Xác định thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính của một số hợp chất hóa học từ loài cỏ bách linh (marsdenialongipes)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN TIẾN THÀNH

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC
TỪ LOÀI CỎ BÁCH LINH (MARSDENIA LONGIPES)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THÁI NGUYÊN- 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN TIẾN THÀNH

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ
HOẠT TÍNH CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC
TỪ LOÀI CỎ BÁCH LINH (MARSDENIA LONGIPES)
Ngành: Hóa hữu cơ
Mã ngành: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHẠM VĂN KHANG

THÁI NGUYÊN- 2020

LỜI CAM ĐOAN
Trải qua quá trình nghiên cứu các tài liệu cộng với nỗ lực của bản thân
trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm, công trình nghiên cứu của tôi
đến nay đã hoàn thành. Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt
nghiệp là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ báo cáo nghiên cứu
khoa học nào khác. .

Học viên

Nguyễn Tiến Thành
Xác nhận của khoa chuyên

Xác nhận của giáo viên hướng

môn

dẫn

PGS. TS. Nguyễn Thị Hiền Lan

PGS.TS. Phạm Văn Khang

i


LỜI CẢM ƠN
Với những thành công đã đạt được trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin
được gửi lời cảm ơn chân thành của mình tới PGS. TS. Phạm Văn Khang người
thầy đã luôn tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và tham
gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn. Cảm ơn đề tài Nafosted Mã số 104.012018.348 đã hỗ trợ tài chính cho luận văn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy giáo, cô giáo và các học
viên cao học K25, K26 trong phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ đã tạo điều kiện
nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu.
Tôi xin được cảm ơn các em sinh viên, các bạn học viên nghiên cứu đề tài
khoa học hợp chất thiên nhiên đã cùng cộng tác với tôi trong suốt quá trình
nghiên cứu, thí nghiệm hoàn thành đề tài luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tập thể Ban giám hiệu nhà trường, Ban
chủ nhiệm khoa Hóa, các thầy cô trong khoa Hóa Học và phòng Đào tạo sau đại
học - trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi hoàn thành luận văn này.
Thái Nguyên,16 tháng 05 năm 2020
Học viên

Nguyễn Tiến Thành

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii
MỤC LỤC ......................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN ..................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................. v
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ............................................................................................ 1
Chương 1 TỔNG QUAN ................................................................................... 2
1.1. Khái quát về loài Cỏ Bách Linh (Marsdenia longipes). .............................. 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật học. .............................................................................. 2
1.1.2. Phân bố. ..................................................................................................... 3
1.2. Tổng quan về chi Marsdenia. ....................................................................... 3
1.3. Khái quát chung về họ Asclepiadaceae R.Br. (Thiên Lý). .......................... 4
1.4. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của các loài trong chi Marsdenia
............................................................................................................................. 5
1.5. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các loài trong chi Marsdenia
........................................................................................................................... 16
1.6. Hoạt động sinh học của steroids trong M. tenacissima ............................ 26
CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM ....................................................................... 29
2.1. Hóa chất và thiết bị phân lập. ..................................................................... 29
2.1.1. Hóa chất................................................................................................... 29
2.1.2. Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học................................. 29
2.2. Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất
phân lập được..................................................................................................... 30
2.2.1. Mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu thực vật. .................................................. 30

iii


2.2.2. Chiết xuất ................................................................................................. 30
2.2.3. Phương pháp định tính các nhóm hợp chất. [3] ..................................... 30
2.2.4. Xác định cấu trúc các chất[3.] .................................................................. 32
2.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư. ................................... 32
2.3.1. Vật liệu và hóa chất. ................................................................................ 32
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro. .................................................... 33
2.3.3. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)[41]. .. 33
2.4. Phân lập, tinh chế các hợp chất. ................................................................. 34
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 37
3.1. Kết quả định tính nhóm hợp chất và kết quả phân lập các hợp chất .......... 37

3.2. Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất ...................................................... 37
3.2.1. Phân tích cấu trúc hợp chất 1 ................................................................. 37
3.2.2. Phân tích cấu trúc hợp chất 2 ................................................................. 43
3.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính độc tế bào trên dòng tế bào ung thư HeLa (cổ
tử cung) và A549 (tế bào ung thư gan). ............................................................. 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 49
1. Kết luận .......................................................................................................... 49
2. Kiến nghị ....................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 50


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN
13

C-NMR

: 13C-Nucler Magnetic Resonance
: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

1

H-NMR

: 1H-Nucler Magnetic Resonance
: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H

