Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu cải tiến quy trình xử lí và đóng gói màng bacterial cellulose

TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN
-----goCQos------

BÙI THỊ HUẾ

ẢNH HƯỞNG CỦA (NH4)2S04, KNO3 TỚI
KHẢ NẢNG TẠO MÀNG BC CHO VI
KHUẨN GLUCONACETOBACTER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
•

••

•

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Ngưòì hướng dẫn khoa học:
TS. PHƯƠNG PHÚ CÔNG

HÀ NỘI, 2015
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS. Đinh Thị
Kim Nhung, Giảng viên chính, tố Thực vật - Vi sinh, Trường Đại hoc Sư phạm Hà
Nội 2, và thầy TS. Phương Phú Công, Cục Khảo thí - Bộ Giáo dục và Đào tạo
người đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong thời gian học tập và nghiên cứu đề


LỜI CAM ĐOAN

này.

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tố bộ môn Thực vật - Vi
sinh, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt
kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN,
Trung tâm thông tin thư viện, Phòng thí nghiệm Vi sinh vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
tạo điều kiện thuận lợi cho em, hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn
quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đõ' em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn
thiện đề tài.
Em xin trân thành cảm ơn ỉ

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Bùi Thị Huế
Tôi xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật.Đây là kết quả của riêng
tôi. Tất cả các số liệu trong bảng biếu và hình ảnh đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý
thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã
công bố dưới sự hướng dẫn của PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và TS. Phương Phú Công
Trong đề tài, tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép các tác
giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình.

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Bùi Thị Huế


DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH TRONG KHÓA LUẬN
Bảng
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 đến hình thành màng BC của

DANH MỤC TÙ VIÉT TẤT

BC:

Bacterial cellulose

cs:

Cộng sự

MT:

Môi trường

STT:

Số thứ tự

MỤC LỤC


MỞ ĐÀU
1 . Lý do chọn đề tài

Màng

sinh

học

(Bacterial

cellulose;

Biocellulose;

BC)

do

vi

khuẩn

Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật
(gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liến kết P-1,4 glucorit). Cellulose vi
khuân khác với cellulose thực vật ở chô không chứa các hợp chất cao phân tử như:
ligin, peptin, hemicellulose, và sáp nến... Do vậy chúng có những đặc tính vượt trội
với độ dẻo dai, độ bền, chắc khỏe, độ đàn hồi.
Với những đặc tính hóa, lí ưu việt trên nên màng BC được xem như là một
nguồn polymer sinh học mới, nó thu hút được sự chú ý của nhiều nhà khoa học ngay
từ nửa sau thế kỉ XIX và được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như:
trong công nghiệp sản xuất giấy, màng BC được dùng đế sản xuất giấy điện tử chất
lượng cao; Trong công nghệ môi trường, màng BC làm màng phân tách để xử lý nước
và biến đổi độ nhớt của nước (Brown, 1989, Jonas và Fonah, 1998). Trong y học,
màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng,
loét da, làm mạch máu nhân tạo điều trị bệnh tim mạch, làm mặt nạ dưỡng da cho con
người; Ngoài ra, màng BC còn được dùng làm chất mang đặc biệt cho các sợi pin và tế
bào năng lượng (Brown, 1989), làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay

thay thế thực phẩm...
Nhận thấy rằng nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng tới quá trình
sinh trưởng và phát triến của vi sinh vật. Đe tìm hiếu rõ hơn ảnh hưởng của nitơ tới
quá trình tạo màng BC mỏng, dai, có thời gian nuôi cấy ngắn nhất tôi đi đến quyết
định chọn đề tài: "Anh hưởng của (NH^ĩSOặ, KNOĩtởi khả năng tạo màng
BCcho vi khuấnGluconacetobacter".
2 . Mục đích nghiên cứu
Lựa chọn nguồn nitơ thích hợp cho lên men tạo màng BC của chủng vi khuẩn
Gluconacetobacter
3 . Nội dung nghiên cứu

4


3.1. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter.
3.2. Ánh hưởng của KN0 3 tới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi
khuầnGluconacetobacter.
3.3. Ánh hưởng của (NH^SCUtới khả năng lên men tạo màng BC của chủng vi
khuẩn Gluconacetobacter.
3.4. Khảo sát khả năng lên men tạo màng của chủng Gluconacetobacter trên
môi trường dinh dưỡng từ nước gạo.
4 . Ý nghĩa của đề tài

4.1.

Ỷ nghĩa khoa học

Tìm được nguồn nitơ thích hợp nhất đối với khả năng tạo màng của chủng
Gluconacetobacter.
4.2.

Ỷ nghĩa thực tiễn

Tạo màng BC trong thời gian ngắn nhất và tốt nhất có triển vọng ứng dụng vào
một số lĩnh vực trong cuộc sống đặc biệt là lĩnh vực y học.
5 . Phương pháp nghiên cứu

5.1. Phương pháp vi sinh vật
5.2. Phương pháp hóa sinh
5.3. Phương pháp toán học
6 . Điểm mới của đề tài

Đã lựa chọn được hàm lượng (NH4) 2S04 là 3g/l thích hợp cho lên men tạo
màng BC cho vi khuẩn Gluconacetobacter.
Chương 1 TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Vị trí và đặc điểm phân loại Gluconecetobacter trong sinh giới

1.1.1.

Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới

Theo hệ thống
Gluconacetobacterthuộc

phân loại của
chi Acetobacter,

nhà

khoa học Bergey thì

họ

Pseudomonadaceae, bộ

Pseudomonadales, lớp Schizommycetes.Gluconacetobacter thuộc nhóm vi khuẩn

5


acetic, là loài vi khuẩn tạo được nhiều BC nhất trong tự nhiên. Mỗi tế bào
Gluconacetobacter có thể chuyển hóa 108 phân tửglucose thành cellulose trong 1
giờ.
Ngày nay, việc phân loại vi khuẩn acetic nói chung và vi khuẩn
Gluconacetobacter nói riêng còn tồn tại nhiều quan điếm khác nhau. Vì vậy, đòi hỏi
cần nhiều nghiến cứu hơn nữa về loại vi khuấn này.
1.1.2.

Đặc điếm phân loại của Gluconacetobacter

1.1.2.1.

Đặc điếm hình thái, tế bào học

Gluconacetobacter là trực khuấn hình
thước khoảng 2ụm, tế bào đứng riêng lẻ hoặc

que,

xếp

thắng hay hơi cong, kích
thành từng chuỗi, không có

khả năng di động, không sinh bào tử.Các tế bào được bao bọc bởi màng nhày có bản
chất là hemicellulose, màng này bắt màu xanh khi nhuộm axit H 2SO4, bắt màu hồng
khi nhuộm fucshin.Gluconacetobacter có khả năng tích lũy 4,5% acid acetic trong
môi trường, khi nồng độ acid trong môi trường khá cao sẽ ức chế hoạt động của vi
khuẩn [4].
Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc
đạt 2-5 mm), tròn, bề mặt nhày và trơn bóng, phần giữa khuấn lạc lồi lên, dày hơn và
sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.
Hình 1.1.Vi khuẩn Gluconacetobacter
ỉ.1.2.2. Đặc điếm nuôi cấy
Trên môi trường thạch đĩa, vi khuấn Gluconacetobacter hình thành khuẩn lạc
nhẵn hoặc xù xì, rìa mép khuẩn lạc bằng phang hay gợn sóng, màu trắng hoặc trong
suốt, khuẩn lạc lồi lên dễ tách khỏi môi trường.
Ở điều kiên nuôi tĩnh, trong môi trường dịch thế chúng sẽ hình thành trên bề
mặt môi trường môt lớp màng cellulose, đó là tập hợp các tế bào vi khuẩn liên kết với
các phân tử cellulose, trong tế bào xảy ra quá trình trao đổi chất nói chung còn ở
màng cellulose xảy ra quá trình trao đối oxy và các chất dinh dưỡng.

6


Ngược lại, khi nuôi cấy trong điều kiện lắc, cellulose hình thành dạng hạt nhỏ
với kích thước không đều nhau và phân tán trong môi trương dinh dưỡng tạo ra những
đặc tính hình thái khác hắn cellulose trong điều kiện nuôi tĩnh [ 6].
1.1.2.3.

Đặc điếm sinh lí,

sinh hóa + Đặc điểm sinh lí:
Vi khuấn Gluconacetobacter phát triến ở nhiệt độ 25 - 35°c, pH: 4 - 6 .
Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống.Ở 37°c, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu. Tuy nhiên vẫn còn những ý kiến khác nhau và nhiều tranh
cãi về điều kiện nhiệt độ, pH tối ưu cho chủng vi khuẩn Gluconacetobacter sinh
trưởng và tạo màng.
Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp nên người ta thường bổ
sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.
+ Đặc điếm sinh hóa:
Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa phân loại mới căn cứ vào
các tiêu chuấn: khả năng oxy hoa acid acetic thành CƠ 2và H2O; hoạt tính catalase;
khả

năng

tăng

trưởng

trên

môi

trường

Hoyer...

Theo

quan

điếm

này

Gluconacetobacterìầ. chủng thuộc chi Acetobacter, họ Pseudomonadaceae,
bộ Pseudomonadales, lớp Schiiommycetes. Đặc điếm phân biệt với các chủng
khác trong cùng một chi được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuấn Gluconacetobacter
theo Frateur (1950)
STT
Đặc điểm
1

2

Hiện tượng

-Oxy hóa ethanol thành -Chuyến hóa môi trường chứa
acid acetic

Bromphenol Blue 0,04% từ màu

-Hoạt tính catalase

xanh sang màu vàng
-Hiện tượng sủi bọt khí

7

Kết quả
+

+


3

-Sinh

trưởng

trên

môi

-Sinh khối không phát triển

-

trường Hoyer
4

-Chuyển

hóa

glycerol -Tạo kết tử đỏ gạch trong dịch sau

thành dihydroxyaceton
5

lên men

-Chuyển hóa glucose thành -Vòng sáng xuất hiện xung quanh
acid

6

+

+

khuấn lạc trên môi trường chứa

-Kiếm tra khả năng sinh

CaCƠ3
-Không hình thành săc tô nâu

-

sắc tố nâu
7

-Kiểm tra khả năng tổng

-Váng vi khuẩn xuất hiện màu

hợp cellulose

xanh lam

1.2.

Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuấn Gluconacetobacter

1.2.1.

Ảnh hường của nguồn cacbon

+

Đe vi khuẩn sinh trưởng và phát triến tốt hơn cần cung cấp nguồn cacbon phù
hợp, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô cơ hay hữu cơ. Giá
trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào hai yếu tố: thành phần hóa
học và tính chất sinh lí của nguồn thức ăn, đặc điếm sinh lí của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật dị
dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thế chuyến hóa thành loại hợp chất cố màu tối
khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ bị chuyến hóa làm
biến đổi pH môi trường. Đế tránh hiện tường này khi khử trùng môi trường có chứa
đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5 atm ở 110°c trong 30 phút. Từ các loại
đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal).
Đe nuôi cấy các loại vi sinh vật khác người ta sử dụng các nồng độ đường không
giống nhau, với vi khuẩn thường dùng 0,2 - 0,5% đường. Gluconacetobacter sinh
trưng chính trong môi trường có ethanol, glucose, glycerol.Có thế sinh trưởng trong
môi trường chỉ có D - mantolse.Hầu hết các chủng không sử dụng sucrose [7].

8


Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon và nitơ (pepton, nước thịt, nước chết ngô,
nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch...) có thể vừa dụng làm nguồn cacbon, vừa
sử dụng làm nguồn nitơ đối với sinh vật [7].
1.2.2.

Nhu cầu nitơcủa vi sinh vật

Môi trường cơ bản cho nghiên cứu về cellulose vi khuấn là môi trường do
Hestrin và Schramm thiết lập [7], có chứa cao nấm men và peptone là nguồn hữu cơ,
(NH 4) 2S04 là nguồn nitơ vô cơ.
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH 3 và NH 4 + .
Tuy nhiên, khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường có sử dụng NH 4+ trong môi
trường sẽ tích lũy anion vô cơ (SO 42 ', cr...) làm hạ thấp rất nhiều trị so pH của môi
trường. Muối anion của các acid hữu cơ ít làm chua môi trường hơn do đó có lúc được
sử dụng nhiều hơn (mặc dù dù đắt hơn).
Muối nitrat là nguồn thức ăn nitơ thích hợp với nhiều loại tảo, nấm sợi, xạ
khuẩn nhưng lại ít thích hợp với vi khuẩn, vì sau khi vi khuẩn sử dụng hết NO 3’ các
ion kim loại còn lại sẽ kiềm hóa môi trường [7]. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt
nitơ chứa trong các thức ăn hữu cơ, các thức ăn này vừa là nguồn cacbon vừa là nguồn
cung cấp nitơ cho sinh vật. Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các
protein cao phân tử, chỉ có các polypeptid không chưa quá 5 gốc axit amin mới có thể
di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật [7].
1.2.3.

Hàm lượng ethanol trong dịch lên men

Ethanol được sử dụng như một cơ chất.Hàm lượng ethanol có thế thay đối từ 2
- 10% V. Hàm lượng cao hơn sẽ làm giảm năng suất lên men. Theo Hong - J00 Son lại
công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2 - ỉ % tốt nhất là ở 0,6% [4]. Theo
Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở 3 - 3,5%. Các tác giả Ebner
và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7 - 10% V. Đe tránh hiện tượng oxy hóa hoàn
toàn acid acetic cần có mooti lượng ethanol sót trong sản phẩm từ 0,2 - 0,5% để ức
chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối acetate [7]. Ngoài việc oxy hóa

9


ethanol, vi khuấn acetic còn có khả năng oxy hóa các rượu khác thành acid tương ứng.
1.3.

Cấu trúc và sự hình thành màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter

1.3.1.

Đặc điểm cấu trúc của màng Bacterial celluỉocse

BC có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực
vật (PC- Plant Cellulose). Màng BC được cấu tạo bởi chuỗi
polyme ß-l,4glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hóa
học đồng nhất với cellulose thực vật nhưng cấu trúc và đặc
tính lại khác xa nhau [16].
Chuỗi polyme (3-1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành
sợi nhỏ (subfibril ) có kích thước 1,5 nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn-sợi
vĩ mô (microfibril ) (Jonas and Farah, 1998), những sợi này kết hợp với nhau tạo
thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al 2000). Dải ribbol có chiều dài
trong khoảng từ 1-9 nm. Những dải ribbol được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với

những dải ribbol của tế bào khác bằng liên kết hiđro hoặc lực Van Der Waals tạo
thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màn mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.

