Nhân Dòng, Biểu Hiện, Tinh Sạch Và Xác Định Hoạt Tính Của Protein Pwo Dna Polymerase Tái Tổ Hợp
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.46 MB, 62 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Nguyễn Thị Thu Huyền
NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH
CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HÀ NỘI - 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Nguyễn Thị Thu Huyền
NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH
CỦA PROTEIN PWO DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 8420101.21
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Lê Thọ Sơn
TS. Hoàng Thị Mỹ Hạnh
Hà Nội - 2019
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
LỜI CẢM ƠN
Khoảng thời gian học tập và nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học - Trường Đại
học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN là hành trang quý báu giúp em trưởng thành và có
ích hơn trong cuộc sống.
Lời đầu tiên em xin được cảm ơn các thầy cô của bộ môn Di truyền học đã cùng
với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt những kiến thức chuyên môn cho
chúng em. Thầy cô luôn quan tâm để cho chúng em có một môi trường học tập toàn
diện và gần gũi nhất. Em sẽ coi bộ môn Di truyền như ngôi nhà thứ hai của mình.
Tiếp theo, em xin được cảm ơn hai thầy cô TS. Lê Thọ Sơn và TS. Hoàng Thị
Mỹ Hạnh đã đồng ý hướng dẫn cho em trong luận văn tốt nghiệp này. Thầy cô không
chỉ động viên em trong quá trình học tập mà còn cho em rất nhiều lời khuyên trong
cuộc sống.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn trìu mến tới gia đình và bạn bè, những người luôn
tin tưởng, hỗ trợ và dìu dắt em trong suốt thời gian qua. Đặc biệt là bố, mẹ những
người luôn hy sinh thầm lặng cho cuộc sống của em.
Sau cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Văn Sáng.
Thầy đã cho em có cơ hội hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Thầy luôn là động lực
để em phát triển cũng như cố gắng hơn mỗi ngày.
Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc
gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN.02-2016.58.
Nghiên cứu có sự hợp tác và hỗ trợ cung cấp trình tự gen mã hóa bới Công ty
TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa.
Hà Nội, tháng 12 năm 2019
Học viên
Nguyễn Thị Thu Huyền
i
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................................v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................vi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... vii
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................1
1.1. Khái quát DNA polymerase .................................................................................1
1.1.1. Phân loại DNA polymerase ...........................................................................1
1.1.2. Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase ...............................................1
1.1.3. Quá trình sao chép DNA ...............................................................................2
1.2. Ứng dụng của DNA polymerase ..........................................................................3
1.2.1. Kỹ thuật giải trình tự .....................................................................................4
1.2.2. Kỹ thuật PCR .................................................................................................5
1.3. Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase ......................................................6
1.3.1. Phân loại nguồn gốc ......................................................................................6
1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ............................... 7
1.3.3. Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR .....................8
1.4. Công nghệ protein tái tổ hợp ..............................................................................10
1.4.1. Tổng hợp gen, tối ưu mã codon ...................................................................10
1.4.2. Nhân dòng gen đích vào vector mong muốn ...............................................11
1.4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp .........................................................................12
1.4.4. Các phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp .............................................16
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .........................................................19
2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 19
2.1.1. Nguyên vật liệu............................................................................................ 19
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................19
2.1.3. Hóa chất và môi trường ...............................................................................19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................21
2.2.1. Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase .......................................21
ii
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
2.2.2. Nhân dòng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase ...............22
2.2.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở E. coli .....................................27
2.2.4. Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase ....................................................27
2.2.5. Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase ............................... 30
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 33
3.1. Phân tích gen mã hóa Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ....................................33
3.2. Nhân dòng vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase ............................. 34
3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo .................................................................34
3.2.2. Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)...35
3.2.3. Tách plasmid, kiểm tra trình tự ...................................................................36
3.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli.............................. 38
3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase ...........................................38
3.4.1. Phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực nickel.................................................39
3.4.2. Phương pháp tinh sạch kết tủa bằng muối ammonium sulfate ....................43
3.5. Xác định hoạt tính của protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase ......................44
3.5.1. Tối ưu thành phần buffer PCR ....................................................................44
3.5.2. Hoạt tính sao chép .......................................................................................45
3.5.3. Khả năng chịu nhiệt độ cao .........................................................................47
3.5.4. Hoạt tính khi có mặt chất ức chế .................................................................47
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 50
iii
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
DANH MỤC HÌNH
Hình 1: Sự đa dạng trong cấu trúc của một số loại DNA polymerase ............................2
Hình 2: Thành phần phức hệ sao chép DNA (replisome) ở vi khuẩn Cổ .......................3
Hình 3: Cây phát sinh của nhóm vi khuẩn Cổ chịu nhiệt ................................................6
Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho một DNA polymerase ....................................8
Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước tổng hợp gen bằng phương pháp POS ....................10
Hình 6: Thiết kế mồi nhân dòng gen mã hóa protein Pwo-pol .....................................12
Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli ......................................15
Hình 8: Sơ đồ mô tả quá trình nhân dòng vector tái tổ hợp pEtM-Pwo ........................22
Hình 9: Sơ đồ quá trình tinh sạch protein Pwo-pol .......................................................27
Hình 10: Khuếch đại gen mã hóa Pwo-pol và xử lý enzyme cắt giới hạn ....................34
Hình 11: Biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo ..........................35
