Báo cáo thực hành thí nghiệm vi sinh thực phẩm HCMUTE

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KĨ THUẬT TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM
_____________________

BÁO CÁO THỰC HÀNH
THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: Ts. Phạm Thị Hoàn

Nhóm thực hiện: Nhóm 2, Sáng t6 tiết 1-5
1. Phạm Thanh Vinh

16116101

2. Hứa Thị Ngọc Huyền

16116033

3. Đinh Thị Phƣơng Thanh

16116078

4. Bùi Mạnh Quang

16116069

05/2018


MỤC LỤC
MỤC LỤC......................................................................................................................................2

DANH MỤC HÌNH.......................................................................................................................5
Bài 1: ĐỊNH LƢỢNG COLIFROM BẰNG PHƢƠNG PHÁP MPN ......................................6
1.

Mục đích .........................................................................................................................................................6

2.

Vật liệu và phương pháp.................................................................................................................................6

3.

Cách tiến hành ................................................................................................................................................6
3.1

Chuẩn bị môi trường LTB: Môi trường LTB (Lauryl Tryptose Broth): .................................................6

3.2

Chuẩn bị môi trường BGBL: ..................................................................................................................6

3.3

Quy trình tiến hành .................................................................................................................................6

4.

Kết quả ...........................................................................................................................................................7

5.

Nhận xét....................................................................................................................................................... 13

Bài 2 ĐỊNH LƢỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ .....................................................14
1.

Mục đích ...................................................................................................................................................... 14

2.

Vật liệu và phương pháp.............................................................................................................................. 14

3.

Cách tiến hành ............................................................................................................................................. 14
3.1

Chuẩn bị môi trường môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga – PCA): ..................................... 14

3.2

Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích : ..................................................................................................... 15

3.3

Đổ hộp ................................................................................................................................................. 15

4.

Kết quả ........................................................................................................................................................ 15

5.

Nhận xét....................................................................................................................................................... 17

Bài 3: ĐỊNH LƢỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM MỐC ...................................................18
1.

Mục đích ...................................................................................................................................................... 18

2.

Vật liệu và phương pháp.............................................................................................................................. 18

3. Cách tiến hành ................................................................................................................................................. 18
3.1

Chuẩn bị môi trường sử dụng (Potato dextrose agar) ........................................................................ 18

3.2

Hấp tiệt trùng ...................................................................................................................................... 18

3.3

Pha loãng mẫu ..................................................................................................................................... 19

3.4

Trải đĩa ................................................................................................................................................ 19

4.

Kết quả ........................................................................................................................................................ 20

5.

Nhận xét....................................................................................................................................................... 21

BÀI 4: KĨ THUẬT CẤY RIA VÀ MÔI TRƢỜNG CHUYÊN BIỆT ....................................22
1.

Mục đích ...................................................................................................................................................... 22
2


2.

Vật liệu ........................................................................................................................................................ 22

3.

Cách tiến hành ............................................................................................................................................. 22
3.1

Chuẩn bị môi trường môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga – PCA): ..................................... 22

3.2

Hấp tiệt trùng ...................................................................................................................................... 23

3.3

Cấy ria ................................................................................................................................................. 23

4.

Kết quả ........................................................................................................................................................ 24

5.

Nhận xét....................................................................................................................................................... 25

Bài 5 – TIÊU BẢN GIỌT TREO – TIÊU BẢN GIỌT ÉP ......................................................26
QUAN SÁT SỰ DI ĐỘNG CỦA VI KHUẨN ..........................................................................26
1.

Mục đích ...................................................................................................................................................... 26

2.

Vật liệu và phương pháp.............................................................................................................................. 26

3.

Cách tiến hành ............................................................................................................................................. 26
3.1

Tiêu bản giọt treo ................................................................................................................................ 26

3.2

Tiêu bản giọt ép ................................................................................................................................... 26

3.3

Quan sát dưới kính hiển vi: ................................................................................................................. 27

4.

Kết quả ........................................................................................................................................................ 27

5.

Nhận xét và giải thích .................................................................................................................................. 27

Bài 6 – TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN ..............................................................................28
1.

Mục đích ...................................................................................................................................................... 28

2.

Vật liệu và phương pháp.............................................................................................................................. 28

3.

Cách tiến hành ............................................................................................................................................. 28
3.1

Tạo vết bôi ........................................................................................................................................... 28

3.2

Nhuộm đơn .......................................................................................................................................... 28

4.