COSY

: Corelated Spectroscopy
: Phổ tương quan hai chiều H-H

DEPT

: Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer
: Phổ DEPT

ESI-Ms

: Electron Impact Mass Spectroscopy
: Phổ khối lượng

HMBC

: Heternuclear multiple - Bond Corelation
: Phổ tương quan hai chiều H-C

HSQC

: Heternuclear Spectroscopy- Quantum Coherence
: Phổ tương tác C-H

RP

: Reversed - Phase Chromatography

NP

: Normal - Phase Chromatography

SEM

:Scanning Electro Microscope

LC

: Liquid chromatography
: Sắc ký lỏng

MS

: Mass spectrometry
: Phổ khối lượng

TLTK

: Tài liệu tham khảo

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Danh mục các loài có giá trị trong họ Thiên lý, chi Hàm Liên .......... 4
ở Việt Nam[1]........................................................................................................ 4
Bảng 1.2. Hợp chất nhóm Triterpene .................................................................. 5
Bảng 1.3: Những hợp chất Glucoside ................................................................. 6
Bảng 1.4: Những hợp chất Polyoxyregnanes steroid ........................................ 10
Bảng 1.5: Những hợp chất Trisaccharides ....................................................... 14
Bảng 1.6: Hợp chất Ketopolyhydroxypregnene ................................................ 15
Bảng 1.7: Hợp chất Pregnane Ester .................................................................. 15

Bảng 1.8 Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dịch chiết tổng .......................... 16
M. tenacissima ................................................................................................... 16
Bảng 1.9 Hoạt động của các chất steroid glycosides ........................................ 26
chiết xuất từ M. tenacissima .............................................................................. 26
Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết ethanol ... 37
Bảng 3.2: Giá trị độ chuyển dịch hóa học của chất1 (δ ppm, J Hz) ................ 39
Bảng 3.3: Tác động gây độc tế bào ung thư của chất 1 ..................................... 48

v


DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sắc kí cột silicagel từ cao chiết EA .................................................. 36
Hình 1.1 Hình vẽ tiêu bản mô tả loài Marsdenia longipes .................................. 3
Hình 1.2: Hình ảnh loài Marsdenia longipes ...................................................... 3
Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của chất 1 .................................................................. 38
Hình 3.2. Phổ 13C-NMR của chất 1 ................................................................... 40
Hình 3.3. Sự tương quan giữa HC của chất 1 (HMBC) ................................ 42
Hình 3.4. Phổ MS của chất 1 ............................................................................. 42
Hình 3.5. Công thức cấu tạo của chất 1 ............................................................. 43
Hình 3.6. Phổ 1H-NMR của chất 2 .................................................................... 43
Hình 3.7. Phổ 13C-NMR của chất 2 ................................................................... 44
Hình 3.9. Phổ HSQC của chất 2 ........................................................................ 46
........................................................................................................................... 46
Hình 3.10. Sự tương quan giữa HC của chất 2 (HMBC)............................... 46
Hình 3.11. Phổ MS của chất 2 ........................................................................... 47

vi

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hóa học các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là một trong những
lĩnh vực nghiên cứu đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm. Từ xưa con
người đã khám phá và biết sử dụng nhiều loài động thực vật nhằm mục đích chữa
bệnh. Từ thực tế nhận thấy các hợp chất thiên nhiên thường có nhiều hoạt tính
sinh học tốt, độ ổn định cao và có độc tính thấp.
Các loài thuộc chi Hàm Liên (Marsdenia) đã được sử dụng từ lâu để chữa
một số bênh như: viêm nhiễm, đau bụng. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng
minh dịch chiết cao tổng số và hợp chất hóa học được phân lập từ loài thực vật
này có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, kháng viêm, chống oxi hóa,....
Ở Việt Nam, loài Cỏ Bách Linh (Marsdenia longipes), chi Hàm Liên
(Marsdenia) thuộc họ Thiên lý được phát hiện tại một số tỉnh thuộc khu vực miền
núi phía bắc. Đến nay chưa có công bố nào về thành phần hóa học của loài thực
vật này. Dó đó chúng tôi đề xuất đề tài: Xác định thành phần hóa học và đánh
giá hoạt tính của một số hợp chất hóa học từ loài Cỏ Bách Linh (Marsdenia
longipes).
Đề tài này khi hoàn thành sẽ cung cấp các thông tin khoa học giá trị làm
cơ sở khoa học quan trọng để sử dụng loài thực vật này làm thuốc chữa bệnh và
sàng lọc các hợp chất có hoạt tính tốt để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Đồng
thời góp phần mở ra một hướng nghiên cứu khả quan trong việc ứng dụng các
sản phẩm được chiết xuất từ hợp chất hữu cơ trong quá trình điều trị và hỗ trợ
điều trị các bệnh nam y trong y học.
2. Mục tiêu của đề tài
1. Đánh giá thành phần hóa học bằng phản ứng định tính.
2. Phân lập và xác định cấu trúc ít nhất 2 hợp chất từ lá loài Cỏ Bách Linh
3. Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được.

