Luận án tiến sĩ nghiên cứu tổng hợp vật liệu ceo2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng trong cảm biến ADN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU CeO2 CÓ CẤU TRÚC NANO
NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

Hà Nội - 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU CeO2 CÓ CẤU TRÚC NANO
NHẰM ỨNG DỤNG TRONG CẢM BIẾN ADN

Ngành: Khoa học vật liệu
Mã số: 9440122

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. PHƯƠNG ĐÌNH TÂM
2. GS.TS. TRẦN TRUNG

Hà Nội - 2020

LỜI CẢM ƠN
Trải qua 3 năm học tập và nghiên cứu hết mình, tác giả đã hoàn thành luận
án Tiến sĩ Khoa học Vật liệu tại Viện AIST, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Để
có thể hoàn thành luận án này, tác giả đã nhận được sự hướng dẫn tận tâm, động
viên và chỉ bảo hết lòng của hai thầy hướng dẫn đó là PGS. TS Phương Đình Tâm
và GS. TS Trần Trung. Qua đây, tác giả xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai
thầy đặc biệt là PGS. TS Phương Đình Tâm – người đã luôn bên cạnh, sát sao, chỉ
bảo, góp ý từng bước thực hiện luận án của tác giả.
Bên cạnh đó, tác giả cũng đã nhận được sự tư vấn, giúp đỡ, động viên vô
cùng to lớn của các thầy PGS. TS Phạm Hùng Vượng, TS. Nguyễn Đức Dũng và cô
PGS. TS Đặng Thị Thanh Lê cùng toàn thể các thầy cô, các bạn nghiên cứu sinh và
học viên cao học đã và đang theo học tại Viện AIST và các anh chị em, bạn bè đồng
nghiệp. Tác giả cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể thầy cô và các
anh chị em và các bạn!
Trong thời gian theo học tại Viện AIST, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội,
tác giả cũng đã nhận được sự tận tình giúp đỡ của tập thể các lãnh đạo Viện AIST,
các phòng ban chức năng trường Đại học Bách Khoa Hà Nội. Tác giả xin trân trọng
cảm ơn tất cả các sự giúp đỡ này!
Ngoài ra, tác giả cũng xin được tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới đại gia đình nội
ngoại hai bên, cảm ơn chồng và các con của tác giả đã luôn đồng hành, tiếp sức cho
tác giả trong suốt thời gian thực hiện luận án!

Tác giả

Nguyễn Thị Nguyệt

i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả nêu
trong luận án là trung thực và chưa từng được tác giả khác công bố.

Hà Nội, ngày
TM. Tập thể hướng dẫn

tháng

năm 2020

Tác giả

PGS.TS Phương Đình Tâm

Nguyễn Thị Nguyệt

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii
MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vi
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ ix
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. x
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
Chương 1: CẢM BIẾN ADN ĐIỆN HÓA .............................................................. 6
1.1 Giới thiệu về chuỗi ADN .................................................................................. 7

1.2 Cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện hóa sử dụng trong nghiên cứu cảm
biến ADN ................................................................................................................ 9
1.2.1 Phương pháp quét thế vòng ........................................................................ 9
1.2.2 Phương pháp quét thế xung vi phân (DPV) .............................................. 11
1.2.3 Phương pháp quét thế sóng vuông (SWV) ............................................... 12
1.2.4 Phương pháp phổ tổng trở EIS ................................................................. 13
1.3 Các phương pháp cố định chuỗi ssADN ......................................................... 15
1.3.1 Hấp phụ vật lý ........................................................................................... 15
1.3.2 Cố định bằng liên kết cộng hóa trị ............................................................ 16
1.3.3 Cố định thông qua tương tác Avidin/Streptavidin -Biotin ....................... 18
1.3.4. Cố định bằng phương pháp điện hóa ....................................................... 19
1.4 Phương pháp phát hiện sự lai hóa ADN ......................................................... 21
1.4.1 Phương pháp đánh dấu ............................................................................. 21
1.4.2 Phương pháp không đánh dấu .................................................................. 25
1.5 Ứng dụng của cảm biến sinh học .................................................................... 29
Kết luận chương 1 ................................................................................................. 29
Chương 2: NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VẬT LIỆU THANH NANO CeO2 &
NANO COMPOSIT CeO2@Ppy ........................................................................... 31
2.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 31
2. 2 Thực nghiệm .................................................................................................. 34
2.2.1 Hóa chất, thiết bị ....................................................................................... 34
2.2.2 Tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2.......................................................... 34
iii


2.2.3 Tổng hợp vật liệu nano composit CeO2@Ppy .......................................... 36
2.3 Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 37
2.3.1 Kết quả tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 ............................................. 37
2.3.2 Kết quả tổng hợp vật liệu nano composit 47
Kết luận chương 2 ................................................................................................. 54