Kết quả ........................................................................................................................................................ 29

5.

Nhận xét kết quả .......................................................................................................................................... 30

BÀI 7: NHUỘM BÀO TỬ ..........................................................................................................32
1.

Mục đích ...................................................................................................................................................... 32

2.

Vật liệu và phương pháp.............................................................................................................................. 32

3.

Cách tiến hành ............................................................................................................................................. 32

4.

Kết quả ........................................................................................................................................................ 33

5.

Nhận xét và giải thích .................................................................................................................................. 33

BÀI 8: NHUỘM GRAM .............................................................................................................34
1.

Mục đích ...................................................................................................................................................... 34

2.

Vật liệu và phương pháp.............................................................................................................................. 34
3


3.

Cách tiến hành ............................................................................................................................................. 35

4.

Kết quả ........................................................................................................................................................ 35

5.

Nhận xét và giải thích .................................................................................................................................. 35

BÀI 9: QUAN SÁT NẤM SỢI ...................................................................................................37
1.

Mục đích ...................................................................................................................................................... 37

2.

Vật liệu và phương pháp.............................................................................................................................. 37

3.

Cách tiến hành ............................................................................................................................................. 37
3.1

Quy trình quan sát hình thái nấm mốc ................................................................................................ 37

3.2

Quy trình chuẩn bị tiêu bản phòng ẩm ................................................................................................ 37

4.

Kết quả ........................................................................................................................................................ 38

5.

Nhận xét....................................................................................................................................................... 40

4


DANH MỤC HÌNH

nh 1.1 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-1 ................................................................. 7
nh 1.2 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-2 ................................................................. 8
nh 1.3 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-3 ................................................................. 8
nh 1.4 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-4………………………………………… 9
nh 1.5 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-5…………………………………………...9
nh 1.6 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-1……………………………………… 10
nh 1.7 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-2 ............................................................ 10
nh 1.8 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-3 ............................................................ 11
nh 1.9 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-4 ........................................................... 11
nh 1.10 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-5……………………………………....12
nh 2.1 Định lượng vi khuẩn hiếu khí với mẫu có nồng độ pha loãng 10-1……….....16
nh 2.2 Định lượng vi khuẩn hiếu khí với mẫu có nồng độ pha loãng 10-2……….....16
nh 2.3 Định lượng vi khuẩn hiếu khí với mẫu có nồng độ pha loãng 10-3 ............... 16
nh 3.1 Định lượng nấm mem/nấm mốc với mẫu có độ pha loãng 10-2..................... 20
nh 3.2 Định lượng nấm mem/nấm mốc với mẫu có độ pha loãng 10-3..................... 20
nh 3.3 Định lượng nấm mem/nấm mốc với mẫu có độ pha loãng 10-4..................... 21
nh 4.1 Kết quả cấy ria lần 1 ...................................................................................... 24
nh 4.2 Kết quả cấy ria lần 2 ...................................................................................... 25
nh 4.3 Kết quả cấy ria lần 3 ...................................................................................... 25
nh 6.1 Nấm men nhộm bằng Alkaline methylene blue ............................................. 29
nh 6.2 Nấm men nhuộm bằng Crystal violet ............................................................ 29
nh 6.3 Nấm men nhuộm bằng Cacbolfuchsin ........................................................... 30
nh 6.4 Vi khuẩn Lactic nhuộm bằng Crystal violet ................................................. 30
nh 7.1 Nhuộm bào tử ................................................................................................. 33
nh 8.1 Nhuộm gram vi khuẩn E.coli ......................................................................... 35
nh 9.1 Nấm sợi quan sát bằng vật kính x4 ................................................................ 39
nh 9.2 Nấm sợi quan sát bằng vật kính x10 .............................................................. 39
nh 9.3Tiêu bản phòng ầm .......................................................................................... 39
nh 9.4 Tiêu bản nấm sợi quan sát bằng vật kính x10 ................................................ 40
nh 9.5 Tiêu bản nấm sợi quan sát bằng vật kính x40 ................................................ 40

