Kháng thể đa dòng, phương pháp sản xuất và ứng dụng

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm

MIỄN DỊCH HỌC
Đề tài: Kháng thể đa dòng, phương pháp sản xuất và ứng dụng

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong


Nội dung chính của bài thảo luận

01

Khái niệm về kháng thể đa dòng

02

Sản xuất kháng thể đa dòng

03

Ứng dụng của kháng thể đa dòng


Khái niệm về kháng thể đa dòng


Khái niệm về kháng thể đa dòng

Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies: pAbs): là các kháng thể được sản sinh ra từ các tế bào B
khác nhau trong cơ thể. Chúng là tập hợp các immunoglobulin:Ig phản ứng chống lại một kháng

nguyên cụ thể. Mỗi loại sẽ liên kết với một epitope trên kháng nguyên.


Khái niệm về kháng thể đa dòng

Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể sẽ sản sinh ra nhiều loại kháng thể, mỗi loại lại tương thích với một
B cell 1

trong nhiều epitope của kháng nguyên. Sự đáp ứng miễn dịch như vậy gọi là đáp ứng miễn dịch đa
dòng.

B ce
ll 2

Với cùng một vật chủ, cùng một loại kháng nguyên nhưng ở hai lần đáp ứng miễn dịch khác nhau thì
kháng thể được sản sinh ra sẽ không hoàn toàn giống nhau giữa hai lần.
B ce
ll 2
B ce
ll 2

B cell 1

Kháng thể đa dòng có thể gây ra hiện tượng phản ứng chéo (cross-reactivity) hay crossimmunity, crossprotective immunity. Theo miễn dịch học thì đây là phản ứng giữ kháng thể và kháng nguyên khác.

B cell 1


Khái niệm về kháng thể đa dòng

Sản xuất kháng thể đa dòng


Sản xuất kháng thể đa dòng

QUY TRÌNH SẢN XUẤT

1. Chuẩn bị kháng nguyên.

2. Lựa chọn và chuẩn bị tá dược.

3. Lựa chọn con vật.

4. Quá trình tiêm và đáp ứng miễn dịch ở con vật.

5. Chiết xuất huyết thanh.


1. Chuẩn bị kháng nguyên

Để sản xuất được kháng thể đa dòng thì đòi hỏi việc phải chuẩn bị được kháng nguyên sạch

Chuẩn bị kháng nguyên gồm:
+ Nghiền phá hủy các mô
+ Tách chiết bằng các phân tử kết tủa muối
- Ngoài ra các phương pháp còn phụ thuộc vào kháng nguyên có hòa tan hay không hòa tan, bản chất của kháng nguyên là protein, carbonhydrate hay acid
nucleic. Đối với các kháng nguyên có bản chất là protein và acid nucleic ta còn có thể tách chiết theo khối lượng bằng cách chạy điện di.

Mục đích: để sản xuất ra kháng thể đa dòng có độ chuẩn cao, huyết thanh miễn dịch (antiserum) có ái lực cao với kháng nguyên để có thể sử dụng trong các

thí nghiệm hoặc các xét nghiệm.


2. Lựa chọn và chuẩn bị tá dược

+ Để có được đáp ứng miễn dịch như mong muốn thì kháng nguyên phải đủ mạnh. Vì vậy, đối với một số loại kháng nguyên “yếu” ta cần dùng những chất
bổ trợ hay tá dược. Một số tá dược lại được sử dụng với mục đích nhân đạo với loài vật dùng để sản xuất kháng thể.
+ Tới nay đã có hơn 100 loại tá dược được công bố và đánh giá, thẩm định. Tuy nhiên, chỉ có một vài loại tá dược là được sử dụng phổ biến.
+ Các tá dược phổ biến thường dùng là:

•
•
•
•
•

FCA Freund’s complete adjuvant
FIA Freund’s incomplete adjuvant
Aluminum salts (Al(OH)3, AlPO4,...)
TiterMax
TM
RIBI

TM


3. Lựa chọn con vật

Tiêu chí để chọn một con vật làm mẫu để lấy kháng thể đa dòng
Lượng pAb cần

Dễ dàng lấy mẫu

Mối quan hệ kháng nguyên giữa các
loài gần gũi

Mục đích sử dụng


4. Quá trình tiêm và đáp ứng miễn dịch


5. Chiết xuất huyết thanh

- Tinh chế kháng thể
Pp1. sử dụng sắc kí trao đổi ion.
Pp2.tinh chế nhờ cột ái lực protein G(hoặc protein A)
Nguyên tắc: sử dụng khả năng liên kết đặc hiệu của protein G (có bản chất là immunoglobulin). Với Fc của kháng thể IgG. Các kháng thể IgG cần tách
khi qua cột sẽ liên kết với protein G theo kiểu kháng thể- protein G. Sử dụng đệm để rửa sạch các protein không đặc hiệu qua cột. Sau khi rửa, kháng thể
đc tách bằng đệm tách ra khỏi cột.
 
Pp3. Kết tủa bằng (NH4)2SO4
- Kiểm tra độ tinh sạch
Pp chạy điện di trên gel.


Ứng dụng của kháng thể đa dòng


Các ứng dụng cơ bản

Kháng thể đa dòng có nhiều ứng dụng nhưng có thể kể tới hai ứng dụng lớn nhất của kháng thể đa dòng là phương pháp ngưng kết sinh học
(Agglutination method) và phương pháp kết tủa miễn dịch (Immunoprecipitation based method).