Chương 3: PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN ADN TRÊN CƠ SỞ CÁC THANH
NANO CeO2 ............................................................................................................ 56
3.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 56
3. 2 Thực nghiệm .................................................................................................. 59
3.2.1 Hóa chất .................................................................................................... 59
3.2.2 Cố định ssADN ......................................................................................... 59
3.2.3 Các phép đo điện hóa ................................................................................ 62
3.3 Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 62
3.3.1 Kết quả cố định chuỗi ssADN .................................................................. 62
3.3.2 Đặc trưng của cảm biến ADN .................................................................. 66
3.3.3 Tối ưu hóa các điều kiện thực nghiệm ...................................................... 69
3.3.4 Độ lặp lại, độ ổn định, tính chọn lọc và khả năng tái sử dụng ................. 73
Kết luận chương 3 ................................................................................................. 75
Chương 4: CẢM BIẾN SINH HỌC ADN TRÊN CƠ SỞ VẬT LIỆU NANO
COMPOSIT CeO2@Ppy ........................................................................................ 76
4.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................... 76
4.2 Thí nghiệm ...................................................................................................... 78
4.2.1 Hóa chất .................................................................................................... 78
4.2.2 Cố định các chuỗi ssADN dò lên bề mặt điện cực ................................... 79
4.2.3 Phân tích điện hóa ..................................................................................... 79
4.3 Kết quả và thảo luận ........................................................................................ 79
4.3.1 Kết quả cố định ssADN ............................................................................ 79
4.3.2 Đặc trưng điện hóa của cảm biến sinh học ADN ..................................... 81
4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thông số đến tín hiệu ra của cảm biến
........................................................................................................................... 84
4.3.4 Độ chọn lọc, độ lặp lại và độ ổn định của cảm biến sinh học ADN ......... 86

iv

4.3.5 Xác định vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR và so sánh với số
liệu phát hiện của cảm biến ADN ...................................................................... 88
Kết luận chương 4 ................................................................................................. 89
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 90
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............... 91
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 92

v


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
TT

Ký hiệu,

Tên Tiếng Anh

chữ viết tắt

Tên Tiếng Việt

1

ADN

Acid deoxyribonucleic

A xít deoxyribonucleic

2

APTES

3-Aminopropyl-triethoxy-

3-Aminopropyl-triethoxy-

silane

silan

3

ASV

Adsortive

Stripping Vôn-ampe hòa tan hấp phụ

Voltammetry
4

BSA

Bovine Serum Albumin

Bovine Serum Albumin

5

CE

Counter electrode

Điện cực đối

6

CPs

Conducting Polyme(s)

(Các) Polyme dẫn điện

7

CTAB

Cetyltrimethyl

ammonium cetyltrimetyl amoni bromit

bromide
8

CV

Cyclic Voltammetry

Vôn - ampe vòng

9

DAO

Diamin Oxidase

Enzym DAO

10

DIG

Digoxigenin

Digoxigenin

11

DPV

Differential

Pulse Quét thế xung vi sai

Voltammetry
12

dsADN

Double strand ADN

Chuỗi ADN kép

13

EDC

1-Ethyl-3-3-Dimethyl-

1-Etyl-3-3-Dimetyl-

aminopropyl Carbodiimide

aminopropyl Cacbodiimit

14

EDS

Energy

dispersive

spectroscopy
15

EDTA

X

Ethylene Diamine Tetracetic Etylen Diamin Tetracetic A
Acid

16

EIS

X-ray Phổ tán sắc năng lượng tia

xít
Impedance Phổ tổng trở điện hóa

Electrochemical
Spectrocopy

17

18

ELISA

FESEM

Enzym-linked

Xét nghiệm miễn dịch liên

Immunosorbent assay

kết với enzym

Field

Emission
vi

Scaning Hiển vi điện tử quét phát


xạ trường

Electron Microscopy
19

FTIR

Fourier Transform Infrared Phổ hồng ngoại biến đổi
Spectrocopy

20

hCG

Fourier

Human

Chorionic hooc môn gonadotropin

Gonadotropin
21

HRP

Horseradish peroxide

Horseradish Perô xít

22

IEP

Isoelectric Point

Điểm đẳng điện

23

ISFET

Ion-Sensitive

Field-Effect Trasistor hiệu ứng trường

Transistor

nhạy ion

24

ITO

Indium Tin Oxide

Ô xít thiếc indi

25

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

26

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lượng

27

MIA

1-Methylimidazole

1-Metyl imidazol

28

NRs

Nanorods

Các thanh nano

29

PABA

Acid Para-Aminobenzoic

A xít 4-Aminobenzoic

30

PANAM

Poly Amidoamine

Poly amidoamin

31

PANi

Polyaniline

Polyanilin

32

PBS

Phosphat Buffer Saline

Đệm phốt phát

33

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi Polyme

34

Ppy

Polypyrrole

Poly pyrol

35

Py

Pyrrole

Pyrol

36

RE

Reference electrode

Điện cực so sánh

37

SCE

Saturated Calomel Electrode

Điện cực Calomen bão hòa

38

SMOs

Solid Metal Oxides

ô xít kim loại bán dẫn

39

ssADN

Single strand ADN

Chuỗi ADN đơn

40

SWV

Square Wave Voltammetry

Quét thế sóng vuông

41

TEM

Transmission

electron Hiển vi điện tử truyền qua

microscopy
42

TGA

Thermogravimetric Analysis

Phân tích nhiệt

43

TMC

N-trimetyl chitosan

N-trimetyl chitosan

vii


44

WE

Working electrode

Điện cực làm việc

45

XRD

X-ray Diffraction

Nhiễu xạ tia X

viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1: Các hóa chất, thiết bị được dùng trong nghiên cứu ............................... 34
Bảng 3.1: Các chuỗi nucleotit tổng hợp được dùng trong nghiên cứu .................... 59
Bảng 3.2: Bảng tổng hợp các đỉnh hấp thụ phổ FTIR của CeO2; ssADN và ssADN
cố định trên các thanh CeO2 ..................................................................................... 64
Bảng 3.3: Giá trị mô phỏng của tất cả các thành phần trong mạch tương đương
Randles ..................................................................................................................... 68
Bảng 3.4: So sánh các thông số phân tích của các cảm biến ADN Salmonella khác
nhau .......................................................................................................................... 69
Bảng 4. 1: Thông tin các chuỗi ADN ...................................................................... 78
Bảng 4.2: Các thông số phân tích của các cảm biến sinh học để phát hiện
Salmonella ................................................................................................................ 84

