Đề tài: Các phương pháp phân tích trong hóa sinh

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA SINH

MỤC LỤC
Contents
NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN....................................................................................................2
MỤC LỤC........................................................................................................................................3
DANH SÁCH CÁC HÌNH..............................................................................................................6
DANH SÁCH CÁC BẢNG............................................................................................................6
LỜI MỞ ĐẦU..................................................................................................................................7
PHẦN I: PROTEIN.........................................................................................................................8
1.

Phương pháp Kjeldahl – Xác định hàm lượng N tổng......................................8

2.

Phương pháp biuret...................................................................................................11

3.

Phương pháp lowry...................................................................................................13

4.

Phương pháp Dumas................................................................................................14

5.

Phương pháp nhuộm màu.......................................................................................14

PHẦN II PHÂN TÍCH CACBONHYDRATE..............................................................................16

1.

Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand....................................16

2.

Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich.........20

3.

Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân bằng acid....22

4.

Phương pháp định lượng saccarose....................................................................24

5.

Định lượng fructose trong dung dịch có lẫn đường khử khác.....................26

6.

Định lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid.......................27

7.
Định lượng đường khử bằng phương pháp quang phổ so màu với thuốc
thử DNS....................................................................................................................................29
8.
Xác định đường khử bằng phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử với
KALIFERRYCYANURE..........................................................................................................31

PHẦN III: LIPID (CHẤT BÉO)....................................................................................................32
1.

Định lượng lipid tổng trong mẫu rắn bằng phương pháp Soxhlet...............33

2.
Định lượng lipid tổng trong mẫu lỏng bằng phương pháp Adam RoseGottlieb.....................................................................................................................................34


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
3.

Phương pháp Chloroform- Methanol....................................................................35

4.

Phương pháp Babcook.............................................................................................35

5.

Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp Lolch...............................36

PHẦN IV: PHÂN TÍCH VITAMIN...............................................................................................37
1.

Caroten: Xác định caroten bằng phương pháp cột..........................................38

2.

Xác định vitamin A bằng phương pháp so màu.................................................39

3.

Xác định vitamin C......................................................................................................40

4.

Xác định vitamin B1 bằng phương pháp so màu huỳnh quang....................41

PHẦN V: KHOÁNG......................................................................................................................43
1.

Phương pháp định lượng Canxi (trong mẫu sữa).............................................44

2.

Phương pháp phân tích mangan:..........................................................................44

PHẦN VI: NƯỚC.........................................................................................................................45
1.

Nhiệt độ.........................................................................................................................45

2.

Độ pH..............................................................................................................................45
2.1

Bằng hộp giấy màu.................................................................................................45

2.2

Phương pháp điện thế - máy đo pH...................................................................45

3. Độ trong (Transparency), độ đục (Turbidity)..................................................................46
3.1

Đo độ trong bằng đĩa Secchi....................................................................................46

3.2

Đo độ đục bằng phương pháp Nephelometric......................................................47

4.

Tổng chất rắn hòa tan (TDS) và tổng chất rắn lơ lửng (TSS).........................47
4.1

Tổng chất rắn hòa tan TDS (Total dissolved Solid).......................................47

4.2

Tổng chất rắn lơ lửng TSS (Total Suspended Solid).....................................48

5.

Độ dẫn điện (EC).........................................................................................................49

6.

Nồng độ muối..............................................................................................................49

7.

Oxy hòa tan (DO).........................................................................................................50
7.1

Phương pháp Winkler............................................................................................50

7.2

Phương pháp điện cực Oxy hòa tan – máy đo Oxy.....................................51

8

Độ cứng tổng hợp..........................................................................................................53

9

Độ kiềm tổng cộng.........................................................................................................55
9.1
9.1.1

Độ kiềm carbonate hay độ kiềm phenolphthalein........................................56
Độ kiềm tổng cộng..............................................................................................56
2


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
PHẦN VII: PHÂN TÍCH ENZYME.............................................................................................57

I.

Các phương pháp xác định hoạt độ một số enzyme thông dụng:...................58
1.

Xác định hoạt độ alpha amylase theo phương pháp wohlgemuth...........58

2

Xác định hoạt độ lipase.............................................................................................60

3

Khảo sát hoạt độ invertase......................................................................................61

4

Khảo sát động học và xác định hoạt độ enyme urease......................................63

5.

Xác định hoạt độ của enzyme peroxidase.............................................................66

6.

Phân tích enzyme trong nấm men bánh mì: enzyme zimaza hay maltala.
68

II.

Ứng dụng enzyme trong phân tích hóa sinh.......................................................73
1.

Xác định cacbohydrate..........................................................................................73

2.

Xác định acid hữu cơ.............................................................................................74

3.

Xác định alcohol......................................................................................................76

4.

Xác định các thành phần khác............................................................................76

TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................................77

3


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 1: phương trình phản ứng giữa thuốc thử Biuret với NH 3…………………………...11
Hình 2: Phương trình đường chuẩn…………………………………………………………12
Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein bằng phương pháp lowry…………………….13
Hình 4: Sơ đồ sự hấp thụ protein tại bước sóng 470nm…………………………………..16
Hình 5: Thiết bị chiết Soxhlet…………………………………………………………………33

Hình 6:.Chai badcook………………………………………………………………………….37
Hình 7: Hệ thống micromanometre…………………………………………………………..70
Hình 8: Đồ thị đường chuẩn…………………………………………………………………74