Agglutination reaction

Precipitation reaction

Ngưng kết sinh học là khi một kháng thể được cho tiếp xúc

Kết tủa miễn dịch là khi một kháng thể được cho tiếp xúc với

với một kháng nguyên. Kháng nguyên này thường là kháng

một kháng nguyên hòa tan và tạo phức hợp kháng nguyên -

nguyên vẫn đang được đính trên chủ của nó như trên tế bào

kháng thể. Thông thường thì không giống ngưng kết, kết tủa

hồng cầu, tế bào vi khuẩn, virus,... Từ đó gây ra hiện tượng

miễn dịch cần thêm một chất giúp cho phức hơp kháng

đông tụ lại.

nguyên – kháng thể trên có thể lắng xuống.


Các ứng dụng cơ bản

Agglutination reaction

Active Agglutination

-

Các epitopes kháng nguyên đích có thể tìm thấy ngay trên

Passive Agglutination

-

hạt mang

-

Các hạt mang này có thể là RBCs, tế bào nấm, tế bào vi
khuẩn,... Và các kháng nguyên sẽ được gắn sẵn trên chúng

Các epitopes kháng nguyên đích không được hình thành tự
nhiên trên hạt mang

-

Epitope hoặc kháng nguyên hòa tan sẽ được gắn lên các hạt
mang bằng các phương pháp hóa học


Các ứng dụng cơ bản

Các ứng dụng cơ bản

Precipitation reaction

1.
2.

Individual protein immunoprecipitation (IP): Dùng để phát hiện một protein đặc hiệu trong môi trường có chứa nhiều protein khác nhau.
Protein complex immunoprecipitation (Co-IP): Dùng để phát hiện ra một phức hệ protein từ sự kết hợp của một protein đã biết trong phức hệ với
kháng thể tương ứng.

3.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP): Xác định vị trí một loại protein cụ thể nào đó gắn lên DNA của một gene. Thường là các yếu tố phiên mã
hoặc các histone.


Ứng dụng trong kĩ thuật SANDWICH ELISA

Kỹ thuật Elisa : Phát hiện sự hiện diện của một kháng thể
hoặc kháng nguyên trong một mẫu.
Nguyên lí:
1.Phủ kháng nguyên
2.Bắt giữ đặc hiệu KN-KT(được liên kết với enzyme)
3.Rửa trôi phân tử không bắt giữ
4.Thêm cơ chất phản ứng với enzyme, phát tín hiệu, đọc
tín hiệu

Kĩ thuật Elisa sandwich
Định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt- capture và phát hiệndetection)
Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng
nguyên càng tốt.


Ứng dụng trong kĩ thuật SANDWICH ELISA

Phát hiện chẩn đoán bênh do vi khuẩn




•
•
•
•

Ứng dụng phát hiện helicobacter pylori trong mẫu huyết thanh và nước bọt gây bệnh viêm dạ dày
Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu trên vỏ bào tử B. anthracis(gây bệnh than)
Ứng dụng phát hiện virus viêm gan C:(dùng công cụ Elisa)
Lấy mẫu máu của bệnh nhân nghi mắc viêm gan C
Sử dụng kháng thể liên kết với kháng nguyên trên virus viêm gan C.
Bị nhiễm virus viêm gan C, các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên- xét nghiệm dương tính.
Không bị nhiễm vi rút C gan, các kháng thể nói chung sẽ không liên kết với bất cứ điều gì- âm tính.


Ứng dụng trong kĩ thuật SANDWICH ELISA

kết quả dương tính giả,





Một xét nghiệm xác nhận sự hiện diện của một kháng nguyên trên thực tế là không có.
Xảy ra do phản ứng chéo, có thể xảy ra khi các epitope từ một mầm bệnh khác tương tự như tìm thấy trên mầm bệnh đang được thử nghiệm.
xét nghiệm dựa trên kháng thể đa dòng thường chỉ được sử dụng làm xét nghiệm sàng lọc, cần phải có các thí nghiệm khác để chứng minh.

kết quả âm tính giả, xảy ra khi xét nghiệm không phát hiện ra một kháng thể trên thực tế.



Nguyên nhân: Do lượng kháng nguyên dưới mức phát hiện được.


Ưu và nhược điểm của kháng nguyên đa dòng

Những ưu điểm và nhược điểm của kháng thể đa dòng chủ yếu được xác định bởi tính đặc hiệu đa epitope của chúng.
Ưu điểm:

-

Thời gian sản xuất ngắn với chi phí thấp.
Độ ổn định cao và chịu được thay đổi pH hoặc đệm.
Ái lực cao vì là nhiều kháng thể liên kết với một kháng nguyên. Chúng sẽ khuếch đại tín hiệu của kháng nguyên ngay cả với mức độ biểu
hiện thấp.

-

Chịu được những thay đổi nhỏ của epitope kháng nguyên. Kháng thể đa dòng ít nhạy cảm với thay đổi kháng nguyên (biến tính nhẹ, thể đa
hình,...) so với kháng thể đơn dòng.

Nhược điểm:

-

Với sự hiện diện của nhiều kháng thể nên dễ xảy ra phản ứng chéo.
Các kháng thể đa dòng giữa các lô khác nhau có thể không hoàn toàn giống nhau


Cảm ơn thầy cùng toàn thể các bạn đã lắng nghe!