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh mô phỏng phân tử ADN với 2 chuỗi xoắn kép .......................... 7
Hình 1.2: Cấu tạo chuỗi polynucleotit và các nucleo bazo ....................................... 8
Hình 1.3: Đồ thị quét thế vòng .................................................................................. 9
Hình 1.4: Đồ thị CV cảm biến ADN trước và sau khi lai hóa các chuỗi ssADN ... 11
Hình 1.5: Dạng thế quét và đồ thị dòng-thế phương pháp quét thế xung vi phân .. 12
Hình 1.6: Dạng thế quét và đồ thị dòng-thế phương pháp quét thế xung vuông .... 12
Hình 1.7: Mạch tương đương của bình điện phân ................................................... 13
Hình 1.8: Tổng trở quá trình Faraday Zf.................................................................. 13
Hình 1.9: Giản đồ Nyquist phổ tống trở điện hóa EIS ............................................ 14
Hình 1.10: Các kỹ thuật cố định ssADN dò quan trọng lên điện cực...................... 15
Hình 1. 11: Sơ đồ chế tạo cảm biến ADN sử dụng hạt PANAM-Au ...................... 17

Hình 1.12: Sơ đồ cố định và lai hóa ADN lên bề mặt điện cực Au ........................ 18
Hình 1.13: Sơ đồ cố định ssADN dò thông qua tương tác streptavidin – biotin ..... 19
Hình 1.14: Sơ đồ các kiểu liên kết của chất chỉ thị oxy hóa khử tới bề mặt ADN . 22
Hình 1.15: Sơ đồ cảm biến điện hóa ADN dựa trên nhãn enzyme theo Gang Liu . 23
Hình 1.16: Sơ đồ cảm biến ADN dựa trên nhãn hạt nano Fe3O4/TMC/Au ............ 25
Hình 1.17: Sơ đồ sự phát hiện điện hóa ADN không đánh dấu theo R. Nurmalasari
.................................................................................................................................. 26
Hình 1.18: Sơ đồ sự phát hiện điện hóa ADN không dán nhãn .............................. 27
Hình 1.19: Đồ thị quét thế vòng (A) và đồ thị Nyquist (B) của cảm biến ADN ..... 28
Hình 2.1: Quy trình tổng hợp vật liệu thanh nano CeO2 bằng phương pháp thủy
nhiệt .......................................................................................................................... 35
Hình 2.2: Quy trình tổng hợp CeO2@Ppy ............................................................... 36
Hình 2.3: Ảnh FESEM CeO2 NRs phụ thuộc nồng độ chất tạo mầm Na3PO4........ 38
Hình 2.4: Phổ nhiễu xạ tia X của CeO2 khi thay đổi nồng độ các chất tạo mầm .... 39
Hình 2.5: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 khi nồng độ Ce3+ thay đổi .......................... 40
Hình 2.6: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 thủy nhiệt khi nhiệt độ thay đổi ................. 41
Hình 2.7: Ảnh FESEM các mẫu CeO2 khi thời gian thay đổi ................................. 43
Hình 2.8: Giản đồ nhiễu xạ tia X mẫu CeO2 khi thời gian thủy nhiệt ..................... 44
Hình 2.9: Phổ tán sắc năng lượng tia X của các thanh nano CeO2 ......................... 45
x


Hình 2.10: Cơ chế hình thành CeO2 cấu trúc nano ................................................. 46
Hình 2.11: Cơ chế hình thành thanh nano CeO2 ..................................................... 46
Hình 2.12: Hình ảnh FESEM của mẫu poly pyrol tinh khiết .................................. 47
Hình 2.13: Ảnh FESEM nano composit CeO2- Ppy phụ thuộc tỷ lệ CeO2/Py....... 49
Hình 2.14: Ảnh hưởng của thời gian polyme hóa đến hình thái bề mặt của
nano composit CeO2-Ppy đặc trưng bởi FESEM ..................................................... 50
Hình 2.15: Hình thái cấu trúc của nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy
đặc trưng bởi: (a)- FESEM và (b)– TEM ................................................................. 51

