Nghiên Cứu Khả Năng Kích Thích Miễn Dịch Kháng Ung Thư Phổi Của Exosome Tế Bào Tua Máu Dây Rốn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
------------------------------------------

Lê Thị Huyền

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH
KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME
TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội, tháng 12 năm 2019


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
------------------------------------------

Lê Thị Huyền
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH
KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME
TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Mã số: 8420101.4
Chuyên ngành: sinh học thực nghiệm

Cán bộ hƣớng dẫn:

TS. Nguyễn Xuân Hƣng
PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Đại học Quốc gia Hà Nội đã tài trợ
kinh phí cho đề tài với mã số QG.18.09 để đề tài được thực hiện và tiến hành đúng
tiến độ.
Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Hưng và PGS. TS.
Hoàng Th Mỹ Nhung người hướng dẫn trực tiếp của tôi đã giúp tôi rất nhiều
trong quá trình hoàn thành nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn hai người
hướng dẫn đã tận tình giúp đỡ tôi trong đ nh hướng nghiên cứu, giải đáp thắc mắc,
khó khăn đồng thời chỉ dạy tôi những bài học quý giá. Nếu không có sự hướng
dẫn và giúp đỡ này, luận văn này của tôi sẽ không được hoàn thành một cách trọn
vẹn.
Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS. BS. Nguyễn Thanh Liêm - Viện trưởng
Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec, ThS. Bùi Việt Anh –
Trưởng nhóm Liệu pháp miễn d ch - Trung tâm công nghệ cao - Bệnh viện Đa
khoa quốc tế Vinmec đã tạo điều kiện cho tôi có cơ hội được thực tập tại phòng thí
nghiệm hiện đại bậc nhất Việt Nam được tiếp cận với những kỹ thuật, trang thiết
b tiên tiến.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Trần Th Tuyết Trinh, ThS.
Chu Th Thảo, TS. Thân Th Trang Uyên, ThS. Nguyễn Văn Phòng ThS.
Nguyễn Đắc Tú, CN. Hoàng Hương Diễm, CN. Trần Trung Nghĩa CN Bùi Th
Hồng Huế CN. Đỗ Th Hoài Thu, CN. Phạm Th Cường và những cán bộ của
Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ gen Vinmec đã hỗ trợ nhiệt tình cho
tôi trong quá trình hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Bên cạnh đó tôi gửi lời cảm ơn tới ThS. Bùi Th Vân Khánh cùng các bạn,
anh, ch tại phòng thí nghiệm Ung thư thực nghiệm – Trường Đại học Khoa học

Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội vì sự giúp đỡ và khuyến khích tôi trong suốt
thời gian làm việc cùng nhau.


Ngoài ra, tôi xin cảm ơn trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học
Quốc gia Hà Nội nơi đã cho tôi không chỉ kiến thức về Sinh học mà còn có một
tầm nhìn mới về nhận thức Khoa học sự sống và các thầy cô bộ môn Sinh học Tế
bào, những
người kiên nhẫn dạy cho tôi kiến thức cơ bản cũng như truyền đạt cho tôi những
kinh nghiệm, giúp tôi có thể trở thành một nhà khoa học thực sự.
Cuối cùng, tôi gửi lời biết ơn chân thành nhất tới gia đình và bạn bè thân
yêu đã tin tưởng, cho tôi nguồn động lực dồi dào thúc đẩy tôi vượt qua mọi khó,
thử thách.
Hà Nội, tháng 12 năm 2019
Học viên

Lê Th Huyền


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ đầy đủ

Từ Tiếng Việt

BSA

Bovine serum albumin

Albumin từ huyết thanh bê

BCA

Bicinchoninic acid

Axit bicinchoninic

CBMC

Cord blood mononuclear cell

Tế bào đơn nhân máu cuống
rốn

CD

Cluster of differeniation

Cụm biệt hóa

CFSE

Carboxyfluorescein succinimidyl
ester

Thuốc nhuộm huỳnh quang

CTL

Cytotoxic T lymphocyte

Tế bào T gây độc

DC

Dendritic cell

Tế bào tua

Dex

Dexosome

Exosome tiết từ tế bào tua

Endosomal sorting complex

Phức hệ vận chuyển được

required for transport

yêu cầu

Food and Drug Administration

Cục Quản lý Thực phẩm và
Dược phẩm Hoa Kỳ

Granulocyte-macrophage colony-

Yếu tố kích thích tạo cụm

stimulating factor

dòng hạt-mono

iDC

Immature dendritic cell

Tế bào tua chưa trưởng thành

ILVs

Intraluminal vesicels

IL

Interleukin

Interleukin

mDC

Mature dendritic cell

Tế bào tua trưởng thành

MDSCs

Myeloid-derived suppressor cells

Tế bào ức chế có nguồn gốc
tủy xương

moDC

Monocyte-derived Dendritic cell

Tế bào tua có nguồn gốc từ
tế bào mono

Major Histocompatibility

Phức hệ phù hợp tổ chức

Complex

chính

Mononuclear cell

Tế bào đơn nhân

ESCRT
FDA
GM-CSF

MHC

MNC

Các chồi mọc phía bên trong
Endosome


MVBs

Multivesicular bodies

Thể đa bào

NK

Natural killer

Tế bào giết tự nhiên

NSCLC

Non small cell lung cancer

OD

Optical density

Mật độ quang

PS

Performance status

Thể trạng bệnh nhân

SCLC

Small cell lung cancer

Ung thư phổi tế bào nhỏ

TAP

Transporter associated with
antigen processing

Bộ máy vận chuyển kháng
nguyên đặc hiệu

Th

T helps

Tế bào T bổ trợ

TNF - α

Tumor necrosis factor alpha

Yếu tố hoại tử khối u alpha

Treg

Regulatory T cells

Tế bào T điều hòa

7AAD

7-amino-actinomycin D

Thuốc nhuộm huỳnh quang
7ADD

Ung thư phổi không tế bào
nhỏ


MỤC LỤC
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN .......................................................................................3
1.1.