Hình 1.2. Sợi cellulose của màng BC Hình 1.3. Sợi cellulose của thực vật
1.3.2.

Một số tính chất của màng Bacterial cellulocse

Brown A. J (1886), đã nghiên cứu các lớp màng đặc đo vi khuẩn
Gluconacetobacter tạo ra trên môi nuôi cấy và thấy có bản chất là hemicellulose.
Hemicellulose là những polysaccarid không tan trong nước nhưng tan trong dng dịch
kiềm tính.
Một số tính chất của màng BC: độ tinh sạch: màng BC có độ tinh sạch tốt hơn

1
0


rất nhiều so với các cellulose khác, có thể phân hủy sinh học, tái chế hay phục hồi
hoàn toàn; Độ bền cơ học: màng BC có độ bền tinh thể cao, sức căng lớn, trọng lượng
lớn, on định về kích thước; Tính hút nước: màng BC có khả năng giữ nước đáng kể
(lên đến 99%), có tính tơi xốp, độ ẩm cao.
1.3.3.

Cơ chế tổng hợp Bacterial cellulocse

Quá trình tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hòa một
cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều loại enzyme, phức hợp
xúc tác các loại protein điều hòa [13].
Theo tác giả Alina Krystynowics và cs có 4 enzyme tham gia xúc tác tổng hợp

cellulose ở vi khuấn Gỉuconacetobacter.

Glucokinase, Phosphoglucomutase,

Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase (ƯDPG pyrophosphorylase hay UPG),
Cellulose synthase (CS). Trong đó UPG là enzyme có vai trò quan trọng nhất.

glucose

cellulose
Hình 1.4.Con đường sinh tống hợp cenlulose ở Gluconacetobacter
Hai giai đoạn chính sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Giai

1
1


đoạn polymer hóa
Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển
glucose thành glucose-6-phosphate.Enzyme phosphoglucomutase tiếp tục chuyển hóa
glucose-6-phosphate

thành

glucose-1-phosphate

thông

qua

phản

ứng

isome

hóa.Glucose-1 -phosphate nhờ enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase chuyển hóa
thành UDP-glucose.Cuối cùng, UDP-glucose được tổng hợp nên sẽ được chuyển hóa
thành cellulosevà cellulose được tiết ra mội trường ngoại bào nhờ một phức hợp
protein màng là cellulose synthase.Enzym này được hoạt hóa nhờ một nucleotide vòng
là cyclic-di-GMP.
Một số chủng vi khuấn Gluconacetobacter có khả năng sử dụng đường
fructose hiệu quả hơn. Hệthống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành
fructose-1-phosphate.Sau đó fructose-1-phosphate sẽ chuyến hóa thành fructose-biphosphate nhờ enzym

fructose-1-

phosphatekinase.Enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển
hóa thành fructose-6-phosphate.Glucose-1 -phosphate lại tham gia vào quá trình
chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose.
Giai đoạn kết tinh
Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết -1,4-glucan. Trong đó các
chuỗi glucan kết hợp tạo thành chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals.Lớp
chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau
bằng liên kết hidro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp
tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi lại tiếp tục kết hợp với
nhau tạo thành các bó sợi [12].
Ý

nghĩa

của

quá

trình

sinh

tống

hợp

cellulose

của

vi

khuấn

Gluconacetobacter
Phần lớn tế bào trong môi trường tĩnh, Gluconacetobacter khôngdi động do
chúng nằm bên trong lớp màng cellulose. Điều này làm cản trở nghiên cứu về quá

1
2


trình chuyến hóa, vận chuyến chất dinh dưỡng và oxy đến tế bào.

Lớp màng cellulose do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra bao xung quanh
môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này ngăn cản sự
cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cạnh
tranh sinh tồn của vi khuẩn Gluconacetobacter. Màng cellulose có khả năng giữ
nước nên nên giúp cho vi khuấn phân hủy các chất dinh dưỡng đế sử dụng và giúp tế
bào chống lại ảnh hưởng của tia ƯV (tia tử ngoại). Nhờ tính dẻo dai và tính thấm nước
của các lớp cellulose mà các tế bào vi khuẩn kháng lại được những thay đổi không
thuận lợi trong môi trường sống như: giảm độ ấm, thay đổi pH, xuất hiện các chất độc
hại. Các vi khuẩn Gluconacetobacter có thể tăng trưởng và phát triển bên trong lớp
vỏ bao.
Thực nghiệm chỉ ra rang cellulose bao quanh tế bào vi khuấn bảo vệ chúng khỏi
tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào Gluconacetobacter được bao bọc bởi BC sống sót
sau 1 giờ xử lý bởi tia cực tím. Khi tách BC ra khỏi tế bào, khả năng sống sót của tế
bào giảm chỉ còn khoảng 3% [6].
Mạng lưới BC là giá thể chống đỡ cho vi khuẩn Gluconacetobacter luôn ở bề
mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng và không khí. Chính mạng lưới này làm cho các tế
bào có thế bám chặt trên bề mặt môi trường và làm tế bào thâu nhận chất dinh dưỡng
một cách dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong môi trường lỏng không có mạng lưới
cellulose [10]. Trong môi trường tự nhiên, đa số vi khuẩn tổng hợp các polysaccharide
ngoại bào để hình thành nên lớp vỏ bao quanh tế bào và màng BC là một điến hình.
Một

