Ứng dụng tin sinh học trong tách dòng gene mã hóa enzyme natokinase trên đối tượng giả định là vi khuẩn bacillus

Ứng dụng tin sinh học trong tách dịng
gene mã hóa enzyme natokinase trên
đối tượng giả định là vi khuẩn bacillus


NỘI DUNG

1
2
3

• Tìm thơng tin về gene cần tách dịng sử
dụng CSDL trực tuyến
•

• Xác định vùng bảo thủ sử dụng CSDL
trực tuyến và phần mềm Clustal Omega
•

5

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

• Thiết kế mồi bằng phần mềm Primer 3
•

4

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,

• Thực hiện phản ứng PCR ảo trên chương
trình, dự đốn tính chất protein
• Xây dựng phương án tách dòng gene.


TÌM KIẾM THƠNG TIN VỀ NATTOKINASE


TÌM THƠNG TIN VỀ GENE CẦN TÁCH DỊNG TRÊN CSDL
TRỰC TUYẾN
• Đối tượng : gene mã hóa
protein nattokinase
• Truy cập:
.
gov
• Từ khóa: nattokinase,
cloning nattokinase,
expression nattokinase
• Tìm hiểu thơng tin về
protein nattokinase, gene
mã hóa, ..
Ảnh: ví dụ về một kết quả tìm kiếm
Nguồn ảnh b: He Ni Peng-Cheng et.al, 2016


Thơng tin về nattokinase
• Nattokinase là một enzyme thuộc họ serine protease
• Được tìm thấy trong Bacillus subtilis trong canh trường đậu tương lên men của Nhật Bản
• Có chức năng sinh học trong việc ngăn chặn cục máu đông và được sử dụng như một

loại thuốc trong điều trị bệnh về tim mạch do có khả năng hịa tan sợi thrombi
• Gene coding cho nattokinase là gene aprN gồm một khung đọc mở ORF gồm 1146 nu,
mã hóa cho chuỗi preprotein( chuỗi aa tín hiệu, chuỗi aa pro peptide, 275 aa protein
trưởng thành, nặng 27.7 kDa, pI là 6.6)
• Chuỗi tín hiệu có chức năng dẫn đường cho enzyme ra ngoại bào
• Chuỗi pro-sequence có tác dụng như một chaperone nội bào, có chức năng hỗ trợ sự
cuộn gấp chính xác của enzyme trưởng thành
• Được biểu hiện trên B. subtilis hoặc E.coli
• Một số chủng Bacillus được sử dụng là B. amyloliquefaciens,  B. licheniformis,  B. subtilis,
and B. amylosacchariticus. Bộ gene của các chủng này được thiết kế sao cho các
protease bị mất chức năng hoặc thiếu hệ thống protease (extracellular-proteasedefcient B. subtilis system )


XÁC ĐỊNH VÙNG BẢO THỦ
Tìm kiếm các genome mang bộ gene
mã hóa protein nattokinase
Cơng cụ : CSDL NCBI
/>de

So sánh để tìm ra vùng bảo thủ
Cơng cụ:
Clustal Omega
/>talo/


XÁC ĐỊNH VÙNG BẢO THỦ-1
•Bước 1: truy cập
tìm kiếm
với từ khóa nattokinase
•Kích vào đường dẫn để xem thơng tin: ngày công bố,

nơi thực hiện, nguồn gốc chủng, canh trường nuôi
cấy để bước đầu xác định quan hệ gần gũi giữa chủng
vi khuẩn mình có và chủng lấy làm khn thiết kế mồi
•Kích vào FASTA để xem trình tự nu
•Lựa chọn nhiều nhất có thể, ít nhất là 3 trình tự, sao
chép vào fle word ở định dạng fasta

Chú ý:
ưu tiên lựa chọn complete cds


Các đoạn gene lựa chọn
>KY576911.1 Bacillus subtilis strain MX6 nattokinase
(aprN) gene, complete cds
>KJ174339.1 Bacillus subtilis strain MTCC 1427
nattokinase (aprN) gene, complete cds
>KF734090.1 Bacillus subtilis subsp. natto strain jap10
nattokinase gene, complete cds
>FJ376817.1 Bacillus subtilis subsp. natto strain Tangshan
nattokinase gene, complete cds
>FJ374767.1 Bacillus subtilis subsp. natto strain MBS 04-6
nattokinase (aprN) gene, complete cds
>JN392072.1 Bacillus subtilis strain LSSE-22 nattokinase
(aprN) gene, complete cds
….