Thực trạng ung thƣ phổi .............................................................................................. 3

1.1.1.

Thực trạng ung thư phổi............................................................................................ 3

1.1.2.

Đáp ứng miễn d ch trong ung thư phổi ..................................................................... 4

1.1.3.

Các phương pháp điều tr ung thư phổi .................................................................... 7

a) Điều tr đích .................................................................................................................... 7
b) Liệu pháp miễn d ch ....................................................................................................... 8
1.2.

Tế bào tua ...................................................................................................................... 9

1.2.1. Đ nh nghĩa tế bào tua .................................................................................................... 9
1.2.2. Con đường trình diện kháng nguyên của tế bào tua ................................................... 11
1.2.3. Cơ chế biệt hóa tế bào tua in vitro .............................................................................. 12
1.3.

Exosome ....................................................................................................................... 14

1.3.1. Đ nh nghĩa Exosome ................................................................................................... 14
1.3.2. Cơ chế hình thành Exosome ....................................................................................... 15
a) Cơ chế hình thành Exosome phụ thuộc ESCRT ........................................................... 16
b) Cơ chế hình thành Exosome không phụ thuộc ESCRT................................................ 17
1.3.3. Chức năng trình diện kháng nguyên của Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua ......... 18
a) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-I của Exosome có nguồn gốc từ tế bào
tua...................................................................................................................................... 18
b) Khả năng trình diện kháng nguyên lớp MHC-II của Exosome có nguồn gốc từ tế bào
tua...................................................................................................................................... 19
1.4.

Ứng dụng của tế bào tua và Exosome trong điều trị ung thƣ ................................. 21

1.4.1. Ứng dụng tế bào tua trong điều tr ung thư tại Việt Nam ........................................... 21
1.4.2. Ứng dụng Exosome trong điều tr ung thư ................................................................. 22
1.5.

Máu cuống rốn trữ đông – nguồn cung cấp tế bào mono........................................ 24

Chƣơng 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................26
2.1.

Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................................. 26

2.2.

Hóa chất và thiết bị ..................................................................................................... 28

2.2.1. Hóa chất ...................................................................................................................... 28
2.2.2. Thiết b ........................................................................................................................ 29


2.2.3. Dụng cụ và vật tư tiêu hao .......................................................................................... 30
2.3.

Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 31

2.3.1. Nuôi cấy dòng tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 ..................................... 31
2.3.2. Tách chiết và xác đ nh nồng độ protein tổng số từ dòng tế bào ung thư biểu mô phế
nang phổi A549 ..................................................................................................................... 31
2.3.3. Rã đông máu cuống rốn trữ đông ............................................................................... 33
2.3.4. Phân lập tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn trữ đông ................................................ 33

2.3.5. Nuôi cấy, biệt hóa và trưởng thành tế bào đơn nhân thành tế bào tua ........................ 34
2.3.6. Thu hoạch tế bào tua DC và môi trường nuôi cấy tế bào tua DC ............................... 35
a) Thu hoạch môi trường nuôi cấy tế bào tua DC ............................................................. 35
b) Thu hoạch tế bào tua ..................................................................................................... 35
2.3.7. Thu nhận Exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào tua máu cuống rốn trữ đông ....... 36
2.3.8. Phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi....................................... 36
a) Phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi ........................................................................ 36
b) Phân lập tế bào Lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi ....................................... 37
2.3.9. Đánh giá ảnh hưởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trưởng của tế bào lympho
T ............................................................................................................................................ 38
2.3.10. Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 của tế bào
lympho T đã cảm ứng ........................................................................................................... 40
2.3.11. Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy ......................................................... 41
2.3.12. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................................ 42

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................43
3.1.

Kết quả thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thƣ A549 ............................ 43

3.2.

Rã đông máu cuống rốn trữ đông ............................................................................. 44

3.3.

Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đông .................................................. 44

3.4.

Kết quả biệt hóa tế bào mono thành tế bào DC ....................................................... 47

3.4.1. Hình thái tế bào ........................................................................................................... 47
3.4.2. Các dấu ấn bề mặt tế bào ............................................................................................ 49
3.5.

Kết quả phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi.................... 52

3.6. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của tế bào tua và Exsome lên sự sinh trƣởng của tế
bào lympho T ........................................................................................................................... 53


3.7. Kết quả đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi A549
của tế bào lympho T đã cảm ứng ........................................................................................... 56

Chƣơng 4 - KẾT LUẬN.........................................................................................59
Chƣơng 5 - KIẾN NGHỊ .......................................................................................60
Chƣơng 6 – TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................61