5


Bài 1: ĐỊNH LƢỢNG COLIFROM BẰNG PHƢƠNG PHÁP MPN
1. Mục đích
Dùng phương pháp MPN (most probable number) để đánh giá số lượng Coliforms
có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu, rồi sau đó rút ra kết luận
về mức độ vệ sinh của mẫu, nguy cơ hư hỏng của thực phẩm và khả năng gây ảnh
hưởng đến sức khỏe con người ở mức độ vi sinh vật này.
2. Vật liệu và phƣơng pháp
 Vật liệu :
- Môi trường LSB (Lauryl Sulfate Broth – dạng bột pha sẵn), BGBL (Billiant Green Bile
Lactose Broth – dạng bột pha sẵn).
- Nước cất pha loãng mẫu.
- Ống nghiệm, pipette tips, micropipette và bộ dụng cụ thí nghiệm ( giấy , nước cất, đèn cồn,
que cấy, bút lông…), 7 ống eppendorf cho 7 độ pha loãng mẫu (mỗi độ pha loãng 1 ống).
- Mẫu: nước trong hồ
Hấp tiệt trùng môi trường LSB, nước cất, các dụng cụ thí nghiệm (được bao lại bằng giấy
bạc hoặc giấy báo để tránh vi sinh vật bên ngoài gây nhiễm) ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút.
Phương pháp MPN
3. Cách tiến hành
3.1 Chuẩn bị môi trường LTB: Môi trường LTB (Lauryl Tryptose Broth):
Môi trường LTB gồm có :
_Trytose 20g/L
_Potassium dihydrogen photsphate 2.75g/L
_Lactose 5g/L
_Sodium lauryl sulfate 0.1g/L
_Sodium chloride 5g/L
_Dipotassdium hydrogen photsphate 2.75g/L

Dùng 5,34g LTB đã pha sẵn pha để chuẩn bị thành 150ml môi trường.
3.2 Chuẩn bị môi trường BGBL:
Môi trường BGBL gồm:
_Pepton 1%
_Lactose 1%
_Ox-bile khô 2%
_Brilliant Green 0.0133 g/L
pH 7.2 (25°C)
Nếu dùng 40g hỗn hợp pha sẵn thì chuẩn bị được 1000ml môi trường BGBL
3.3 Quy trình tiến hành
Pha loãng mẫu: mẫu được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette vô
trùng chuyển 0.15ml mẫu vào ống eppendorf chứa 1.35ml nước cất, trộn đều ta được mẫu có
độ pha loãng 10-1 . tiếp tục lấy 1 ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml nước từ độ pha loãng 106


1

sang ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng thứ 2. Trộn mẫu thật kỹ. Dung dịch này có độ
pha loãng 10-2. Tiếp tục tiến hành tương tự đến độ pha loãng 10-7.
a. Tuần tự cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống
chứa 10 ml môi trường LSB và ống durham úp ngược. Thực hiện tương tự với dịch mẫu
đã pha loãng 10-2, 10-3 đến 10-7. ủ ống nghiệm trong 48h giờ ở 37˚C. ống dương tính là
ống có màu đục và có bọt khí trong ống Durham. Ghi nhận số ống dương tính.
b. Thử nghiệm khẳng định : dùng que cấy vòng chuyển mẫu từ các ống LSB dương tính
sang các ống nghiệm chứa môi trường BGBL và ủ trong 48 giờ. Ghi nhận số ống dương
tính ứng với mỗi độ pha loãng. Lựa chọn các độ pha loãng và tính kết quả.
4. Kết quả
Kết quả LTB

n 1.1 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-1

7


n 1.2 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-2

n 1.3 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-3
8


n 1.4 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-4

n 1.5 Kết quả LTB với độ pha loãng 10-5
Kết quả BGBL
9


n 1.6 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-1

n 1.7 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-2
10


n 1.8 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-3

n 1.9 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-4

11

n 1.10 Kết quả BGBL với độ pha loãng 10-5
Các ống nghiệm có bọt khí trong ống durham và môi trường bị đục (so với ống đối chứng
bên phải) là ống dương tính.
ảng 1 Số ống dương tín
Độ pha loãng

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

LTB

3

3

3

3

2

BGBL

3

3

3

3

2

Vậy kết quả là:
10-3

10-4

10-5

Tra bảng MPN

MPN/ml

3

3

2

1100

1100.103

12


5. Nhận xét
Theo QCVN 01: 2009/BYT về quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước sinh hoạt:

Với kết quả MPN/ml cho thấy nguồn nước từ mẫu có số lượng Coliforms khá cao
(1100.103 MPN/ml), vượt quá giới hạn tối đa cho phép, điều này chứng minh nguồn nước
không đảm bảo vệ sinh, không được phép sử dụng trong sinh hoạt.

