: Phổ hồng ngoại IR của mẫu CM-hs-CPS2 chuẩn theo kết quả
nghiên cứu của Fengyao Wu [19]. .......................................................... 40
Hình 3.11: Kết quả đo phổ hồng ngoại IR của mẫu P1 ............................ 41
Hình 3.12: Kết quả đo phổ hồng ngoại IR của mẫu P2 ............................ 42
Hình 3.13: Kết quả đo phổ hồng ngoại IR của mẫu P3 ............................ 42

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


Khóa luận tốt nghiệp

Viện Đại học Mở Hà Nội

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại khoa học ......................................................................... 4
Bảng 1.2: Thành phần acid béo của Cordyceps militaris ................................ 9
Bảng 1.3: Hàm lượng của một số loại đường có trong Polysaccharide của quả
thể và sợi nấm Cordyceps militaris ............................................................... 14
Bảng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides ............................. 14
Bảng 1.5: Hiện trạng kỹ thuật tinh sạch Polysccharide ................................. 16
Bảng 1.6: Khả năng kháng khối u của một số polysaccharide được thu nhận từ
một số loại nấm ............................................................................................ 18
Bảng 2.1: Thiết bị dùng trong thí nghiệm ..................................................... 24
Bảng 2.2: Xây dựng phương trình đường chuẩn Glucose ............................. 26
Bảng 3.2: So sánh phổ IR giữa các mẫu ....................................................... 42

Hoàng Thị Nhàn

Lớp: 1301-CNSH


MỞ ĐẦU
Chi nấm Cordyceps được biết đến cách đây hơn 2000 năm trước công
nguyên, với hơn 350 loài trên toàn thế giới. Trong đó có loài Cordyceps

sinensis thường ký sinh và sinh trưởng lên ấu trùng của một loài côn trùng
thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là ấu trùng của loài Hepialus
armoricanus. Sản phẩm quả thể nấm trên xác ấu trùng được dân gian Trung
Quốc từ xưa gọi là Đông Trùng Hạ Thảo, là loại dược liệu quý hiếm bậc nhất
đối với y học cổ truyền Trung quốc.Bên cạnh Cordyceps sinensis còn có loài
nấm Cordyceps militaris cũng có đặc điểm tương tự. Loài nấm Cordyceps
militaris phân bố chủ yếu ở vùng núi cao thuộc dẫy núi Hymalaya có độ cao
trên 4000m so với mực nước biển như vùng Tây Tạng (Trung Quốc), một số
vùng thuộc Nepan và Butan[5].
Trong chi Cordyceps còn có một loài khác là Cordyceps militaris (L. ex
Fr.)Link cũng có thành phần và tính chất dược liệu tương tự với Cordyceps
sinensis. Loài nấm dược liệu này với nhiều tên thông dụng khác nhau tại một
số quốc gia như: Đông trùng hạ thảo, Trùng thảo, Bắc Trùng thảo (Trung
Quốc), Tong ch’ung ha ch’o (Hàn Quốc), Tochukaso (Nhật Bản),
Yarchakunbu (Tây Tạng) Shonkor Kumar Das và cộng sự, 2010 [5].
Loài Nấm Cordyceps militaris có hàm lượng các hoạt chất có hoạt tính
sinh

học

trong

quả

thể

như

cordycepin,

ergosterol,

mannitol,

cordyepolysaccharide và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí còn
cao hơn cả loài Cordyceps sinensis[5]. Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng, sinh
khối của các loài nấm này có một số chức năng dược lý: bảo vệ gan, tăng
cường chức năng thận, chống ung thư bạch cầu, chống hình thành khối u và
hạn chế di căn, cải thiện khả năng tiết insuline đối với người tiểu đường, tăng
cường khả năng [5,7].
Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng quả thể Cordyceps militaris và cơ thể
ấu trùng bị chúng kí sinh có chứa các chất có hoạt tính sinh học quan trọng, có
phổ tác dụng dược lý rộng như polysaccharides, cordycepin, ergosterol[8].
Cordyceps polysaccharides (CP) là nhóm hoạt chất giàu nhất và quan trọng
Hoàng Thị Nhàn