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1: Bảng thực nghiệm của luxisun………………………………………………….....19
Bảng 2: Chuẩn bị dãy ống nghiệm chuẩn và mẫu…………………………………………30
Bảng 3: Một số Vitamin và các phương pháp phân tích……………………………….....43
Bảng 4: Chuẩn bị dãy ống nghiệm với các nồng độ và độ pha loãng khác nhau……….60
Bảng 5:Chuẩn bị ống nghiệm………………………………………………………………….......62
Bảng 6: Chuẩn bị dung dịch mẫu……………………………………………………………65
Bảng 7: Kết quả thí nghiệm…………………………………………………………………65
Bảng 8: Chuẩn bị ống nghiệm…………………………………………………………………….66
Bảng 9: đánh giá chất lượng nấm men bánh mì…………………………………………72

4


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

LỜI MỞ ĐẦU
Thực phẩm hay nói đơn giản đó là thức ăn, chủ yếu bao gồm các chất như:
carbohydrate, chất béo (lipid), chất đạm (protein), các vitamin, khoáng chất, và nước,
mà con người hay động vật có thể ăn hay uống được, với mục đích cơ bản là thu nạp
các chất dinh dưỡng nhằm nuôi dưỡng cơ thể hay vì sở thích.
Tuy nhiên, các chất trong thực phẩm dễ bị chuyển hóa bởi nhiều yếu tố khác
nhau trong quá trình chế biến và bảo quản.Một trong những yếu tố đó là enzyme.Do
phản ứng enzyme mà chất lượng của các nguyên liệu trong quá trình chế biến và bảo
quản tăng lên, hoặc giảm sút.Các biện pháp công nghệ trong sản xuất thực phẩm hoặc
là kìm hãm hoạt độ của các enzyme hoặc là tạo điều kiện để chúng hoạt động một cách

tối đa.
Tất cả các thuộc tính lý, hoá, sinh của các thành phần thực phấm đều có thế đo
được, biểu diễn được dưới dạng các thông số cụ thể.Việc phân tích, đo đạc và định
lượng các thành phần hóa học thực phấm ngày càng được chú trọng để đảm bảo chất
lượng sản phẩm hoặc nghiên cứu và tạo sản phẩm mới.Cùng với sự phát triển nhanh
chóng của khoa học kỹ thuật, các phương pháp phân tích ngày càng phát triển hơn,
hiện đại hơn và có độ chính xác cao hơn, góp phần đắc lực cho việc kiểm tra chất
lượng và quản lý sản xuất.
Yêu cầu đặt ra là phải xác định được hàm lượng các chất có trong thực phẩm,
cũng như hoạt độ xúc tác của enzyme trong sản xuất thực phẩm.Trên cơ sở biết được
hàm lượng của các nguyên liệu hay các chất có trong thực phẩm, người ta xác định
được giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thực phẩm.Việc xác định được hoạt độ xúc tác
của các enzyme trong thực phẩm nhằm biết được các biến đổi diễn ra trong chế biến,
từ đó có những cách thức sản xuất cho phù hợp.
Hóa sinh thực phẩm là môn học quan trọng trong ngành thực phẩm, cung cấp
cho chúng ta những kiến thức cần thiết về cấu tạo cũng như sự chuyển hóa của các
chất có trong thực phẩm khi đi vào cơ thể.
Ngày nay, có rất nhiều phương pháp phân tích trong hóa sinh thực phẩm.Trong
bài tiểu luận này, chúng em xin trình bày một số phương pháp phân tích phổ biến trong
hóa sinh thực phẩm.
Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Phan Minh Anh Thư đã giúp chúng em hoàn thiện
bài báo cáo này.Vì kiến thức chuyên môn chưa tốt nên trong quá trình tìm hiểu không
tránh khỏi thiếu sót, rất mong sự đóng góp ý kiến cô và các bạn.
5


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

PHẦN I: PROTEIN
Protein là polymer của các amino acid.

Protein có nhiều chức năng quan trọng


Dinh dưỡng: phát triển, tiêu hóa, trao đổi chất (enzyme).



Cấu trúc vật lý: phô mát, bánh mì, các chất tạo bọt, tạo gel…

Các phương pháp xác định hàm lượng protein
1. Phương pháp Kjeldahl – Xác định hàm lượng N tổng
1.1.Nguyên tắc:
Khi đốt nóng phẩm vật cần phân tích với H 2SO4 đậm đặc, các hợp chất
hữu cơ bị oxy hóa. Carbon và hydro tham gia tạo thành CO 2 và H2O. Còn nitơ sau
khi được giải phóng ra dưới dạng NH 3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2 SO4 tan
trong dung dịch. Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng dung dịch NaOH, đồng thời cất và thu
NH3 bằng một lượng dư H2SO4 0.1N. Định lượng H2SO4 0.1N dư bằng dung dịch NaOH
0.1N chuẩn, qua đó ta tính được lượng nitơ có trong mẫu nguyên liệu cần phân tích.
1.2.Quy trình thực hiện



Vô cơ hóa mẫu

Quá trình này được tiến hành hoàn toàn trong tủ Hotte.Mẫu được cho vào bình
Kjeldahl.Tùy loại nguyên liệu nhiều hay ít chất đạm, ví dụ: mẫu rắn cân 0.2 đến 0.5g,
mẫu lỏng lấy từ 2 đến 5ml (nước mắm lấy 2mL, sữa lấy 5mL). Thêm vào từ từ 10mL
H2SO4 đậm đặc (tỉ trọng 1.84).Để tăng nhanh quá trình vơ cơ hóa (đốt cháy) cần phải
cho thêm chất xúc tác. Có thể dùng Se kim loại (0.05g) hoặc dùng 0.5g hỗn hợp
CuSO4 :K2SO4 (1:3). Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi, làm tăng vận tốc

quá trình phản ứng.Có thể dùng xúc tác là acid perchloric HClO 4, giải phóng oxy cho
phản ứng oxy hóa.Sau khi thêm các chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, và chỉ
đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dung dịch. Lưu ý: nếu quá trình vô cơ
hóa được thực hiện đơn giản bằng cách đun trực tiếp bình Kjendahl trên bếp điện thì
trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo léo sao cho không còn một vết đen
nào của mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình. Đun cho
tới khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng.
Hướng dẫn sử dụng bộ vô cơ hóa mẫu
6