13


Bài 2 ĐỊNH LƢỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ
1. Mục đích
Tổng số vi khuẩn hiếu khí là một chỉ tiêu vi sinh cơ bản của thực phẩm .
Dựa vào chỉ tiêu này, người ta có thể đánh giá khái quát về tình trạng vệ sinh của
thực phẩm cũng như dự đoán thời gian bảo quản của sản phẩm. Số khuẩn lạc nhóm vi
khuẩn hiếu khí có trong 1g hoặc 1ml thực phẩm càng cao chứng tỏ điều kiện vệ sinh
sản xuất kém và thời gian sản phẩm sẽ càng ngắn. Tùy thuộc vào loại thực phẩm mà giá
trị tổng số vi khuẩn hiếu khí cho phép có mặt trong sản phẩm có thể thay đổi.
2. Vật liệu và phƣơng pháp
 Vật liệu :
_ Môi trường sử dụng là môi trường M1 – môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga
– PCA) có pH 7.0 ± 0.2.
- Đĩa petri.
- Bình tam giác chứa nước cất.
- Các bình cầu chứa môi trường.
- Các ống đầu tuýp, hộp đựng đầu tuýp.

- Cốc đựng rác trong quá tr nh đổ hộp.
- Micro pipet, pipet tip.
- Đèn cồn.
- Mẫu: nước dưa chua
Dụng cụ phải được vô trùng bằng autoclave ở 121OC trong 30 phút: Đĩa petri, bình tam
giác, bình cầu chứa môi trường, ống đầu tuýp, hộp đựng đầu tuýp.
 Phương pháp đếm khuẩn lạc
3. Cách tiến hành
3.1 Chuẩn bị môi trường môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga – PCA):
Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 1000ml nước. Đun sôi 30 phút. Lấy phần dịch
trong rồi thêm nước cho đủ 1000 ml. Bổ sung thêm 50g glucose (5% w/v); 1g pepton (0,1%
w/v) và 22g agar (2,2% w/v).
Môi trường được pha chế, phân phối vào 2 bình thủy tinh được đậy kín bằng bông
gòn không thấm nước ở miệng b nh. Sau đó quấn giấy bạc hoặc giấy báo xung quanh
miệng bình cho kín. Không nên phân phối môi trường vào đĩa petri trước rồi mới hấp vì
14


sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạp chất và sau
quá trình nuôi cấy sẽ khó quan sát và làm ảnh hưởng đến kết quả.
 Vai trò của mỗi thành phần trong môi trường:
_Giá đỗ cung cấp nguồn dinh dưỡng gồm các chất khoáng vitamin…
_Glucose cung cấp nguồn năng lượng.
_Pepton cung cấp nguồn nitơ.
_Agar có tác dụng làm đông cứng bề mặt thạch để cố định và dễ dàng quan sát khuẩn
lạc.
Phải pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật vì môi trường dinh dưỡng gồm hỗn hợp
các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm
thấu, cân bằng ion của tế bào và sự ổn định pH của môi trường để vi sinh vật sinh
trưởng và phát triển tối ưu nhất.

3.2 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích :
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml mẫu vào
ống nghiệm chứ 9 ml nước vô trùng, trộn thật kỹ. Dung dịch này có độ pha loãng 10-1. Tiếp
tục chuyển 1 ml mẫu từ độ pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9 ml nước vô trùng thứ 2,
trộn thật kỹ. Dung dịch này có độ pha loãng 10-2. Tiếp tục làm tương tự đến độ pha loãng 103
.
3.3 Đổ hộp
- Dùng bút lông ghi chú lên đĩa petri ( tên mẫu, ngày tiến hành, độ pha loãng, nhóm nghiên
cứu..)
- Dùng pipet vô trùng chuyển 2 ml mẫu pha loãng vào giữa đĩa petri. Tương ứng với mỗi
độ pha loãng 3 đĩa
- Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường PCA đã được đun chảy và ổn định ở
45-50˚C
- Trộn đều mẫu bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều
3-5 lần ngày sau khi đổ môi trường.
- Đặt các đĩa petri trên mặt phẳng ngang và để yên cho môi trường đông đặc hoàn toàn.
- ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30˚C trong 24-48 giờ, 24h kiểm tra kết quả sơ bộ, 48h kiểm tra
kết quả chính thức.
Lƣu ý: Khi ủ phải để hộp petri ở trạng thái lật úp (phần môi trường ở trên, phần nắp
nằm bên dưới)
4. Kết quả