vài

nghiên

cứu

còn

cho

thấy,

cellulose

được

tổng

hợp

bởi

Gluconacetobacter còn đóng vai trò tích trữ và có thế sử dụng khi vi sinh vật này bị
thiếu dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo gluconase hay
endo glucanase. Các enzyme exo gluconase hay endo glucanase phân hủy cellulose
được phát hiện trong dịch nuôi cấy ở một và chủng Gluconacetobacter sản xuất
cellulose [10].

1
3


1.4.

Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter trên thế giới và ở
Việt Nam

1.4.1.

Trên thế giới

Vi khuấn Gluconacetobacter và màng BC đã thu hút được sự chú ý của nhiều
nhà khoa học trên thế giới và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: công nghệ môi
trường, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, y học... Các nghiên cứu hiện nay về
màng Bc trến thế giới đã tập trung vào vấn đề đề sản xuất và ứng dụng các sản phẩm
từ màng BC vào các lĩnh vực khác nhau.
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuấn Gluconacetobacter và những ứng dụng
của nó đã được hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1999, dùng màng BC
làm môi trường phân tách cho quá trình xử lí nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho
các pin và năng lượng tế bào. Brown, Jonas và Farad, dùng màng như một chất đế biến
đối độ nhớt, đế làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học,
thực phẩm hoặc thay thế thực phẩm. Đặc biệt Jay shah, Brown. M. R. (2005) đã dùng
BC làm vải đặc biệt, Barbara Surma và cộng sự (2008), Jonas và Farad (1998) dùng
màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất đế cố định pritein thay co sắc
kí. Đặc biệt, trong y học, người ta đã chế tạo các phức chất (vật liệu composite) từ sự
kết hợp giữa cellulose và chitosan, hoặc cellulose và polyvinul, các phức chất này
được sử dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm
sạch máu điều trị các bệnh tim mạch.
Các sản phẩm chế tạo từ microbial cellulose cũng được ứng dụng trong phẫu
thuật và nha khoa. Ngoài ra, màng BC còn được sử dụng làm mặt nạ dưỡng da cho phụ
nữa, làm giấy chất lượng cao, microbial cellulose được dùng chế tạo màn hình điện tử,
vải nonwoven (vải không qua dệt), thực phấm phụ gia,...
Trong những năm gần đây có một số công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của
nguồn cacbon dến khả năng hình thành màng cellulose; nghiên cứu chế tạo màng từ vi
khuẩn và nghiên cứu đặc tính màng, đồng thời nghiên cứu ứng dụng sản xuất giấy điện

1
4

tử chất lượng cao từ màng vi khuẩn (Jay shah, Brown. M. R., 2005); nghiên cứu của
Alexander Steinbuchel, Sang Ki Rhee (2005) về con đường hình thành cellulose ở vi
khuấn, cấu trúc sợi cellulose và đặc tính của màng cellulose, mối quan hệ giữa khả
năng hình thành cellulose và khả năng sinh axit acetic [15]; trong khi đó Alina
Krystynowicz và cộng sự (2005) đã so sánh đặc điếm sinh học phân tử của chủng
Gluconacetobacter dại (có khả năng tổng hợp cellulose) và chủng đột biến (không
có khả năng tống hợp cellulose) [16]; năm 2006 đã có các nghiên cứu về cấu trúc của
màng BC sử dụng làm monocomposit; Czafa, w. Young; Elvie Escoro Brown đã
nghiên cứu và đi đến kết luận có sự tương đồng vầ cấu trúc giữa màng BC với
colagen. Năm 2007, Neelobon và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi
cấy đến khả năng hình thành màng trong điều kiện cụ thế là nuôi tĩnh, nuôi lắc và nuôi
trong bioreactor; Sirlene M. Costa và cộng sự nghiên cứu đặc tính vật lý của màng,
cấu trúc sợi cellulose của màng trong điều kiện nuôi cấy, ứng dụng trong sản xuất
giấy; Wojciech K. và cộng sự nghiên cứu đặc tính, cấu trúc màng cellulose ứng dụng
làm da nhân tạo. Năm 2008, Barbara Surma-S'lusarska và cộng sự [17] đã đưa ra
phương pháp chế tạo màng và nghiên cứu đặc điếm màng, ảnh hưởng của nguồn
cacbon, đường glucose, manitol và xylose đến quá trình tạo màng, cấu trúc sợi
cellulose của màng và ứng dụng trong sản xuất giấy. Hầu hết các tác giả nước ngoài
nghiên cứu theo hướng sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn, ứng dụng của màng BC
trong y học, công nghiệp giấy, trong chế biến thực phẩm.
Tuy nhiên những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là trong
ngành dược phấm và mỹ phấm. Czajt và cs (2006), sử dụng màng Bc đắp lên vết
thương hở, vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Các tác giả Jonas và Farad (1998), Czaja
và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ.
1.4.2.