1

Lớp: 1301 - CNSH


nhất, được xem là công cụ và đối tượng nghiên cứu để ứng dụng và phát triển
các sản phẩm đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris. Đông trùng hạ thảo được
xem là một loại dược liệu cỏ truyền quý hiếm bậc nhất của Trung Quốc so với
các loại nấm dược liệu khác. Chính vì vậy gần đây các phương pháp để tách
chiết, tinh sạch, phân tích đánh giá cấu trúc của Cordyceps polysaccharide từ
sợi nấm và quả thể được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi[9].
Các polysaccharide có tác dụng dược lý tăng cường miễn dịch, bảo vệ tế bào
gan, giảm mỡ máu, chống đột biến, giảm đường huyết, chống oxy hóa [7]. Trong
số các tác dụng trên, tác dụng kháng khối u của tế bào gan được đề cập nhiều hơn

cả. Các nghiên cứu dược tính của các hoạt chất trong sinh khối Cordyceps
militaris cho thấy có khả năng kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu
(Kim et al., 2006, Lee H.et al.,2006, Park C.et al.,2005), ung thư phổi, ung
thư vú (Ahn Y.J. et al., 2001). Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có
hiệu quả trong chữa trị rối loạn chức năng của gan (Nan J.X et al. 2001), sự
lão hoá, các chứng viêm tấy (Won S.Y and Park E.H., 2005). Ngoài ra còn có
tác dụng kìm hãm sự oxy hoá của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng
thấp (Klaunig J.E và Kamendulis L.M., 2004, Balaban R.S et al., 2005) [7].
Có rất nhiều nghiên cứu để tìm ra phương pháp tách chiết
polysaccharides tối ưu nhất phù hợp với từng điều kiện cơ sở nghiên cứu cũng
như ứng dụng nhất định. Hiện nay, các phương pháp thường sử dụng công
nghệ chiết bằng siêu âm, chiết bằng nước nóng, chiết bằng cồn, đun hồi
lưu và đun hồi lưu trong môi trường kiềm. Công nghệ chiết bằng siêu âm đem
lại hàm lượng cao nhưng lại khó triển khai được bằng quy mô lớn, trong khi
đó đun hồi lưu đạt được giá trị tương ứng cao nhất là 22.6% . Ở Việt Nam đã
một số nhóm nghiên cứu đã bước đầu công bố một số kết quả trong việc sản
xuất chế phẩm từ các chủng nấm Cordyceps, sản phẩm thu nhận được có chất
lượng tốt nhưng khó khăn khi kiểm soát hàm lượng polysaccharide và các
hoạt chất khác như adenosine, cordycepine trong sản phẩm và triển khai với
quy mô công nghiệp. Chính vì vậy việc tìm ra một phương pháp tách chiết
phù hợp với điều kiện Việt nam hiện nay rất là quan trọng.
Hoàng Thị Nhàn

2

Lớp: 1301 - CNSH


Hiện nay trên thế giới mỗi năm sản lượng nấm dược liệu đạt được lên tới
hơn 10 triệu m3, trong đó có bao gồm cả Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. và

Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link[5,7]. Trong 2 năm gần đây, tại Việt Nam
Cordyceps militaris (L. ex Fr.) Link bắt đầu được nuôi quy mô công nghiệp ở
một số địa phương như: Hà Nội, Đà Lạt, Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Sapa (Lào
Cao), Thành phố Hồ Chí Minh. Dự kiến trong những năm tới sản lượng quả
thể Cordyceps militaris Link tại Việt nam sẽ tăng lên nhanh chóng, quy mô
nuôi trồng công nghiệp ngày càng được triển khai ở nhiều địa phương. Như
vậy, nguồn nấm dược liệu Cordyceps militaris sẽ rất phong phú, phục vụ cho
các nghành sản xuất dược liệu và thực phẩm chức năng trong nước, một phần
nguyên liệu cũng sẽ hướng tới xuất khẩu.
Đề tài: “Nghiên cứu tách chiết polysaccharide từ quả thể nấm
Codyceps militaris”

góp phần tạo ra kỹ thuật và công nghệ sản xuất

Cordycep polysaccharide là rất cần thiết nhằm bổ sung nguồn nguyên liệu cho
ngành sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng.
Mục tiêu
- Xác lập được 01 quy trình tách chiết Polysaccharide từ quả thể nấm
Codyceps militaris.
- Đánh giá được một số nhóm chức cơ bản của các polysaccharide tách
chiết được.
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình tách chiết polysaccharide: lựa chọn phương pháp
1

tách chiết phù hợp, tỷ lệ chất chiết: dung môi, nhiệt độ, pH, dung môi
kết tủa, thời gian chiết, tần suất chiết

1.1 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp chiết: đun hồi lưu, siêu âm
1.2

2

Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết: cỡ hạt chất
chiết, tỷ lệ chất chiết/dung môi, hỗn hợp dung môi, nhiệt độ, thời gian
Bước đầu xác định một số nhóm chức cơ bản trên các mẫu
Polysaccharide phân lập được