Hình 2.16: Phổ EDS của nano composit cấu trúc lõi-vỏ CeO2 NR@Ppy ............... 52
Hình 2.17: (A)- Giản đồ nhiễu xạ tia X và (B)- phổ FT-IR của các mẫu vật liệu... 52
Hình 2.18: Giản đồ phân tích nhiệt.......................................................................... 54
Hình 3.1: Sơ đồ cố định ssADN lên bề mặt điện cực .............................................. 61
Hình 3.2: Sơ đồ chế tạo cảm biến ADN trên cơ sở các thanh nano CeO2 .............. 62
Hình 3.3: Phổ FTIR của (a)- CeO2; (b)- ssADN và (c)- ssADN/CeO2 ................... 63
Hình 3.4: Phổ UV-vis của (a)- chuỗi ssADN và (b)- ssADN/CeO2 ........................ 65
Hình 3.5: Ảnh huỳnh quang của cảm biến trên cơ sở CeO2 NRs ............................ 66
Hình 3.6: Giản đồ Nyquist đo trong dung dịch đệm pH = 7 ................................... 66
Hình 3.7: Tín hiệu ra của cảm biến ADN phụ thuộc vào [dsADN] ........................ 68
Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến tín hiệu ra của cảm biến .................................... 70
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ ion đến tín hiệu ra của cảm biến ...................... 71
Hình 3.10: Ảnh hưởng của nồng độ ssADN dò đến tín hiệu ra của cảm biến ........ 72
Hình 3.11: Ảnh hưởng của thời gian lai hóa đến tín hiệu ra của cảm biến ............. 73
Hình 3.12: Các đặc trưng của cảm biến trên cơ sở CeO2 NRs ................................ 74
Hình 4.1: Ảnh huỳnh quang của cảm biến trên cơ sở CeO2 NR@Ppy ................... 80
Hình 4.2: Phổ hồng ngoại FTIR cảm biến trên cơ sở CeO2-NR@Ppy .................. 81
Hình 4.3: Đường cong CV- (A) và đồ thị Nyquist của cảm biến- (B) .................... 82
Hình 4.4: Giản đồ Nyquist (a) và đồ thị ∆Ret (b) phụ thuộc [ssADN đích] ............ 83
Hình 4.5: Tối ưu các điều kiện thực nghiệm ........................................................... 86
Hình 4.6: Các đặc trưng riêng của cảm biến ........................................................... 87
Hình 4.7: Sơ đồ biểu diễn phương pháp phát hiện vi khuẩn Salmonella ................ 88

xi


Hình 4.8:

So sánh kết quả phát hiện mẫu vi khuẩn Salmonella

bằng phương pháp PCR với số liệu của cảm biến ADN .......................................... 89

xii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, bệnh dịch do vi sinh vật gây ra đang là mối hiểm hoạ không thể
lường trước được. Trong những năm qua đã có hàng chục nghìn người chết bởi các
loài vi sinh vật gây bệnh như: vi rút H5N1, SARS, vi khuẩn gây bệnh tả, vi rút viêm
não Nhật Bản... gây ra. Trong số đó, căn bệnh thương hàn do chủng vi khuẩn
Salmonella gây ra đã khiến hàng chục triệu người mắc bệnh với số người chết lên
tới hàng triệu người. Theo thống kê của Bộ y tế [1] ở Việt Nam tỷ lệ mắc thương
hàn tính trên 100.000 dân trong năm: 2010 là 64,4; 2011 là 56,8, trong đó tỷ lệ tử
vong là 0,02/100.000 dân; tới năm 2016 là 0,58. Tính riêng cho đối tượng là trẻ em
số ca mắc thương hàn do khuẩn Salmonella theo các năm 2012, 2013, 2014, 2015
và 2016 lần lượt là: 613, 706, 469, 492, 374 với số trẻ chết được ghi nhận vào năm
2014 là 3 trẻ. Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp phát hiện vi sinh vật gây
bệnh đang là yêu cầu cấp thiết đặt ra cho các nhà khoa học cũng như của các hãng
công nghiệp.
Hiện nay, các phương pháp phân tích nhanh vi sinh vật thường được sử dụng
là PCR, ELISA, nuôi cấy tế bào... là các phương pháp phân tích truyền thống trong
công nghệ sinh học. Trong đó, các xét nghiệm miễn dịch như ELISA chỉ có thể phát
hiện được Salmonella ở giới hạn 104 đến 105 CFU/mL, với thời gian làm giàu mẫu
mất khoảng 16 h đến 24 h và giới hạn này được cải thiện bằng phương pháp phản
ứng chuỗi PCR xuống tới 5 CFU/mL [2]. Việc lấy mẫu xét nghiệm đòi hỏi quy trình
khắt khe, các thí nghiệm phải được thực hiện trong phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn
của tổ chức Y tế thế giới, trang thiết bị đắt tiền. Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển
phương pháp bổ sung cho các phương pháp này là việc hết sức cần thiết. Trong đó,
sử dụng cảm biến sinh học được cho là phương pháp hiệu quả, bổ sung cho các

phương pháp truyền thống do cảm biến sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, dễ
dàng sử dụng, thời gian phân tích nhanh và cho kết quả tin cậy [2],[3].
Cảm biến sinh học là một thiết bị phân tích trên cơ sở kết hợp giữa phần tử
sinh học và bộ phận chuyển đổi tín hiệu để chuyển đổi các tín hiệu sinh hoá thành
tín hiệu dễ dàng cho người quan sát. Do các phân tử sinh học không thể tự gắn được
1