XÁC ĐỊNH VÙNG BẢO THỦ-2
Bước 2:
• Truy cập

/>ustalo/
để vào phần mềm Clustal Omega
• Đưa các trình tự lựa chọn vào, set
các thơng số mong muốn theo
hướng dẫn.
• Cho chương trình chạy để xem kết
quả


Kết quả xác định vùng bảo thủ

Vùng
bảo thủ.
Vùng
phân li.

Vùng bảo thủ là vùng có nhiều dấu sao bên dưới, dùng làm
vùng thiết kế mồi.


THIẾT KẾ MỒI
• Lựa chọn genome gần gũi nhất
với đối tượng cần tách dịng là vi
khuẩn bacillus
• Cơng cụ:
• PCR 16S, giải trình tự gene
• taxonomy

Thiết kế mồi phục vụ cho việc
tách dịng

Cơng cụ: Primer Blast

/tools/primer-blast/


LỰA CHỌN ĐOẠN GENE GẦN GŨI ĐỂ LÀM ĐOẠN KHN
• Trong trường hợp của vi khuẩn, ngoài việc xác định dựa trên đặc điểm canh trường nuôi
cấy, thời gian và địa điểm, để xác định quan hệ gần gũi cần xác định thêm sự tiến hóa của
vi khuẩn nhờ vào giải trình tự 16S RNA, sau đó phân tích quan hệ gần gũi
• Cơng cụ : Clustal W hoặc phần mềm MEGA 5


SỬ DỤNG PHẦN MỀM PRIMER
BLAST ĐỂ THIẾT KẾ MỒI
• Truy cập
/>tools/primer-blast/
• Lựa chọn vùng có dấu sao liên
tiếp ở hai đầu để thiết kế mồi
xi và mồi ngược
• Nhập các thông số mong
muốn và cho chạy để được
đoạn mồi.

Vùng gạch chân đỏ là vùng lựa chọn
để thiết kế mồi


Giao diện primer blast

Tại ơ range: nhập vào vị trí của

vùng muốn thiết kế mồi
Tại ô product size: nhập vào độ
dài chuỗi sản phẩm lấy dư lên
Tại ô primer melting
temperature: đặt nhiệt độ như
cài đặt hoặc đặt nhiệt độ 52C-58
C
Các thơng số khác có thể để là
mặc định


Kết quả mồi
Kết quả lựa chọn mồi: mồi có điểm
thơng số cao nhất sẽ được đưa lên đầu
Bộ mồi được lựa chọn:
Forward
primer

TGCCGGAAAAAGCAGTACAGA

Reverse
primer

TTTGTCCAAGTCGGGTGCTT


THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR ẢO
• Thực hiện phản ứng PCR với bộ mồi trên cơ sở dữ liệu
• Cơng cụ: SMS PCR hoặc insilico PCR
• />ml

• />

CHẠY THỬ BỘ MỒI BẰNG SMS PCR
truy cập:
/>ts.html

nhập trình tự

nhập mồi xi và mồi ngược

Kết quả: Cho ra một trình tự nên mồi là đặc hiệu

Kết quả chạy PCR ảo (sử dụng cho dự đoán
protein)
>>960  bp  product  from  linear  template  KY576911.1  Bacillus 
subtilis strain MX6 nattokinase (aprN) gene, complete cds, base 
267 
to 
base 
1226 
(T7 
­ 
T3). 
TGCCGGAAAAAGCAGTACAGAAAAGAAATACATTGTCGGATTTAAGCAGACAATGAGTGC 
CATGAGTTCCGCCAAGAAAAAGGATGTTATTTCTGAAAAAGGCGGAAAGGTTCAAAAGCA 
ATTTAAGTATGTTAACGCGGCCGCAGCAACATTGGATGAAAAAGCTGTAAAAGAATTGAA 
AAAAGATCCGAGCGTTGCATATGTGGAAGAAGATCATATTGCACATGAATATGCGCAATC 
TGTTCCTTATGGCATTTCTCAAATTAAAGCGCCGGCTCTTCACTCTCAAGGCTACACAGG 
CTCTAACGTAAAAGTAGCTGTTATCGACAGCGGAATTGACTCTTCTCATCCTGACTTAAA 
CGTCAGAGGCGGAGCAAGCTTCGTTCCTTCTGAAACAAACCCATACCAGGACGGCAGTTC 