Tại Việt Nam

ơ Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về Gluconacetobacter và màng
BC còn khá mới mẻ. Các công trình nghiên cứu mới chi' quan tâm tới quá trình tạo

1
5


màng, đặc tính và cấu trúc của màng, về ứng dụng thực tiễn, mới chỉ được ứng dụng
trong chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng và được ứng dụng trong sản xuất
thạch dừa [3], [5], [6], [9], [10]. Hiện nay việc nghiên cứu tìm môi trường tối ưu cho
quá trình tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter chưa được thực hiện. Hầu như
có rất ít các nghiên cứu liên quan đến sự hình thành BC và ứng dụng màng BC. Năm
1997, có công trình của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Mùi nghiên cứu môi trường
nước giá đỗ thay thế nước dừa trong sản xuất thạch dừa từ vi khuẩn
Gỉuconacetobacter. Năm 1995 - 2000, các công trình nghiên cứu về vi khuẩn
Gluconacetobacter và khả năng lên men sinh axit acetic của nhóm tác giả Lê Văn
Nhương, Nguyễn Thị Ngọt, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Văn Cách. Các công trình
mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình sinh axit acetic, khả năng tạo màng BC, đặc
tính cấu trúc màng BC [4]; gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm nên và
giá đỡ để cố định tế bào vi khuẩn. Năm 2000, nghiên cứu của nhóm Đinh Thị Kim
Nhung, Đỗ Thị Hương, Nguyễn Khắc Thanh, Nguyễn Duy Hưng và cộng sự nghiên
cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và điều kiện lên men cho vi khuấn
Gluconacetobacter ứng dụng vào làm thạch dừa. Năm 2003, có nghiên cứu của
nhóm tác giả Nguyễn Thúy Hường, Phạm Thành Hố về chọn lọc dòng
Gluconacetobacterũìích hợp cho các loại môi trường dùng trong sản xuất cellulose
vi khuẩn [11]. Năm 2006, nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Văn
Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan và cộng sự về màng BC từ Gluconacetobacter tẩm dầu
mù u dùng trong điều trị bỏng [6]. Năm 2008, có nghiên cứu của Đinh Thị Kim Nhung
đã chọn được một chủng Gluconacetobacter NH], khảo sát khả năng tạo màng của
chủng này. Ngoài nguồn nguyên liệu nước hoa quả dùng cho lên men giấm, còn có thế

sử dụng nhiều nguồn nguyên lệu khác như các loại bia, rượu nhạt, các nguyên liệu có
chứa đường, tinh bột, axit hữu cơ, giàu vitamin... từ các vùng miền khác nhau ở Việt
Nam.
Việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ chủng Gluconacetobacter ngày càng

1
6


được nhiều tác giả quan tâm. Ngày càng có nhiều các nghiên cứu, công bố liên quan
đến chủng Gluconacetobacter sự hình thành màng BC và các hướng ứng dụng màng
BC. Năm 2006, tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ môn Vi Sinh - Ký Sinh,
Trường đại học Y Dược học Tp.HCM đã chế tạo thành công màng trị bỏng sinh học
dầu mù u bằng phương pháp lên men. Màng BC có khả năng thấm nước cao, kết dính
chặt và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trò như màng sinh học, có thế thay thế da
tạm thời. Với các hoạt chất tái sinh mô và các chất sát khuẩn đều có nguồn gốc thiên
nhiên không gây đau rát và không chứa các yếu tố gây kích ứng da, chính vì vậy dùng
màng sinh học đế ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vết thương bỏng, tạo điều kiện
che phủ sớm vết thương, qua đó, rút ngắn thời gian điều trị và giảm thiếu sẹo xấu trên
vùng bỏng sâu.
Gần đây, nhóm nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Kim Nhung đã thu nhận màng
BC từ vi khuấn Gluconacetobacter , ứng dụng màng BC trong điều trị bỏng.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
2.1.

Đối tượng ngiên cứu và hóa chất
2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là chủng Gluconacetobacter từ phòng thí nghiệm Vi
Sinh - Khoa sinh - KTNN, Trường Đại học Sư pham Hà Nội 2 cung cấp.
2.1.2.

Dụng cụ và thiết bị

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng một số dụng cụ và thiết bị
sau:
Tủ ấm, tủ say Binder (Đức).
Box cấy vô trùng (Haraeus).
Nồi hap Tommy (Nhật).
Máy lac Orbital Shakergallenkump (Anh).
Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 0.5 \x\ - 10ml.

1
7


Kính hiến vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40.
Cân (Preccisa XT 320M- Thụy Sỹ).
Khay nhựa có kích thước 15 X 1 0 x 4 cm.
Tủ lạnh, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn...
2.1.3.