15


Hình 2.1 Mẫu có nồng độ pha loãng 10-1

Hình 2.2 : Mẫu có nồng độ pha loãng 10-2

Hình 2.3 : Mẫu có nồng độ pha loãng 10-3

16


Bảng kết quả
Đĩa

Nồng độ 10-1

10-2

10-3

1

18

8

6

2

27

7

5

Tính toán kết quả

(

)

5. Nhận xét
Kết quả được quan sát sau 48h.
Đặc điểm của các khuẩn lạc : Các khuẩn lạc trải đều ra bề mặt thạch
Màu sắc: khuẩn lạc có màu trắng sữa
Hình dạng : chủ yếu là chấm điểm có đường kính khoảng 0.1 mm, viền khuẩn lạc trơn
láng, nhiều nhất ở 2 đĩa 10-1 .

17


Bài 3: ĐỊNH LƢỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM MỐC
1. Mục đích
Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc từ đó thông qua số lượng nấm men nấm
mốc đếm được để xác định, đánh giá chất lượng của mẫu, nguy cơ hư hỏng, thời hạn
bảo quản và mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực , đồng thời quan
sát được hình thái, cấu trúc của nấm men và nấm mốc.
2. Vật liệu và phƣơng pháp
 Vật liệu :
_Môi trường sử dụng là môi trường M5 – môi trường Potato dextrose agar
_Nước cất dùng để pha loãng mẫu.
_12 đĩa petri cho 4 độ pha loãng mẫu (mỗi độ pha loãng 3 đĩa).
_5 ống eppendorf cho 5 độ pha loãng mẫu - Micropipette và hộp pipette tips.
_đèn cồn và hột quẹt.
_Cốc đựng ethanol
_Que cấy hình L
_Mẫu: nước mía căn tin Trường Đại học Sư phạm Kĩ thuật TP.HCM

 Phương pháp:
3. Cách tiến hành
3.1 Chuẩn bị môi trường sử dụng (Potato dextrose agar)
Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 100g khoai tây cắt lát, không gọt vỏ với 500ml
nước trong 30 phút. Lọc qua giấy lọc, giữ lại phần dịch, đó là chất chiết khoai tây. Lấy 50ml
(20% v/v) dịch chiết khoai tây, thêm 200ml nước cất, 6g glucose (2%), 6g agar (2%).
3.2 Hấp tiệt trùng
Hấp tiệt trùng trong Autoclave ở 121°C trong 15 phút, gồm:
- Môi trường được pha chế, phân phối vào 2 bình thủy tinh được đậy kín bằng bông
gòn không thấm nước ở miệng b nh. Sau đó quấn giấy bạc hoặc giấy báo xung quanh
miệng bình cho kín.
- Nước cất khoảng 70ml được chứa trong erlen, được đậy kín bằng bông gòn không
thấm nước ở miệng b nh. Sau đó quấn giấy bạc hoặc giấy báo xung quanh miệng bình
cho kín.
- 12 cặp đĩa petri đã rửa sạch bọc trong giấy bạc hoặc giấy báo.
18


- 6 ống eppendorf
- Hộp pipette tips bọc trong giấy bạc hoặc giấy báo.
3.3 Pha loãng mẫu
Dùng micro pipette pha loãng mẫu theo dãy thập phân từ 10-1 đến 10-5.
3.4 Trải đĩa
Sử dụng kỹ thuật trãi đĩa để tiến hành xác định chỉ tiêu tổng số nấm men, nấm mốc trong
mẫu
- Ghi nhãn lên đĩa petri ( tên mẫu, tên kỹ thuật viên, ngày,..)
- Đổ môi trường vào trong đĩa petri khoảng 15 ml. Chờ môi trường đông đặc hoàn toàn.
- Dùng pipette cho 2 ml mẫu vào chính giữa đĩa thạch
- Nhúng que thủy tinh hình L vào một cốc chưa ethanol. Sau đó gõ nhẹ que thủy tinh vào
thành cốc để loại bớt ethanol thừa