lên bề mặt cảm biến, do đó cần có một lớp vật liệu trung gian để cố định giữa bộ
chuyển đổi và phân tử sinh học. Lớp vật liệu này không chỉ gắn kết thành phần sinh
học và bề mặt cảm biến mà nó còn đóng vai trò chuyển điện tích từ dung dịch đến
bề mặt cảm biến. Hiện nay, trên thế giới có nhiều loại vật liệu được sử dụng để gắn
kết phân tử sinh học lên bề mặt cảm biến như ống nano cacbon [4][5], polyme dẫn
[6], các vật liệu ô xít kim loại bán dẫn [7], các hạt nano kim loại [8], các vật liệu ô
xít kim loại đất hiếm [9] ...v.v.
CeO2 cấu trúc nano là một trong các vật liệu hứa hẹn nhất đói với cảm biến
sinh học điện hóa do các đặc tính hấp dẫn như là tính bền hóa học, tương thích sinh
học, không độc, bề mặt riêng cao, dẫn điện và đặc tính vận chuyển electron cao.
CeO2 có năng lượng vùng cấm rộng, Eg = 3,4 eV và điểm đẳng điện cao IEP = 9,2.
Điều này rất thích hợp cho việc hấp phụ các phân tử có điểm đẳng điện thấp mà
không cần bất kỳ xử lý hóa học nào [10]. Tuy nhiên, các công trình công bố chủ yếu
sử dụng điện cực dạng màng cấu trúc đơn pha chỉ bao gồm các hạt oxit kim loại để
phát triển cảm biến sinh học sẽ có hiện tượng giảm diện tích bề mặt riêng do sự co
cụm và mất biên giới giữa các hạt, dẫn đến làm giảm khả năng hấp phụ các tác
nhân. Để tránh được hiện tượng nêu trên, thường là tạo một lớp hấp phụ các phân tử
tác nhân trên bề mặt hạt, cũng đồng thời nâng cao hiệu suất của cảm biến: tăng độ
nhạy, giảm giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, tác giả đã lựa chọn cách bao
phủ các thanh nano CeO2 (vật liệu được nghiên cứu) bằng lớp màng mỏng poly
pyrol (Ppy) để tạo vật liệu lai hóa Ppy@CeO2 cấu trúc lõi-vỏ. Điều thú vị ở đây là
Ppy với giá trị hàm công (chênh lệch năng lượng giữa mức Fermi và năng lượng

chân không) khoảng 5,0 eV [11] và CeO2 có giá trị hàm công là 5,34 eV [12] khi
tiếp xúc các electron lẻ của Ppy dễ dàng chuyển sang các orbital trống của Ce với
cấu hình 3d94f0 trong CeO2, tạo điều kiện thuận lợi cho việc hình thành các liên kết
cộng hóa trị giữa “Salmonella ssADN dò” và vỏ PPy. Khi đó cấu trúc lõi-vỏ này
đảm bảo được độ xốp, cùng những khoảng trống không gian chứa dung dịch có tác
nhân phân tích để tạo ra cảm biến ADN đối với vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu
chẩy cấp ở người.
“Nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm ứng dụng
trong cảm biến ADN” là đề tài mà nghiên cứu sinh hướng tới. Theo đó việc tập
2


trung nghiên cứu tổng hợp vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng thanh nano (CeO2 NRs)
có kích thước phù hợp và trên bề mặt được che phủ bởi lớp PPy tạo thành cấu trúc
lõi-vỏ với lớp hấp phụ “Salmonella ssADN dò”, tạo thành một cảm biến sinh học
phát hiện khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy ở người.
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Mục tiêu chung của đề tài là phát triển cảm biến sinh học ADN trên cơ sở vật
liệu CeO2 có cấu trúc nano nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy cấp.
Mục tiêu cụ thể:
✓ Tổng hợp được vật liệu nano một chiều CeO2 và vật liệu nano composit
CeO2@Ppy có cấu trúc lõi vỏ.
✓ Phát triển được cảm biến ADN hiệu suất cao trên cơ sở vật liệu nano một
chiều CeO2 chế tạo được.
3. Nội dung nghiên cứu của luận án
- Nghiên cứu tổng hợp vật liệu nano CeO2 và vật liệu CeO2@Ppy có cấu trúc
lõi vỏ.
- Nghiên cứu cố định chuỗi ADN lên bề mặt cảm biến.
- Phát triển cảm biến ADN trên cơ sở các vật liệu đã chế tạo được nhằm phát
hiện đoạn ADN của vi khuẩn Salmonella gây bệnh tiêu chẩy cấp.

4. Phương pháp nghiên cứu
Trong quá trình thực hiện luận án này, tác giả đã sử dụng phương pháp
nghiên cứu thực nghiệm, trong đó:
-

Vật liệu thanh nano CeO2 được tổng hợp bằng phương pháp thuỷ nhiệt,
vật liệu có cấu trúc lõi vỏ CeO2@Ppy được tổng hợp bằng phương pháp
trùng hợp hóa học.

-

Đặc trưng hình thái, cấu trúc vật liệu đã được nghiên cứu bằng các
phương pháp như: Kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường (FESEMJEOL/JSM-7600F); phổ tán xạ năng lượng tia X (EDS); phương pháp
phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD); phương pháp phân tích phổ hồng
3


ngoại (FTIR), phương pháp phân tích nhiệt (TGA) thực hiện trên thiết bị
Labsys TG/DSC (SETARAM – Pháp).
-

Đặc trưng của cảm biến đã được nghiên cứu bằng phương pháp quét thế
tuần hoàn (CV) và phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa (EIS) thực hiện
trên thiết bị IM6-Thales tại Viện AIST trường Đại học Bách Khoa Hà
Nội.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Trong bối cảnh ngày càng có nhiều loại dịch bệnh do các loài vi sinh vật gây
ra, sự ra đời của các công cụ phát hiện sớm các vi sinh vật như cảm biến ADN là
hết sức quan trọng. Trong nghiên cứu này, cảm biến sinh học đã được phát triển