Hóa chất

Nguồn Cacbon: Ethanol, Glucose, Acid acetic, Agar.
Nguồn Nitơ: (NH 4) 2S0 4 , KNO3.
Các muối khoáng: KH2PO4, CaCC>3, MgSƠ4.7H20.

Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
Ngoài ra còn sử dụng: nước dừa.

1
8


2. /.¥. Môi trường
2.1.4.

ỉ.

Môi

trường

giữ

Glucose: 20g KH 2PƠ 4 : 2g Pepton : 5g Nước

giong (MT1)
(NH 4) 2S0 4 : 3g
MgS0 4.7H 20: 2g

máy: lOOOml.
2.1.4.2.

Môi

trường

Agar: 20g

nhân

giống

(MT2)
Glucose: 20g KH 2P0 4 : 2g pH: 5,0 - 6,0 Nước

MgS0 4.7H 20: 2g

dừa: lOOOml
2.1.4.3.

Môi trường lên

Glucose: 20g KH2PO4: 2g pH: 5,0 - 6,0 Nước

2.2.1.

Các

men (MT3)

(NH 4) 2S0 4 : 3g

Axit acetic: 2%

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.1.

Axit acetic: 2%

MgS0 4.7H 20: 2g

dừa: lOOOml
2.2.

(NH 4) 2S0 4 : 3g

Phương pháp vỉ sinh vật

Phương pháp bảo quản chủng giống trên thạch nghiêng
chủng

sau

khi

phân

lập

được

xác

định

là

vi

khuấn

Gluconacetobacterđuợc cấy vào ống thạch nghiêng, nuôi 4-5 ngày trong tủ ấm

30°c. Sau đó giữ lạnh trong tủ lạnh ở 4°c dùng cho các bước nghiên cứu tiếp theo
2.2.1.2.

Phương pháp hoạt hỏa giong

1
9


Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, trước khi đem sử dụng
phải hoạt hóa giống, nhân giống đảm bảo đủ số lượng tế bào vi sinh vật cho quá trình
lên men. Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng môi trường tiêuchuẩn không có thạch
agar, đem hấp thanh trùng ở 121° c trong 20 phút. Sau đó đem xử lý trong đèn cực tím
trong 15 phút, cấy truyền giống từ ống thạch nghiêng vào nuôi lắc 130 vòng/phút
trong 24h [8], [14].
2.2.1.3.

Phương pháp nghiên cứu đặc điếm hình thái và cách sắp xếp tế

bào trên tiêu bản nhuộm kép
Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng, làm vết bôi trên lam kính, cố

định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn, nhuộm tế bào bằng phương pháp
nhuộm gram:
Tím gentian: 2 phút Rửa
nước
Dung dịch lugol: 2 phút Rửa
nước Cồn 95°: 20 giây Rửa
nước
Dung dịch íucshin: 2 phút
Rửa nước
Hong khô trên ngọn lửa đèn cồn
Sau đó soi trên tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiến vi quang học với độ
phóng đại 1000 lần. Neu tế bào vi khuấn nhuộm màu hồng, đó là vi khuẩn
Gluconacetobacter.
2.2.1.4.

Phương pháp lên men tạo màng

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110°c trong 20
phút đế tránh caramen đường.Sau đó khử khuấn ở đèn cực tím trong 15 phút. Bổ sung
vào môi trường 10% giống hoạt hóa.
Nuôi cấy ở điều kiện tĩnh và theo dõi sự hình thành màng BC. Khoảng sau 5
ngày thì có thể thu được màng.

2
0


2.2.2.

Phương pháp xác định trọng lượng tươỉ của màng BC

Sau khi nuôi cấy, màng được lấy ra, để ráo nước khoảng 4 -5 giờ, trên khay
nhựa của nhiệt độ phòng thí nghiệm. Tiến hành cân màng trên cân điện tử. Trọng
lượng tươi của màng được tính bằng hiệu số của trọng lượng khay nhựa lúc có và
chưa có màng.
2.2.3.
2.2.3.1.

Phương pháp hóa sinh

Phương pháp kiêm tra hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí
thì chủng vi khuấn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +). Ngược lại, chủng
vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase -).
2.2.3.2.

Xác định khả năng oxy hóa acỉd acetỉc

Sử dụng môi trường sau để khử khả năng oxy hóa acid acetic của vi khuẩn
tuyển chọn.
Thành phần:
Cao nấm men

: lOg

Calcium acetate

:

lOg

Thạch

: 20g

Nước máy

: lOOOml

pH

: 7,0-7,2

Phân phối môi trường vào bình tam giác đem khử trùng ở 121°c trong 20 phút,
để nguội khoảng 40-45°C đổ thạch đĩa, cấy vi khuẩn tuyển chọn mới hoạt hóa (1824h) nuôi 6-7 ngày ở điều kiện thích hợp. Quan sát hiện tượng: nếu xung quanh khuấn
lạc có vòng trắng sữa là phản ứng dương tính (acetat bị oxy hóa, calcium giải
phóng ra tạo màu trang sữa), nêu không là âm tính.
2.2.4.