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cơ chế ung thư phổi thoát khỏi giám sát miễn d ch [29] ..........................4
Hình 1.2: Vai trò của PD1 và CTLA-4 trong đáp ứng miễn d ch kháng khối u. ......7
Hình 1.3: Các phương pháp điều tr ung thư phổi .....................................................8
Hình 1.4: Sự hình thành các quần thể tế bào tua [69]..............................................10
Hình 1.5: Con đường trình diện kháng nguyên của tế bào tua ................................12
Hình 1.6 : GM-CFS điều hòa sự phát triển của DC qua các tín hiệu phân từ khác
nhau [86] ..................................................................................................................13
Hình 1.7: Qúa trình giải phóng Exosome từ thể đa bào MVEs [24] .......................15
Hình 1.8: Cơ chế hình thành Exosome theo con đường phụ thuộc ESCRT [30] ....17

Hình 1.9: Con đường trình diện kháng nguyên của Exosome từ tế bào tua [47] ....21
Hình 2.1: Mẫu máu cuống rốn trữ đông tại Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec ..26
Hình 2.2: Bản tự nguyện chấp thuận tham gia hiến tặng mẫu sinh học tại Bệnh
viện Đa khoa Quốc tế Vinmec .................................................................................27
Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm .................................................................................31
Hình 2.4: Máu cuống rỗn trữ đông chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll..............34
Hình 2.4: Máu ngoại chia làm 4 phần sau ly tâm với Ficoll....................................37
Hình 3.1: Tế bào trên buồng đếm hồng cầu khi nhuộm với thuốc nhuộm Turck ...45
Hình 3.2: Tế bào đơn nhân trước và sau khi loa bỏ tế bào trôi nổi sau 2 giờ nuôi
cấy ............................................................................................................................46
Hình 3.3: Quần thể tế bào trước và sau khi phân lập tế bào mono ..........................47
Hình 3.4: Hình thái tế bào mono biệt hóa thành tế bào DC.....................................49
Hình 3.5: Phân tích theo phương pháp dòng chảy tế bào các dấu ấn bề mặt tế bào
vào ngày D1, D6 và D7............................................................................................50
Hình 3.6: Tỷ lệ trung bình các dấu ấn bề mặt. .........................................................52


Hình 3.8: Sự tăng sinh tế bào lympho T CD3+ khi nhuộm CSFE. .........................54
Hình 3.9: Hoạt tính gây độc lên tế bào A54 của tế bào Lympho T. ........................57
Hình 3.10: Tỷ lệ hoạt tính gây độc tế bào (mẫu 1) ..................................................58


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Một số thử nghiệm về biệt hóa tế bào tua với các tổ hợp cytokine khác
nhau ..........................................................................................................................14
Bảng 1.2: So sánh tiềm năng liệu pháp miễn d ch dựa trên DC và Dex .................22
Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm ..........................................................28
Bảng 2.1: Thiết b sử dụng trong thí nghiệm ...........................................................29
Bảng 2.2: Dụng cụ và vật tư sử dụng trong thí nghiệm ...........................................30
Bảng 2.3: Chuẩn b mẫu chuẩn dung d ch protein...................................................32

Bảng 2.5: Thiết kế thí nghiệm tế bào Lympho T cảm ứng với DC và Exosome ....39
trên đĩa 12 giếng .......................................................................................................39
Bảng 2.6: Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng gây độc tế bào A549 của ..........40
tế bào Lympho T ......................................................................................................40
Bảng 2.7: Kháng thể sử dụng trong phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy
..................................................................................................................................41
Bảng 3.1: Số lượng MNC thu được từ máu cuống rỗn trữ đông .............................45
Bảng 3.2: Hiệu suất phân lập tế bào mono ..............................................................47
Bảng 3.3: Giá tr trung bình các dấu ấn bề mặt biểu hiện trên tế bào tua ở giai đoạn
nuôi cấy ngày (Đơn v : %) ......................................................................................51


MỞ ĐẦU
Tại Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung, gánh nặng ung thư ngày càng
trở nên nghiêm trọng đòi hỏi sự quan tâm đặc biệt của toàn xã hội. Theo ghi nhận Tổ
chức Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer,
IARC) năm 2018, mỗi năm ở nước ta có khoảng 164.671 ca mới mắc, tỷ lệ mới mắc
trên 100.000 dân là 151 4; đứng thứ 130 trên 186 quốc gia có báo cáo số liệu ung thư.
Trong đó tỷ lệ mắc mới ung thư phổi chiếm thứ hai với 14 4% sau ung thư gan. Phần
lớn người b bệnh ung thư phổi đến khám và điều tr ở giai đoạn muộn nên việc điều tr
càng khó khăn tốn kém và thời gian sống ngắn. Các phương pháp điều tr ung thư
truyền thống hiện nay như phẫu thuật, xạ tr , hóa tr … thường gây ra các tác dụng phụ
đối với người bệnh như: đau đớn, mệt mỏi chán ăn khó thở, ho, thiếu máu, rụng tóc,
chất lượng cuộc sống giảm. Vì vậy, thực tế này đòi hỏi những phương pháp điều tr mới
hiệu quả hơn ít tác dụng phụ, cải thiện chất lượng sống và kéo dài thời gian sống cho
người bệnh hơn so với các hình thức điều tr truyền thống.
Hiện nay, liệu pháp miễn d ch được chú trọng đặc biệt, ngày càng trở thành
phương thức điều tr ứng dụng rộng rãi trong điều tr ung thư sau khi thực hiện thủ thuật
loại bỏ khối u, xạ tr , hóa tr . Liệu pháp này giúp tăng cường hệ miễn d ch của cơ thể,
nhận diện được những kháng nguyên của khối u mà trước đó không được phát hiện. Khi