Hoàng Thị Nhàn

3

Lớp: 1301 - CNSH


PHẦN 1: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về nấm Codyceps militaris
1.1.1. Đặc điểm của nấm Codyceps militaris
Cordyceps militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng có giá trị
dược liệu quý tương tự như nấm Cordyceps sinensis. Khác với nấm
Cordyceps sinensis với sản lượng rất ít và chỉ mọc trong tự nhiên, loài nấm
Cordyceps militaris có thể được nuôi trồng trong điều kiện nhân tạo. Vào cuối
mùa thu thì các chất trên da của ấu trùng Hepialus armoricanus tương tác với
các bào tử nấm tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm đã đâm sâu vào ấu trùng
Hepialus armoricanus để sinh trưởng và phát triển. Đến đầu mùa hè năm sau,
do tác động của các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng thích hợp, nấm phát
sinh mạnh mẽ và gây chết sâu, sau đó chúng hình thành chồi, phát triển chui
ra khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu. Đông trùng hạ thảo chủ yếu
tìm thấy vào mùa hè ở các vùng núi cao trên 4000m như Vân Nam, Cam Túc,
Thanh Hải, Tứ Xuyên… [8]
Bảng 1.1: Phân loại khoa học

Giới

Nấm

Ngành

Ascomycota

Phân ngành

Ascomycotina

Lớp

Asccomycetes/Pyrenomycetes

Bộ

Hypocreales

Chi

Cordyceps

Loài

Cordyceps militaris

Hoàng Thị Nhàn

4

Lớp: 1301 - CNSH


Hình 1.1: Cordyceps militaris
Theo Sung et al, trên thế giới có hơn 350 loài Codyceps khác nhau, tính
riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 120 loài Đông trùng hạ thảo. Tuy
nhiên cho đến nay người ta mới chỉ nghiên cứu được 2 loài nấm Codyceps
sinensis và Cordyceps militaris có giá trị dược liệu tốt với con người. Loài
nấm Cordyceps militaris phân bố ở vùng núi thấp hơn có độ cao từ 20003000m so với mực nước biển, có hàm lượng các hoạt chất có tính sinh học
trong quả thể như Cordycepin, mannitol, cordypolysaccharide, superoxide
dismutase và nhiều thành phần khác tương đương, thậm chí còn cao hơn của
loài Cordyceps sinensis[5]. Nhờ các hợp chất hóa học này giá trị dược liệu
chính của loài nấm Cordyceps militaris được các nhà khoa học thống kê như
sau: kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư máu (Kim et al., 2006, Lee H.et
al., 2006, Park C.et al., 2005), ung thư phổi, ung thư vú (Ahn Y.J et al., 2001).
Nhiều nghiên cứu cũng đã chứng minh nấm có hiệu quả trong chữa trị rối
loạn chức năng của gan (Nan J.X et al. 2001), sự lão hóa. Ngoài ra còn có tác
dụng kìm hãm sự oxy hóa của lipid, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp
(Klaunig J.E và Kamendulis L>M., 2004, Balaban R.S et al., 2005) [7].
Hiện nay trên thế giới mỗi năm sản lượng nấm đạt được lên tới hơn 10
triệu ݉ଷ , trong đó Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. và Cordyceps militaris
(L. ex Fr) Link.,[5,7]. Trong 2 năm gần đây, tại Việt Nam Cordyceps militaris
(L. ex Fr) Link bắt đầu được nuôi quy mô công nghiệp ở một số địa phương
như: Hà Nội, Tam Đảo, Thành phố Hồ Chí Minh. Hàm lượng hoạt chất


adenosine trong sản phẩm đạt bình quân là 0,33-1,45mg/g và Cordycepin là 39mg/g. Trong những năm vừa qua, Viện Hóa học – Vật liệu, Viện Khoa học
và Công nghệ Quân sự/BQP cùng một số đơn vị trong cả nước như Viện Bảo

vệ thực vật.. đã nghiên cứu thành công công nghệ nhân giống, nuối trồng quy
mô công nghiệp đối với chủng Cordyceps militaris (L. ex Fr) Link và đã triển
khai chuyển giao cho nhiều cơ sở ở Hà Nội, Đà Lạt, Nha Trang, Thành phố
Hồ Chí Minh.
1.1.2. Thành phần hóa học trong Codyceps militaris
Cordyceps militaris có chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học quan
trọng nhất là adenosine, codycepin, polysaccharide có tác dụng rất tốt trong
điều trị bệnh ung thư và các bệnh do virus. Bên cạnh đó đông trùng hạ thảo
còn chứa khoảng 28 acid béo bão hòa và không bão hòa, các loại vitamin như
B1, B2, B12, E, K và các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu, Ze, Mn,
Se…Selen (Se) là một chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, giúp ngăn
ngừa ung thư...
1.1.2.1.Adenosine
Chất Adenosine có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng
lượng của cơ thể. Chất này giúp cải thiện tuần hoán ngoại biên và tim mạch,
cải thiện năng lực cho cơ bắp, giảm sinh trưởng của các tế bào thoái hóa, tăng
lượng oxy trong máu...Vì vậy việc bổ sung hàm lượng Adenosin cao cho cơ
thể là vô cùng cần thiết, giúp cho con người luôn dồi dào năng lượng để lao
động hiệu quả.

