luận án tiến sĩ nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá đu đủ rừng (trevesia palmata (roxb ex lindl ) vis , họ nhân sâm araliaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG
(Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis.,
họ Nhân sâm Araliaceae)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

LÊ THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU B ÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG
(Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis.,

họ Nhân sâm Araliaceae)
Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc
Mã số: 9720202
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Võ Xuân Minh
2. PGS.TS. Đỗ Quyên

HÀ NỘI – 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi với sự hướng
dẫn khoa học của tập thể cán bộ hướng dẫn.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và được công bố một
phần trong các bài báo khoa học. Luận án chưa từng được công bố trong bất kỳ
công trình nào khác. Nếu có điều gì sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Tác giả

Lê Thị Thanh Thảo


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các Thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp
và những người thân trong gia đình.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng đặc biệt và biết ơn sâu sắc tới:
GS.TS. Võ Xuân Minh và PGS.TS. Đỗ Quyên, những người Thầy đã tận tâm
hướng dẫn khoa học, đã luôn động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất
cho tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cảm ơn chân thành tới các Thầy
Cô trong: Ban Giám đốc, Viện Đào tạo Dược, Trung tâm Nghiên cứu Ứng
dụng Sản xuất thuốc, Bộ môn Dược lý - Học viện Quân Y, phòng Sau đại học
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Thực vật,
Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô
Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội, Viện Hóa Sinh biển, Trung tâm
các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học &
Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Hà
Nội đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới Trường Cao đẳng Y tế Hà
Đông, Ủy ban nhân dân Thành phố Hà Nội, các anh/chị đồng nghiệp, người
thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi
hoàn thành luận án.
Ngày

tháng

năm 2020

Lê Thị Thanh Thảo


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ, ký hiệu viết tắt trong luận án

Danh mục các hình
Danh mục các bảng
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG

3

1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố

3

1.1.2. Thành phần hóa học

4

1.1.3. Tác dụng sinh học và dược lý

6

1.1.4. Công dụng

7

1. 2. CAO THUỐC

8

1.2.1. Định nghĩa, phân loại
1.2.2. Kỹ thuật điều chế cao thuốc
1.3. TỔNG QUAN VỀ TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH

8
10
23

1.3.1. Khái niệm về tăng cường miễn dịch và chất tăng cường miễn
dịch

23

1.3.2. Mô hình nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch
của một số chế phẩm thảo mộc
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠN G PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢN G NGHIÊN CỨU

24
30
30

2.1.1. Nguyên liệu

30

2.1.2. Động vật thí nghiệm

30

2.1.3. Thuốc thử, hóa chất và dung môi

31


2.1.4. Máy móc, trang thiết bị nghiên cứu

32

2.1.5. Địa điểm nghiên cứu

33

2.2. PHƯƠN G PHÁP NGHIÊN CỨU

33

2.2.1. Phương pháp nghiên cứu xây dựng qui trình bào chế cao khô
lá Đu đủ rừng qui mô phòng thí nghiệm

33

2.2.2. Phương pháp nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh
giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng

46

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch và
độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

48
53

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ
CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG QUI MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM

53

3.1.1. Kết quả xác định một số hợp chất chính sử dụng làm chất
đánh dấu

53

3.1.2. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu lá Đu đủ rừng
làm nguyên liệu chiết xuất

56

3.1.3. Kết quả xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng

72

3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT
LƯỢNG VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU
ĐỦ RỪNG

88

3.2.1. Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của cao khô lá Đu đủ
rừng

88

3.2.2. Kết quả đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng

95

3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN
DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG TRÊN
ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

100

3.3.1. Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô
lá Đu đủ rừng

100


3.3.2. Đánh giá độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN

108
119

4.1. VỀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH BÀO CHẾ CAO KHÔ LÁ ĐU
ĐỦ RỪNG

119

4.1.1. Về xác định nhóm hợp chất chính sử dụng làm chất đánh dấu
trong xây dựng qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng

119

4.1.2. Về lựa chọn 2 phương pháp định lượng

120

4.1.3. Về tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng

121

4.1.4. Về qui trình bào chế cao lá Đu đủ rừng

122

4.1.5. Về thiết bị chiết xuất, cô đặc và kết quả bào chế cao 3:1

128

4.1.6. Bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng phương pháp phun sấy

129

4.2. VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VÀ ĐỘ ỔN
ĐỊNH CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG

135

4.2.1. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở

135

4.2.2. Về đánh giá độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng

136

4.3. VỀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH VÀ ĐỘC TÍNH
CỦA CAO KHÔ LÁ ĐU ĐỦ RỪNG

136

4.3.1. Tác dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng

136

4.3.2. Độc tính của cao khô lá Đu đủ rừng

143

KẾT LUẬN

145

KIẾN NGHỊ

147

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN
CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
STT Viết tắt

Phần viết đầy đủ

1.
2.

A
Aer

Độ hấp thụ quang
Aerosil

3.

AO

Acid oleanolic

4.

BC

Bạch cầu

5.

C

Nồng độ

6.

13

C-NMR

Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ carbon 13)
Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr)

7.

CI

8.

CR/DP

9.

cs.

là tỷ lệ % (khối lượng/khối lượng) của chất rắn trên tổng
khối lượng dịch phun sấy
Cộng sự

10.

Cyc

Cyclophosphamid

11.

DĐVN

Dược điển Việt Nam

12.

DM/DL

Dung môi/dược liệu (ml/g)

13.
14.

ĐĐR

EtOH

Đu đủ rừng
Ethanol

15.

HMBC

Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy
(Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết)

16.

HPLC

High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng
hiệu năng cao)

17.
18.

HS chiết
HSPL

Hiệu suất chiết
Hệ số pha loãng

19.
20.

HSPS
Hiệu suất phun sấy
HR-ESI-MS High resolution - electrospray ionization - mass
spectroscopy (Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù
điện tử)

21. IL
22. INF

Interleukin
Interferon

23. KLCT

Khối lượng cơ thể


24. KTTP
25. KLRbk

Kích thước tiểu phân

26. LD50
27. LOD

Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số con vật thử)
Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

28. LOQ

Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

29. M

Khối lượng

30. Mal
31. MeOH
32. m/z

Maltodextrin
Methanol
Mass to charge ratio (tỉ lệ khối lượng/điện tích)

33. OA
34. RSD

Ovalbumin + Al(OH)3

35. SPN

Saponin toàn phần

36. SD

Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

37. SE
38. STT

Standard error (Sai số chuẩn)
Số thứ tự

39. TCCS

Tiêu chuẩn cơ sở

40. TCMD

Tăng cường miễn dịch

41. TD/CR

Tá dược/Chất rắn

42. TLC

Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

43. KLLTĐ
44. KLTƯTĐ

Khối lượng lách tương đối
Khối lượng tuyến ức tương đối

45. TB
46. TNF

Trung bình

Tumor necrosis factor (Yếu tố hoại tử khối u)

47. UV – VIS

Ultraviolet-vis ible (Tử ngoại - khả kiến)

Khối lượng riêng biểu kiến

Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối)


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1. Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis .,)

4

1.2. Cấu trúc saponin phân lập từ Đu đủ rừng

5

1.3. Sơ đồ thiết bị bể chiết siêu âm và que siêu âm

15

1.4. Cấu tạo hệ thống phun sấy

22

2.1. Sơ đồ nghiên cứu

trên mô hình gây suy giảm miễn

dịch bằng

Cyclophosphamid

49

3.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ lá Đu đủ rừng

53

3.2. Phổ UV-Vis của mẫu trắng và mẫu chuẩn

56

3.3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo thời gian phản ứng
tạo màu
3.4. Đồ thị biểu diễn sự

57
phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào lượng acid

oleanolic chuẩn

58

3.5. Sắc ký đồ của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng

61

3.6. Đồ thị mô tả sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ acid oleanolic