các tế bào ung thư này được phát hiện, hệ thống miễn d ch sẽ loại bỏ chúng ra khỏi cơ
thể một cách hiệu quả. Hơn thế nữa, liệu pháp sử dụng tế bào miễn d ch không gây xâm
lấn và ít gây đau đớn cho người bệnh. Đây là một liệu pháp đầy hứa hẹn trong việc điều
tr ung thư.
Tế bào tua là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp gây đáp ứng miễn
d ch tế bào T ngăn chặn sự phát triển khối u. Và trong những thập kỷ gần đây vắc xin
dựa trên tế bào tua đã và đang trở thành một chiến lược quan trọng trong liệu pháp miễn
d ch điều tr ung thư. Tuy nhiên sử dụng tế bào tua trong điều tr ung thư có một số
nhược điểm như các tế bào tua thường khó lưu trữ và phải đòi hỏi quá trình thu nhận
phức tạp cũng như cần nhiều kỹ thuật đánh giá chất lượng tế bào. Gần đây các exosome
tiết từ tế bào tua (Dex) chỉ ra những chức năng đáp ứng miễn d ch tương tự và được
1


phát triển để sử dụng như là một cách thay thế. Giống như DC Dex biểu hiện các phức
hệ phù hợp tổ chức chính (MHC lớp 1, MHC lớp 2), các phân tử đồng kích thích và các
thành phần khác tương tác với các tế bào miễn d ch. Trong những năm gần đây liệu
pháp ghép tế bào tua đồng loài đã được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng và tế bào
máu dây rốn chính là một nguồn thay thế đầy tiềm năng trong liệu pháp miễn d ch đồng
loài điều tr ung thư. Sử dụng các exosome phân lập từ các tế bào tua máu dây rốn làm
vắc xin phòng chống ung thư chính là hướng nghiên cứu mới, khắc phục được các
nhược điểm của các phương pháp khác.
Dựa trên cơ sở đó chúng tôi thực hiện đề tài: “nghiên cứu khả năng kích thích
miễn dịch kháng ung thƣ phổi của exosome tế bào tua máu dây rốn trữ đông” để
đánh giá khả năng kích thích miễn d ch chống ung thư in vitro của các Exosome thu
nhận từ tế bào tua được phân lập và nhân nuôi từ máu dây rốn người. Các kết quả
nghiên cứu sẽ là tiền đề cho việc phát triển liệu pháp vắc xin mới phòng chống ung thư
phổi.

2

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1.

Thực trạng ung thƣ phổi

1.1.1. Thực trạng ung thƣ phổi
Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất và cũng là nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu trên thế giới do chẩn đoán muộn và điều tr hạn chế ở cả nam giới và nữ giới
[31]. Dựa trên ước tính của GLOBOCAN 2018, có khoảng 2,1 triệu trường hợp mắc
mới (chiếm 11,6% tổng số trường hợp ung thư mới) và 1,7 triệu trường hợp tử vong liên
quan đến ung thư phổi (chiếm 18,4% tổng số trường hợp tử vong). Hầu hết các trường
hợp ung thư phổi được chẩn đoán ở giai đoạn cuối khi khối u đã di căn khi đó chi phí
điều tr tốn kém nhưng hiệu quả thấp, tỷ lệ tái phát cao. Hút thuốc là yếu tố nguy cơ
hàng đầu gây nên ung thư phổi và chiếm đến 80% cái chết do ung thư phổi [74]. Thời
gian sử dụng thuốc lá cũng như số lượng tiêu thụ thuốc lá/ngày tỷ lệ thuận với nguy cơ
mắc ung thư phổi. Bên cạnh đó tiếp xúc với radon (khí ga tự nhiên-chất gây ung thư tự
nhiên), ami-ăng asen không khí ô nhiễm… cũng là những yếu tố tăng nguy cơ ung thư
phổi. Ngoài ra, một số yếu tố liên quan đến ung thư phổi di truyền cũng đã được chứng
minh như đột biến soma trong gen TP53 đột biến gene EGFR, gen mã hóa cho thụ thể
nicotine acetylcholine [30, 47].
Ung thư phổi được chia làm hai loại dựa theo theo loại tế bào b ảnh hưởng: ung
thư phổi tế bào nhỏ chiếm 15% (small cell lung cancer (SCLC)) và phần lớn là ung thư
phổi không tế bào nhỏ (non-small cell lung cancer (NSCLC)) chiếm 85% bao gồm các
loại: ung thư biểu mô tuyến (chiếm 40%) ung thư biểu mô vẩy (25-30%) và ung thư tế
bào lớn (5-10%) [74]. Tùy thuộc vào loại ung thư cũng như giai đoạn bệnh mà bệnh
nhân có các phác đồ điều tr khác nhau. Tuy nhiên, mặc dù có nhiều tiến bộ trong chẩn
đoán và điều tr ung thư phổi vẫn là căn bệnh gây ra nhiều thách thức cho các bác sỹ
lâm sàng do đáp ứng bệnh không tốt, tỷ lệ bệnh nhân ung thư phổi sống trên 5 năm là

dưới 5% [51]. Vì vậy, nhu cầu làm rõ cơ chế gây bệnh, áp dụng phối hợp các phương
pháp điều tr là cần thiết để có thể nâng cao hiệu quả chữa bệnh và kéo dài thời gian
sống của bệnh nhân.
3


1.1.2. Đáp ứng miễn dịch trong ung thƣ phổi
Một trong số các loại tế bào miễn d ch có chức năng quan trọng việc tiêu diệt khối
u là tế bào lympho T gây độc (CTL - cytotoxic T Lymphocytes). Tế bào CTL hoặc tế
bào giết tự nhiên NK (Natural killer cell) được huy động nhờ sự trình diện các kháng
nguyên ung thư chủ yếu bởi tế bào tua (Dendritic cell-DC) và đại thực bào. Tuy nhiên,
chức năng trình diện kháng nguyên trong ung thư ác tính thường b suy giảm. Chức
năng phòng thủ chống ung thư được cân bằng và sau đó vượt quá mức do điều hòa đáp
ứng miễn d ch.