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Adenosine


1.1.2.2 Cordycepin
Cordycepin có cấu
u trúc 3’
3’-deoxyadenosin là mộtt purin alkaloid có ddạng
củaa nucleosid adenosin bbị mất một oxy ở vị trí 3’ phầnn đư
đường ribose.
Cordycepin đượcc phân lập

l lần đầu vào năm 1950 từ Cordyceps militaris
militaris.
Bằng phân tích phổ NMR (nuclear magnetic resonance) và IR (infrared),
cordycepin đượcc xem như
nh là một hợp chất có hoạt tính sinh họcc được ly trích
từ quả thể và sợi nấm.
m. Cordycepin có công thức
th C10H13N5O3 và có phân tử
lượng 251, điểm
m nóng chảy
ch tại 230-231OC, độ hấp thu cực đạii tại
t 259 nm. Có
thể hoà tan trong dung dịch
d
đệm muối,
i, methanol hay ethanol, nh
nhưng không
hoà tan trong benzen, ether hay chloroform, do vậy
v nhiềuu nghiên ccứu đã sử
dụng dung dịch muốii kh
khử trùng và đệm
m phosphat làm dung môi.

Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Cordycepin
dycepin
Vì cordycepin có cấu
c trúc tương tự adenosin nên RNA polymerase
không thể phân biệt.
t. Khi tham gia tổng
t

hợp nên phân tử RNA, cordycepin
ngăn chặnn quá trình kéo dài thêm các RNA và tạoo ra các phân tử
t RNA kết
thúc sớm. Do đó,
ó, cordycepin được xem như chấtt kháng ung th
thư hiệu quả.
Năm
m 2003, Sun và cs đã
đ chứng minh hàm lượng
ng cordycepin vvới hoạt tính
kháng

khốii

u

ở Cordyceps

kyushuensis cao

hơ
hơn Cordyceps

sinensis và Cordyceps militaris,
m
ở Cordyceps nuôi cấyy cao hơn ttự nhiên, và
trong sợi nấm cao hơn
ơn ấu trùng chủ. Tác giả cũng khẳng định rằằng đây là hợp
chất có tiềm năng dượcc học
h cao. Năm

m 2007, Noriko Yoshikawa và cs ch
chứng
minh cordycepin có hoạt
ho tính kháng ung thư hiệu quả thông qua vi
việc ức chế


quá trình methyl hóa acid nucleic và polyadenin hóa. Đồng dạng của
cordycepin là 2’,5’- oligoadenin có tác dụng kháng virus thông qua việc ức
chế reverse transcriptase. Tác giả cũng chứng minh rằng tiền chất của
cordycepin là adenosin cũng có hoạt tính kháng ung thư.
1.1.2.3. Sterols
Một số hợp chất loại sterol đã được tìm thấy trong Cordyceps đông
trùng hạ thảo . Một số trong những chất này là ergosterol, Delta – 3
ergosterol, ergosterol peroxide, 3-sitosterol, daucosterol và campasterol. v.v…
Trong đó, ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiềm chất thiết yếu của
vitamin D2, có giá trị rất quan trọng. Ergosterol trong C. sinensis có thể được
xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High
Performace Liquid Chromatography) do Li và cộng sự thực hiện năm 1991
[10,14], được cho là chất ophiocordin, ở Cordyceps pseudomilitaris là chất
bioxanthracenes và tập hợp bốn exopolysaccharide với các trọng lượng phân
tử thay đổi từ 50 kDa tới 2260 kDa tìm thấy ở C. Militaris[5].
1.1.2.4 Nucleotides
Nucleotides( gồm có adenosine, uridine và guanosine) là các thành phần
khá đa dạng trong nấm Cordyceps. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, guanosine
có hàm lượng cao nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi cấy trong điều
kiện nhân tạo hàm lượng của nucleotide thường cao hơn C.Militaris tự nhiên.
Nucleotides trong Cordyceps

tự nhiên bắt nguồn từ sự phân rã của

nucleotides trong suốt quá trình bảo quản, tiếp đó các nhà nghiên cứu cũng
tìm ra rằng độ ẩm có thể làm tăng đáng kể hàm lượng nucleotide trong
Codyceps khi nuôi trên môi trường rắn [13].
1.1.2.5 Protein và các amino acid
Hàm lượng protein trong Cordyceps vào khoảng 29,1 – 33% bao gồm 18
acid amin: acid aspartic, threonin, serin, glutamat, prolin, glycin, valin,
methionin, isoleucin, leucin, tyrosin, phenylalanin, lysin, histidin, cystin,
cystein và tryptophan. Các acid amin có hàm lượng cao nhất là glutamat,
Hoàng Thị Nhàn