trên cơ sở vật liệu CeO2 có cấu trúc dạng thanh nano và vật liệu lai giữa CeO2 và
polyme dẫn. Cơ chế phát hiện của cảm biến đã được giải thích rõ ràng trên cơ sở sự
tương tác của chuỗi ssADN dò với ssADN đích.
Cảm biến ADN sau khi được phát triển sẽ góp phần vào sự phát triển phương
pháp phát hiện các vi sinh vật gây bệnh, ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học và môi
trường.
6. Những đóng góp mới của luận án
Những nghiên cứu của luận án đã mang lại những đóng góp mới bao gồm:
- Đã tổng hợp được vật liệu thanh nano CeO2 có chiều dài ~200 nm và đường
kính ~20 nm bằng phương pháp thủy nhiệt đơn giản với tiền chất ban đầu là
Ce(NO3)3.6H2O và chất khoáng hóa Na3PO4, thời gian thủy nhiệt ngắn (24 h)
và nhiệt độ 200 oC.
- Đã chế tạo được vật liệu nano composit có cấu trúc lõi vỏ CeO2/Ppy bằng
phương pháp trùng hợp hóa học với tỷ lệ tiền chất CeO2/Py = 1/10, thời gian
tổng hợp 6 h, trong dung dịch chứa FeCl3.6H2O.
- Đã phát triển được cảm biến ADN điện hóa trên cơ sở vật liệu thanh nano
CeO2 nhằm xác định vi khuẩn Salmonella với giới hạn phát hiện và độ nhạy
tương ứng là 0,01 µM và 3362,1 ΩµM-1cm-2. Khoảng phát hiện tuyến tính từ
0,01 µM đến 2 µM.
4


- Đã phát triển một cảm biến sinh học ADN dựa trên vật liệu nano composit
cấu trúc lõi-vỏ CeO2-NR@Ppy nhằm phát hiện vi khuẩn Salmonella với
khoảng tuyến tính là 0,01÷0,4 nM, độ nhạy 593,7 ΩnM-1cm-2. Giới hạn phát
hiện và giới hạn định lượng của cảm biến ADN tương ứng là 0,084 nM và
0,28 nM.
7. Cấu trúc của luận án
Bản luận án được trình bày theo bố cục như sau:
MỞ ĐẦU

Chương 1: Trình bày tổng quan về “Cảm biến sinh học điện hóa”.
Chương 2: Trình bày về kết quả “Nghiên cứu tổng hợp vật liệu thanh
nano CeO2 và nano composit CeO2@Ppy”.
Chương 3: Trình bày về kết quả nghiên cứu về “Cảm biến ADN độ nhạy
cao trên cơ sở các thanh nano CeO2.
Chương 4: Trình bày về kết quả nghiên cứu về “Cảm biến sinh học
ADN trên cơ sở vật liệu nano composit CeO2@Ppy”.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO

5


Chương 1: CẢM BIẾN ADN ĐIỆN HÓA
Hiện nay, cùng với các phương pháp phân tích truyền thống như PCR,
ELISA, cảm biến sinh học cũng đang dần trở thành thiết bị bổ sung hiệu quả để xác
định vi sinh vật gây bệnh. Cảm biến sinh học đầu tiên trên thế giới được nghiên cứu
bởi L.D. Clark vào năm 1962 là cảm biến sinh học enzym dùng để phát hiện gluco
trong máu [13]. Kể từ đó, cộng đồng nghiên cứu từ các lĩnh vực khác nhau như: vật
lý, hóa học, vật liệu… đã cùng nhau nghiên cứu phát triển loại cảm biến này ngày
hoàn thiện hơn nữa.
Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm: 1) Bộ chuyển đổi
(transducer): là các cảm biến vật lý hoặc hoá học giúp chuyển đổi các tín hiệu thu
được do các phản ứng sinh hóa tạo ra thành các tín hiệu có thể quan sát được. 2)
Tác nhân cố định: là thành phần làm cầu nối giúp gắn kết các phần tử sinh học lên
trên bề mặt cảm biến. Tác nhân cố định thường là các vật liệu polyme dẫn, ống
nano cacbon, ô xít kim loại, vật liệu nano composit hoặc vật liệu lai [5–7], [11]. 3)
Phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor): là enzym, kháng thể, đoạn ssADN…[15],
có vai trò tương tác với chất cần phân tích tạo ra các tín hiệu đặc trưng, các tín hiệu

này được phát hiện bằng bộ chuyển đổi. Ngoài ra, nó còn có bộ phận chuyển đổi và
xử lý tín hiệu.
Có nhiều cách để phân loại cảm biến sinh học. Dựa vào các phần tử sinh học,
nó được chia thành cảm biến enzym, cảm biến miễn dịch và cảm biến ADN…v.v.
Nếu dựa vào bộ chuyển đổi tín hiệu, cảm biến sinh học được chia thành cảm biến
quang, cơ, nhiệt, điện. Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở bộ chuyển đổi tín
hiệu điện được sử dụng nhiều hơn cả do nó có cấu tạo đơn giản, thiết bị nhỏ gọn, độ
nhạy cao. Trong các bộ chuyển đổi tín hiệu điện, bộ chuyển đổi tín hiệu điện hoá
đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu. Đây là bộ chuyển
đổi dựa vào sự tương tác của các phân tử sinh học với các chất cần phân tích làm
thay đổi tín hiệu sinh hoá, tín hiệu này sẽ được phát hiện bằng bộ chuyển đổi và
hiển thị ở đầu ra của cảm biến.
Trong chương này, tác giả sẽ trình bày tổng quan về cảm biến sinh học ADN
điện hoá. Nội dung chương sẽ khái quát lại cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện
6


hóa, các bộ chuyển đổi sử dụng trong cảm biến sinh học ADN, phương pháp cố
định, cơ chế phát hiện lai hóa và các ứng dụng của cảm biến sinh học điện hóa
ADN.

