Thiết kế mồi tổng hợp gen sản sinh α amylase từ chủng bacillus subtillis

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC
Thiết kế mồi tổng hợp gen sản sinh
α-amylase từ chủng Bacillus subtillis
GVHD: PGS.TS Nguyễn Văn Cách


Phân tích đề bài

• Quy trình tách dòng gen: Chủng Bacillus subtilis => Tinh sạch và thu DNA tổng số => PCR đoạn
gen sản xuất α-amylase (đoạn gen đích) tạo số lượng đoạn gen đủ lớn => Tạo vector và tách
dòng gen.

Vậy làm sao để tách đặc hiệu đoạn gen đích ? => Cần thiết kế mồi đặc hiệu để PCR cho đoạn
gen đích.

• Thiết kế mồi ảo => Đặt mua mồi dựa trên cơ sở mồi đã thiết kế.


• Thiết kế mồi ảo dựa trên vùng bảo thủ từ khuôn ảo.
•

Khuôn ảo là trình tự Nu của chủng Bacillus subtilis có quan hệ họ hàng gẫn gũi, điều kiện sinh trưởng tương đồng với điều kiện của ta.

• Mượn trình tự Nu của các nhà khoa học cũng nghiên cứu về gene tổng hợp enzyme α-amylase từ Bacillus subtilis để tìm vùng bảo thủ giữa
các chủng Bacillus subtilis này.

• Thiết kế mồi, thực hiện PCR ảo trên khuôn ảo.
• So sánh sản phẩm PCR ảo với kho dữ liệu Database trong NCBI.
• Dự đoán tính trạng sản phẩm.

Tìm kiếm thông tin về các chủng Bacillus subtilis sản xuất α-amylase trên cơ
sở dữ liệu NCBI

Chọn ít nhất 3 bài báo nghiên cứu về
Bacillus Subtilis có sản xuất enzyme
α-amylase.


Bài báo 1

•
•
•
•

Locus: DQ124370
Độ dài: 1977 bp
Version: DQ124370.1
Strain: Bacillus subtilis 233


Bài báo 2

•
•
•
•

Locus: KC113313

Độ dài: 1980 bp
Version: KC113313 .1
Strain: Bacillus subtilis AS01a


Bài báo 3

•
•
•
•

Locus: JQ768415
Độ dài: 1983 bp
Version: JQ768415.1
Strain: Bacillus subtilis JN16


• Các đối tượng dùng tham khảo nghiên cứu đều thuộc cùng loài Bacillus subtilis.
=> Lựa chọn chủng làm khuôn ảo có họ hàng gần và có điều kiện sinh trưởng phát triển tương đồng với điều kiện
sinh trưởng của chủng thực của ta.

• Chọn chủng Bacillus subtilis strain AS01a – được nghiên cứu ở Ấn Độ.


Sử dụng phần mềm Clustal Omega để tìm ra vùng cấu trúc bảo thủ từ
3 chủng trên


Đếm số thứ tự Nucleotide thuộc vùng mà ta chọn để thiết kế mồi.

+ Chọn Nu bắt đầu thiết kế mồi xuôi từ Nu 7– 30
+ Chọn Nu bắt đầu thiết kế mồi ngược 1977– 1954


Sử dụng phần mềm Primer-Blast của NCBI để thiết kế mồi cho phản
ứng PCR ảo


Chạy chương trình, đưa ra kết quả 4 cặp mồi


Tiến hành PCR ảo với khuôn ảo và cặp mồi ảo thứ 1 – sử dụng phần
mềm smsPCR


Sản phẩm PCR ảo

Kích thước sản phẩm PCR ảo 1977 bp


Dựa vào phần mềm Blast của NCBI, tiến hành so sánh sản phẩm PCR ảo với
cơ sở dữ liệu.
Mục đích: Dựa vào sự tương đồng
trình tự Nu mà phán đoán sự tương
đồng tính trạng.
=> Cụ thể: Xem xét sản phẩm PCR
có trình tự tương đồng với các
chủng Bacillus subtilis sản xuất
amylase không qua đó phán đoán

nó có khả năng sản xuất amylase ?



Tìm đọc thông tin về chủng có sự tương đông lớn với
sản phảm PCR ảo



KẾT LUẬN:



Sản phẩm thu được qua thực hiện chươn g trình PCR có khả năng biểu hiện tính trạng sản xuất enzyme α-

amylase.



Kết quả thu được chỉ mang tính tham khảo do ban đầu chỉ mượn thêm 2 trình tự để tìm vùng bào thủ, vì vậy

để có kết luận chính xác ta cần tiến hành tìm hiểu để đưa ra khuôn ảo tốt hơn, so sánh với nhiều trình tự và
rất nhiều bài báo khác.


Phương án tách dòng gen ảo

1.

Chọn vector tách dòng.

2.

Chọn đoạn DNA insert (đoạn gen đích đã được tách riêng và PCR lên số lượng lớn).

3.

Lựa chọn enzyme thích hợp cắt nối thích hợp với vị trí trên vector.

4.

Chèn đoạn DNA inseart vào vector.

5. Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ giữ gen (E.coli DH5α đã loại bỏ độc tính)
6.

Phân lập tế bào có chứa vector tái tổ hợp bằng chỉ thị (kháng sinh, lac Z)

7. Giữ giống bằng glycerol hoặc đông khô.


Vector pCR2.1

•

Thuộc nhóm vector Plasmid

•

Kích thước nhỏ, sao chép nhanh trong tế bào vi khuẩn, tạo số lượng bản sao lớn.

•

Mạnh và đa năng, phù hợp với nhiều RE khác nhau với hàng chục trình tự
nhận biết của chúng được nối tiếp nhau thành một đoạn dài gọi là polylinker.

•

Vùng polylineker gồm 13 trình tự nhận biết bởi 13 enzymee cắt hạn chế tương
tự như vùng polylineker của pUC19 => cho phép gắn xen bất kỳ trình tự DNA
lạ nào, hoặc có thể cho phép tạo dòng đoạn DNA có hai đầu dính khác nhau
mà không cần chất gắn.

Plasmid: pCR2.1 – 3929 bp


Bài báo cáo của em còn nhiều thiếu sót, mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo từ thầy và các bạn ạ
Em cảm ơn thầy và các bạn đã quan tâm lắng nghe