8

Lớp: 1301 - CNSH


arginin và acid aspartic và có dược tính cao nhất là arginin, glutamat,
tryptophan và tyrosin. Năm 2011, Zheng và cs đã nghiên cứu họ protein
trong Cordyceps militaris. Kết quả cho thấy bộ gen Cordyceps militaris chứa
61 họ protease nhưng hầu hết là serin protease và metallopeptidase, 12 gen
mã hóa trypsin, 167 gen mã hóa protein kinase, 105 gen mã hóa glycosid
hydrolase. Hơn nữa, Cordyceps militaris sở hữu hầu hết các gen cần thiết cho
hoạt động biến dưỡng adenin và adenosin, ngoại trừ việc thiếu ribonucleotid
triphosphat reductase và deoxyadenosin kinase [14,19].
1.2.6 Acid béo
Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm
70% tổng số acid béo, trong đó lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong
quả thể và 21,5% trong sinh khối. Lượng acid béo no chủ yếu là acid
palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối
Bảng 1.2: Thành phần acid béo của Cordyceps militaris

Acid béo

Phần trăm acid béo tổng (%)
Quả thể

Sinh khối

Palmitic acid (C16:0)

24.5

21,5

Palmitoeic acid (C16:1)

2.3

2,1

Stearic acid (C18:0)

5.8

5,0

Oleic acid (C18:1)

6.0

17,7

Linoleic acid (C18:2)

61.3

33,0

Linolenic acid (C18:3)

-

20,6

1.1.2.7. Polysaccharide
Cordyceps chứa một lượng lớn polysaccharid, khoảng 3-8% khối lượng,
đây là một trong những hợp chất sinh học chính. Từ năm 1977, nhiều nghiên
cứu khoa học tại Trung Quốc và Nhật Bản đã chứng minh được những ích lợi
từ polysaccharid trong việc kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng viêm cũng
như tác động điều hòa miễn dịch. Các hợp chất polysaccharid ở Cordyceps là

Hoàng Thị Nhàn

9

Lớp: 1301 - CNSH


mộtt galactomannan nhiều
nhiề nhánh. Các hợp chất này bao gồm
ồm D

D-mannose và
D-galactose với tỷ lệệ 3:5, thường
th
chứa một tỷ lệ nhỏ protein. Nó là
l một cấu
trúc phân nhánh gồm
ồm các liên
li kết (1-6) và (1-2) liên kết
ết các gốc
g α-Dmannopyranosyl ở mạch
mạ
chính, có các liên kết đaa dạng gi
giữa các
monosaccharid kế cận
ận tạo
tạ thành các cấu trúc xoắn vàà vòng nh
nhỏ. Tuy nhiên,
một mannoglucan với
ới trọng
trọ lượng phân tử xấp xỉ 7700 g/mol đđược phân tách
gần đây chỉ chứaa các đơn
đ vị mannose và glactose với tỷ lệ 1:9. Các phân tích
cho thấy nó có mộtt khung sườn
s
α-D-glucan với các liên kết (1-4)
4) và (1
(1-3); và
các mạch nhánh của α--D-(1-6)-mannopyranose (Manp) được
ợc gắ
gắn vào khung

sườn qua vị trí O-6 của
ủa gốc
g α-(1-3)-glucopyranosyl
glucopyranosyl (Glcp). Nghiên ccứu này
cũng cho thấy dượcc tính của
c polysaccharid là từ các đặcc tính của nó như
nh trọng
lượng phân tử, ví dụụ nh
như các polyglucan có trọng lượng phân tử
ử lớn hơn (101000 kDa) có xu hướng
ớng tan trong nước
n
tốt hơn và vì thế có hoạ
hoạt tính kháng
khối u hiệu quả hơn.
n. Tuy nhiên, hoạt
ho tính kháng ung thư là do ssự tăng cường
miễn dịch cho cơ thể hơ
ơn là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp[8,,17].

Hình 1.4: Công thức cấu tạo polysaccharide
1.1.2.8. Acid cordyceptic
Acid cordyceptic là một isomer của acid quinic, đượcc nghiên
nghi cứu đầu
tiên ở Cordyceps sinensis năm 1957. Cấu trúc tinh thể của acid cordyceptic
được xác định là D-mannitol.
mannitol. Mannitol là hợp
h chất sinh học
ọc chính có nhi
nhiều

hoạt tính quan trọng
ng nh
như kháng gốc tự do, lợi tiểu, trị ho. Chất
Chấ này tồn tại
trong tự nhiên chủ yếu
ếu ở rễ, thân và lá cây; được tìm thấy nhiều
ều trong nnấm ăn,
cà rốt và rêu. Hàm lượ
ợng acid cordyceptic trong Cordyceps kho
khoảng 7-29%.
Mannitol có cấu tạoo gồm
gồ một alcohol và một đường, hoặc một
ột polyol; ttương
tự như xylitol hay sorbitol. Tuy nhiên, mannitol có xu hướng
h ớng lo
loại bỏ ion


