NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT:KỸ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG.TS.VŨ BÍCH NGỌC

9/16/19

TS. Vũ Bích Ngọ

1


SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Đặc điểm sinh học của
tế bào
Các yếu tố ảnh hưởng
đến sự thành công của
nuôi cấy tế bào
9/16/19

TS. Vũ Bích Ngọc-


ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Tăng trưởng và phân chia chậm
Tính chất cần giá đỡ
Tính cơ học yếu
Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
Cơ chế kìm hãm ngược
Có thể được bảo quản lâu dài bằng phương pháp lạnh sâu
9/16/19
9/16/19

..

TS. Vũ Bích Ngọc-
TS. Vũ Bích Ngọc-


Phân chia chậm

Tăng trưởng, phân chia chậm (20-40 giờ)
Hiệu suất sinh chất có hoạt tính sinh học thấp

9/16/19

TS. Vũ Bích Ngọc-


Chu kì tế bào
Interphase:
• Kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động
vật có vú
• Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein
và phát triển về kích thước
o Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi
chu kì tế bào và không phân chia
o Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích
thước, tổng hợp RNA và protein,
có 1 G1 Checkpoint
o S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra
o Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục
phát triển và sản xuất các protein
mới. Có 1 G2 Checkpoint

Điểm kiểm soát G2
• DNA replicated
• cell big
• environment suitable

Mitosis hay M Phase:
• Sự phát triển và tổng hợp protein
• Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.
• Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ
• Có Checkpoint trong giữa kì của
Mitosis (Metaphase Checkpoint) để
đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự
phân chia.

G2
Gap2

Điểm kiểm
soát
Metaphase
• NST sắp xếp
M
Mitosis

trên mặt phẳng
thoi vô sắc

G1
Gap1

G0
S
Synthesis

Điểm kiểm soát G2
• cell big
• environment suitable


Điểm kiểm soát G1
• Là điểm quan trọng quyết
định sự phân chia của tế
• Khi tế bào vượt qua điểm này,
đi vào phase S, quá trình
phân chia không thể đảo
ngược.


Điểm kiểm soát G2
• Đảm bảo tế bào phân chia
thuận lợi
• Nếu tế bào bị lỗi hoặc tổn
thương, G2 checkpoint sẽ
dừng lại để sửa chữa
• Nếu tổn thương không thể
đảo ngược, tế bào đi vào
quá trình apoptosis à đảm
bảo DNA hư hỏng tế bào
không truyền cho thế hệ
sauà quan trọng trong ngăn

ngừa ung thư


Điểm kiểm soát thoi vô sắc


Tính chất cần giá đỡ

-TB bám vào giá đỡ để có thể sống sót, phân chia
- Ngoại trừ: hồng cầu, TB ung thư, 1 số dòng TB liên
tục

9/16/19

TS. Vũ Bích Ngọc-


Tính cơ học yếu

Không có vách tế bàoè tế bào dễ tổn thương
9/16/19

è Tế bào dễ biến đổi

TS. Vũ Bích Ngọc-


Thay đổi kiểu gen và kiểu hình
Dung hợp, biến nạp, tải nạp… à tế
bào thay đổi kiểu gen và kiểu hình

• Ở mỗi tế bào phân chia,
sự tự làm mới và biệt hoá
được quyết định bởi
tương tác của yếu tố bên
trong và tín hiệu hướng
dẫn hoặc tín hiệu chọn lọc
bên ngoài


Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

1
MSC của các loài có khả năng biệt
hoá thành tế bào mỡ như nhau ở
pass 5 (6-8 ngày)

2
rASC và hBMMSC thời gian tạo
giọt mỡ dài hơn ở pass10; không
có khả năng tạo mỡ sau pass 15

3
rBMMSC và hASC: ít thay đổi khả
năng biệt hoá, thời gian hình
thành giọt mỡ không khác nhau
cho đến pass 20