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
- Bật công tắc (1) và gia nhiệt trước khoảng 5 phút.
- Mang găng tay bảo hộ và nhẹ nhàng lắp bộ giữ (2) chứa các bình vô cơ hóa mẫu (4)
vào.
- Cho dung dịch mẫu và chất oxy hóa (H2SO4) vào bình vô cơ hóa mẫu.
- Đóng chặt hệ thống bằng bộ Gaskets.
- Điều chỉnh núm (2) để tăng/giảm nhiệt độ đun.
Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, dung dịch trở nên trong suốt.Cần làm nguội trước khi
lắp vào hệ thống chưng cất BUCHI Distillation Unit. 4



Cất đạm

Chuẩn bị máy cất đạm: Cắm điện, bật máy, mở vòi nước làm lạnh, chờ đến khi màn
hình hiện lên thì máy đã sẵn sàng làm việc. Lấy vào erlen 10ml dung dịch H 2SO4, lắp
vào máy. Chú ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng.Cài đặt chương trình cho máy (tỷ lệ sục
hơi: 50%, thể tích NaOH 40%: 5 – 10mL, thời gian cất: 15 – 30 phút).
Tiến hành: Chuyển toàn bộ dung dịch mẫu sau khi đã vô cơ hóa xong ở bình Kjeldahl

vào bình định mức 100, thêm nước cho đến vạch định mức. Lưu ý acid H 2SO4 đậm đặc
rất háo nước và tỏa nhiệt mạnh khi tiếp xúc với nước nên có thể làm bay hơi một
phần.Vì vậy, cần làm nguội và điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đó đổ ra
erlen.
Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức.Lắp vào hệ thống,
chú ý không lắp lệch, khí sẽ thoát ra ngoài, mất mẫu.
Tiến hành cất đạm trên máy cho đến khi NH 3 được giải phóng hoàn toàn khỏi bình
Kjendahl.



Định phân

Lấy erlen ra khỏi máy sau khi đã tráng nước cất để lấy hết mẫu bám trên
ống.Cho 10 giọt phenolphtalein vào bình và định phân bằng NaOH 0.1N.
Xác định hệ số hiệu chỉnh K: Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn,
nếu muốn pha dung dịch có nồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng,
sau đó hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn
thích hợp.
7


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
Thủ tục hiệu chỉnh như sau:
- Gọi K là tỷ số giữa nồng độ thực tế (Ct) và nồng độ cần pha (Cp) của NaOH.
- Lấy 10mL H2SO4 0.1N (chuẩn) vào erlen, định phân bằng V (mL) NaOH 0.1N đã pha
sẵn.Thêm 3 giọt chỉ thị phenolphtalein.Từ thể tích định phân (V) suy ra được Ct và K.
1.3. Tính kết quả:
Hàm lượng phần trăm Nitơ tổng có trong mẫu:

N=
Trong đó:
N – hàm lượng Nitơ tính bằng phần trăm khối lượng
a – số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3
b – số mL dung dịch NaOH 0.1N sử dụng chuẩn độ
m – khối lượng mẫu đem vô cơ hóa, g
V – tổng thể tích định mức dung dịch vô cơ hóa (100mL)
v – thể tích dung dịch vô cơ hóa dùng chưng cất (10 mL)
0.0014 – lượng Nitơ (gam) ứng với 1mL H2SO4 0.1N
K – hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N
% Protein = % Nitrogen × 6,25(Phần lớp Protein chứa 16% N => hệ số 6,25
(100/16=6,25))
Ưu điểm của phương pháp
•

Ứng dụng cho tất cả các loại thực phẩm

•

Đơn giản, chi phí thấp

•

Chính xác, phương pháp chuẩn để phân tích hàm lượng protein thô (AOAC
945.01)

Nhược điểm của phương pháp
8

Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
•

Không phải tất cả N là protein, ngoài ra có thể xác định cả: Purine, Pyrimidine
DNA, RNA, Urea, Nhiều tế bào thực vật có > 50% N phi protein, Melamine
(6N/phân tử).

•

Chỉ xác định được hàm lượng N tổng, không xác định được chính xác hàm
lượng N protein

•

Sử dụng hóa chất độc hại, thời gian tiến hành tương đối lâu.

2. Phương pháp biuret
2.1 Nguyên tắc
Biuret và peptide phản ứng với Cu 2+ tạo thành một phức hợp có màu tím hấp thụ
ánh sáng bước sóng 540nm.(Biuret là một hợp chất ngưng tụ của urea sau khi bị đốt
nóng). Cường độ màu hấp thu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu.