hydrogen trong nước làm dung dịch trở nên acid. Công thức hóa học của
mannitol là C6H14O6, trọng lượng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 166oC, tỷ
trọng 1,489 (20oC) và nhiệt độ sôi 290-295oC (467 kPa). Mannitol có nhiều
đặc tính quan trọng đã được sử dụng trong y học và thực phẩm, hàm lượng
mannitol có trong quả thể nấm Cordyceps vào khoảng 29-85 mg/g, sợi nấm
có hàm lượng acid cordyceptic cao hơn so với trong quả thể [7,15].
1.1.2.9.Ergosterol

Ergosterol là tiền chất quan trọng cho vitamin D. Hàm lượng ergosterol
ở Cordyceps militaris nuôi cấy rất cao, chỉ đứng sau Cordyceps sinensis tự
nhiên phân lập ở Tây Tạng. Các ergosterol và các chất đồng dạng của nó có
hoạt tính kháng virus, điều hoà tim mạch, điều trị bệnh thận do giảm

immunoglobin A.
1.1.3 Các ứng dụng từ quả thể nấm Codyceps militaris

1.1.3.1 Tăng cường khả năng miễn dịch
Một thí nghiệm kéo dài 5 năm trên 61 bệnh nhân bị bệnh lupus cho thấy,
việc dùng Cordyceps militaris với liều 3-4 g/ngày và artémisinine (0,6
g/ngày) đã làm giảm sự tái diễn căn bệnh tự miễn này. Trong một thí nghiệm
khác với các bệnh nhân bị ung thư giai đoạn tiến triển, người ta kết luận rằng
các bệnh nhân được điều trị bằng loại nấm này đã được cải thiện chức năng
miễn dịch và nâng cao chất lượng cuộc sống[4].
1.1.3.2 . Điều trị bệnh ung thư
Chất Cordycepin trong thuốc Cordyceps militaris có thể ức chễ sự phân
hạch của các tế bào ung thư, trì hoãn sự lây lan của các tế bào ung thư, có khả
năng diệt một lượng lớn các tế bào T, các thực bào trong cơ thể. Các
polysaccharides trong Cordyceps militaris có thể góp phần thúc đẩy chuyển hóa
hạch, tăng cường khả năng tự chống ung thư cơ thể. Đồng thời Cordyceps
militaris còn có tác dụng an thần, giảm đau tương đối tốt làm giảm sự khởi đầu
của cơn đau ung thư. Do hiện này vẫn chưa có thuốc chữa trị unh thư đặc hiệu,
và hầu hết các loại thuốc này không chỉ tốn kém mà còn có tác dụng phụ tương
Hoàng Thị Nhàn

11

Lớp: 1301 - CNSH


đối lớn, như vậy nếu so sánh, Cordyceps militaris không những không có tác
dụng phụ mà còn giúp cơ thể phục hồi một cách toàn diện, tăng cường chức
năng miễn dịch của họ. Do đó, việc sử dụng Cordyceps militaris để phòng chống
ung thư và dùng như các chất bổ trợ trị liệu là một lựa chọn tốt[7].

1.1.3.3 Giải độc thận
Thử nghiệm mù đôi được thực hiện trên 21 bệnh nhân cao tuổi theo liệu
trình điều trị với amikacine (một kháng sinh rất độc cho thận), người ta quan
sát thấy bệnh nhân có sử dụng nấm Cordyceps militaris thì thận được bảo vệ
tốt hơn, giảm tác dụng gây độc của kháng sinh so với nhóm đối chiếu dùng
giả dược. Kết quả một nghiên cứu khác trên 51 bệnh nhân bị suy thận chỉ
dùng nấm Cordyceps militaris thì thấy có cải thiện chức năng thận và hệ miễn
dịch. Một thử nghiệm khác cũng được thực hiện trên 69 bệnh nhân ghép thận,
kết quả là nấm Cordyceps militaris đã làm giảm độc tính của cyclosporine
trên thận[4].
1.1.3.4. Điều trị bệnh phổi
Cordyceps militaris có khả năng tăng cường hiệu năng sử dụng oxy
trong cơ thể, cùng với các chiết xuất từ nó đã được chứng minh có thể giúp hỗ
trọ điều trị nhiều bệnh về đường hô hấp, bao gồm cả các bệnh nghiêm trọng
như hen suyễn, COPD (bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính), viêm phế quản, giúp
ức chế cơn co khí quản,v.v.[4].
1.1.3.5. Điều trị bệnh tim mạch
Phân tích hoá học cho thấy Cordyceps militaris có adenosine, deoxyadenosine, nucleotide adenosine và các loại nucleotide tự do khác,v.v.
giúp giữ ổn định và điều chỉnh rối loạn nhịp tim. Cordyceps militaris kết hợp
với bài thuốc của đông y có thể hỗ trợ chữa trị các bệnh về tim.
Ngoài ra, các digoxin, hydrochlorothiaside, dopamine và dobutamine
trong đông trùng hạ thảo giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của các bệnh
nhân suy tim mãn tính, như làm tăng các điều kiện chung về thể chất, sức
khoẻ, chức năng tim[4].
Hoàng Thị Nhàn