Hình 12: Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp ......................................................36
Hình 13: So sánh trình tự amino acid của gen mã hóa Pwo DNA polymerase.............37
Hình 14: Biểu hiện protein DNA polymerase ở E. coli ................................................38
Hình 15: So sánh sự phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao .....................................................39
Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sạch sắc ký ái lực ........................................40
Hình 17: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC ...................................41
Hình 18: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC ...................................42
Hình 19: Tinh sạch bằng kết tủa muối AS bão hòa ở 4oC .............................................43
Hình 20: Ảnh hưởng của pH đến sự ổn định của buffer PCR .......................................44
Hình 21: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến khả năng khuếch đại đoạn gen ngắn ........45
Hình 22: Hoạt tính sao chép của Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh sạch ............................... 46
Hình 23: Phản ứng của enzyme và protein tái tổ hợp ở nhiệt độ biến tính 98oC ..........47
Hình 24: Hoạt tính của các proein Pwo-pol trong phản ứng sử dụng khuôn genome ..48
iv
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự ...........................................4
Bảng 2: Đặc tính của một số enzyme DNA polymerase bền nhiệt .................................5
Bảng 3: Các chủng E. coli phổ biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp ...........................13
Bảng 4: Vị trí các đặc điểm của vector biểu hiện pEtM................................................16
Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock .................................................................20
Bảng 6: Trình tự cặp mồi nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA .......................................22
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR nhân dòng gen mã hóa Pwo-pol ..........................23
Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt, nối gen và plasmid.................................................24
Bảng 9: Trình tự các cặp mồi giải trình tự ....................................................................26
Bảng 10: Thành phần hóa chất đổ gel điện di SDS-PAGE ...........................................30
Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen AcrH ....................30
Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen KOD .....................31
Bảng 13: Thành phần buffer bảo quản protein Pwo-pol ...............................................32
Bảng 14: Thành phần 10X buffer PCR tối ưu hoạt tính của protein Pwo-pol ..............32
Bảng 15: Phân tích sử dụng codon của gen mã hóa Pwo DNA polymerase .................33
v
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Tên đầy đủ
aa
Acid amin
APS
Ammonium persulfate
bp
Base pair
BSA
Bovine serum albumin
CAI
Codon adaptation index
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
Deoxynucleoside triphosphate
DTT
Dithiothreitol
E. coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylene Diamine Tetracetic Acid
His
Histidine
IMAC
Immobilized metal affinity chromatography
IPTG
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
kb
Kilo base
kDa
Kilo dalton
Kod-pol
T. kodakarensis DNA polymerase
LB
Luria-Bertani
NTA
Nitrilotriacetic acid
PAGE
Polyacrylamide gel electrophoresis
PCR
Polymerase Chain Reaction
Pfu-pol
P. furiosus DNA polymerase
Pwo-pol
P. woesei DNA polymerase
RNA
Ribonucleic acid
SDS
Sodium dodecyl sulfate
Taq-pol
T. aquaticus DNA polymerase
TEMED
Tetramethylethylenediamine
vi
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
MỞ ĐẦU
Enzyme DNA polymerase là một trong những enzyme quan trọng được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: (1) trong sinh học phân tử, nhằm nghiên cứu
gen và hệ gen; (2) trong y học, để chẩn đoán và phát hiện các bệnh di truyền, tầm soát
ung thư; (3) trong nông nghiệp, như xác định các tác nhân gây bệnh cho cây trồng vật
nuôi, thực vật biến đổi gen; (4) trong khoa học hình sự, để nhận diện các dấu chuẩn di
truyền. Mặc dù có vai trò quan trọng, nhưng ở Việt Nam việc tự sản xuất enzyme
DNA polymerase vẫn gặp nhiều khó khăn về mặt quy trình và đánh giá chất lượng.
Các nghiên cứu nếu có đến nay, hầu hết là quy trình tối ưu cho dòng enzyme DNA
polymerase thế hệ cũ với hoạt tính kém bền, kém ổn định. Do vậy, nguồn enzyme
DNA polymerase thế hệ mới sử dụng cho các mục đích phát triển khoa học công nghệ
ở Việt Nam đã và đang phải nhập từ nước ngoài. Quá trình nhập khẩu thường kèm
theo nhiều vấn đề không mong muốn cho người sử dụng như (1) thời gian vận chuyển
kéo dài từ một đến vài tháng làm chậm tiến độ của đề tài, dự án; (2) chất lượng của
enzyme bị ảnh hưởng do điều kiện bảo quản không đảm bảo trong thời gian dài; (3)
bởi các yếu tố rủi ro mà giá thành mua enzyme từ các công ty hóa chất là rất đắt đỏ.
Hiện nay, các công ty công nghệ sinh học của Việt Nam đang rất cần nguồn enzyme
được sản xuất trong nước với chất lượng tốt, tương đương với quốc tế nhưng có giá
thành rẻ hơn, thời gian cung cấp nhanh hơn để làm nguyên liệu đầu vào cho việc phát
triển các loại kit khác nhau. Do vậy cần thiết phải xây dựng được quy trình sản xuất
enzyme DNA polymerase có chất lượng tốt tại các cơ sở nghiên cứu trong nước. Việc
sản xuất enzyme trong nước sẽ giúp chủ động được nguồn nguyên liệu, giảm giá thành
và các chi phí vận chuyển khi phải nhập enzyme từ nước ngoài, tạo động lực cho sự
phát triển của các công ty công nghệ sinh học của Việt Nam.
Pwo-pol là enzyme có hoạt động ổn định nhất với các chuỗi DNA kích thước
dưới 3 kb. Hiện nay trên thị trường, enzyme này đang được thương mại hóa bởi một số
hãng như Roche (Sigma), Genaxis và peQlab (Avantor) tuy nhiên quy trình sản xuất
lại không được công bố. Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein Pwo DNA
polymerase tái tổ hợp ở E. coli”. Mục đích của nghiên cứu nhằm góp phần đánh giá
chính xác hiệu quả sử dụng enzyme Pwo-pol ở quy mô phòng thí nghiệm đồng thời
vii
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
định hướng cải tiến hiệu quả enzyme trong ứng dụng ở Việt Nam. Nghiên cứu được
thực hiện dựa trên các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Thiết kế tối ưu mã bộ ba cho gen mã hóa Pwo DNA polymerase sử dụng công cụ tin
sinh.
2. Tổng hợp và nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA polymerase, tạo vector tái tổ hợp
pEtM-Pwo.
3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli BL21 (DE3).
4. Tinh sạch protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp.
5. Xác định hoạt tính của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp tinh sạch được.
viii
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát DNA polymerase
DNA polymerase là thành phần trung tâm tổng hợp nên các chuỗi DNA bổ
sung theo khuôn mẫu trong tế bào sống [7]. Ngoài những vai trò cơ bản nhằm duy
trì tính toàn vẹn của bộ gen bởi quá trình sao chép và sửa chữa, DNA polymerase
còn được sử dụng rộng rãi trong in vitro. Vì vậy, nhiều enzyme DNA polymerase đã
được phân lập để xác định cấu trúc và chức năng của chúng.
1.1.1. Phân loại DNA polymerase
DNA polymerase thể hiện sự đa dạng cả trong cấu trúc và chức năng ở các
sinh vật khác nhau. Vào những năm 1950, nhà khoa học Arthur Kornberg và cộng
sự đã tìm thấy DNA polymerase (pol) I, đầu tiên ở vi khuẩn E. coli. Các nhà nghiên
cứu sau đó tiếp tục phát hiện thêm nhiều loại DNA pol thuộc các loài khác nhau
cung cấp cho khoa học [25].
Theo phân loại dựa trên so sánh trình tự amino acid và mối quan hệ di
truyền, các DNA pol được chia thành 7 họ lần lượt A, B, C, D, X, Y, RT. Họ
polymerase A bao gồm Klenow Fragments của Escherichia coli và DNA
polymerase I của Bacillus, Thermus aquaticus DNA polymerase, và T7 RNA –
DNA polymerases. Họ polymerase B phụ thuộc DNA bao gồm các DNA
polymerase của phage T4, và RB69. Họ polymerase C (như DNA pol III của E.
coli), họ polymerase D (như DNA pol II của Euryarchaeotic), họ polymerase X
(như DNA pol β của người), họ polymerase Y (như DNA pol IV, V của E. coli), họ
polymerase RT.