1

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Khái quát về loài Cỏ Bách Linh (Marsdenia longipes).
1.1.1. Đặc điểm thực vật học.
1.1.1.1. Tên khoa học.
- Tên khoa học: Marsdenia longipes.
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật.

1: Cành chứa lá và hoa. 5: Hoa 9: Cánh lá.
13: Hoa đực
cái.
2: Hoa.
6: Phấn 10: Hoa.
14: Mặt cắt ngang
hoa.
của hoa đực.
3: Tràng hoa mở rộng
7: Hạt
11: Tràng hoa mở ra
15: Hoa cái.
giống.
4: Trụ và tràng hoa
8: Hạt. 12: Trụ và lõi tràng hoa. 16: Phấn hoa.
Hình 1.1 Hình vẽ tiêu bản mô tả loài Marsdenia longipes
- Marsdenia longipes được coi như là một loài mới và được tìm thấy từ các
tỉnh miền núi phía bắc của Việt Nam. Nó có hình thái tương tự như Marsdenia R. Br.
nhưng khác về số lượng hoa trên cuống, chiều dài cột sống và cuống lá, đỉnh của lá,

2

loại hình phiến, màu cánh hoa, hình dạng quả và số hạt trên mỗi quả. Các đặc điểm
hình thái chẩn đoán cùng với hình ảnh SEM của hạt phấn và hạt của Marsdenia
longipes và các loài đồng minh được mô tả ở hình 1.2.[2]

Hình 1.2: Hình ảnh loài Marsdenia longipes
1.1.2. Phân bố.
- Cây chủ yếu phân bố ở các tỉnh miền núi phía bắc của Việt Nam, Lào và
Trung Quốc.
1.2. Tổng quan về chi Marsdenia.
- Tên khoa học: Marsdenia longipes.
- Tên tiếng việt: Bách Linh
- Marsdenia là một chi lớn bao gồm hơn 120 loài, chủ yếu ở khu vực các
tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, Lào và Trung Quốc.
- Chi Marsdenia có thể được mô tả như sau:
 Cây leo hay trườn, không có rễ phụ phát triển trên thân, có thể là dây leo
hoặc đôi khi trườn dưới mặt đất.
 Lá mọc đối không nạc, phiến lá hình trứng, cuống lá dài, mảnh.
 Hoa nhỏ màu trắng, cụm hoa gồm nhiều nhánh.
 Gốc đài hoa có các tuyến mọc xen kẽ với lá đài, ít khi không có tuyến
đài.

3


 Tràng hình cái hũ, thùy tràng không gập vào trong nụ, phủ nhau bên phải,
họng tràng thường có lông, mặt trong thùy tràng không có gờ. Tràng phụ đơn
dính với cột nhị nhụy, vảy tràng phụ thường ngắn hình tam giác.
 Chỉ nhị dính nhau; bao phấn 2 ô, có phần phụ ở đỉnh; hạt phấn dính thành

khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở
đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót đính và 2 chuôi; khối phấn hướng lên, chỉ có
một khối phấn trong mỗi ô phấn.
 Đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy.
 Quả đại
 Hạt nhiều, có mào lông ở đỉnh
1.3. Khái quát chung về họ Asclepiadaceae R.Br. (Thiên Lý).
- Tên khoa học: Asclepiadaceae R.Br
- Tên tiếng việt; Thiên Lý ( Bách, Hàm Liên).
- Cây dây leo hay trườn. Lá hình trứng, cuống lá thường dài và mảnh.
- Cụm hoa chùm với nhiều hoa có mầu sắc khác nhau.
- Phân bố ở khu vực nhiệt đới. Ở Việt Nam có khoảng trên 120 loài.
- Giá trị kinh tế: Nhiều loài làm thuốc và làm cảnh (Cleome speciosus).
Bảng 1.1: Danh mục các loài có giá trị trong họ Thiên lý, chi Hàm Liên
ở Việt Nam[1]
STT

Tên khoa học

Tên Việt Nam

LT TP

LG LC CDK

1

Marsdenia tenacissima

Hàm liên nam

X

X

2

Marsdenia hainanensis

Hàm liên hải nam

X

X

3

Marsdenia koi T siang

Hàm liên Kôi

4

Marsdenia balansae Cost.

Hàm liên Ba Vì

5

Marsdenia glabra Cost

Hàm liên không lông

X

6

Marsdenia tinctoria R. Br

Hàm liên nhuộm

X

7

Marsdenia tonkinensis Cost Nhạ nhầu
X
Ghi chú: LT: làm thuốc; TP: thực phẩm (làm rau ăn, lấy quả); LG: lấy

X

X

gỗ; LC: làm cảnh; CDK: công dụng khác.