62

3.7. Hình ảnh vi phẫu lá Đu đủ rừng

65

3.8. Hình ảnh soi bột lá Đu đủ rừng

66

3.9. Hình ảnh sắc ký đồ TLC dược liệu lá Đu đủ rừng

68

3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu và số lần chiết đến chiết xuất
saponin toàn phần

75

3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất saponin toàn phần

77

3.12. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn điều chế cao lá Đu đủ rừng 3:1

87

3.13. Sơ đồ tóm tắt giai đoạn bào chế cao khô lá Đu đủ rừng

88

3.14. Kết quả chụp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) của bột cao khô lá
Đu đủ rừng
3.15. Hình ảnh TLC của cao khô lá Đu đủ rừng

89
92


Hình

Tên hình

3.16. Hình ảnh TLC trong theo dõi độ ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng

Trang
99

3.17. Hình ảnh vi thể lách chuột ở các lô (HE × 100)

104

3.18. Hình ảnh vi thể tuyến ức chuột ở các lô (HE × 100)

104

3.19. Tương quan giữa liều dùng theo tỷ lệ chuột chết

109

3.20. Ảnh đại thể gan, lách và thận chuột ở các lô khác nhau (HE x 25)

116

3.21. Hình ảnh mô bệnh học gan chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400)

117

3.22. Hình ảnh mô bệnh học lách chuột sau 90 ngày uống thuốc (HE x 400)

117

3.23. Hình ảnh mô bệnh học thận chuột sau 90 ng ày uống thuốc (HE x 400)

118


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

3.1. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang theo thời gian phản ứng tạo màu

57

3.2. Kết quả xác định độ lặp lại và độ đúng của phương pháp UV- Vis

59

3.3. Kết quả xác định tính tương thích hệ thống HPLC

60

3.4. Diện tích pic và thời gian lưu của các dung dịch chuẩn ở các nồng độ

61

3.5. Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ đúng trong ngày và khác ngày

62

3.6. Độ nhiễu nền của sắc ký đồ mẫu chuẩn acid oleanolic

63

3.7. Kết quả xác định tỷ lệ mất khối lượng do làm khô của bột lá Đu đủ rừng

67

3.8. Kết quả xác định hàm lượng tro toàn phần của bột lá Đu đủ rừng

67

3.9. Hàm lượng saponin toàn phần trong lá Đu đủ rừng

69

3.10. Hàm lượng acid oleanolic trong lá Đu đủ rừng

70

3.11. Tóm tắt các chỉ tiêu chất lư ợng trong tiêu chuẩn cơ sở lá Đu đủ rừng

71

3.12. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến chiết xuất saponin toàn phần

72

3.13. Ảnh hưởng của kích thước tiểu phân dược liệu đến chiết xuất saponin
toàn phần
3.14. Ảnh hưởng của dung môi đến chiết xuất saponin toàn phần

73
74

3.15. Ả nh hưởng của tỷ lệ dung môi/dược liệu và số lần chiết đến chiết xuất
saponin toàn phần

74

3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết xuất saponin toàn phần

76

3.17. Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất saponin toàn phần

76

3.18. Thông số qui trình chiết xuất dịch chiết lá Đu đủ rừng bằng phương
pháp chiết siêu âm

77

3.19. Kết quả chiết xuất lá Đu đủ rừng qui mô 2 kg/ mẻ bằng phương pháp
chiết siêu âm

78

3.20. Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao lá Đu đủ rừng 3:1

78

3.21. Công thức và điều kiện phun sấy khảo sát ảnh hưởng của tá dược

79

Bảng

Tên bảng

Trang

3.22. Ảnh hưởng của loại tá dược đến hiệu suất phun s ấy

80

3.23. Công thức và điều kiện phun sấy khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá
dược/chất rắn

81

3.24. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn đến phun sấy cao Đu đủ rừng

82

3.25. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và
tốc độ cấp dịch

83

3.26. Ả nh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến phun sấy cao
Đu đủ rừng