Mặt khác, dựa trên đặc điểm riêng của mỗi loại DNA polymerase có thể
phân chúng thành các loại có đặc tính (1) sao chép (replicative) như pol α, γ; (2) sửa
chữa (repairing) như pol β; (3) đọc sửa (proofreading) chiều 5’ – 3’ như pol δ, ε
[44]. Cụ thể, các DNA-pol có khả năng sao chép từ sinh vật nhân thực được tìm
thấy trong họ polymerse B (pol α); từ vi khuẩn được tìm thấy trong họ polymerase
A (pol I) và C (pol III); và với vi khuẩn Cổ chúng thuộc họ polymerase B và D [2].
1.1.2. Cấu trúc và chức năng của DNA polymerase
Hiện nay, các nghiên cứu đã xác định được nhiều cấu trúc của DNA
polymerase. Một số DNA pol đại diện ở hình 1 cho thấy sự đa dạng nhưng vẫn duy
trì tính bảo thủ cao về mặt cấu trúc trong quá trình thực hiện chức năng của chúng.
1
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
Hình 1: Sự đa dạng trong cấu trúc của một số loại DNA polymerase
Được so sánh bởi Steitz và cộng sự, 1999 [39] a. Taq DNA polymerase liên kết DNA; b.
Cấu trúc bậc hai của HIV-RT và DNA; c. Mô hình DNA liên kết với RB69 gp43; d. Phức
hợp cấu trúc bậc 3 pol β của chuột với DNA và dideoxy-NTP. Các màu khác nhau biểu
diễn các miền khác nhau tương ứng trên cả 4 cấu trúc: Miền “thumb” chuỗi màu xanh lá,
miền “palm” chuỗi màu đỏ, miễn “finger” chuỗi màu xanh dương, chuỗi màu vàng là vị trí
liên kết DNA, và chỉ duy nhất trong cấu trúc pol β của chuột có chứa miền màu tím có khả
năng đọc sửa trong quá trình sao chép DNA.
Theo quan sát tổng thể, các DNA polymerase có hình dạng giống cấu trúc
bàn tay phải, bao gồm các miền “thumb,” “palm,” and “fingers”. Miền palm có
chức năng xúc tác phản ứng chuyển hóa phosphoryl. Trong khi đó, miền finger đảm
nhận các tương tác quan trọng với các nucleoside triphosphate của mạch khuôn
DNA. Miền thumb đóng vai trò xác định vị trí DNA xoắn kép, thúc đẩy quá trình
dịch chuyển và gắn nucleotide của DNA polymerase (processivity). Nghiên cứu của
Kim và cộng sự, 2008 đã so sánh sự tương đồng trong cấu trúc của Pfu DNA
polymerase với KOD1 DNA polymerase (polB). Ngoài 3 thành phần quan trọng là
các miền “fingers, palm, thumb” các DNA polymerase này còn có vùng
exonuclease và N-terminal là những vùng có ý nghĩa quan trọng cho ứng dụng công
nghệ sinh học [23].
1.1.3. Quá trình sao chép DNA
Quá trình sao chép DNA là sự kiện quan trọng diễn ra trong mỗi chu kỳ của
tế bào [37] có sự tham gia của một bộ máy sao chép. Trong đó, các thành phần
chính đã biết có sự tương tác với nhau và với các protein khác (hình 2).
2
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
Hình 2: Thành phần phức hệ sao chép DNA (replisome) ở vi khuẩn Cổ
Nghiên cứu bởi Li và cộng sự [27], 2010 đã tinh sạch các protein này bằng phương pháp
dung hợp đuôi 6xHis-tag và tinh sạch sắc ký ái lực ở Thermococcus kodakarensis. Trong
đó, leading strand: mạch tổng hợp liên tục; lagging strand: mạch tổng hợp gián đoạn. Các
thành phần của phức hệ này bao gồm enzyme DNA polymerase PolB, polD liên kết kháng
nguyên nhân tế bào tăng sinh (PCNA) tổng hợp nên các đoạn DNA mới; enzyme DNA
ligase cũng liên kết với PCNA nối các đoạn tổng hợp ngược chiều tháo xoắn; còn enzyme
Fen I liên kết PCNA sửa chữa trình tự tổng hợp; với sự trợ giúp của các enzyme MCM
phức hệ protein duy trì liên kết với enzyme tháo xoắn helicase; GINS: liên kết trực tiếp với
MCM-helicase và primase enzyme tổng hợp đoạn RNA ngắn; RPA: protein ngăn chặn sự
đóng xoắn trở lại của sợi đơn).
Nhìn chung, các phức hệ sao chép DNA được duy trì khả năng hoạt động
dựa trên những nguyên tắc chung ở cả ba giới vi khuẩn thông thường (bacteria), vi
khuẩn Cổ (archaea), và sinh vật nhân thực (eukaryotes). Trong số các sinh vật nhân
sơ, bộ máy sao chép của vi khuẩn Cổ được xem là ít phức tạp hơn nhưng lại gần gũi
với sinh vật nhân chuẩn hơn so với các loại vi khuẩn thông thường. Thành phần
chính được mô tả và có chức năng giống nhau giữa chúng là các DNA polymerase
như pol α tương ứng polB hoặc polD; pol δ, ε tương ứng với enzyme Fen I.
1.2. Ứng dụng của DNA polymerase
Hai kỹ thuật PCR và giải trình tự là những kỹ thuật cốt lõi trong nghiên cứu
di truyền học. Đặc biệt được ứng dụng trong các lĩnh vực khoa học và sự sống như:
(1) trong Sinh học: bảo tồn sự đa dạng động thực vật, bảo tồn nguồn gen quý; (2)
trong y học: phân tích đánh giá khả năng mắc các bệnh di truyền; (3) trong khoa học
pháp y: nhận biết các dấu chuẩn di truyền (STR), các đoạn lặp, tìm kiếm đa hình;
(4) trong nông nghiệp: tạo giống cây trồng vật nuôi có hiệu quả kinh tế; (5) trong vi
sinh vật với môi trường: nghiên cứu khả năng tiến hóa, mức độ lây lan ảnh hưởng
tới con người và các sinh vật khác. DNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong
cả hai kỹ thuật trên. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của các công ty công nghệ
3
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
sinh học, đã đặt ra những thách thức trong quá trình sản xuất enzyme DNA
polymerase có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu nghiên cứu và ứng dụng.