Cách pha thuốc thử Biuret

Thuốc thử biuret được pha từ 3 dung dịch thuốc thử là dung dịch A, B và C. Các dung
dịch này được chuẩn bị như sau:
- Dung dịch A: 05g CuSO 4. 5H2O hòa tan trong 495 mL nước ( dung dịch CuSO4.
5H2O 1%)
- Dung dịch B: 10g NaKC 4H4O6.4 H2O hòa tan trong 490 mL nước ( dung dịch

NaKC4H4O6.4 H2O 2%)
- Dung dịch C: 20,5g Na 2CO3 và 4g NaOH hòa tan và định mức thành 1 lít dung dịch
(dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N).
Thuốc thử biuret = 1 mL dung dịch A + 1 mL dung dịch B + 98 mL dung dịch C

9


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
Hình 1: phương trình phản ứng giữa thuốc thử Biuret với NH 3
Amino acid đơn và dipeptide không phản ứng
Vùng nồng độ tuyến tính là 1-5 mg/ml
Sử dụng đường chuẩn độ với BSA (bovine serum albumin).
2.2 Quy trình thực hiện



Dựng đường chuẩn

Pha 5 dung dịch protein chuẩn từ huyết thanh bò ứng với 5 nồng độ khác nhau 2, 4,
6, 8 và 10 (mg protein/ mL).Lấy 1 mL từng dung dịch protein chuẩn và 5 mL thuốc thử
biuret cho ống nghiệm.Hỗn hợp được lắc đều trong 15 phút ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp
sau đó được đem đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm.
Vẽ đường chuẩn: trục hoành là nồng độ protein, trục tung là độ hấp thu.

Hình 2: Phương trình đường chuẩn



Xác định độ hấp thu mẫu thực phẩm

- Trích ly protein (nếu mẫu là mẫu rắn). Sau đó, ta tiến hành pha loãng mẫu sao cho
nồng độ protein trong mẫu nằm trong khoảng 0 – 10 mg/mL.
- Lấy 1 mL dịch trích và 5 ml thuốc thử biuret cho vào ống nghiệm và lắc đảo trong 15
phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó, hỗn hợp được đem đi xác định độ hấp thu ở bước sóng
540 nm.
10


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
- Giá trị nồng độ protein trong mẫu được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn.
Ưu điểm
•

Nhanh (khoảng 30 phút), đơn giản, màu sắc ít biến đổi hơn so với các phương
pháp Lowry, UV, có ít hợp chất phi protein gây ảnh hưởng nên phản ứng Biuret,
không phát hiện N từ nguồn không phải peptide hoặc protein.

•

Không sử dụng hó chất độc hại.

Nhược điểm
•

Không nhạy bằng phương pháp Lowry.

•

Cần 2 – 4 mg protein cho một lần đo.

•

Các muối ammoni nồng độ cao có thể gây ảnh hưởng.

3. Phương pháp lowry
3.1 Nguyên tắc
Cu2+ trong môi trường kiềm sẽ tạo phức hợp với protein.Cu 2+ xúc tác oxy hóa nhóm
phenol trong tyrosine và tryptophan bằng thuốc thử Folin-Ciocalteau (phosphomolybdicphosphotungstic acid) => tạo ra hỗn hợp có màu.

Hình 3: sơ đồ phản ứng phân tích protein bằng phương pháp lowry
3.2 Quy trình thực hiện
Pha loãng mẫu (20 – 100 microgam protein)
Cho mẫu phản ứng với KNa tartate- Na2CO3 10 phút ở nhiệt độ phòng.
11


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
Phản ứng với CuSO4- KNa tartate-NaOH 10 ở nhiệt độ phòng.
Tiếp đó cho phản ứng với Folin 10 phút ở 500C.
Đo độ hấp thu ở bước sóng 600 nm.
Ưu điểm:
•

Tính chuyên biệt cao, nhanh và đơn giản (~1.5 giờ).

•

Rất nhạy: 20-100 µg.– 50-100 x so với Biuret, 10-20 x so với UV 280 nm

Nhược điểm
•

Rất nhạy cảm với thay đổi pH.

•

Màu dễ bị biến đổi bởi các loại protein khác nhau (nhiều hơn so với Biuret).

•

Có nhiều hợp chất gây ảnh hưởng: sucrose, lipid, đường khử, hexoamine, amino
sulfate…

4. Phương pháp Dumas
4.1.Nguyên tắc
Mẫu được đem đốt cháy ở 700- 1000 0C sau đó được phản ứng với đồng ở 600 0C,
xác định hàm lượng protein bằng phương pháp sắc kí khí.
4.2.Cách tiến hành
Mẫu đem cân cho vào thiết bị rồi đốt cháy bằng Oxy tinh khiết (toàn bộ Nito trong
mẫu chuyển thành N2 và NxOy ) rồi dẫn qua ống có chứa Cu. N xOy phản ứng với Cu tạo
ra N2.Khí sinh ra chỉ còn N2.Dẫn vào cột sắc ki khí để xác định hàm lượng Nito.
Ưu điểm:
•

Không sử dụng hóa chất độc hại.

•

Có thể xác định lượng protein trong mẫu trong vòng 3 phút, có thể tiến hành một

lúc 150 mẫu.

Nhược điểm:
•

Thiết bị mắc tiền
12


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
5. Phương pháp nhuộm màu
5.1.Nguyên tắc
Mẫu protein được trộn với một lượng dư biết trước chất nhuộm.Ở pH thấp, các
nhóm bazơ của protein mang điện tích (+) và gắn kết tuyến tính với điện tích (-) của
chất nhuộm tạo kết tủa.Phần chất nhuộm thừa sẽ được xác định bằng cách đo màu.

5.2 Quy trình:
•

Trộn protein, chất nhuộm, đệm pH 2

•

Lọc hoặc ly tâm

•

Đo độ hấp thụ của dung dịch lọc ở 470 nm

Mật độ quang của chất nhuộm gắn kết protein ≈ nồng độ chất nhuộm ban đầu – nồng

độ chất nhuộm trong dịch lọc.

13


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm

Hình 4: Sơ đồ sự hấp thụ protein tại bước sóng 470nm
Các yếu tố ảnh hưởng đến nhuộm màu ion âm:
•

Nhiệt độ

•

Thành phần phi protein

•

Hệ thống đệm

•

Chất lượng protein

=> Phân tích protein trong sữa, bột mì, sản phẩm từ đậu nành, thịt….