1.1 Giới thiệu về chuỗi ADN
ADN có tên gọi đầy đủ là axit deoxyribo nucleic cấu tạo bởi 2 chuỗi polyme
sinh học là các poly nucleotit liên kết với nhau hình thành cấu trúc xoắn kép xung
quanh một trục tưởng tượng (Hình 1.1-(A)).

Hình 1.1: Hình ảnh mô phỏng phân tử ADN với 2 chuỗi xoắn kép [16]

Mỗi nucleotit được cấu tạo bởi các nucleobazo gọi tắt là bazo chứa nitơ liên
kết với một phân tử đường deoxyribo và một nhóm phốt phát thông qua các liên kết

hóa học. Các nucleotit liên kết với nhau thông qua liên kết hóa học giữa phân tử
đường của nucleotit đứng trước với nhóm phốt phát của nucleotit đứng sau. Các
chuỗi poly nucleotit của ADN liên kết với nhau thông qua liên kết hydro giữa các
cặp bazo A-T và C-G theo nguyên tắc bổ sung cặp bazo. Trong đó A chỉ liên kết với
T thông qua 2 liên kết hydro còn C chỉ liên kết với G thông qua 3 liên kết hydro và
ngược lại để tạo nên chuỗi dsADN mạch kép như được mô tả ở Hình 1.1-(B). Ở đó,
4 loại bazo trong cấu trúc ADN bao gồm: C- Cytosine và T- thymine là 2 bazo có

7


kích thước phân tử nhỏ thuộc nhóm pyrimidin; G- guanine và A- adenine là 2 bazo
có kích thước phân tử lớn thuộc nhóm purin (Hình 1.2).
Cấu tạo của chuỗi nucleotit và các bazo có trong chuỗi ADN được mô tả lại
ở Hình 1.2:

Hình 1.2: Cấu tạo chuỗi polynucleotit và các nucleo bazo

Khi đun nóng vượt quá nhiệt độ sinh lý (khoảng 80÷90 ℃) các chuỗi ssADN
trong dsADN xoắn kép sẽ tách nhau ra tạo thành hai chuỗi đơn. Do A liên kết với T
bằng 2 liên kết hydro nên liên kết A-T sẽ bị đứt trước còn G liên kết với C bằng 3
liên kết hydro bền vững hơn nên sẽ bị đứt sau ở khoảng nhiệt độ lớn hơn 90 ℃.
Hiện tượng này được gọi là hiện tượng biến tính của ADN. Nhiệt độ mà tại đó các
chuỗi ssADN trong chuỗi dsADN cấu trúc xoắn kép tách nhau ra được gọi là điểm
chảy (melting point)-Tm của ADN. Giá trị Tm đặc trưng cho các chuỗi dsADN phụ
thuộc vào số liên kết A-T và G-C có trong chuỗi dsADN đó. Chuỗi dsADN có
lượng liên kết G-C càng cao thì giá trị Tm sẽ càng lớn. Khi hạ nhiệt độ từ từ tới
khoảng 60÷70 ℃, các chuỗi ssADN sau khi biến tính sẽ liên kết lại với nhau theo
nguyên tắc bổ sung cặp bazo. Đây được gọi là hiện tượng hồi tính của ADN.
Trong số 4 bazo của ADN thì A và G là hai bazo có khả năng oxy hóa dễ

nhất trên bề mặt điện cực khi có dòng điện đi qua tại điện thế tương ứng là 1,18 và
1,05 V (so với điện cực calomen bão hòa-SCE) [17]. Đây là một trong những tính
chất quan trọng của ADN được các nhà khoa học sử dụng để phát hiện sự lai hóa
các chuỗi ssADN trong cảm biến sinh học ADN điện hóa.
8


1.2 Cơ sở lý thuyết về các phương pháp điện hóa sử dụng trong
nghiên cứu cảm biến ADN
Các phương pháp điện hóa sử dụng trong nghiên cứu cảm biến ADN hoạt
động dựa trên cơ sở bình điện hóa 3 điện cực bao gồm: điện cực làm việc (WE),
điện cực đối hay điện cực tham chiếu (CE), thường sử dụng điện cực Pt hoặc C
graphit, và điện cực so sánh (RE) có điện thế điện cực không đổi, thường dùng là
điện cực Ag/AgCl. Để thực hiện phép đo điện hóa, các điện cực được kết nối với hệ
đo điện hoá có phần mềm điều khiển trên máy tính. Hiện nay, các phương pháp đo
phổ biến thường được sử dụng trong các cảm biến sinh học điện hóa nói chung và
cảm biến sinh học điện hóa ADN nói riêng là: phương pháp quét thế vòng, quét thế
xung vi phân, quét thế sóng vuông và phương pháp đo phổ tổng trở điện hóa. Đặc
điểm chính của các phương pháp này được khái quát ở các phần tiếp theo sau đây.
1.2.1 Phương pháp quét thế vòng
Quét thế vòng là phương pháp nghiên cứu điện hóa trên cơ sở cho dòng một
chiều đi qua bình điện hóa có điện thế biến đổi theo thời gian với tốc độ quét được
giữa ở một giá trị nhất định. Cường độ dòng trao đổi giữa điện cực WE và CE sẽ
được ghi lại theo sự thay đổi của điện thế áp đặt lên WE so với điện cực RE. Đồ thị
mô tả sự biến thiên của cường độ dòng điện thu được theo quá trình quét thế được
gọi là đồ thị CV (cyclic voltammetry) (Hình 1.3):