TCACGGTACGCATGTCGCCGGTACGATTGCCGCTCTTAATAACTCAATCGGTGTTCTGGG 
CGTAGCGCCAAGCGCATCATTATATGCAGTAAAAGTGCTTGATTCAACAGGAAGCGGCCA 
ATATAGCTGGATTATTAACGGCATTGAGTGGGCCATTTCCAACAATATGGATGTTATCAA 
CATGAGCCTTGGCGGACCTTCTGGTTCTACAGCGCTGAAAACAGTAGTTGATAAAGCGGT 
TTCCAGCGGTATCGTCGTTGCTGCCGCAGCCGGAAACGAAGGTTCATCCGGAAGCACAAG 
CACAGTCGGCTACCCTGCAAAATATCCTTCTACTATTGCAGTAGGTGCGGTAAACAGCAG 
CAACCAAAGAGCTTCATTCTCCAGCGTAGGTTCTGAGCTTGATGTAATGGCTCCTGGCGT 
GTCCATCCAAAGCACACTTCCTGGAGGCACTTACGGCGCTTATAACGGAACGTCCATGGC 
GACTCCTCACGTTGCCGGAGCAGCAGCGCTAATTCTTTCTAAGCACCCGACTTGGACAAA


CHẠY THỬ MỒI BẰNG INSILICO
• Truy cập: />• Lựa chọn lồi vi khuẩn, nhập trình tự mồi, cho phép sai lệch

Bước 1: chọn lồi vi khuẩn

Bước 2: nhập trình tự mồi và chọn
chi vi khuẩn


Giao diện kết quả

Kết quả trình bày
dưới dạng như một
bản điện di


kết quả chuỗi được khuếch đại

DỰ ĐỐN TÍNH CHẤT CỦA PROTEIN
• Xác định protein được tạo
từ sản phẩm PCR
• Cơng cụ: BlastX hoặc
ExPASy
• .
gov/Blast.cgi
• />anslate/

• Phân tích cấu trúc
protein để xác định
tính chất
• Cơng cụ: CSDL NCBI
hoặc ExPASy


DỰ ĐỐN TÍNH CHẤT PROTEIN BẰNG CSDL NCBI
• Truy cập:
i.n
lm.nih.gov/Blast.cgi
(cơng cụ blast
đoạn gene sang
protein)
• Nhập các thơng số
mong muốn vào
các ô nhập dữ liệu
đầu vào


Kết quả

• Lựa chọn trình tự khớp 100 %,
dựa vào cấu trúc của protein đó
để dự đốn cấu trúc protein quan
tâm.
• Chọn vào phần gạch chân ở mục
Accession để xem một số thông tin
protein.


Thông tin về protein
Chọn GRAPHIC
CDD search result để
xem rõ hơn thông tin chức năng từng vùng
trên gene


Kết quả cho thấy: Protein sẽ có cấu trúc tương
tự nhưu một ezyme nattokinase, có hai vùng:
- Vùng inhibitor I9: hoạt động như chaperone
để cuộn gấp đúng protein
Vùng peptidase_S8_subtilisin_subset: mang
chức năng của enzyme, chứa trung tâm hoạt
động
Như vậy bị thiếu mất chuỗi tín hiệu
Trình tự chuỗi protein dự đốn:
AGKSSTEKKYIVGFKQTMSAMSSAKKKDVISEKGGKVQKQFKYVNAAAATLDEKAVKELKKDPSVAYVE
EDHIAHEYAQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDG
SSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMDVINMSLGGPS
GSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSTSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSVGSELDVM
APGVSIQSTLPGGTYGAYNGTSMATPHVAGAAALILSKHPTWT