Hình 1.1: Cơ chế ung thƣ phổi thoát khỏi giám sát miễn dịch [22]
Ung thư phổi trốn thoát khỏi giám sát miễn d ch nhờ vào các tế bào gây ức chế miễn d ch trong
vi môi trường khối u: tế bào T điều hòa Treg, tế bào ức chế có nguồn gốc tủy xương MDSCs, đại
thực bào hoặc ức chế hoạt hóa tế bào T thông qua các chốt kiểm soát miễn d ch

Vai trò bảo vệ cơ thể cũng như quá trình phát triển khối u là kết quả tương tác
giữa các tế bào ung thư và hệ thống miễn d ch được gọi là ―chỉnh sửa miễn d ch‖
4


(immunoediting) bao gồm ba pha riêng biệt: loại trừ, cân bằng và trốn thoát [70]. Trong
giai đoạn loại trừ đáp ứng miễn d ch cấp tính, bao gồm hệ miễn d ch bẩm sinh và đáp
ứng, nhận diện và tiêu diệt các tế bào ung thư thông qua một quá trình gọi là giám sát
miễn d ch trước khi chúng phát triển thành một khối u [70]. Các dòng tế bào ung thư
thoát khỏi pha loại trừ duy trì trạng thái không hoạt động trong pha cân bằng tiếp theo,

trong thời gian này, sự phát triển khối u không xảy ra nhưng khả năng miễn d ch của
các tế bào khối u tiếp tục được đ nh hình dưới áp lực miễn d ch chọn lọc từ hệ miễn
d ch đáp ứng. Hệ quả của áp lực chọn lọc là quá trình ức chế miễn d ch trung gian khối
u làm thay đổi quần thể tế bào khối u, dẫn đến trốn thoát miễn d ch và tăng trưởng khối
u [70]. Các tế bào khối u bước vào pha trốn thoát miễn d ch có thể tạo ra trạng thái ức
chế miễn d ch trong vi môi trường khối u bao gồm: tế bào ung thư nguyên bào sợi, tế
bào nội mô đại thực bào, tế bào tua, tế bào lympho và các chất ngoại bào với nhiều chất
trung gian như cytokine chemokine các yếu tố tăng trưởng và enzyme [55].
Các loại tế bào gây ức chế miễn d ch chính được tìm thấy trong vi môi trường
khối u là tế bào T điều hòa (regulatory T cells (Treg)), tế bào ức chế có nguồn gốc tủy
xương (myeloid-derived suppressor cells (MDSCs)) và các đại thực bào liên quan đến
khối u (tumor-associated macrophages (TAM)) [42, 55].
-

Tỷ lệ cao Treg trong các khối u liên quan đến tiên lượng xấu ở nhiều loại ung thư
khác nhau bao gồm: ung thư phổi không tế bào nhỏ ung thư dạ dày, tế bào gan, tụy,
tế bào thận ung thư vú và ung thư cổ tử cung. Treg (biểu hiện các marker bề mặt
CD4, CD25 và yếu tố phiên mã Foxp3) ức chế chức năng và sự tăng sinh của các tế
bào T CD4+, CD8+ đặc hiệu khối u và tế bào NK. Dựa theo nghiên cứu của
Shigematsu và cộng sự (2012), quần thể tế bào Treg có tỷ lệ cao hơn đáng kể trong
khối u và các hạch lympho so với máu ngoại vi trong ung thư phổi [56]. Tương tự,
sự biểu hiện của Foxp3 có trong khoảng một phần ba người bệnh mắc NSCLC và tỷ
lệ Foxp3/CD8 là chỉ số dự đoán đáp ứng hóa tr ở người bệnh giai đoạn tiến triển
[38].

-

Trong NSCLC, MDSCs được xác đ nh bằng các dấu ấn bề mặt: CD11+CD14CD15+CD33+. MDSCs cảm ứng các tế bào Treg, hạn chế sự tăng sinh tế bào T chức
5

năng (effector T cell) thông qua sản xuất các phân tử ức chế miễn d ch khác nhau.
MDSCs hoạt hóa arginase, tổng hợp oxit nitric (NO), tạo các gốc oxy tự do (radical
oxygen species ROS) và tiêu thụ cystein làm ức chế hoạt hóa các tế bào T và biệt
hóa các loại tế bào nhớ [46]. Ở bệnh nhân ung thư phổi, MDSCs có khả năng tạo ra
IL-10 MMP9 và TGFβ kích thích sự hình thành mạch và di căn. Sự biểu hiện quá
mức COX2 trong ung thư phổi và quá trình chuyển tiếp trung biểu mô (epithelialmesenchymal transition EMT) có vai trò quan trọng trong ức chế đáp ứng miễn d ch
kháng khối u của MDSCs.
-