- Khẽ đưa que thủy tinh gần ngọn lửa đèn ethanol để làm bốc cháy que thủy tinh. Làm
nguội bằng cách chạm que thủy tinh vào phần nắp bên trong đĩa thạch.
- Trãi mẫu vi sinh vật sao cho dàn đều khắp bề mặt môi trường thạch.
- Nhúng que thủy tinh vào ethanol, gõ nhẹ vào cốc và đốt cháy que thủy tinh.
- Lặp lại thao tác với đĩa thạch kế tiếp. Tương ứng với mỗi độ pha loãng thực hiện 3 lần
- Tiến hành nuôi cấy trong tủ ủ vi sinh ở 30˚C trong 16-48h
- Tiến hành quan sát h nh thái đại thể của khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc nấm men/ nấm mốc
và ghi nhận lại kết quả.
Lƣu ý: Trong thời gian ủ, nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào trong môi
trường nuối cấy, tạo thành khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt
thời gian ủ, hạn chế chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt
khác khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để tránh sự phát tán của
bào tử và không khí, gây nhiễm vào mẫu hay môi trường nuôi cấy khác. Khi ủ phải
để hộp petri ở trạng thái lật úp (phần môi trường ở trên, phần nắp nằm bên dưới) .

19


4. Kết quả

Hình 3.1: Mẫu có nồng độ pha loãng 10-2

Hình 3.2 : Mẫu có nồng độ pha loãng 10-3

20


Hình 3.3: Mẫu có nồng độ pha loãng 10-4
10-2

10-3

10-4

1

>400

328

91

2

>400

336

83

3

>400

364

103

Nồng độ
Đĩa

Tính toán kết quả
(

)

5. Nhận xét

Ở các đĩa thạch với nồng độ pha loãng 10-1 và 10-2 số lượng khuẩn lạc lớn nên không
đếm. Các đĩa thạch với nồng độ pha loãng 10-3 đến 10-4 số lượng khuẩn lạc ít hơn, có thể
đếm được. Nồng độ pha loãng 10-5 không thấy khuẩn lạc xuất hiện.
Nấm mốc có cấu tạo dạng sợi nhỏ màu trắng phát triển thành các mầm/chồi, khúm
nấm mốc tròn to, đường kính khoảng 1 – 4 mm, mọc lan như lông tơ, dẹt.
Nấm men là những tế bào đơn tính theo kiểu nảy chồi, phát triển thành các khuẩn
lạc tròn, một số oval, khu màu trắng nhạt, đường kính nhỏ hơn nấm mốc, khoảng 0,5 –
1 mm, khuẩn lạc nấm men có mép viền đều, bề mặt bóng và lồi ít.
21


BÀI 4: KĨ THUẬT CẤY RIA VÀ MÔI TRƢỜNG CHUYÊN BIỆT
1. Mục đích
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu
và đưa về dạng thuần khiết. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc
nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.
Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ một tế bào ban
đầu. Trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở
dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá
hoặc sử dụng vào thực tiễn một loài nào đó th cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết.
Kỹ thuật cấy ria (streak-plate technique) có thể tạo ra được các khuẩn lạc thuần
khiết và cô lập.

2. Vật liệu
 Vật liệu:
_Môi trường sử dụng là môi trường M1 – môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga –
PCA) có pH 7.0 ± 0.2.
_Nước cất dùng để pha loãng mẫu.
_Micropipette và hộp pipette tips.
_Đèn cồn và hột quẹt.
_Đĩa petri.
_Que cấy vòng.
_Mẫu khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí ( lấy từ bài định lượng vi khuẩn hiếu khí)
Môi trường được pha chế, phân phối vào các b nh thủy tinh, nước cất và các dụng cụ được
hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Các b nh chứa môi trường chưa được sử dụng phải
được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-8 °C. Trước khi sử dụng phải được đun chảy và làm nguội
khoảng 45 - 50°C.
3. Cách tiến hành
3.1 Chuẩn bị môi trường môi trường giá đậu đường (Plate Count Aga – PCA):
Cân 100g giá đậu (đã rửa sạch), thêm 500ml nước. Đun sôi 30 phút. Lấy phần dịch trong
rồi thêm nước cho đủ 250 ml. Bổ sung thêm 12,5g glucose (5% w/v); 0,25g pepton (0,1%
w/v) và 5.5g agar (2,2% w/v).