84

3.27. Công thức và điều kiện khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch

phun

85

3.28. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/dịch phun đến phun sấy cao Đu đủ rừng

85

3.29. Công thức và thông số qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng bằng
phun sấy

86

3.30. Kết quả xác định mất khối lượng do làm khô của cao khô lá Đu đủ
rừng

90

3.31. Kết quả xác định hàm lượng tro toàn phần của cao khô lá Đu đủ rừng

90

3.32: Kết quả thử độ nhiễm khuẩn của cao khô lá đu đủ rừng

91

3.33. Hàm lượng saponin toàn phần trong cao khô lá Đu đủ rừng

93

3.34. Hàm lượng acid oleanolic trong cao khô lá Đu đủ rừng

94

3.35. Tóm tắt các chỉ tiêu

chất lượng trong tiêu chuẩn cơ sở cao lá Đu đủ

rừng

95

3.36. Sự thay đổi độ ẩm, độ nhiễm khuẩn, hàm lượng saponin toàn phần và
hàm lượng acid oleanolic của 3 lô theo thời gian bảo quản
3.37. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khối lượng lách tương đối

96
101

3.38. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên khối lượng tuyến ức tương
đối

101


Bảng

Tên bảng

Trang

3.39. Ảnh hưởng của thuốc thử lên số lượng bạch cầu

102

3.40. Ảnh hưởng của thuốc lên một số loại bạch cầu ở máu ngoại vi

103

3.41 . Kết quả nhận xét giải phẫu bệnh của lách và tuyến ức

105

3.42 . Ảnh hưởng của thuốc thử lên nồng độ IgG máu ngoại vi

106

3.43. Ảnh hưởng của thuốc thử đến phản ứng bì với kháng nguyên OA

106

3.44. Ảnh hưởng của thuốc thử đến nồng độ IL–2

107

3.45. Ảnh hưởng của thuốc thử đến nồng độ TNF-α

108

3.46. Mối tương quan liều lượng và tỷ lệ phần trăm chuột chết sau uống cao

khô lá Đu đủ rừng

109

3.47. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đối với khối lượng cơ thể
chuột

110

3.48. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đến số lượng hồng cầu và
lượng huyết sắc tố trong máu chuột

111

3.49. Ả nh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên hematocrit và thể tích trung
bình hồng cầu trong máu chuột

112

3.50. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên số lượng bạch cầu và tiểu
cầu trong máu chuột
3.51. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng đối với hoạt độ AST và ALT

113
114

3.52. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên các chỉ số albumin và
cholesterol toàn phần trong máu

115

3.53. Ảnh hưởng của cao khô lá Đu đủ rừng lên nồng độ creatinin máu
chuột

115


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh suy giảm miễn dịch là một nhóm các tình trạng khác nhau gây
nên do một hay nhiều khiếm khuyết của hệ miễn dịch và biểu hiện trên lâm
sàng bởi gia tăng tình trạng dễ mắc nhiều bệnh nhiễm trùng. Ngày nay, các
bệnh suy giảm miễn dịch có xu hướng ngày càng gia tăng với hậu quả cấp tính,
tái diễn hay mạn tính thường là nặng nề [1].
Hiện nay, cơ quan quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (US FDA) đã
cấp phép cho nhiều thuốc có tác dụng điều trị cho bệnh nhân suy giảm miễn
dịch được dùng trên lâm sàng. Các thuốc tăng cường miễn dịch (TCMD) có
nguồn gốc phong phú, các chất có nguồn gốc từ các chế phẩm sinh học
(Immunoglobulin, Interferon,…) là sản phẩm công nghệ cao, giá thành còn khá
cao. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược thường có nhiều tác dụng
không mong muốn [2].
Có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng TCMD của các loài thực vật đã
được thực hiện. Đặc biệt, trong số các nhóm hợp chất thiên nhiên, nhóm chất
saponin là nhóm có tác dụng tăng cường miễn dịch nổi bật nhất [3], [4].
Đu đủ rừng (ĐĐR, Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis. họ Nhân
sâm Araliaceae) là một cây nhỡ, mọc nhiều và dễ mọc ở bìa rừng hay rừng tái
sinh. Với nguyên liệu nghiên cứu là lá, nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có ở các
khu vực Hà Giang, Ba Vì, Cúc Phương, Phú Thọ…, nên việc thu hái không
làm ảnh hưởng đến môi trường sinh thái hay đa dạng sinh học [5].