PHẦN II PHÂN TÍCH CACBONHYDRATE
Carbohydrate là hydrate của carbon như: C 6(H2O)6, C12(H2O)11, C18(H2O)16, Polyhydroxy
aldehyde, ketones và các dẫn xuất.

•

Monosaccharide (đường đơn): không thể phân hủy thành dạng đường đơn giản
hơn ở điều kiện thường.

•

Oligosaccharide: thường 2-10 đường đơn.

•

Polysaccharide: polymer của đường đơn.
14


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
Chức năng: Nguồn carbon và năng lượng.
Một số phương pháp định lượng carbohydrate:
1. Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand
1.1 Nguyên tắc
Trong môi trường kiềm các đường khử (glucoza, fructoza, mantoza...) khử oxit
đồng (2) thành oxit đồng 1 (Cu +2→Cu+1).Để định lượng đường khử dùng thuốc thử
Fehling: dung dịch sunfat đồng (Fehling I) và dung dịch muối xecnhet: muối kali-natri
tartrate kép (Fehlinh II) hoặc gọi là Fehling A và Fehling B, theo tỉ lệ 1:1. Khi trộn Fehling
I và Fehling II, đầu tiên tạo thành Cu(OH)2 có màu xanh da trời.

Như vậy muối xecnhet giữ cho ion Cu + trong môi trường kiềm không bị kết tủa dưới
dạng Cu(OH)2. Muối phức này không bền, vì vậy các đường có chứa nhóm andehit
hoặc xeton dễ dàng khử Cu+2 thành Cu+ ra kết tủa oxit đồng (Cu2O) có màu đỏ.

Để định lượng oxit đồng I được tạo thành trước hết oxi hóa nó bằng sunfat sắt 3
hoặc sunfat kép sắt amon trong môi trường axit sunfuric, Cu + sẽ bị oxi hóa trở lại thành
Cu+2 , còn Fe+3 bị khử thành Fe+2.
Cu2O + Fe2(SO4)3 + 2H2SO4 = 2 CuSO4 + FeSO4 + H2O
Tiếp đó lượng Fe+2 tạo thành được xác định bằng cách oxi hóa nó bằng dung dịch
KMnO4 chuẩn độ trong môi trường axit.
10FeSO4 + 2 KMnO4 + 8H2SO4 = 5Fe2(SO4)3 + 2MnSO4 + K2SO4 + H2O
Dựa vào lượng KMnO4 tiêu tốn người ta lập bảng tỉ lệ giữa lượng KMnO 4 1/30N và
lượng đường khử (bảng 1) để dễ sử dụng.
15


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



Hóa chất

Thuốc thử Fehling
+ Fehling I: 40g CuSO4.5H2O/1 lít
+ Fehling II: 200g muối xecnhet + 150g NaOH/ 1 lít


Dung dịch Fe2(SO4)3 trong axit sunfuric: 50g Fe2(SO4)3 + 200ml H2SO4 đậm đặc
(d = 1,4)/lit. Hoặc dung dịch sunfat kép sắt amoni



86g (NH4)2SO4. Fe2(SO4)3.24H2O + 200g (108,7ml) H4SO4 d = 1,84/l



KMnO4 1/30N; 1,06g KMnO4/1 lít nước cất đun sôi. Nồng độ KMnO 4 được xác
định bằng oxalat amoni hoặc axit oxalic một ngày sau khi pha.

1.2 Cách tiến hành
16


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm



Xử lí mẫu

Tùy đối tượng nghiên cứu (hạt, quả...) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng
để định lượng đường có khác đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau:
a. Trong trường hợp nguyên liệu không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin:
Có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước.Cân và cho vào cối sứ 1g nguyên liệu hạt
hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô...đã được nghiền nhỏ
(và sấy khô đến khối lượng không đổi). Nếu nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì
cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30ml nước cất nóng 70
- 80°C. Chuyển toàn bộhổn hợp vào bình định mức dung tích 1 lít. Đun cách thủy 70 80°C trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì axetat
[Pb(C2H2O2) 2.3H2O)] hoặc chì nitrat [Pb(NO 3)2] 10%.Tránh dùng quá dư chì axetat
(dùng 2 - 5ml chì axetat).Sau đó loại bỏ lượng chì axetat dư bằng dung dịch Na 2SO4
bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút.Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua
giấy lọc vào cốc hay bình khô.Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm.
b. Trong trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc
Cần chiết đường bằng rượu 70 - 80°C, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có
lắp ống làm lạnh không khí.Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì

axetat vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều.
c. Trường hợp mẫu chứa nhiều protein
Kết tủa protein và các tạp chất dùng dung dịch tricloacetic 10 %, sau đó trung hòa bằng
dung dịch NaOH 5 % với chỉ thị metyl đỏ (màu đỏ chuyển sang màu vàng).Thêm nước
cất tới vạch định mức, lọc qua giấy lọc.Nước qua lọc là dung dịch đường khử cần định
lượng.
d. Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều axit hữu cơ
Cần chú ý trong quá trình đun khi chiết, đường saccarose có thể bị thủy phân một phần.
Do đó cần xác định riêng đường khử và đường saccarose. Trước khi đun cách thủy hỗn
hợp phải trung hòa axit bằng dung dịch Na 2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0.