1.2.1. Kỹ thuật giải trình tự
Giải trình tự DNA/RNA là một ứng dụng quan trọng trong sinh học của
DNA polymerase. Phương pháp giải trình tự bằng enzyme đã được Frederick
Sanger tiến hành vào năm 1975 bằng cách sử dụng sự kết thúc chuỗi [36]. Từ đó,
việc giải trình tự DNA/RNA trở thành thông lệ trong các nghiên cứu sinh học phân
tử. Các công nghệ giải trình tự thế hệ kế tiếp (NGS) đã được phát triển và liên tục
cải tiến từ năm 2005 đến nay.
Bảng 1: Phân loại DNA polymerase ứng dụng giải trình tự
Được tổng hợp bởi Chen-Yao, 2014 [5]
Họ
A
Bacteria
(E. coli)
Pol I
Eukaryote (Human)
Archaea
Viruses
Enzyme
Pol γ (p140/p55/p55)
N.A.
T3, T5, T7
Klenow, KlenTaq, Taq
Pol θ (p100/p90/p80)
Bst, Bsu, T7
Pol ν
B
Pol II
Pol α/primase
Pol BI
HSV-1
T4, Ф29, 9 N, KOD1
(p180/p68/pri2/pri1)
Pol BII
RB69, T4
Pfu, Vent
Pol δ (p125/p66/p50/p12)
Pol BIII
Ф29
N.A
N.A.
N.A.
N.A.
N.A.
Pol D
N.A.
N.A.
Pol ε (p260/p59/p17/p12)
Pol ζ (p350/p24)
C
D
Pol III
core
(α/ε/θ)
*N.A.
DP2/DP1
N.A.: không có
DNA polymerase là thành phần khác biệt trong việc cải tiến các công nghệ
giải trình tự. Ban đầu, giải trình tự Sanger sử dụng enzyme Klenow (một phần phân
tách DNA-pol I của E. coli) để kết hợp hiệu quả với 2 ′, 3′-dideoxynucleotide
(ddNTPs) dẫn đến chấm dứt chuỗi tổng hợp DNA (Atkinson và cộng sự, 1969).
Tiếp theo với sự cải tiến hóa học, các chất nền nucleotide được sử dụng để giải trình
tự DNA trở nên lớn hơn và cồng kềnh hơn, enzyme Klenow ban đầu không còn kết
hợp hiệu quả các cơ chất mới [5]. Thay vào đó, sự đa dạng của DNA polymerase
được sử dụng và thiết kế riêng cho các công nghệ giải trình tự tiếp theo. Hiện nay,
các polymerase bền nhiệt họ polA, pol B đã và đang được cải biến, thử nghiệm trên
các thiết bị điện di mao quản (CE) và NGS.
4
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
1.2.2. Kỹ thuật PCR
Kỹ thuật nhân bản gen bằng phương pháp PCR là ứng dụng tiềm năng nhất
của các DNA polymerase bền nhiệt (bảng 2) được phát triển bởi Kary Mullis và
cộng sự, 1986 [20]. Như phân loại ở trên, DNA-pol thể hiện sự đa dạng rất cao về
chủng loại cũng như đặc tính của chúng. Hiện nay, khoảng hơn 50 loại khác nhau
của nhóm DNA-polB bền nhiệt đã được phân lập và xác định hoạt tính [31].
Bảng 2: Đặc tính của một số enzyme DNA polymerase bền nhiệt
Được tổng hợp bởi Kay Terpe, 2013 [40]
Tên loài
Crenarchaeota
Sulfolobus
solfataricus
Euryarchaeota
Pyrococcus
furiosus
Pyrococcus GB-D
Pyrococcus
abyssi
Pyrococcus
woesei
Thermococcus
kodakarensis
Thermococcus
litoralis
Thermococcus
gorganarius
Bacteria
Thermus
aquaticus
Thermus
brokianus
Thermus
caldophilus
DNA-pol
Họ
Chịu nhiệt
Tỉ lệ sai sót
Kéo dài
(kb/phút)
Đọc
sửa
Đầu thò
Dpo4
Y
NP
8x10-3 –
3x10-4
NP
_
NP
Pfu
B
95oC/1h
0.5 – 1.5
+
Bằng
Deep Vent
B
95oC/23h
1.4
+
95% bằng
Isis
B
100oC/5h
NP
+
Bằng
Pwo
B
100oC/2h
NP
NP
+
Bằng
KOD1
B
95oC/12h
2.6 (x10-6)
6.0-7.8
+
Bằng
Vent
B
95oC/6.7h
1.0
+
95% bằng
Tgo
B
95oC/2h
1.5
+
Bằng
Taq
A
95oC/40’
1.8x10-4 –
8.0x10-6
1.0 – 4.8
_
95% 3'A
Tbr
A
96oC/150’
NP
NP
_
3'A
Tca
A
95oC/70’
NP
1.0-2.3
_
3'A
2.2 – 0.7
(x10-6)
12 – 2.7
(x10-6)
6.7 – 0.6
(x10-6)
45 – 2.8
(x10-6)
5.6 – 3.5
(x10-6)
NP: Chưa công bố
DNA-polB hay còn được gọi là enzyme DNA polymerase thế hệ mới có đặc
tính đọc sửa 3’ – 5’ exonuclease giúp quá trình nhân bản DNA diễn ra chính xác
hơn khi so sánh với Taq-pol (thế hệ enzyme bền nhiệt đầu tiên, có nguồn gốc từ
Thermus aquaticus).
Các nhà nghiên cứu đã nhận ra rằng các loại DNA-polB của vi khuẩn Cổ đã
giải quyết vô số vấn đề gặp phải với Taq-pol như (1) dễ mắc lỗi sao chép khi nhân
những đoạn DNA lớn; (2) hạn chế kích thước đoạn DNA nhân lên được; (3) hiệu
suất PCR giảm do sự bắt cặp không khớp của mồi; (4) sự kết hợp không theo khuôn
mẫu của dAMP khi kết thúc tái bản, một nu A luôn được duy trì ở đầu của mỗi sản
5
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
phẩm PCR. Bên cạnh đó, các nghiên cứu động học tiết lộ rằng độ chính xác cao của
các loại DNA-polB phụ thuộc rất nhiều vào sự kết hợp nucleotide chính xác cùng
với khả năng đọc sửa exonucleoytic. Do đó, DNA-polB của vi khuẩn Cổ đã được
phát triển để tự xúc tác các phản ứng PCR với hiệu quả cao ngay cả khi có mặt của
chất ức chế. Đồng thời, các loại DNA-polB của vi khuẩn Cổ thường có độ sai sót
thấp (khả năng đọc sửa 3’-5’ proofreading) nên được ứng dụng chính trong gây đột
biến trực tiếp.