Cho đến nay, cây ĐĐR ở Việt Nam mới chỉ được sử dụng theo kinh
nghiệm dân gian lấy lõi thân thay cho vị thuốc thông thảo [5]. Trên thế giới
cũng chỉ có rất ít nghiên cứu về hóa học và tác dụng dược lý của loài này [6],
[7] và chưa có các chế phẩm nào có tác dụng TCMD từ ĐĐR được nghiên cứu.


2

Xuất phát từ thực tế trên, cần phải nghiên cứu về tác dụng TCMD của
ĐĐR để định hướng phát triển thành sản phẩm cho đối tượng bệnh nhân suy
giảm miễn dịch đang ngày càng tăng tại Việt Nam và sử dụng được nguồn
nguyên liệu dồi dào trong nước, luận án “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác
dụng tăng cường miễn dịch của cao khô lá Đu đủ rừng (Trevesia palmata
(Roxb. ex Lindl.) Vis., họ Nhân sâm Araliaceae)” được tiến hành với các mục
tiêu sau:
1. Xây dựng được qui trình bào chế cao khô lá Đu đủ rừng ở qui mô
phòng thí nghiệm.
2. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng và bước đầu đánh giá được độ
ổn định của cao khô lá Đu đủ rừng.
3. Đánh giá được tác dụng tăng cường miễn dịch và độc tính của cao khô
lá Đu đủ rừng trên động vật thực nghiệm.


3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐU ĐỦ RỪNG
Đu đủ rừng (ĐĐR) có tên khoa học là Trevesia palmata (Roxb. ex
Lindl.) Vis, thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae). ĐĐR còn được gọi là Thông thảo

gai, Thầu dầu núi, Nhật phiến, Thôi hoang [8], [9].
1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
1.1.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây nhỡ cao 7 - 8 m hoặc hơn, thân ít phân nhánh, cành có gai, ruột xốp.
Lá đơn, phiến lá phân thuỳ chân vịt, xẻ sâu như lá thầu dầu, có 5 - 9 thuỳ nhọn
có răng, gân nổi ở hai mặt, mép lá có răng cưa thô; cuống lá dài và có gai. Lá
non phủ lông mềm, màu nâu nhạt, lá già nhẵn [8], [9]. Lá nhiều kiểu hình, có
thể tròn hoặc không tròn ở vòng ngoài; bề ngang từ 30 - 90 cm; gốc lá hình tim
rộng; thùy 5 - 10, lá đơn, không bị xẻ ở cây non, xẻ chân vịt ở cây già. Lá chia
thùy, thành các thùy lá có hình mác tới hình elip hoặc bị xẻ với nhiều hình
dạng. Các lõm phân thùy nằm ở khoảng giữa tính từ gốc lá đến đỉnh lá, có thể
xẻ đến tận gân giữa, tạo thành cuống giả. Đỉnh lá nhọn, mép lá có răng cưa;
lông của cành phân nhánh hình khiên hoặc không đồng đều, có bề ngang
khoảng 0,1 - 0,3 mm, mọc rậm rạp ở gân giữa và gân chính. Cuống lá kích
thước từ 20 x 0,3 cm đến 90 x 1 cm; có thể không có gai hoặc có gai chỉ ở gần
gốc lá và ở đỉnh. Lưỡi bẹ lá kèm có kích thước tới 2 cm. Hoa to khoảng 1 cm,
màu trắng. Hoa mọc thành tán, ở đỉnh hoặc ở nách, độ dài tổng thể khoảng 60
cm; cụm hoa thứ cấp thường có một tán ở đỉnh và 2 tán hoa ở vị trí đối diện
qua điểm phân nhánh chính giữa. Lá bắc hình tam giác, nhọn, dài tới khoảng 3
cm, không bị rụng, có lông tơ dày, thỉnh thoảng xuất hiện các gai có lông cứng
dài 1 - 2 mm; lông phủ hình sao không đều, bề rộng tới 1 mm, mọc rậm rạp.
Mỗi tán từ 25 - 65 hoa; bề rộng 6 - 10 cm, cuống dài từ 2 -