TAM là các đại thực bào tập trung tại các khối u rắn, có vai trò trong sự tăng trưởng,
tiến triển và di căn của khối u, bao gồm đại thực bào phân cực M1 (kháng khối u) và
đại thực bào M2 (thúc đẩy tăng trưởng và di căn khối u). Nghiên cứu của Ma J và
cộng sự đã chỉ ra rằng mật độ M1 có trong khối u ở nhóm người mắc NSCLC có tỷ
lệ sống dài cao hơn so với nhóm người có có tỷ lệ sống thấp [41]. Trong khi đó sự
biểu hiện của IL-17 và prostaglandin E2 (PGE2) trong vi môi trường khối u kích
thích M2 biệt hóa và chiếm ưu thế [40].
Ngoài ra, ức chế miễn d ch còn xảy ra thông qua hai chốt kiểm soát miễn d ch

CTLA-4 (T-lymphocyte-associated protein 4) và PD-1(Programmed death 1). CTLA-4
là phân tử có cấu trúc tương đồng với thụ thể đồng kích thích CD28, cạnh tranh liên kết
với các phối tử CD80/CD86 biểu hiện trên bề mặt tế bào trình diện kháng nguyên [49].
Nhờ có ái lực cao, CTLA-4 ngăn cản thụ thể CD28 liên kết với CD80/CD86, do đó
cung cấp tín hiệu ức chế đến tế bào T ngăn cản quá trình tế bào T hoạt hóa. Ghi nhận ở
người mắc NSCLC cho thấy tỷ lệ CTLA4 nội bào cao hơn so với tỷ lệ tế bào lympho T
CD4+ [24]. Giống như CTLA-4, PD-1 cũng ức chế hoạt động của tế bào T thông qua
giảm tín hiệu đồng hoạt hóa của thụ thể CD28 nhưng không cạnh tranh trong tương tác
với CD80/CD86, mà ức chế hoạt tính của thụ thể CD28. PD-1 biểu hiện trên bề mặt tế
bào T đã hoạt hóa liên kết với các phối tử PD-L1/PD-L2 biểu hiện trên bề mặt ở các tế
bào ung thư dưới tác động IFN-γ do tế bào Th đã tiết ra, cung cấp tín hiệu ức chế trong

pha chức năng (effector phase) đáp ứng tế bào T, giảm sản xuất cytokine tăng sinh tế
bào [14].
6


Hình 1.2: Vai trò của PD1 và CTLA-4 trong đáp ứng miễn dịch kháng khối u.
CTLA-4(A) cạnh tranh liên kết với phân tử CD28 trong liên kết với phân tử đồng kích thích
CD80/86 và PD-1(B) giảm hoạt tính CD28 khi liên kết với PD-L1 hoặ PD-L2 [60].

1.1.3. Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ phổi
SCLC ít phổ biến trong ung thư phổi nhưng khả năng lây lan sang các v trí khác
trong cơ thể cao. Vì vậy, hóa tr là phương pháp ưu tiên trong SCLC. Phẫu thuật hiếm
khi sử dụng đôi khi được áp dụng để lấy các mẫu sinh thiết mô xác đ nh loại ung thư
phổi mắc phải. Trong khi đó NSCLC chiếm phần lớn trong ung thư phổi, có xu hướng
phát triển chậm và mất nhiều thời gian để xâm lấn nên các phương pháp điều tr cục bộ:
phẫu thuật và/hoặc xạ tr , hóa tr là phương pháp điều tr chính. Tuy nhiên, các phương
pháp điều tr truyền thống trên thường gây ra nhiều tác dụng phụ cho người bệnh như:
giảm sức khỏe, gây mệt mỏi chán ăn rụng tóc... Vì vậy hiện nay, một số phương pháp
mới trong điều tr ung thư đang được tập trung nghiên cứu và phát triển, nổi bật là
phương pháp điều tr đích và liệu pháp miễn d ch.
a) Điều trị đích

7


NSCLC thường liên quan đến mức độ biểu hiện thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì
EGFR (Epidermal growth factor receptor) với tần xuất cao, chiếm khoảng 40-80% bệnh
nhân. Dựa theo hai con đường hoạt hóa chính: PI3K / AKT / mTOR và RAS / RAF /
MEK / MAPK, EGFR kích thích tăng trưởng khối u, xâm lấn cục bộ, tạo mạch, tự thực
bào (autophagy), và chuyển hóa tế bào [35]. Do đó điều tr đích là phương pháp sử

dụng thuốc nhắm vào các phân tử đích để ngăn chặn con đường thúc đẩy khối u tiến
triển và kiểm soát bệnh tốt trong khoảng thời gian dài. Có khoảng 22 loại thuốc điều tr
đích đã được Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ FDA (U.S. Food and
Drug Administration) công nhận trong điều tr ung thư phổi bằng cách ức chế các gene
đảm nhận các nhiệm vụ khác nhau như: EGFR, VEGF (vascular endothelial growth
factor-yếu tố tăng trưởng nội mô thành mạch) TP53 ALK ROS1 BRAF…

Liệu pháp
miễn d ch

Phẫu
thuật
Xạ tr

Phương pháp
điều tr
Ung thư phổi
Điều tr
đích

Hóa tr

Hình 1.3: Các phƣơng pháp điều trị ung thƣ phổi
Phẫu thuật, xạ tr , hóa tr điều tr đích và liệu pháp miễn d ch.

b) Liệu pháp miễn dịch
Mặc dù đã có những tiến bộ mạnh mẽ trong điều tr NSCLC, hầu hết các bệnh
nhân đều trải qua giai đoạn tiến triển của bệnh đáp ứng không tốt sau hai hoặc nhiều hơn
hai chu kỳ hóa tr liệu, nên việc phát triển các phương pháp điều tr mới là cần thiết. Liệu
pháp miễn d ch chính là một bước ngoặt mới, là lựa chọn thay thế và bổ sung cho điều tr