So sánh các DNA-pol từ Thermococcus và Pyrococcus có tỷ lệ lỗi trung bình
thấp khoảng 10-6 (bảng 2). Trong đó, KOD1-pol có hiệu suất PCR tốt hơn về các
tiêu chí như (1) kéo dài và tổng hợp sợi DNA nhanh hơn (extension rate); (2) hoạt
động xúc tác hiệu quả hơn (higher processivity); (3) thể hiện hiệu suất vượt trội
trong cả hai loại phản ứng PCR thông thường và real time PCR. Tuy nhiên, chi phí
sản xuất hoặc sử dụng enzyme này thường rất cao. Vì vậy Pwo-Pol của vi khuẩn
thuộc chi Pyrococcus được sử dụng phổ biến hơn bởi độ bền cao, và cũng có độ
chính xác tương đương KOD1-pol.
1.3. Tình hình nghiên cứu Pwo DNA polymerase
1.3.1. Phân loại nguồn gốc
Pwo DNA polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ Pyrococcus woesei
thuộc chi Pyrococcus được mô tả bởi Zillig và cộng sự, 1987 [46]. P. woesei là một
trong những vi sinh vật ái cực đoan (extremophile) có khả năng sinh trưởng và phát
triển trong những điều kiện khắc nghiệt nhất với nhiệt độ khoảng từ 95-103oC.
Thermococcales
Hình 3: Cây phát sinh của nhóm vi khuẩn Cổ chịu nhiệt
Được xây dưng dựa trên trình tự gen 16S rRNA bằng phần mềm MEGA-7, chỉ ra 2 nhóm
ngành chính: Crenarchaeota (nhánh màu đỏ) và Euryarchaeota (nhánh màu xanh) tách
biệt với vi khuẩn suối nước nóng T. aquaticus. Trong đó, nhóm ngành Crenarchaeota bao
gồm hầu hết các loài được phân lập có khả năng chịu nhiệt cao trên 80oC [8].
6
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
Hệ gen của P. woesei có sự tương đồng với các loài khác thuộc chi
Pyrococcus (hình 3). Theo thống kê, các trình tự của P. woesei đã công bố trên ngân
hàng gen (28857 bp) bao gồm 22 gen đơn lẻ và 1 cụm ba gen (X59857). Khi so
sánh các trình tự này với các loài trong chi Pyrococcus thấy tỉ lệ tương đồng cao,
giống đến 99% với các gen tương ứng của P. furiosus.
Một nghiên cứu khác đã tiến hành phân tích microarray DNA kết hợp PCR
trên tổng số 2065 khung đọc mở (ORF) của P. woesei. Kết quả đem so sánh với hệ
gen của P. furiosus cho thấy 105 ORF tương đồng bị thiếu trên hệ gen của P.
woesei. Các cụm gen thiếu này bao gồm một cụm (Mal I, PF1737 - PF1751) liên
quan đến chuyển hóa maltose và một cụm khác (PF0691 - PF0695) giúp loại bỏ các
loại nitơ trong phản ứng độc hại. So sánh với các loài khác trong cùng chi
Pyrococcus là P. horikoshii và P. abyssi, độ tương đồng khoảng 75%, do chúng
không có gen mã hóa amylase cũng như không có các yếu tố IS [19, 34].
1.3.2. Nghiên cứu biểu hiện Pwo DNA polymerase tái tổ hợp
Pwo DNA polymerase là một trong những enzyme bền nhiệt đã được nghiên
cứu biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn E. coli. Các công bố này chỉ ra, Pwo-pol
tái tổ hợp có khả năng gây độc đối với tế bào biểu hiện E. coli BL21 (DE3). Để
khắc phục vấn đề này, quá trình tối ưu biểu hiện Pwo-pol đã được tiến hành trên
trên tế bào vật chủ E. coli BL21 (DE3) plysS [6, 12]. Tuy nhiên, tất cả các nghiên
cứu đều chưa có đánh giá nhiều về đặc tính của protein tái tổ hợp này (bảng 2).
Pwo DNA polymease tự nhiên mang nhiều đặc tính nổi trội của nhóm
enzyme bền nhiệt. Do đó, việc phân tích các đặc tính của protein Pwo-pol ở trong tự
nhiên sẽ giúp đánh giá chính xác hoạt tính của protien Pwo-pol tái tổ hợp trong
nghiên cứu.
Tương tự các DNA polymerae khác Pwo-pol cần một co-factor là các ion
Mg2+ hoặc Mn2+ để có thể xúc tác trong suốt quá trình. Lượng ion Mg2+ hoặc Mn2+
sẽ bị mất đi nếu enzyme bị ức chế hoặc bất hoạt trong giai đoạn diễn ra phản ứng
bởi các chất gây ức chế như phospholipit, EDTA, phenol… Một phản ứng PCR với
xúc tác enzyme Pwo-pol có thể được tối ưu từ 1 – 10 mM MgSO4, 100 – 300 µM
dNTP mỗi loại [1].
7
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
1.3.3. Các đặc tính quan trọng của DNA polymerase dùng cho PCR
Khả năng bền nhiệt (Thermostability): đây là một trong những yếu tố cần
thiết cho phản ứng khuếch đại DNA. Trong mỗi chu kỳ đều có bước biến tính làm
tách mạch DNA bằng nhiệt độ cao (từ 94-98oC). Tính chất bền nhiệt của DNA
polymerase phụ thuộc vào thời gian half-life của nó tại nhiệt độ cao nhất định. Cụ
thể Pwo-pol có thời gian half-life lên đến 2h tại 100oC [6]. Thời gian bền nhiệt cũng
phụ thuộc vào nồng độ protein hoặc một số điều kiện khác như các chất tẩy rửa
(DTT, Tween 20), betaine (BSA) và đường. Chưa có nhiều chứng minh độ pH hay
nồng độ muối ảnh hưởng đến tính bền nhiệt của ezyme DNA polymerase.
Tốc độ kéo dài chuỗi (Extension rate): đại diện cho số lượng dNTPs trùng
hợp mỗi giây trên mỗi phân tử DNA polymerase. Tốc độ kéo dài chuỗi DNA phụ
thuộc mạnh mẽ vào môi trường phản ứng và khuôn mẫu DNA. Một số phân tử
DNA có trình tự giàu GC, thậm chí có thể hình thành các cấu trúc ngăn chặn sự kéo
dài mồi. Tốc độ kéo dài của Pwo-pol sẽ tương tự với Pfu-pol khoảng 0.5-1.5
kb/phút, thấp hơn 5-10 lần enzyme Tkod-pol [40]. Tốc độ kéo dài chuỗi không xem
xét đến khả năng bám cũng như đọc sửa của của DNA polymerase ở trạng thái ổn
định. Tốc độ kéo dài như là sự khác biệt giữa tốc độ trùng hợp và loại bỏ các
nucleotide ở đầu 3’.