4

4 cm, lá bắc kích thước từ 0,2 - 1 cm, hình tam giác hẹp, có răng cưa, màu nâu
hoặc hơi trắng. Đế hoa hình chuông hoặc hình con quay, kích thước từ 6 x 6 - 9
x 9 mm. Đĩa hoa dạng phòng (flat) hoặc hình vòm; gốc trụ hình đầu kích thước
2 x 1 - 4 x 1 mm. Đài hoa có răng cưa, cánh hoa hình răng, mũi cánh hoa nhọn

dài khoảng 1 mm. Hoa 8 - 10 cánh, kích thước thước 5 x 1,6 - 8 x 2,5 mm. Hoa
hợp một phần, nhị từ 8 - 10, kích thước bao phấn 2 x 1,5 - 3
x 2,5 mm; chỉ nhị kích thước từ 4 - 6 cm. Hạt phấn có kích thước 25,7 - 32,4
µm. Quả dài 13 -18 mm, có khía; hạt dẹt. Có hoa tháng 5 - 6, có quả tháng 7 - 9
[10].

a. Toàn cây

b. Lá

c. Hoa

Hình 1.1. Cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. ex Lindl.) Vis.,)
*Nguồn: Ảnh chụp Đu đủ rừng tại Vị Xuyên tỉnh Hà Giang tháng 5 năm 2015

1.1.1.2. Phân bố
ĐĐR mọc nhiều và dễ mọc ở những vùng đất ẩm dọc theo các sông,
suối, ở thung lũng các rừng phục hồi [11]. Ở nước ta, loài này phân bố ở các
tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Quảng Trị [8], Sơn La, Lào Cai, Tuyên
Quang, Hà Giang, Hà Nội, Thái Nguyên, Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Lâm
Đồng [12]. Trên thế giới, chúng có ở Trung Quốc, Bangladesh, Nepal, Ấn Độ,
Thái Lan, Lào, Campuchia [10].
1.1.2. Thành phần hóa học
Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của ĐĐR kể cả
trong nước và nước ngoài vẫn còn rất hạn chế. Một số nghiên cứu chỉ ra,


5

saponin là thành phần chính của loài này với aglycon là acid oleanolic (AO) và

hederagenin.
Năm 2000, từ cao ethanol (EtOH) lá loài T. palmata Vis. thu hái ở Italia,
De Tommasi N. và cộng sự (cs.) đã phân lập được 6 saponin bisdesmosidic mới
và 2 saponin triterpenoid đã biết, tất cả các hợp chất phân lập được đều có phần
aglycon là AO hoặc dẫn chất của acid này. Theo nghiên cứu này, saponin phân
lập từ cây ĐĐR có cấu trúc tương tự như Quil A (phân lập từ loài Quillaja
saponaria), đều là saponin triterpenoid có 2 mạch đường (R và R 1) và chủ yếu
là các đường glucose, rhamnose, arabinose; các nhóm thế còn lại như R 2 là
nhóm methyl (-CH3) và dẫn chất oxy hóa của nó (-CH 2OH); R3 đa số là dẫn
chất hydroxyl (-OH) [6].