8


ung thư phổi. Hiện nay, một số liệu pháp miễn d ch như vắc-xin peptide cá thể
(personalized peptide vaccines - PPV) [52], bất hoạt điểm kiểm soát miễn d ch (immune
checkpoint blockade - ICB), hoặc vắc xin DC tế bào tua… đã được áp dụng trong các
thử nghiệm lâm sàng [34]. PPV sản xuất cho từng người bệnh nhưng vẫn tồn tại nhược
điểm do giới hạn số lượng các loại peptide [52]. Đối với liệu pháp ICB, nhiều loại thuốc
như nivolumab và atezolizumab đã được FDA chấp thuận cho tất cả bệnh nhân mắc
NSCLC tiến triển thực hiện một chu trình hóa tr , có tác dụng bất hoạt lần lượt các chốt
miễn d ch PD-1 và PD-L1. Gần đây vắc xin DC được nghiên cứu sâu rộng do đặc điểm
sinh học cũng như chức năng trong cơ thể. Vắc-xin DC được phân loại nguồn tế bào
như: tế bào đơn nhân (monocytes) tự thân nuôi cấy in vitro và ex vivo và DC được cảm
ứng kháng nguyên trước khi truyền vào cơ thể [48]. Liệu pháp miễn d ch dựa trên DC là
an toàn và có thể thúc đẩy phản ứng miễn d ch chống ung thư và kéo dài sự sống của
người bệnh. Hơn thế nữa, DC có vai trò trong cả đáp ứng hệ miễn d ch bẩm sinh và đáp
ứng, bắt đầu phản ứng miễn d ch bằng cách kích thích các tế bào T tiêu diệt tế bào ung
thư và kích hoạt các tế bào bộ nhớ ngăn ngừa ung thư tái phát. Tuy nhiên sử dụng vắc
xin tế bào tua trong điều tr ung thư có một số nhược điểm. Gần đây các nghiên cứu về
Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua cũng chỉ ra những chức năng đáp ứng miễn d ch
tương tự và được phát triển để sử dụng như là một vắc-xin thay thế [50].
1.2.

Tế bào tua

1.2.1. Định nghĩa tế bào tua
Tế bào tua là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp, có khả năng bắt giữ
và thực bào trước khi trình diện các kháng nguyên của vi rút, vi khuẩn và quan trọng
hơn là các kháng nguyên của tế bào ung thư cao và mạnh hơn những tế bào miễn d ch
thông thường khác như đại thực bào hoặc tế bào lympho B [58]. Tế bào tua gây đáp ứng

miễn d ch tế bào T, kích thích khả năng tăng sinh và biệt hóa các tế bào naive T. Tế bào
tua cũng đóng góp vào các chức năng của các tế bào lympho B và giúp duy trì trí nhớ
miễn d ch bằng cách tiết các cytokine để thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B (IL-1, IL-6,

9


TNF-a...), hoặc theo các phương thức khác nhau như phụ thuộc hoặc không phụ thuộc
vào tín hiệu tăng sinh CD40 [72].

Hình 1.4: Sự hình thành các quần thể tế bào tua [53]
Tế bào tua gồm hai quần thể chính: tế bào tua dòng tủy (Langerhans DC, Interstitial DC,
Myeloid DC) và dòng lympho (Plasmocytoid DC) có nguồn gốc từ tế bào gốc tạo máu.

DC là một quần thể phân bố rộng rãi, có nguồn gốc từ bạch cầu tủy xương hình
thái tua dài được mô tả lần đầu tiên bởi Steinman và Cohn vào năm 1973. Trong cơ thể
người, DC tồn tại với nhiều quần thể khác nhau: DC dòng tủy và DC dòng lympho có
nguồn gốc từ tế bào gốc tạo máu CD34+. DC dòng tủy gồm các tế bào Langerhans
(quần thể DC đặc biệt) được tìm thấy trong biểu mô và các tế bào Interstitial DC là các
DC kẽ tìm thấy trong các mô khác [18]. Ngoài ra, quần thể Myeloid DC (mDC) biểu
hiện cao CD14+ được cho là có nguồn gốc từ tế bào mono. Plasmacytoid DC (pDC) là tế
bào DC dòng tủy gây cảm ứng rất mạnh cho phản ứng miễn d ch gây độc tế bào, bởi
chúng tiết ra một lượng lớn IFN loại 1. Trong máu và các mô cơ quan bạch huyết, pDC
và mDC được tìm thấy nhiều nhất. Trong môi trường In vitro, nhiều nghiên cứu đã
chứng minh rằng DC chức năng cao có thể được biệt hóa từ các tế bào mono CD14+
bằng cách nuôi cấy trong môi trường có GM-CSF và IL-4 [61]. Sự trưởng thành của các