Tiến hành thí nghiệm

Dung dịch mẫu sau khi đã được chuẩn bị (xem ở trên) được lấy 10 ml (0,8 – 40mg
đường) cho vào bình tam giác V 100ml, thêm 5ml Fehling I và 5 ml Fehling II. Đun sôi
hỗn hợp trong 3 phút tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu tiên. Sau khi đun sôi dung dịch
17


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
vẫn giữ màu xanh biếc đặc trưng.Nếu dung dịch mất màu chứng tỏ lượng Fehling cho
vào không đủ.Lúc đó phải làm lại thí nghiệm hoặc cho thêm lượng Fehling hoặc giảm
lượng mẫu.Để yên, lọc bằng phễu lọc đường (G-4) vào bình lọc chân không
benzen.Rửa bình và phễu lọc bằng nước cất nóng 3 – 4 lần. Chú ý giữ phần lớn lượng
oxit đồng I nằm lại trong bình tam giác và lớp oxit đồng trong bình và trên phễu luôn
được phủ một lớp nước nóng để Cu 2O khỏi bị oxi hóa bởi O 2 của không khí. Hòa tan
kết tủa của oxit đồng I vào bình bunzen khác bằng cách cho những lượng nhỏ (5ml)
dung dịch sunfat sắt 3 trong môi trường H 2SO4 vào bình có chứa kết tủa Cu 2O và

chuyển sang phễu lọc.Tráng cẩn thận bình và phễu lọc 3-4 lần bằng nước cất nóng.
Nước tráng cũng thu vào bình. Định phân dung dịch bằng KMnO 4 1/30N cho đến khi
xuất hiện màu hồng nhạt không mất đi trong 20-30 giây.Biết lượng định phân, tra bảng
suy ra lượng đường trong dung dịch thí nghiệm. Làm thí nghiệm kiểm chứng song song
thay dung dịch đường bằng nước cất.
1.3 Tính kết quả
Hàm lượng đường khửtính theo phần trăm (%):

RS% =
Trong đó:
a: sốmg glucoza tra bảng ứng với sốml KMnO 4 1/30N trừ đi sốml KMnO 4 1/30N
của mẫu kiểm chứng;
V: dung tích bình định mức;
V1: lượng dung dịch mẫu thí nghiệm lấy để xác định đường khử (trong ví dụ trên
10ml)
m: lượng mẫu (g) nguyên liệu thực phẩm;
100: hệ sốchuyển đổi %;
1000: hệ số chuyển đổi sang mg
2. Định lượng đường khử theo phương pháp vi lượng của Rodzevich
2.1 Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở trong môi trường kiềm của đường khử (glucose,
fructose, mantose...) có thể khử dễ dàng đồng (II) thành oxit đồng (I) (Cu +2 →Cu+1) dưới
18


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
dạng kết tủa màu đỏ và qua lượng CuSO 4 dư (không tham gia phản ứng) tính được
lượng đường khử.Cơ chế của quá trình xảy ra theo các giai đoạn sau:
Khi trộn hai dung dịch Fehling I và Fehling II với nhau thì xảy ra phản ứng giữa
chúng theo hai giai đoạn:

Đầu tiên tạo thành kết tủa đông hidroxit màu xanh da trời:
CuSO4 +2NaOH = Cu(OH)2 + Na2SO4
Sau đó Cu(OH)2 tác dụng với muối Seignett tạo thành muối hòa tan có dung dịch
màu xanh thẫm:

Muối trên là một hợp chất không bền, vì thế các đường khử có nhóm andehit hoặc
xeton dễ dàng khử đồng (II) oxit tạo thành kết tủa đồng (I) oxit có màu đỏ, bản thân
đường bị oxi hóa khi tác dụng với dung dịch Fehling:

Lượng CuSO4 dư (không tham gia phản ứng) cho tác dụng với KI trong môi trường
H2SO4 sẽ giải phóng ra iot tự do.
CuSO4 + 4KI + H2SO4

I2 + CuI2 + 2K2SO4

Chuẩn độ lượng iot tạo thành bằng natri thiosunfat (Na 2S2O3) chuẩn, qua đó tính được
lượng đường khử có trong dung dịch.
I2 + 2Na2S2O3 = Na2S4O6 +2NaI



Hóa chất

Dung dịch Fehling I: 34,64 g CuSO4.5H2O trong 500ml H2O
19


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
Dung dịch Fehling II: 173g Seignett + 50g NaOH trong 500ml H 2O
Dung dịch KI 30%, dung dịch H2SO4 25% , dung dịch Na2S2O3 0,1N.

2.2 Tiến hành



Xử lí mẫu

Cách thực hiện tương tự phương pháp Bertrand



Tiến hành thí nghiệm

Bước 1: Cho vào bình nón dung tích 50ml: 1ml dung dịch đường, 2ml nước cất, 1ml
dung dịch Fehling I và 1ml dung dịch Fehling II
Bước 2: Đun sôi 2 phút (kể từ lúc xuất hiện bọt sôi đầu tiên). Sau khi đun sôi, dung
dịch vẫn còn màu xanh đặc trưng và ở dưới có một lớp kết tủa đồng I oxit màu đỏ gạch
là được. Nếu dung dịch mất màu hoàn toàn chứng tỏ lượng dung dịch Fehling cho vào
không đủ để oxi hóa hoàn toàn lượng đường có trong dung dịch mẫu thí nghiệm.
Trường hợp đó phải làm lại thí nghiệm với dung dịch đường ít hơn hoặc pha loãng dung
dịch đường.Ngược lại, nếu không có lớp kết tủa đồng I oxit thì phải tăng lượng dung
dịch đường, giảm nước cất (luôn đảm bảo thể tích là 5ml).
Bước 3: Làm nguội, cho thêm vào hỗn hợp 1ml H 2SO4 25% và 1ml KI 30%, lắc đều
và giữ trong 20 phút.
Bước 4: Chuẩn độ I2 tạo thành bằng Na2S2O3 0,1N. Song song làm thí nghiệm đối
chứng bằng cách thay dung dịch đường bằng nước cất
2.3 Tính kết quả
Hàm lượng đường khử được tính theo công thức sau:

X=
Trong đó:

a: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ đối chứng,
b: hệ số Na2S2O3 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm,
f: hệ số chỉnh nồng độ của Na2S2O3 0,1N
20


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
3,3: hệ số chuyển thành đường
V: tổng thể tích dịch chiết từng gam nguyên liệu (ml)
V1: thể tích thí nghiệm (ml)
W: khối lượng nguyên liệu (g)
100: hệ số chuyển thành %
3. Định lượng đường saccarose theo phương pháp thủy phân bằng acid
Trong nhiều loại rau, củ, quả...các vật phẩm thực phẩm có chứa một lượng khá lớn
saccarose cùng với đường khử.Saccarose không có tính khử nên không thể trực tiếp
xác định bằng phương pháp Bertrand.Để có thể xác định saccarose bằng phương pháp
này phải thủy phân saccarose thành đường khử (glucozo và fructozo).
3.1 Nguyên tắc
Khi thủy phân dung dịch saccarose bằng axit ta được hỗn hợp của hai đường khử
là glucose và fructose.Định lượng đường khử tạo thành cho pháp tính được lượng
saccarose có trong mẫu thí nghiệm.
C12H22O11

+

H2O

(saccarose)

C6H12O6

+ C6H12O6

(glucose)

(fructose)

Hóa chất :
Dung dịch HCl 5%
Dung dịch NaOH 5% hoặc dung dịch Na2CO3 bão hòa
Metyl đỏ 0,02% (0,02g metyl đỏ trong 60ml rượu etylic và 40ml nước cất
Các thuốc thử dùng để xác định đường khử theo phương pháp Bertrand
3.2 Tiến hành
•

Lấy 10ml dung dịch mẫu thí nghiệm (đã loại bỏ protein và chuẩn bị cho xác định
đường khử cho vào bình nón 250ml)

•

Cho thêm 5ml dung dịch HCl 5%
21


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
•

Đun cách thủy hỗn hợp có ống làm lạnh bằng không khí trong 30 – 40 phút, làm
nguội nhanh.

•

Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch Na 2CO3 bão hòa đến pH 6,5 – 7,0 với chỉ thị
metyl đỏ(3 giọt)

•

Thêm từng giọt kiềm cho đến khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng

Xác định lượng đường bằng phương pháp Bertrand
Chú ý: Khi xác định saccarose là các dịch chiết bằng nước có thểkết quả sẽ bị sai
khác, bởi vì có một số polysacarit cao phân tử khác cũng chuyển vào dịch chiết một số
phần hay hoàn toàn.Trong quá trình thủy phân những chất này cũng tạo thành các
monosacarit.Do đó có thể chiết đường bằng cồn sao cho nồng độ của cồn trong dung
dịch đạt 75 – 80%.
3.3 Tính kết quả
Hàm lượng saccarose của mẫu thí nghiệm được tính theo công thức:

X = (a – b). 0,95
Trong đó:
X: hàm lượng saccarose tính theo %
a: hàm lượng đường khử theo glucose của dịch đường sau khi thủy phân bằng
axit (%)
b: hàm lượng đường khửcủa dung dịch đường (trước khi thủy phân) (%)
0,95: hệ số chuyển từ glucose sang saccarose.
4. Phương pháp định lượng saccarose
4.1 Nguyên tắc
Làm trong dung dịch trước khi phân cực để tránh ảnh hưởng của các chất có góc
quay cực khác và loại bỏ các chất màu ảnh hưởng đến kết quả đo. Các chất làm trong
thường sử dụng là: Axetat chì trung tính Pb(CH 3COO)2.3H2O và axetat chì kiềm tính

2Pb(CH3COO)2.Pb(OH)2 ở dạng bột hoặc dung dịch. Axetat chì lắng hàng loạt các chất
như axit oxalic, oxit axit protein, saponin, các chất màu, các chất pectin, các chất màu
melanoidin...
22


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
Chú ý: không dùng quá lượng axetat chì vì một số kết tủa có khả năng hòa tan khi
dư axetat chì như các protein. Nitrat chì là chất làm trong mạnh hơn, đó là một hỗn hợp
gồm hai dung dịch Pb(NO 3)2 và NaOH. 340 g Pb(NO3)2 /1 lit; 32g NaOH/1 lit dùng lượng
bằng nhau (5-10 ml). Khi sử dụng cho nitrat chì trước, NaOH sau.Chú ý: Lượng chì dư
trong dung dịch có thể loại bỏ bằng dung dịch NaH 2PO4 hoặc 1 giọt axit axetic đậm đặc.
Thước đo độ đường: theo quy định thước đo độ đường trong kế chỉ 100°S khi ta hòa
tan 26g đường saccaroza tinh khiết trong 100 ml nước cất và phân cực trong ống 200
mm ở 20°C. 26 g gọi là lượng cân tiêu chuẩn, 200 mm là ống phân cực tiêu chuẩn. Khi
cân mẫu với lượng cân chuẩn và phân cực kế bằng ống tiêu chuẩn, số chỉ trên thước
đo cho ta biết % đường trong mẫu.Trong thực tế phân tích ta có thể lấy bội số hoặc ước
số của chúng. Ví dụ nếu lấy13g pha trong 100ml phân cực trong ống 200 mm thì thành
phần đường sẽ là P×2.
Trong đó: P – số đọc trên máy. Hoặc pha 26g trong mẫu 100 ml phân cực bằng ống
100 mm thì thành phần đường cũng bằng P×2.