Phương pháp toán học

Chúng tôi xử lí các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phương pháp
trong cuốn "ứng dụng tin học trong sinh học" [1], và "Thống kê và ứng dụng" [ 2] như:

2
1


số trung bình công: dùng đế tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí

nghiệm:
n

1=1

Trung bình bình phương các sai lệch:

Hệ số biến thiên:

cv= I 100 %
A

Trong đó: n: số lần nhắc lại.
Xji Giá trị của lần thứ i
S: Độ lệch chuân m: Sai
số trung bình học
2.2.5.

Quá trình xử lí màng BC từ chủngGluconacetobacter

Do màng BC khi được tạo thành còn khá nhiều thành phần dư của môi trường
bám vào nên mục đích của quá trình xử lí màng là loại bớt các sản phẩm dư thừa
(thành phần chính là đường dư), giảm độ pH, làm sạch khuẩn đồng thời phần nào giúp
màng đạt được hiệu quả về mặt cảm quan: màu trắng trong, dai và bền hơn... Song
màng BC chúng tôi nghên cứu chủ yếu được ứng dụng sản xuất ở qui mô công nghiệp,
vì vậy các bước xử lí màng phải đơn giản, hiệu quả và ít tốn kém.
Màng BC thu trực tiếp từ dịch nuôi cấy được qua các bước xử lí sau:
Bảng 2.1. Các bước xử lí màng BC
STT

Kết quả

Các bước xử lí

2
2


1

-Rửa sạch màng bằng nước máy nhiều

-Loại bỏ bớt acid acetic và các

lần

thành phần dư thừa từ môi
trường, màng có màu vàng, mùi
hơi chua.

2

-Ngâm màng BC trong dung dịch muối

-Làm chết và làm sạch vi khuẩn

NaCl 0,7M, ở 25 - 40°c trong 12 giờ

3

-Rửa nước và đun sôi 3 lần.

-Loại bớt muối và chất dư thừa

-Cho màng BC vào dung dịch NaOH

- Loại bỏ chất dư thừa, làm

0,5M (400g màng BC/1 lít), ở 30 - 40°c

trắng màng, kiềm hóa bề mặt sợi

cho đến khi màng chuyển sang màu trắng

cellulose. Màng có màu trắng

trong (20 phút)

trong, mùi khét, giảm độ cứng

-Rửa sạch bằng nước máy nhiều lần

và dai
-Giảm bớt nồng độ kiềm (pH:
8,3)

4

-Trung hòa bằng acid citric loãng và

-Màng có màu trắng đục, có mùi

kiểm tra bằng máy đo pH. Rửa sạch để

kiềm

muối Natri acetat
-Ngâm cồn 70°, kiếm tra nếu còn kiềm

-Kiềm còn dư và chất dư thừa sẽ

tiếp tục trung hòa bằng acid acetic -Rửa

tan trong cồn, sau khi trung hòa

nước và đun sôi màng 3 lần, mỗi lần

pH: 7

đun sôi từ 2 - 3 phút

-Loại bỏ muối Natri acetat, các
chất dư thừa. Màng trắng hơi
đục, không mùi

Sau khi xử lí màng BC, chúng tôi tạo màng có kích thước 10x10 cm, sau đó
sấy màng ở nhiệt độ 45°c trong khoảng 6 giờ đế làm thoát bớt hơi nước có trên màng.

2
3

Nhìn chung, thời gian đế sấy màng phụ thuộc nhiều vào độ dày của màng, nếu sấy
màng ở nhiệt độ quá cao màng sẽ bị giòn, giảm tính dẻo dai.
Quy trình bảo quản như sau:
+ Sấy màng ở độ ẩm khoảng 30%.
+ Đóng gói chế phẩm màng trong các túi nilon nhờ máy hút chân không.

+ Hấp vô trùng ở nhiệt độ 121°c, trong 15 phút.
Chương 3 KÉT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN
3.1.

Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter

3.1.1.

Quan

sát

hình

hình

thái

tế

bào

của

chủng

vi

khuẩn

Gluconacetobacter
Chủng Gluconacetobacter nhận từ phòng Vi sinh, Khoa Sinh-KTNN, trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiến vi quang học Labomed (Mỹ) với độ
phóng đại 1000 lần, nhận thấy vi khuầnGỉucơnacetobacter là trực khuẩn hình que,
thẳng hay hơi cong,kích thước khoảng 2|Lim, tế bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành từng
chuỗi, không có khả năng di động, không sinh bào tử. Các tế bào được bao bọc bởi
màng nhày có bản chất là hemicellulose,bắt màu hồng khi nhuộm íucshin.

2
4


Hình 3.1. Kết quả nhuộm Gram của Gluconacetobacter
3.1.2.

Sinh trưởng trên môi trường thạch đĩa

Trên môi trường thạch đĩa, vi khuẩn Gỉuconacetohacter hình thành khuẩn
lạc như hình 3.2

2

5