10

DC này có thể đạt được bằng cách nuôi cấy bổ sung với yếu tố hoại tử khối u (TNFcùng sự kích thích của kháng nguyên [43]. Ngoài ra, vào năm 2016 Taieb J và cộng
sự đã mô tả một loại tế bào DC mới được gọi là interferon-producing killer DC (IKDC)
ở chuột có khả năng trực tiếp giết các tế bào đích, biểu hiện tương tự chức năng tế nào
NK và DC [62]. Cho đến nay, ở người IKDC nói chung cũng chưa được xác đ nh [54].
1.2.2. Con đƣờng trình diện kháng nguyên của tế bào tua
Để thực hiện các chức năng trên tế bào tua bắt giữ và chế biến các protein từ các
tế bào nhiễm virut hoặc từ các tế bào khối u, trình diện kháng nguyên với các tế bào
lympho T thông qua hai con đường: nội sinh và ngoại sinh.
Trong con đường trình diện kháng nguyên nội sinh, các tế bào biểu hiện kháng
nguyên MHC lớp I. Protein được phân cắt trong bào tương bởi proteosome (một phức
hợp các protein có hoạt tính phân giải protein), hoặc bằng protease khác sau đó các
mảnh peptide được vận chuyển qua màng của mạng lưới nội chất bởi các kênh protein
vận chuyển. Tại đây sự tổng hợp và lắp ráp chuỗi nặng và beta 2 microglobulin của
MHC lớp I xảy ra, kết hợp với peptid hình thành một phức hợp ổn đ nh rồi được vận
chuyển đến bề mặt tế bào và được trình diện với các tế bào T CD8+ [33]. Đối với con
đường trình diện kháng nguyên ngoại sinh, protein ngoại sinh được đưa vào trong tế bào
bởi quá trình thực bào và được phân cắt thành các mảnh bởi các protease trong
endosome. Khi đó các chuỗi alpha và beta của MHC lớp II được tổng hợp, lắp ráp
trong mạng lưới nội sinh chất đi qua bộ máy Golgi và trans-Golgi để đến endosome,
liên kết với các peptid rồi cuối cùng được vận chuyển đến bề mặt tế bào được nhận
diện bởi tế bào T CD4+ [15]. Đối với con đường tế bào chất, kháng nguyên ngoại sinh
từ các khoang nội bào được giải phóng vào tế bào chất, phân hủy trong proteasome và
vận chuyển phụ thuộc phân tử vận chuyển gắn với xử lý kháng nguyên (transporter
associated with antigen processing (TAP)) đến lưới nội chất hạt. Từ đây quá trình trình
diện kháng nguyên diễn ra tương tự như con đường trình diện kháng nguyên nội sinh.
Con đường khác theo không bào, các phân tử MHC lớp I gặp và liên kết với các peptide
ngoại sinh trong bộ máy Golgi hoặc endolysosome giống như các phân tử MHC lớp II
11

trước khi được vận chuyển đến bề mặt tế bào. Và sự trình diện chéo trong khoang
endolysosome là độc lập với TAP [12].

Hình 1.5: Con đƣờng trình diện kháng nguyên của tế bào tua [75]
Tế bào tua trình diện kháng nguyên nội sinh thông qua phức hệ phù hợp tổ chức chính lớp I
(MHC lớp I) và trình diện kháng nguyên ngoại sinh bằng phức hệ phù hợp tổ chức chính lớp II
(MHC lớp II). Ngoài ra, tế bào tế tua còn xảy ra trình diện kháng nguyên chéo theo con đường tế
bào chất và không bào

1.2.3. Cơ chế biệt hóa tế bào tua in vitro
Nhiều thử nghiệm đã chứng minh biệt hóa DC từ các tế bào đơn nhân MNC sử
dụng tổ hợp cytokine: GM-CFS, IL-4 kết hợp với TNF-α LPS… (Bảng 1.1) ở các nồng
độ khác nhau. Trong quá trình biệt hóa này, GM-CFS đóng vai trò kích hoạt các tín hiệu
nội bào theo các con đường khác nhau: chuyển đổi tín hiệu kinase Janus và hoạt hóa yếu
tố phiên mã (janus kinase/signal transducer and activator of transcription (JAK/STAT)),
hoạt hóa kinase mitogen-activated protein MEK, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K),
12


và yếu tố phiên mã NF-кB. Các tín hiệu này hoạt động đồng thời, thực hiện các chức
năng riêng biệt: tăng sinh biệt hóa và duy trì khả năng sống trong quá trình điều hòa,
phát triển DC [67].

Hình 1.6 : GM-CFS điều hòa sự phát triển của DC qua các tín hiệu phân từ khác
nhau [67]
Dưới sự kích hoạt GM-CFS, STAT5 là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình biệt hóa. Tín hiệu
PI3K/PKB thúc đẩy sự tăng sinh khả năng duy trì sự sống của các tế bào tiền thân DC. Trong
khi đó hoạt hóa các yếu tố phiên mã MEK/ERK và NF-кB liên quan mật thiết đến quá trình biệt
hóa và duy trì khả năng sống của tế bào.Viết tắt: GM-CFS: Granulocyte-macrophage colonystimulating factor, ERK: extracellular signal-regulated kinases, PI3K: phosphatidylinositol 3kinase, NF-кB:Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B, STAT: Signal
transducer and activator of transcription

Theo kết quả nghiên cứu của Sahana Holla vào năm 2014 về vai trò của IL-4 trong
sự biệt hóa DC, khi không có sự kết hợp với IL-4, GM-CFS gần như không có khả năng
biệt hóa DC từ tế bào mono người dù cơ chế phân tử chưa được làm sáng rõ [29]. Tương
tự, TNF-α chiếm một vai trò quan trọng trong quá trình thúc đẩy sự trưởng thành của DC.
Thời gian thích hợp nhất khi bổ sung TNF-α vào môi trường biệt hóa DC hiện nay vẫn
chưa rõ ràng tuy nhiên, hiệu quả biệt hóa DC từ MNC máu cuống rốn cao hơn khi được
bổ sung TNF-α sớm [23].

13