12

Lớp: 1301 - CNSH

1.1.3.6. Tăng sức bền
Liều 3 g Cordyceps militaris mỗi ngày cho kết quả tốt trong việc gia
tăng năng lượng cơ thể cho người cao tuổi bị các bệnh mạn tính. Một thí
nghiệm thực hiện năm 2004 tại Mỹ cho thấy những người ở độ tuổi 40-70 có
sức khỏe tốt nếu được dùng trích tinh Cordyceps militaris trong 12 tuần đã có
sự gia tăng sức bền thể lực so với nhóm đối chỉ dùng giả dược [4].
1.1.3.7 Làm giảm LDL-Cholesterol trong máu
Nấm Cordyceps militaris có khả năng giảm lượng cholesterol xấu trong
máu đồng thời nâng cao hàm lượng cholesterol tốt trong cơ thể. Đây là kết
quả của công trình nghiên cứu từ 273 người tại Trung Quốc bị cao lipid máu,
được biết trong quá trình nghiên cứu, mỗi người sử dụng 3g Cordyceps
militaris mỗi ngày [12,15].
1.2. Giới thiệu về Polysaccharide từ quả thể nấm Cordyceps militaris
1.2.1. Đặc điểm Polysaccharide từ quả thể nấm Cordyceps militaris
Polysaccharides là các phân tử carbohydrate polyme bao gồm chuỗi dài
các đơn vị monosaccharide bị ràng buộc bởi các liên kết glycosidic và thủy
phân cho các monosaccharides cấu thành hoặc oligosaccharides.
Các hợp chất polysaccharid ở Cordyceps là một galactomannan nhiều
nhánh. Các hợp chất này bao gồm D-mannose và D-galactose với tỷ lệ 3:5,
thường chứa một tỷ lệ nhỏ protein. Nó là một cấu trúc phân nhánh gồm các
liên kết (1-6) và (1-2) liên kết các gốc α-D-mannopyranosyl ở mạch chính, có
các liên kết đa dạng giữa các monosaccharid kế cận tạo thành các cấu trúc
xoắn và vòng nhỏ. Tuy nhiên, một mannoglucan với trọng lượng phân tử xấp
xỉ 7700 g/mol được phân tách gần đây chỉ chứa các đơn vị mannose và
glactose với tỷ lệ 1:9. Các phân tích cho thấy nó có một khung sườn α-Dglucan với các liên kết (1-4) và (1-3); và các mạch nhánh của α-D-(1-6)mannopyranose (Manp) được gắn vào khung sườn qua vị trí O-6 của gốc α(1-3)-glucopyranosyl (Glcp). Nghiên cứu này cũng cho thấy dược tính của
polysaccharid là từ các đặc tính của nó như trọng lượng phân tử, ví dụ như
Hoàng Thị Nhàn

13

Lớp: 1301 - CNSH


các polyglucan có trọng lượng phân tử lớn hơn (10-1000 kDa) có xu hướng
tan trong nước tốt hơn và vì thế có hoạt tính kháng khối u hiệu quả hơn. Tuy
nhiên, hoạt tính kháng ung thư là do sự tăng cường miễn dịch cho cơ thể hơn
là hiệu ứng gây chết tế bào trực tiếp [8,17].
Bảng 1.3: Hàm lượng của một số loại đường có trong Polysaccharide của
quả thể và sợi nấm Cordyceps militaris
Một số loại đường

Hàm lượng (mg/g khô)
Quả thể

Sợi nấm

Arabinose

11.38± 0.97

Nd

Fuctose

21.23± 3.48

7.31± 1.44

Mannitol

117.66 ±2.23

112.55 ±3.08

Ribose

86.76± 8.79

Nd

Sucrose

Nd

53.07± 9.10

Treschalose

23.61± 1.02

16.89 ±0.72

Total

260.64 ±16.49

189.82± 10.68
(Nd: Không phát hiện được)

1.2.2. Hiện trạng tách chiết và tinh sạch Polysaccharide từ quả thể nấm
Cordyceps militaris
Có rất nhiều nghiên cứu để tìm ra phương pháp tách chiết
polysaccharides tối ưu nhất phù hợp với từng điều kiện cơ sở nghiên cứu cũng
như ứng dụng nhất định. Bảng sau là một số kết quả nghiên cứu về tách chiết
Polysaccharides từ Cordyceps militaris.
Bảng 1.4: Hiện trạng kỹ thuật tách chiết Polysaccharides
Nhóm
nghiên
cứu
Che và