Hóa chất

Dung dịch axetat chì trung tính 250g Pb(CH 3COO)2.3H2O + 50 ml nước cất, khuấy
đều, lọc. Nước lọc trung hòa bằng axit yếu.Pha nước cất đến khấc 1 lít. Dung dịch
axetat chì kiềm tính: 100g oxit chì (PbO)+ 230g axit chì trung tính +50 ml nước cất. Đun
sôi trong ½ giờ để thủy phân oxit. Để nguội, lọc, pha bằng nước cất đến 1 lit (54Bx).

Dung dịch nitrat chì: 340 g Pb(NO3)2 trong 1 lit; 32g NaOH trong 1 lit
HCl 24,85 Bx: 510,57 ml HCl đậm đặc trong 1 lít
NaCl: 231,5 g NaCl trong 1 lít
Than hoạt tính 5g/100ml, axit axetic đậm đặc, Ete etylic, bột kẽm,
4.2 Tiến hành: Xác định hàm lượng saccaroza trong đường kính
Cân 26 g đường bằng cân phân tích vào 1 cốc khô có miệng rót (đã cân trọng
lượng cốc). Hòa tan đường trong cốc bằng khoảng 40 – 50 ml nước cất đã đun nóng
dùng đũa thủy tinh khuấy cho đường tan hết.
Rót toàn bộ dung dịch đường sang bình định mức, rửa sạch đường trong cốc, que
thủy tinh và phễu bằng một ít nước cất, chuyển tất cả vào bình định mức.
Thêm nước cất đến gần vạch định mức, để yên khoảng15-20 phút cho nhiệt độ
dung dịch đường gần bằng nhiệt độ trong phòng.
23


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
Thêm nước cất đến vạch bình định mức, đậy nút bình lắc đều, để yên 1-2 phút rồi
lọc.Khi lọc nhớ đậy phễu, lọc bằng kính thủy tinh để tránh nước bay hơi làm thay đổi
nồng độ. Mẻ lọc đầu đổ đi.Nước lọc phải trong suốt.Rót dung dịch vào ống phân cự 200
mm; nhớ tráng ống bằng dung dịch nước lọc 1-2 lần và rót bằng cách đẩy nhẹ trên
miệng ống để tránh tạo bọt.
Đậy nắp ống phân cực bằng nắp thủy tinh bằng cách đẩy nhẹ nắp trên miệng
ống.Giữ yên rồi vặn nút cao su vào miệng ống.
Lau khô hai đầu ống bằng một miếng giấy lọc.
Đưa ống ra ánh sáng quan sát, ống phải được nhìn thông suốt và không có bọt, nếu
có bắt buộc phải làm lại Đặt ống phân cực vào máy, bật điện và bắt đầu đo.Ghi kết quả
và ghi nhiệt độ t.
4.3 Tính kết quả
Hàm lượng đường saccaroza tính theo %; X

X = Pt [1 + 0,0003 (t – 20)]
Trong đó:
Pt : hàm lượng đường đọc được trên máy ;
t : nhiệt độ
5. Định lượng fructose trong dung dịch có lẫn đường khử khác
Muốn biết riêng hàm lượng của glucose và fructose, người ta phải định lượng
fructose.Nếu hàm lượng các đường khử khác không đáng kể thì hàm lượng glucose
bằng hiệu hàm lượng đường khử và hàm lượng fructose.Trước hết phải xác định lượng
đường khử tổng số, sau đó mới xác định lượng fructose.
5.1 Nguyên tắc
Đầu tiên oxi hóa glucose và các đường khử khác bằng dung dịch kiềm của iôt
CH2OH(CHOH)4CHO+ I2 + 3NaOH = CH2OH(CHOH)4COONa + 2NaI + H2O
Trong điều kiện này, fructose không bị oxi hóa. Sau đó xác định fructose bằng phương
pháp Bertrand hoặc phương pháp vi lượng.
24


Các Phương Pháp Phân Tích Hóa Sinh Trong Thực Phẩm
•

Hóa chất

Dung dịch iot 0,2N trong KI, dung dịch NaOH 0,2N, dung dịch NaOH 5%, dung dịch
H2SO4
5%, dung dịch Na 2SO3
5%, dung dịch methyl 0,02% (0,02g metyl
đỏ(C15H15N3O2) 60 ml cồn, 40 ml nước)
Các thuốc thử dùng để xác định đường khử
5.2 Tiến hành
Cho vào bình nón 250ml 20ml dung dịch thí nghiệm (chứa không quá 20 mg

glucose. Trung hòa đến pH 6,5 – 7,0. Cho thêm 5ml dung dịch iot 0,2N và 2,5ml dung
dịch NaOH 0,2N (thêm từng giọt).Giữ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Axit hóa dung dịch bằng 2ml H 2SO4 5% và loại iot dư bằng dung dịch Na 2SO35%
(nhỏ từng giọt cho đến khi dung dịch mất màu vàng rơm).
Thêm vài giọt metyl đỏ và trung hòa hỗn hợp bằng NaOH 5%.Thể tích dung dịch
thu được là Vđo. Dịch thu được chỉ chứa fructose. Phân tích fructose theo phương pháp
Bertrand hoặc theo phương pháp vi lượng.
5.3 Tính kết quả
Nếu fructose được xác định theo phương pháp vi lượng thì hàm lượng đường được
xác định theo công thức sau:

X = . 100 (%)
Trong đó:
a - số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn đội đối chứng,
b - hệ số Na2S2O3 0,1N chuẩn độ mẫu thí nghiệm,
f - hệ số chỉnh nồng độ của Na2S2O3 0,1N
3,3 - hệ số chuyển thành đường
V – tổng thể tích dịch chiết từm gam nguyên liệu (ml)
20 – lượng dung dịch thí nghiệm loại các đường khử khác (trừ fructose)
V1– thể tích thí nghiệm (ml)
25