υext ~ κpol – κexo
Đặc tính xử lý trình tự (Processivity): là xác suất, sau khi gắn nucleotide,
polymerase sẽ không tách khỏi DNA khi chuyển sang vị trí tiếp theo.
Hình 4: Cơ chế cạnh tranh động học cho một DNA polymerase
Được nghiên cứu bởi Pavlov và cộng sự, 2004 [31].
8
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
DNA polymerase nằm trên một điểm liên kết khuôn mẫu với primer (hình 4).
Các hằng số tốc độ bậc một tương ứng: κpol (bổ sung nucleotide); κexo (cắt bỏ
nucleotide); κoff (phân ly polymerase từ phân tử DNA). Khi đó, giá trị processivity
của chúng được tính theo công thức:
P = (κpol – κexo) / (κpol +
κexo) + (κpol – κexo) / (κpol + κexo + κoff)
Tương tự như khả năng kéo dài chuỗi, giá trị của P phụ thuộc vào trình tự
DNA khuôn và thành phần phản ứng ví dụ như nồng độ muối.
Hầu hết các enzyme DNA-polB có khả năng xử lý trình tự không cao khoảng
từ 4-30 nucleotide/1 lần bám của DNA polymerase [40]. Điều này gây ra hạn chế
với nhóm enzyme này trong một số ứng dụng sao chép DNA plasmid. Một phương
pháp hiệu quả để cải thiện nhược điểm này là các DNA-pol lai được dung hợp với
một phần protein khác có khả năng bám DNA tốt (như Sso7d).
Sự chính xác (Fidelity): là một đặc tính của DNA polymerase, thể hiện số
nucleotide được chèn chính xác sau mỗi lần chèn sai. Khả năng này cũng được hiểu
là hiệu quả xúc tác cho những cơ chất biến đổi của DNA polymerase. Nếu DNA
polymerse có khả năng xúc tác hiệu quả cao thì sự chính xác trong quá trình chèn
nucleotide càng cao và ngược lại.
Tốc độ đọc sai (Error-rate): Đối với các enzyme DNA polymerase bền
nhiệt, chúng có khả năng đọc sửa (proofreading) nhờ hoạt động exonuclease theo
chiều 3’-5’ để khắc phục nhược điểm chèn sai [43]. Tần số sai sót (đột biến) của
Pwo-pol sau mỗi lần nhân đôi khoảng 10-6 thấp hơn 18 lần so với Taq-pol có sự sai
sót từ 1.8x10-4 – 8.0x10-6 [40].
Các thành phần đệm PCR và điều kiện chu trình nhiệt có thể ảnh hưởng đến
độ chính xác của DNA polymerase theo các cách khác nhau hoặc ở các mức độ
khác nhau. Ví dụ, mặc dù các ion magie được xem như là co-factor giúp DNA
polymerase xúc tác tổng hợp nucleotide chính xác, nhưng lượng magie dư thừa sẽ
làm giảm độ chính xác của chúng. Nồng độ nucleotide không đồng đều cũng sẽ làm
giảm độ chính xác vì sự kết hợp sai của nucleotide nồng độ cao hơn sẽ xảy ra
thường xuyên hơn. Các điều kiện chu trình nhiệt như làm biến tính DNA đến nhiệt
độ cao trong thời gian dài có thể dẫn đến việc giải phóng các bazơ từ chuỗi liên kết
phosphodiester, dẫn đến những sai sót [21].
9
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
1.4. Công nghệ protein tái tổ hợp
1.4.1. Tổng hợp gen, tối ưu mã codon
Hiện nay, các nhà khoa học có thể dễ dàng truy cập các dữ liệu tin sinh nhằm
khuếch đại và tổng hợp một đoạn trình tự gen đích của đối tượng nghiên cứu. Theo
thống kê trên ngân hàng dữ liệu trình tự của NCBI, đã lưu trữ hệ gen của gần 50
nghìn loài sinh vật khác nhau trong đó bao gồm Eukaryotes (9631 trình tự);
Prokaryotes (220559 trình tự); Viruses (33870 trình tự); Plasmids (19175 trình tự);
Organelles (15058 trình tự). Từ nguồn dữ liệu quý giá này, các nhà khoa học tiếp
tục phát triển nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein được mã hóa.
Tổng hợp gen
Tổng hợp gen de novo là một công cụ thiết yếu trong các nghiên cứu sinh
học như tương tác protein nucleic acid, đột biến gen được định hướng và tối ưu hóa
việc sử dụng codon để biểu hiện gen từ các trình tự đã biết. Một số phương pháp
sinh học phân tử như cắt enzyme giới hạn [29], enzyme nối ligase [11], sau đó
khuếch đại bằng PCR hoặc chèn vào vector nhân dòng để biểu hiện protein tái tổ
hợp [30]. Tuy nhiên, quá trình này thường tạo ra các sản phẩm phụ hoặc không
mong muốn do đột biến.
Gen mã hóa protein Pwo-pol sử dụng trong nghiên cứu này được tổng hợp
dựa trên quy trình lắp ráp oligonucleotide POS (patch oligonucleotide synthesis)
như hình 5 bao gồm 3 bước chính: Phosphorylation, Ligase Chain Reaction,
Polymerase Chain Reaction. POs là một trong những phương pháp tổng hợp gen
nhanh chóng và chính xác nhất.
Bước 1:
Phosphorylation
Bước 2: LCR
Bước 3: PCR
Hình 5: Sơ đồ minh họa các bước tổng hợp gen bằng phương pháp POS
Được nghiên cứu bởi Yang và cộng sự, 2011 [42]
10
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
Bước 1: Phosphoryl hóa các đoạn oligo cấu trúc (COs - constructional oligonucleotides) và
các đoạn oligo ráp-nối (POs - patch oligonucleotides)
Bước 2: Nối các đoạn COs với các đoạn POs bằng phản ứng LCR để hình thành nên đoạn
gen hoàn chỉnh
Bước 3: PCR khuếch đại đoạn gen hoàn chỉnh sử dụng cặp mồi ở phía ngoài cùng
Tối ưu hóa việc sử dụng codon biểu hiện gen
Codon là mã bộ ba, được cấu tạo từ 4 loại nucleotide adenine (A), guanine
(G), cytosine (C) and thymine (T) và có tất cả 64 mã bộ ba mã hóa cho hơn 20 loại
acid amin khác nhau. Vậy nên mã bộ ba có tính dư thừa, nhiều bộ ba có thể quy
định cùng một loại acid amin. Các sinh vật thường ưu tiên sử dụng các mã bộ ba
riêng của chúng, điều này phản ánh sự cân bằng giữa chiều hướng của đột biến và
chọn lọc tự nhiên cho hiệu quả dịch mã.