4

X

X

1.4. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học của các loài trong chi Marsdenia

- Trên thế giới, chi Marsdenia cũng đã được quan tâm nghiên từ khá sớm,
nhiều cấu trúc các hợp chất được phân lập từ chi Marsdenia thuộc loại Triterpen;
Glycoside; C21 Polyoxyregnanes steroid; trisaccharides; sitosterol; 2-Deoxy
sugars; Flavonoid như kaempferol; Trifolin ( kaemferol 3-galactoside; 1ketopolyhydroxypregnene), Pregnane Ester,….[3-41]
- Các chất thuộc nhóm C21 steroid phân lập được trong chi Marsdenia có đặc
điểm ở vị trí C-11 và C-12 thường có các liên kết ester với các acid và vị trí số 3 có
liên kết glycoside và ở vị trí C-17 có thể có cấu hình α- hoặc β-. Bên cạnh đó nhiều
chất thuộc nhóm triterpene, flavonoid, sterol,… cũng được phân lập, xác định cấu
trúc theo các phương pháp quang phổ. Dưới đây là một số nhóm chất tiêu biểu của
chi Marsdenia:
Bảng 1.2. Hợp chất nhóm Triterpene
STT Định danh chất

Công thức cấu tạo

Loài
Marsdenia

3β,16β,21β,22α,
1

TLTK
[26]

globifera

28pentahydroxyolean-12-ene on

[26]
3β,16β,21β,22α,
2

Marsdenia

28-

globifera

pentahydroxyolean-12-ene on

5


Bảng 1.3: những hợp chất Glucoside
STT Nhóm chất

1

Công thức cấu tạo

Loài

16

Marsdenia

Glycoside

tenacissima

TLTK

[18]

mới được
phân lập
từ rễ.
[18]

[18]

6


2

Glycoside

Marsdenia

được phân

roylei

[20]

lập từ thân

[36]

[36]

7


[36]

[36]

[36]

[36]

[36]

8


[36]

[36]

[19]

[19]

9


[38]

Bảng 1.4: Những hợp chất Polyoxyregnanes steroid
STT

Nhóm chất

Công thức cấu tạo

10

Loài

TLTK


1

Polyoxypre

Marsdenia

gnanes

tenacissima

[6]

steroid

[6]
2

[6]
3

4

[12]

[12]
5

11


[12]
6

7

[12]

8

[12]

12


9
[16]

10
[29]

11

[29]

13


Bảng 1.5: Những hợp chất Trisaccharides
STT

Nhóm chất

Công thức cấu tạo

Trisaccharides

Loài

Marsdenia

1

TLTK

[4]

roylei

2

[4]

[4]
3

4

[4]

5

[4]

14


6

[4]

7

[4]

Bảng 1.6: Hợp chất Ketopolyhydroxypregnene
STT
1

Nhóm chất

Công thức cấu tạo

Loài

Ketopolyhydroxypre

Marsdenia

gnene

volubilis.

TLTK
[5]

Bảng 1.7: Hợp chất Pregnane Ester
STT

Nhóm chất

1-4

A Pregnane Ester

Công thức cấu tạo

Loài
Marsdenia

TLTK
[32]

tenacissima

[32]

15


1.5. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các loài trong chi Marsdenia
- Thành phần hóa học chính của loài trong chi Marsdenia là Triterpen,
Glycoside; Polyoxyregnanes steroid. Các hợp chất này có tác dụng chủ yếu trong
việc chống oxi hóa, hoạt tính kháng viêm, ức chế tế bào ung thư [7-41]
- Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học chủ yếu tập trung vào loài Marsdenia
tenacissima.
+ Từ những năm 1970, dịch chiết loài M. tenacissima extract đã được thử
nghiệm ức chế tế bào ung thư. Đến nay, có nhiều công trình đã công bố về thử
nghiệm in vitro và in vivo khả năng ức chế tế bào ung thư của dịch chiết và chất
phân lập được.
Bảng 1.8 Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dịch chiết tổng
M. tenacissima

In vitro
Mô hình

Kết quả

Trong invitro, hoat động ức

Chiết xuất của M. tenacissima thể

chế tăng trưởng lymphoma

hiện hoạt tính ức chế các dòng tế

ác tính ung thư thục quản,

bào ung thư (% tỷ lệ ức chế) : U

ung thư phổi, dạ dày, gan và

lymphoma ác tính (40,0%), ung

ung thư cổ tử cung

thư thục quản (26,3%), ung thư
phổi (21,4%), ung thư dạ dày
(26,7%),ung thư gan (33,3%) và
ung thư cổ tử cung (50,0%)

16

TLTK