Hình 1.3: Đồ thị quét thế vòng

9

Quá trình quét thế từ điện thế âm sang điện thế dương gọi là quá trình phân
cực thuận và ngược lại quá trình quét thế từ điện thế dương sang điện thế âm gọi là
quá trình phân cực ngược. Khoảng điện thế quét được lựa chọn sao cho làm xuất
hiện quá trình oxy hóa khử trên bề mặt điện cực làm việc và có thể thu lại được
dưới dạng tín hiệu dòng-thế trên đồ thị CV. Để thu được tín hiệu rõ nét, nhạy với sự
thay đổi về tính chất bề mặt điện cực, các chất dò oxy hóa khử như: [Fe(CN)6]3-/4-,
[Ru(NH3)6]2-/3-… đã được sử dụng để phát hiện sự lai hóa trong các cảm biến sinh
học ADN điện hóa sử dụng phương pháp không đánh dấu.
Trong quá trình phân cực thuận, điện thế quét tăng theo thời gian kéo theo sự
tăng mật độ điện tích trong lớp kép thì cường độ dòng oxy hóa cũng tăng theo. Khi
điện thế quét đạt đến điện thế oxy hóa (Epa) của các ion dò oxy hóa khử thì cường
độ dòng oxy hóa sẽ đạt cực đại do lúc này có một lượng lớn ion có trong lớp kép
tham gia quá trình oxy hóa. Nếu chất dò oxy hóa khử trong trường hợp này là
[Fe(CN)6]3-/4- thì phản ứng oxy hóa sẽ là:
[Fe(CN)6]4- - 1e -> [Fe(CN)6]3-

(1.1)

Tiếp tục tăng phân cực về phía điện thế dương, cường độ dòng oxy hóa giảm
do lúc này mật độ các ion trong lớp kép đã giảm đi đáng kể. Cường độ dòng oxy
hóa lúc này phụ thuộc chủ yếu vào tốc độ khuếch tán các ion trong dung dịch. Quá
trình phân cực ngược diễn ra ngay khi kết thúc quá trình phân cực thuận, điện thế
quét sẽ giảm dần từ điện thế dương hơn về điện thế âm hơn. Tương ứng với mỗi giá
trị Epa sẽ có một giá trị điện thế khử Epc đặc trưng cho mỗi loại cấu tử hóa học khác
nhau, phụ thuộc vào tính chất bề mặt điện cực, thành phần cấu tử, nhiệt độ và nồng
độ các ion có trong dung dịch đo. Phản ứng khử xảy ra sẽ là:
[Fe(CN)6]3- + 1e -> [Fe(CN)6]4-

(1.2)

Khi sự lai hóa các chuỗi ssADN xảy ra, hình thành nên chuỗi dsADN có cấu
trúc xoắn kép sẽ làm tăng mật độ nhóm PO4- mang điện tích âm trên bề mặt điện
cực. Do lực đẩy tĩnh điện giữa các nhóm PO4- mang điện tích âm và các ion dò oxy
hóa khử (cũng mang điện tích âm) khiến cho các ion này khó tiếp cận với bề mặt
điện cực hơn, phản ứng oxy hóa khử xảy ra khó khăn hơn dẫn tới cường độ dòng
10


oxy hóa và cường độ dòng khử giảm, điện thế oxy hóa và điện thế khử tăng. Sự thay
đổi vị trí cũng như chiều cao các cực đại dòng oxy hóa (Ipa) và dòng khử (Ipc) trên
đồ thị CV (Hình 1.4) là cơ sở để nhận biết quá trình lai hóa các chuỗi ssADN.

Hình 1.4: Đồ thị CV cảm biến ADN trước và sau khi lai hóa các chuỗi ssADN

1.2.2 Phương pháp quét thế xung vi phân (DPV)
Quét thế xung vi phân cũng là một phương pháp nghiên cứu điện hóa trên cơ
sở bình điện hóa 3 điện cực bằng phương pháp quét thế. Nguyên tắc của phương
pháp này là điện cực làm việc được phân cực bằng điện áp một chiều biến thiên
tuyến tính theo thời gian, cộng thêm một điện áp xoay chiều dưới dạng xung có biên
độ nhỏ không đổi.
Cường độ dòng được ghi lại hai lần ứng với mỗi xung thế, lần 1 là trước lúc
nạp xung (I1) và lần 2 là trước khi ngắt xung (I2). Cường độ dòng thu được I = I2 –
I1 là hàm của điện thế đặt lên điện cực làm việc. Phổ ghi được có dạng cực đại của
cường độ dòng điện phụ thuộc vào điện thế (Hình 1.5). Vị trí của cực đại xác định
bản chất của chất nghiên cứu còn chiều cao cực đại xác định nồng độ chất nghiên
cứu. Sự lai hóa các chuỗi ssADN dẫn đến sự thay đổi (thông thường là giảm) cường
độ dòng cực đại thu được. Nguyên nhân của hiện tượng này được giải thích tương
tự với phương pháp quét thế vòng. Cụ thể là sự lai hóa các chuỗi ssADN tạo thành

các chuỗi dsADN có cấu trúc xoắn kép sẽ làm gia tăng mật độ các nhóm PO4- mang
11