Trong những năm gần đây, ngày càng có nhiều báo cáo về các gen có mức
độ biểu hiện cao ở một số vi sinh vật đã cung cấp nhiều thông tin về biểu hiện gen.
Trong đó, chủ yếu liên quan đến các gen mã hóa protein là yếu tố phiên mã / dịch
mã (TF), protein ribosome (RP), protease và chaperons (CH), các enzyme phân giải,
sinh tổng hợp, chuyển hóa, quang hợp, hô hấp và glycolysis... là các sản phẩm quan
trọng đối với sinh lý tế bào. Có lẽ, sự chuyển dịch trong thành phần axit amin của
các gen này có thể giảm thiểu chi phí năng lượng sinh tổng hợp đáng kể cho sinh
vật. Bên cạnh các cơ chế khác, người ta cũng đề xuất rằng chuyển dịch codon
(codon bias) có thể ảnh hưởng đến biểu hiện gen bằng cách tối ưu hóa tốc độ dịch
mã và do đó, các gen biểu hiện cao có thể được đặc trưng bởi tối ưu sử dụng mã bộ
ba so với các gen biểu hiện trung bình [35].
Có rất nhiều các mô hình đã đưa ra để đo lường mức độ chuyển dịch codon.
Trong đó, chỉ số CAI (Codon Adaptation Index) do Sharp và Li nghiên cứu đã
nhanh chóng được sử dụng rộng rãi để dự đoán mức độ biểu hiện của các gen khác
nhau [33]. Giá trị của chỉ số CAI dao động từ 0 – 1, là 1 nếu một gen luôn được sử
dụng các condon đồng nghĩa trong tập tham chiếu. Chỉ số CAI được xem xét là phù
hợp cho biểu hiện gen ở E. coli dao động từ 0.8 – 1, %GC của các gen từ 30 – 70%
tổng số nucleotide [14]. Vì vậy, tối ưu hóa mã bộ ba là một bước quan trọng trong
nghiên cứu biểu hiện gen Pwo-pol để phù hợp với vật chủ biểu hiện E. coli.
1.4.2. Nhân dòng gen đích vào vector mong muốn
Kỹ thuật PCR nhân dòng gen
11
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
Stop codon
Start codon
Coding strand
Non-Coding strand
5’ ATG ATT CTG GAT GTG GAT TAT ATC AC -------- G CTG AAC ATT AAG AAA AGC TAA 3’
3’ TAC TAA GAC CTA CAC CTA ATA TAG TG--------- C GAC TTG TAA TTC TTT TCG ATT 5’
Complementary
Start codon
C GAC TTG TAA TTC TTT TCG ATT
Mồi ngược
5’ ATG ATT CTG GAT GTG GAT TAT ATC AC -------- G CTG AAC ATT AAG AAA AGC TAA 3’
Mồi xuôi
3’ TAC TAA GAC CTA CAC CTA ATA TAG TG--------- C GAC TTG TAA TTC TTT TCG ATT 5’
ATT CTG GAT GTG GAT TAT ATC AC
Complementary
Hình 6: Thiết kế mồi nhân dòng gen mã hóa protein Pwo-pol
Nhiều kỹ thuật đã được giới thiệu để lắp ráp các đoạn DNA khác nhau như PCR các
đoạn trình tự chồng gối (overlaping), tuy nhiên phổ biến nhất trong kỹ thuật nhân
dòng gen là việc sử dụng enzyme giới hạn. Yêu cầu của phương pháp là trên cả hai
trình tự DNA chèn và vector phải có cùng vị trí nhận biết của enzyme giới hạn,
chúng sẽ được nối lại từ các vết cắt kiểu đầu dính hoặc đầu bằng. Tuy nhiên không
phải khi nào đoạn gen đích cũng chứa vị trí cắt enzyme giới hạn tương ứng. Việc sử
dụng mồi PCR chứa các vị trí cắt enzyme giới hạn có thể giải quyết hiệu quả vấn đề
này (hình 6). Đoạn gen đích được nhân bản bằng PCR cực kỳ nhanh chóng và hiệu
quả với sự trợ giúp của DNA polymerase bền nhiệt. Giải trình tự các sản phẩm PCR
thu được, kiểm tra và phân tích dữ liệu trước khi chèn vào vector nhân dòng [16].
Escherichia coli được xem như là là một trong những bioreactor phù hợp
nhất trong phần lớn các thí nghiệm nhân dòng gen. Vector plasmid chứa trình tự
gen của sinh vật lạ được chuyển vào và sao chép độc lập với hệ gen của vi khuẩn E.
coli. Đây được gọi là công nghệ DNA tái tổ hợp dựa trên cơ chế biến nạp
(transformation) trong tự nhiên của vi khuẩn nhưng được thực hiện theo phương
pháp sốc nhiệt ở trong phòng thí nghiệm. Trước khi xử lý sốc nhiệt, tế bào vi khuẩn
E. coli được xử lý với canxi ở nồng độ cao khoảng 100mM. Trong điều kiện môi
trường giàu canxi màng tế bào vi khuẩn tích điện dương hơn, và DNA plasmid tích
điện âm có xu hướng tiếp xúc lại gần màng tế bào vi khuẩn. Tế bào khả biến E. coli
sau đó xử lý sốc nhiệt từ 0-42oC dẫn đến màng tế bào bị mất đi một lượng các lipid
và protein [3]. Ở trạng thái cấu trúc màng tế bào lỏng lẻo DNA plasmid dễ dàng
chuyển vào bên trong, khả năng biến nạp tăng lên khoảng 60% so với khi biến nạp
vào tế bào không xử lý với canxi [26].
1.4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp
12
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
a. Vật chủ biểu hiện
Các điều kiện vật chủ, vector và nuôi cấy (môi trường, nhiệt độ nuôi cấy) là
ba yếu tố chính quyết định sự thành công trong biểu hiện protein tái tổ hợp. Hiện
nay, có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp từ đơn giản đến phức tạp
nhưng phổ biến hơn cả là hệ thống biểu hiện ở prokaryote.