Phương pháp

Kết quả

Chiết từ quả thể: Sử dụng 3 phương

Sử dụng phương pháp

cộng sư

pháp chiết: siêu âm và nước, siêu âm nước nóng đun hồi lưu ở

[14]

Hoàng Thị Nhàn

và cồn, nước nóng đun hồi lưu

14

800C, chiết ba lần, thời

Lớp: 1301 - CNSH


gian 90 phút là tốt nhất.
Shi và

Chiết từ quả thể: Sử dụng nước và

Hàm lượng

cộng sư

sóng vi ba, tỷ lệ chất chiết: nước:

Polysaccharides đạt

[15]

2:4, thời gian sử dụng sóng vi ba 20

10.7%

phút
Jeong Seok

Chiết dịch nuôi cấy bằng nước nóng

Hàm lượng

Kwon và

600C, thời gian 24h, 3 lần, kết tủa

Polysscharide trong dịch

cộng sự

bằng Ethanol,lọc bằng giấy lọc

nuôi cấy đạt 2.53 -6.74

[16]

Whatman 0.45mm

g/l.

Hui Yan và

Chiết quả thể; sử dụng sóng siếu âm

Thu được hai thành phần

cộng sự

140W và nước, tỷ lệ chất chiết/nước:

polysacharide là CPS-1

[17]

1/45, thời gian chiết 80 phút, sử dụng

và CPS2, hiệt suất chiết

phương pháp enzym và Sevag để loại

đạt 0.82%

Protein trong Polysaccharide thô
Chen Xiao

Chiết quả thể: Sử dụng 3 phương

Hàm lượng

Li và cộng

pháp chiết: cô cạn, đun hồi lưu, đun

polysaccharide đạt đối

sự [18]

hồi lưu trong môi trường kiềm. Các

với 3 phương pháp cô

điều kiện được lựa chọn là: (1)

cạn, đun hồi lưu, đun hồi

Phương pháp cô cạn:tỷ lệ chất

lưu trong môi trường

chiết/nước: 1/40, thời gian 3 giờ,

kiềm đạt ương tứng là:

chiết 3 lần. (2) phương pháp chiết

20.25%; 22.6% và

đun hồi lưu: tỷ lệ chất chiết/nước:

1.49%.

1/20, thời gian 1 giờ, chiết 2 lần. (3)
Phương pháp chiết hồi lưu trong môi
trường kiềm:
nồng độ NaOH trong dung dịch chiết
là 0.7 mol/l, tỷ lệ chất chiết 1/8, thời
gian 0.5 giờ, chiết 3 lần

Hoàng Thị Nhàn

15

Lớp: 1301 - CNSH


Fengyao

Chiết quả thể bằng nước nóng 700C,

Thu được thành phần

Wu và

thời gian 10 giờ, 2 lần, tỷ lệ chất

CM-hs-CPS2.

cộng sự

chiết/nước:1/20. Kết tủa

[19]

Polysaccharide bằng ethanol

Tinh sạch:
Hiện trạng về kỹ thuật tinh sạch Polysaccharide được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 1.5: Hiện trạng kỹ thuật tinh sạch Polysccharide
Nhóm

Phương pháp

Kết quả

Liu và cộng

Sử dụng cồn để kết tủa và loại bỏ

- Phương pháp hỗn hợp

sự [20]

protein bằng các hỗn hợp dung môi

dung môi chloroform:

chloroform: butanol tỷ lệ 1:2.4

butanol loại 97% hàm

(v/v), thời gian phản ứng 5 phút

lượng protein.

hoặc kết hợp phương pháp Sevag

Kết hợp phương pháp

với triflouromethyl, trichloroethane

Sevag với

nghiên cứu

triflouromethyl,
trichloroethane thì loại
được 96.2% protein.
Fengyao Wu

- Sử dụng cột sắc ký trao đổi inon

- Thu được hợp phần

và cộng sự

DEAE-Cellulos 52 để tinh sạch và

CM-Hs-CPS2 chứa ác

[19]

lọc bằng cột lọc gel Sephadex G-

thành phần manose,

100

glucosse, galactose với
tỷ lệ 1.35:8.34:1.00 và

được liên kết bởi nhóm
α- glycosidic

Hui Yan và

- Sử dụng phương pháp Sevag và

cộng sự [17] Enzym để loại protein với tỷ lệ 1/40
enzym trypsin 3%, tại pH 8, nhiệt

Hoàng Thị Nhàn

16

- Kết quả thu được hai
thành phần CPS-1 và
CPS2 ở dạng rắn.

Lớp: 1301 - CNSH