22


3.2 Hấp tiệt trùng
Hấp tiệt trùng trong Autoclave ở 121°C trong 15 phút (nhằm tiêu diệt hết tất cả các bào
tử), gồm:
_Môi trường được pha chế, phân phối vào 2 bình thủy tinh được đậy kín bằng bông gòn
không thấm nước ở miệng b nh. Sau đó quấn giấy bạc hoặc giấy báo xung quanh miệng
bình cho kín. Không nên phân phối môi trường vào đĩa petri trước rồi mới hấp vì sẽ làm
nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạp chất và sau quá trình

nuôi cấy sẽ khó quan sát và làm ảnh hưởng đến kết quả.
_Nước cất khoảng 70ml được chứa trong erlen, được đậy kín bằng bông gòn không thấm
nước ở miệng b nh. Sau đó quấn giấy bạc hoặc giấy báo xung quanh miệng bình cho kín.
_Đĩa petri đã rửa sạch bọc trong giấy bạc hoặc giấy báo.
_Hộp pipette tips bọc trong giấy bạc hoặc giấy báo.
 Lưu ý: sau khi hấp tiệt trùng:
_Các bình chứa môi trường chưa được sử dụng phải được bảo quản trong tủ lạnh ở 28 °C. Trước khi sử dụng phải được đun chảy và làm nguội khoảng 45 - 50°C. Agar là chất
tạo gel tốt, khi để nguội dung dịch agar sẽ tạo thành gel nhờ các liên kết hydro ở nồng độ
thấp (khoảng 0.04%)
_Bình chứa nước cất chưa được sử dụng phải được bảo quản trong tủ lạnh ở 2-8 °C.
_Đĩa petri được cho vào tủ sấy.
3.3 Cấy ria
a. Bật đèn cồn.
b. Đun chảy môi trường thạch.
c. Giữ môi trường thạch ở nhiệt độ 48 - 50°C trong 10 – 15 phút.
d. Mở nút bông và hơ nhẹ b nh đựng môi trường. Đổ môi trường vào trong đĩa petri. Cẩn
thận giữ nắp hộp petri che phần đáy hộp và miệng b nh khi tiến hành đổ đĩa.
e. Sau khi đổ xong, để yên vài phút cho môi trường đặc lại hoàn toàn.
f. Ghi nhãn lên phần đáy thạch ( tên vi khuẩn, độ pha loãng, tên kỹ thuật viên, ngày…)
g. Pha loãng mẫu bằng cách hòa tan 100mg Saccharomyces boulardii dạng khô vào 30ml
nước cất đã tiệt trùng.
h. Dùng thao tác vô trùng lấy một ít sinh khối vi khuẩn bằng que cấy vòng đã vô trùng.
i. Tiến hành cấy ria lên bề mặt thạch đã chuẩn bị xong như sau:

23


j.

é mở nắp hộp petri vừa đủ để cho que cấy vòng vào để tránh ngoại nhiễm.

k. Trải nhẹ nhàng phần sinh khối nấm men + dưa chua lên một khu vực nhỏ trên môi
trường thạch (vùng 1).
l.

ơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó cho que cấy trở lại vào đĩa petri và làm nguội
chúng bằng cách chạm vào phần môi trường gần vùng

m. Tiến hành ria que cấy theo các đường cấy như h nh vẽ. Cứ mỗi lần chuyển sang
vùng cấy mới phải hơ que cấy lại trên ngọn lửa đèn cồn và làm nguội bằng cách chạm
vào vùng môi trường gần bên. Xoay nhẹ đĩa để chuyển từ vùng cấy này sang vùng cấy
khác.
n. Ủ đĩa petri trong tủ ủ với nhiệt độ và thời qian phù hợp (48h). Sau đó lấy ra quan sát và
ghi nhận lại kết quả
4. Kết quả

Hình 4.1: Kết quả cấy ria lần 1
24


Hình 4.2: kết quả cấy ria lần 2

Hình 4.3: Kết quả cấy ria lần 3
5. Nhận xét
- Đường cấy không được đẹp và đều, có làm rách bề mặt thạch.
- Các khuẩn lạc đã được phân lập, phát triển riêng lẻ ở các vị trí tách biệt .
- Đặc điểm của khuẩn lạc:
_Hình dạng khuẩn lạc : Khuẩn lạc tròn, mịn, viền khuẩn lạc trơn, đường kính khoảng
1mm
_Màu sắc khuẩn lạc: trắng đục

_Bề mặt khuẩn lạc: bề mặt phẳng, trơn láng.

25