Đặc điểm nổi bật của vật chủ E. coli phù hợp biểu hiện protein tái tổ hợp
Một trong những vật chủ được ưu tiên để sản xuất protein tái tổ hợp là E.
coli. Ưu điểm: có tốc độ sinh trưởng nhanh (15 phút/chu kỳ sinh trưởng) và mật độ
tế bào cao, dễ thao tác, mức độ biểu hiện lớn trong thời gian ngắn và chi phí thực
hiện thấp. Nhược điểm: thiếu sự biến đổi sau dịch mã cho nhiều protein có tính chất
phức tạp, kích thước protein biểu hiện bị hạn chế, đôi khi protein biểu hiện có thể ở
dạng thể vùi không tinh sạch được. Tuy nhiên E. coli được biết đến với toàn bộ hệ
gen đã được giải mã. Do đó, nhiều sửa đổi đã được thực hiện trên E. coli để tối ưu
hóa chúng trở thành đối tượng tiềm năng cho nghiên cứu biểu hiện protein. Các nỗ
lực để tăng cường khả năng biểu hiện gen được thể hiện thông qua cải biến di
truyền (genetic engineering) cũng như các kỹ thuật trên phạm vị toàn hệ gen (strain
engineering) [28].
E. coli bao gồm nhiều chủng. Do đó, việc lựa chọn được vật chủ phù hợp có
thể đem lại hiệu quả biểu hiện cho các protein khác nhau. Mặc dù các vật chủ đó
cũng có những ưu điểm và nhược điểm riêng như trong bảng 3.
Bảng 3: Các chủng E. coli phổ biến cho biểu hiện protein tái tổ hợp
Được tổng hợp bởi Hayat SMG và cộng sự, 2018 [13]
Chủng
Đặc điểm
Lợi ích
BL21 (DE3)
Có chứa vùng gen DE3 lysogen biểu
hiện T7 RNA polymerase
Thiếu lon và ompT proteases
Cảm ứng bằng IPTG
Phù hợp biểu hiện các gen
không tạo độc tố
BL21 (DE3)
pLysS
Có chứa vùng gen DE3 lysogen biểu
hiện T7 RNA polymerase
Có T7 lysozyme để phân giải T7
polymerase trước khi được cảm ứng
Ngăn chặn sự biểu hiện sớm
Phù hợp biểu hiện các gen
tạo độc tố
Lemo21
(DE3)
Gồm các đặc điểm của BL21 (DE3)
Biểu hiện đồng thời được các dòng
khác nhau bởi sự đa dạng mức độ
của lysozyme
Phù hợp cho biểu hiện các
protein khó như: các protein
gây độc tố, các protein
màng và ít tan
13
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
Tuner (DE3)
Có sự biến đổi lac permerase (lacY)
Cho phép sự tiếp nhận đồng
dạng ở tất cả các tế bào
trong quần thể
Phù hợp biểu hiện protein
gây độc và không tan
Origami
Có đột biến ở các gen trxB và gor
Làm tăng sự hình thành các
liên kết S-S ở tế bào chất
Rosetta
Các dẫn xuất BL21 lacYZ
Có thêm các bản sao của gen mã hóa
tRNA cho các codon hiếm AUA,
AGG, AGA, CUA, CCC, GGA
Phù hợp cho biểu hiện các
protein dị hợp
C41 (DE3)
và C43
(DE3)
Các chủng đột biến của BL21 (DE3)
ngăn chặn cái chết của tế bào khi có
sự biểu hiện của các protein tái tổ
hợp gây độc
Phù hợp cho biểu hiện các
protein gây độc hoặc protein
màng từ tất cả các sinh vật
Hơn một thập kỷ trước, Walker và cộng sự đã phân lập được các chủng E.
coli đột biến C41 (DE3) và C43 (DE3) mang các đột biến dập tắt tự phát (suppresor
mutations). Vai trò của các đột biến này được cho rằng đã làm giảm độc tính gây ra
từ việc sản xuất protein nội bào dưới sự kiểm soát của promoter T7. Không có gì
đáng ngạc nhiên, sau đó người ta đã phát hiện ra rằng các đột biến ở các chủng này
làm giảm hiệu quả dịch mã của T7 RNA polymerase [9]. Hiện nay, chúng được biết
đến là các chủng đột biến của E. coli BL21 (DE3) và được sử dụng như một vật chủ
phổ biến biểu hiện protein tái tổ hợp. E. coli BL21 được định nghĩa là một trong
những loại chủng B thiếu Lon protease (tế bào chất) và protease OmpT (màng
ngoài). DE3 là các chủng tương ứng có chứa lysogen λDE3, mang gen T7 RNA
polymerase dưới sự kiểm soát của promoter lacUV5. T7 RNA polymerase sẽ được
thể hiện bằng cách bổ sung chất cảm ứng isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside
(IPTG) vào môi trường sinh trưởng [45].
b. Vector biểu hiện
Vector biểu hiện (plasmid thiết kế) đóng vai trò quan trọng trong quá trình
sản xuất protein tái tổ hợp. Vector được thiết kế có khả năng nhân lên độc lập với
hệ gen của vật chủ nuôi cấy, dễ dàng thao tác và kiểm soát mức độ biểu hiện cũng
như tinh sạch protein tái tổ hợp.
14
Luận văn thạc sĩ 2019
Nguyễn Thị Thu Huyền
Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở E. coli
Được xây dựng bởi Jia và Jeon, 2016 [17] a. Cấu trúc vector biểu hiện protein tái tổ hợp ở
tế bào chất; b. Cấu trúc vector sử dụng biểu hiện protein ở màng tế bào. D tags (Detection);
P tags (Purification); S tags (Solubility and translation initiation); TT (Transcriptional
terminator)
Cấu trúc vector biểu hiện phổ biến ở vi khuẩn E. coli thường bao gồm các
yếu tố như marker chọn lọc là các gene kháng kháng sinh, điểm khởi đầu sao chép
(Ori), promoter phiên mã (T7-promoter), vùng không dịch mã đầu 5’ (5’UTR) và vị
trí bắt đầu dịch mã. Bên cạnh đó, một điểm quan trọng khác của các vector biểu
hiện là sự có mặt của đuôi dung hợp (His tag, GST tag…) nằm trên cùng khung đọc
mở với gen được biểu hiện, ngược chiều phiên mã với các yếu tố khác (hình 7).
Vùng T7 promoter được sử dụng để kiểm soát mức độ biểu hiện của protein. Cặp
đuôi ái lực giúp định hướng biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp. Đuôi lớn hơn
để bắt đầu biểu hiện protein, phát hiện tính tan và độ hòa tan của protein; đuôi nhỏ
hơn sử dụng để tinh chế protein. Các vị trí cắt enzyme như TEV protease hoặc
thrombin được thiết kế trên vector để loại bỏ các đuôi ái lực sau khi tinh chế
protein. Với các protein tái tổ hợp sản xuất trong tế bào chất các đuôi ái lực được
thiết kế gắn vời đầu C-terminus của protein đích (hình 7b). Trong khi đó, với các
protein tái tổ hợp sản xuất ở màng các đuôi ái lực được thiết kế gắn vời đầu Nterminator của protein đích (hình 7a).
15
