BÁO cáo THỰC tập NUÔI cấy tế bào ĐỘNG vật

BÁO CÁO THỰC TẬP NUÔI
CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1


NHỮNG NỘI DUNG CHÍNH
MỤC TIÊU
CƠ SỞ LÍ THUYẾT
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
KẾT LUẬN

2


MỤC TIÊU
 Nuôi cấy tế bào động vật là một trong những kĩ thuật cơ
bản được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Y, Sinh,
Dược.
 Mục tiêu:
 Làm quen với kĩ thuật nuôi cấy tế bào từ tuỷ xương
chuột với các thao tác thu nhận mô, phân lập, quan sát
và đánh giá tế bào.
 Biết được các dụng cụ, các bước chuẩn bị cho nuôi
cấy tế bào.
3


CƠ SỞ LÍ THUYẾT
Nuôi cấy sơ cấp: là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy

chuyền đầu tiên. Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là hỗn hợp
các dòng tế bào khác nhau hoặc chứa dòng trội nhất, trong đó có những tế bào
quan tâm.
Trong bài thực tập tế bào nuôi cấy là tế bào tuỷ xương chuột, tế bào quan tâm
là các tế hình thoi, có tính bám.
Quy trình nuôi sơ cấp:
•
•
•

Bước 1: thu nhận mô có chứa tế bào sống
Bước 2: phẫu tích hay tách rời tế bào, xác định mật độ tế
bào.
Bước 3: nuôi cấy (passage 0)

Nuôi cấy thứ cấp: là việc nuôi cấy sau lần cấy chuyền đầu tiên để được
Passage 1
4


PHƯƠNG PHÁP
Phương pháp:
Ngày 1: (4/10/2016)
o Gói dụng cụ hấp khử trùng
o Pha chế môi trườngPBSo Làm quen với thiết bị phòng thí nghiệm

Ngày 2: (7/10/2016)
Chiếu tủ ( tủ an toàn cấp 2):
Quy trình chiếu tủ: mặc áo blouse, đeo bao tay, khẩu trang
Dùng khăn sạch thấm cồn 70 lau túi

dụng cụ đã hấp khử trùng, lau tủ an
toàn bằng cồn 70

Dùng 2 tay kéo cửa tủ
đến mức quy định

Xếp dụng cụ vào tủ

Kéo cửa tủ lại, bật nút
UV, chiếu UV trong 30
phút
5


VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
Ngày 2: (7/10/2016)
Thu nhận xương đùi và tuỷ

6


VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
Đếm tế bào:

‾ Đếm ít nhất 3 lần.
‾ Nếu giữa các ô đếm quá chênh lệch thì phải đếm buồng đếm khác
‾ Đếm các tế bào đơn, chọn các tế tròn sáng, đồng nhất về kích thước.
7

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
Ngày 3 (11/10/2016)
Thay môi trường cho tế bào tuỷ xương chuột:
Lấy bình nuôi cấy ra khỏi tủ nuôi

Chiếu tủ an toàn cấp 2
Rửa 2 lần PBS

Cho môi trường mới
vào

Chụp hình

Chụp hình

Hút bỏ môi
trường cũ

Ủ 37 độ C, 5% CO2

Ngày 4 (14/10/2016)
Cấy trải: do mật độ tế bào phân bố không đều nên cần cấy trải để dàn đều tế bào trước
khi nuôi cấy thư cấp
Chiếu tủ an toàn cấp 2
Hút vào Fancon
Cho vào bình nuôi

Cào bong lớp
tế bào
Huyền phù

Cho môi trường mới vào

Lấy bình nuôi cấy ra khỏi tủ nuôi
Ly tâm
Chụp hình

Thu cặn tế bào

Ủ 37 độ C, 5% CO2

Chụp hình

8


KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Ngày 1: (4/10/2016)

Cách gói dụng cụ để hấp khử trùng
Cách pha chế dung dịch: để kiểm tra dung dịch tan hết hay chưa
bằng cách kiểm tra pH. Nếu như pH ổn định thì dung dịch tan hoàn
toàn.
Lưu ý: với dung dịch là môi trường nuôi cấy thì không hấp mà sẽ
lọc

9


KẾT QUẢ BIỆN LUẬN
•Ngày 2: (7/10/2016)

•Xác định mật độ tế bào:
•Kết quả đếm lần 1: 171 tế bào
•Kết quả đếm lần 2: 182 tế bào.
•Kết quả đếm lần 3: 169 tế bào.
•a = (171+182+169)/3 = 172 tế bào
•Mật độ tế bào:

A = a/5x10^4x20

= 172/5x10^4x20
= 6,9.106 (tế bào/ml)
10


KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Ngày 2: (7/10/2016)
Kết quả quan sát: trong mẫu thu có các tế bào quan tâm như tế bào tròn, sáng, kích thước đều.
Tuy nhiên có các tế bào nhỏ sáng có thể là tiểu cầu, có tế bào lõm là hồng cầu và các tế bào bị vỡ
không còn hình dạng ban đầu của nó

Hình chụp môi trường trước khi nuôi cấy

Hình chụp môi trường thu tế bào từ tủy xương
Tế bào không bám hình tròn

11


KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Ngày 3 (11/10/2016)

Trước khi thay môi trường, môi trường nuôi có màu cam, đục.
=> Tế bào phát triển bình thường
Hình chụp có nhìn thấy những tế bào quan tâm là hình thoi bám ở đáy bình, ngoài ra còn có các tế bào
không bám hay tế bào bám có dạng hình tròn. Môi trường không bị nhiễm.