Thay đổi kiểu gen và kiểu hình

hASC và rBMMSC biệt hoá thành dòng tế bào
tạo xương trong suốt quá trình nuôi cấy

rASC và hBMMSC mất khả năng biệt hoá thành
dòng tế bào tạo xương sau pass 10


KÌM HÃM
TIẾP XÚC
- ĐIỀU HOÀ
SỰ TĂNG
SINH

• Kìm hãm tiếp xúc
• Kích thích sự tăng sinh
– Mật độ thấp
– Các tín hiệu từ môi trường:
các nhân tố tăng trưởng
• Ức chế sự tăng sinh
– Giới hạn mật độ: mật độ tế
bào cao
– Kìm hãm tiếp xúc: tương
tác tế bào
– Các tín hiệu từ môi trường:
p53 gene product

14

Các yếu tố ảnh hưởng
đến sự thành công của
nuôi cấy tế bào (tăng sinh
invitro)

TS. Vũ Bích Ngọc-

9/16/19


SỰ TĂNG SINH IN VITRO CỦA TẾ
BÀO
–

–

phụ thuộc vào trạng thái tự nhiên của tế bào:
•
Vai trò của bộ gen – Giới hạn Hayflick
•
Vai trò của sự biểu hiện gen
phụ thuộc Môi trường nuôi cấy
• Cơ chất tế bào bám
• Thành phần sinh lí và sinh hoá của môi trường nuôi
• Thành phần của phase khí
• Nhiệt độ nuôi
• Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền

1
6

Vai trò của bộ gen -giới hạn HayFlick
Leonard
Hayflick
(1965)

Tế bào
phân
chia 5070 lần



Vai trò của bộ gen

1
Chiều dài telomere giảm
theo tuổi

2
Hoạt tính của
telomerase cao nhất ở
các pass đầu tiên

3
Mức độ hoạt động của
telomerase khác nhau
giữa các loài và các
nguồn thu: giảm nhiều
nhất ở rASC và

hBMMSC


Thời gian nhân đôi của rBMMSC không thay đổi
trong suốt quá trình nuôi trong khi ở hASC, rASC,
hBMMSC thời gian này tăng gấp 2

Izadpanah R, Trygg C, Patel B, et al. Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived
From Bone Marrow and Adipose Tissue. Journal of cellular biochemistry. 2006;99(5):1285


Yếu tố phiên mã

Chịu trách nhiệm điều hoà đặc tính sinh
học của tế bào

Các yếu tố khác (bổ sung từ ngoài): định
hướng sự biệt hoá của tế bào

POU được mã hoá bởi Oct-4

BMP-6, TGF-β3, dexamethasone, ascorbate 2phosphate, proline, pyruvate, insulin, transferrin,
selenous acid, 5aza-cystidine

Oct-2 , Sox-2 và Rex 1 điều hoà chặt chẽ trong quá
trình phát triển phôi
Duy trì tính đa tiềm năng của tế bào


SỰ BÁM DÍNH IN VITRO

• Sự bám dính tế
bào là cần thiết
cho sự tăng
sinh và biệt
hóa
• Các phân tử
bám dính tế
bào:
– Tương tác tế
bào-tế bào:
CAMs,
cadherins
– Tương tác tế
bào-chất nền:
integrin,
transmembra
me
proteoglycan

• Phức hợp nối chặt (Tight junctional complex)
trong tế bào biểu mô cho sự tương tác tế
bào-tế bào.
22


23

Các nhân tố
ảnh hưởng

đến sự bám
dính

•
•
•

Sự phân tách bằng enzyme: tiêu hủy các phân
tử bám dính và chất nền ngoại bào
Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng lớp
đơn (monolayer)
Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự tăng
sinh và biệt hóa của tế bào

Experimental Methods 2006


Các yếu tố ảnh hưởng đến sự
thành công của nuôi cấy tế bào

Tế bào thích hợp

Điều kiện thích hợp
Phase rắn
• Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển
eg. glass, plastic, collagen, agar
Phase lỏng
• Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành
phần môi trường nuôi
Phase khí

Nhiệt độ
Độ vô trùng của môi trường

Experimental Methods 2006

24


Pha rắn
• Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và
di chuyển
• Dụng cụ phổ biến nâất là polystyrene plastic
• Những cơ chất khác như glass, filter wells
• Bề mặt có têể được xử lí với:
• Phủ với cơ chất nền như Collagen, poly-l-lysine,
matrigel
• Lớp feeder: monolayer of supporting cells,
perhaps promote cell growth and differentiation
by cell contact and substance secreted
• Neurons on glial cell feeder layers