Hình chụp môi trường sau khi nuôi cấy

Hình chụp tế bào sau khi nuôi cấy

12


KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Ngày 3 (11/10/2016)
Sau khi thay môi trường, môi
trường trong suốt, có màu hồng.
Tế bào lơ lững, không bám dính
bị loại bỏ.
Hình chụp sau khi thay môi
trường thấy rõ các tế bào bám
hình thoi và các tế bào bám dính
khác hình tròn,

Tế bào bám dính hình thoi
Tế bào bám dính hình tròn
Cụm tế bào bám dính

Hình chụp tế bào sau khi thay môi trường

13

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Ngày 4 (14/10/2016)
Thu được môi trường có đục màu cam.

Hình chụp môi trường trước khi cấy trải
14


Tế bào bám dính hình thoi
Tế bào bám dính hình tròn
Cụm tế bào bám dính

Hình chụp tế bào trước khi cấy trải
• Hình chụp tế bào cho thấy có các tế bào bám và tế bào không bám.
• Môi trường không bị nhiễm, mật độ tế bào phân bố không đều.
=> Mật độ chưa đạt yêu cầu, do đó thực hiện cấy trải
• Nguyên nhân mật độ phân bố không đều do bước huyền phù chưa
15
tách hoàn toàn tế bào đơn khi thu bào tuỷ xương..


KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Ngày 4 (14/10/2016)
Hình chụp tế bào sau khi cấy trải.
Mật độ tế bào đồng đều hơn, tuy nhiên
vẫn còn một số cụm tế bào chưa phân
tách.
Nguyên nhân: Do sử dụng phương pháp

tách cơ học bằng Cell Crapper nên không
thể phân tách hoàn toàn các cụm tế bào
dính nhau thành từng tế bào đơn lẻ như
khi sử dụng phương pháp dùng trypsin.
Tế bào không bám dính
Cụm tế bào không phân tách
Hình chụp tế bào sau khi cấy trải
16


KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Sau khi nuôi cấy trải, môi trường có màu đỏ.
Có khuẩn lạc mọc trong môi trường nuôi cấy
của flask.
Nguyên nhân:
Bọc đựng pipette pastuer mở khi chuyển vô tủ
vô trùng => bị nhiễm
Có thể do nhiễm khi lấy Cell Crapper ra khỏi
bọc
Do thao pha loãng môi trường sau li tâm

Hình chụp tế bào sau khi nuôi cấy cấy trải17


KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
Qui trình đông lạnh và giải đông:
• Làm theo quy trình đông lạnh chậm
• Kết quả sau khi giải đông:
• Tỉ lệ tế bào chết/tổng số tế bào: 4/32
= 12.5%

=> Tỉ lệ sống sót: 87.5%
=> Đây là tỉ lệ sống sót sau giải đông
chấp nhận được!

Hình chụp tế bào sau khi giải đông
18


QUY TRÌNH IVF

19


NHỮNG NỘI DUNG CHÍNH
MỤC TIÊU
CƠ SỞ LÍ THUYẾT
VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
KẾT LUẬN

20


MỤC TIÊU
CƠ SỞ LÍ THUYẾT

21


•

Tập thu nhận và chuyển trứng heo
=>Thu nhận được trứng từ các nang lớn

Năng trứng heo
(Hình minh họa)

• Tập kéo kim
=>Chưa đạt yêu cầu về đường kính và độ dài
• Tập chuyển trứng
=>Chuyển được, tuy nhiên vẫn bị mất trứng

22


Tạo vi giọt
Chức năng

Thể tích

Đĩa tập chuyển trứng

4 giọt 50 ul PBS

Đĩa loại cumulus

1 giọt 10ul FertiMed
3 giọt 50ul FertiMed

Đĩa thụ tinh

2 giọt 10ul FertiMed
2 giọt 10+40ul FertiMed (vi giọt treo)

Đĩa nuôi phôi

4 giọt 10+40ul Embryos (vi giọt treo)

Tập chuyển trứng
=>Chuyển được, tuy nhiên vẫn bị mất bị mất trứng
23


Quy trình thu nhận trứng
• Gây siêu bài noãn cho chuột
• Tiêm 10IU PMSG (0.1 ml, 100IU/ml)
• 46-48 giờ sau tiên PMSG, tiêm 0.1 mlhCG 100IU/ml.
• 13-14 giờ sau tiêm hCG tiến hành thu nhận trứng

24


Thu nhận đoạn bóng
Quy tình mổ chuột thu đoạn bóng

25