Hình 1.2. Cấu trúc saponin phân lập từ Đu đủ rừng
*Nguồn: Theo De Tom masi N. và cs. (2000) [6]

Theo kết quả nghiên cứu của Dinda B. và cs. (2010), 6 saponin đã được
phân lập và xác định cấu trúc từ Trevesia palmata Vis. trong đó có 3 saponin
có aglycon là AO và 2 saponin có aglycon là hederagenin [13].
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Panyaphu K. đã sử dụng các phản ứng
hóa học để định tính các nhóm chất đặc trưng, kết quả cho thấy trong lá cây T.
palmata Vis. thu hái ở miền Bắc Thái Lan có mặt của các nhóm hợp chất
phenolic, flavonoid, triterpen và lacton glycosid [14].
Năm 2018, từ lá ĐĐR, Kim B. và cs. đã phân lập được 2 hợp chất
triterpen

glycosid

là

hederagenin-3-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1 → 3)-α-ʟ-

rhamnopyranosyl-(1→2)-α-ʟ-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-ʟ-arabinopyranosid
và


6

acid 3-O-α-ʟ-rhamnopyranosyl asiatic cùng với 3 hợp chất đã biết là
macranthosid A, α-hederin và ilekudinosid D [15].
Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học của
ĐĐR. 1.1.3. Tác dụng sinh học và dược lý
Hiện nay, cũng chưa có nhiều nghiên cứu về hoạt tính của các hợp chất
và các cao chiết từ ĐĐR.
Năm 2000, De Tommasi N. và cs. đã chứng minh dịch chiết từ lá T.
palmata và một số saponin phân lập được cùng với các sản phẩm prosapogenin
thủy phân đều thể hiện tác dụng chống tăng sinh tế bào trên các dòng tế bào
J774 (dòng tế bào ung thư đại thực bào chuột), HEK-293 (dòng tế bào phôi
thận người 293), WEHI164 (dòng tế bào u sarcoma xơ) so với chất đối chứng
là 6-mercaptopurin [6].
Năm 2012, nghiên cứu của Panyaphu K. và cs. cho thấy, loài T. palmata
có hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH (EC 50 là 9,3 g tương ứng
14,76 g/mg dịch chiết); hàm lượng phenolic tổng định lượng theo phương pháp
cân tính theo acid gallic là 10,86 mg/g dịch chiết [14].
Theo nghiên cứu của Rahman K.M.H. và cs. (2014), cắn methanol
(MeOH) từ lá của loài T. palmata có tác dụng giảm đau và hạ đường huyết trên
chuột nhắt gây tăng đường huyết thực nghiệm thông qua xét nghiệm dung nạp
glucose đường uống. Cắn dịch chiết loài T. palmata làm giảm liều phụ thuộc
vào lượng đường trong máu ở chuột thực nghiệm uống glucose. Ở liều 100,
200 và 400 mg/kg cân nặng chuột thực nghiệm, mức đường huyết giảm tương
ứng 17,9, 28,1 và 47,4%, được so sánh với thuốc glibenclamid liều 10 mg/kg
cân nặng làm giảm lượng đường trong máu 47,4%. Trong thử nghiệm giảm đau

trên mô hình gây đau bằng tiêm acid acetic màng bụng chuột thực nghiệm, ở
các liều 50, 100, 200 và 400 mg//kg cân nặng làm giảm số lượng các cơn co
thắt bụng lần lượt là 33,3, 40,7, 48,1 và 55,6% so với


7

nhóm đối chứng sử dụng aspirin thuốc giảm đau tiêu chuẩn ở liều 200 và 400
mg/kg cân nặng tương ứng là 48,1 và 63,0% [16].
Sayeed M.A. và cs. (2014) đã chứng minh tác dụng làm tan huyết khối
và kháng viêm in vitro của dịch chiết từ lá loài T. palmata. Kết quả nghiên cứu
cho thấy, cắn MeOH và các cắn phân đoạn (n-hexan, cloroform, ethyl
acetat, nước) đều có tác dụng làm tan huyết khối với kết quả tương ứng là 43,3;
44,2; 43,3; 40,3; 44,3% so với đối chứng dương streptokinase là
71,67%. Tác dụng kháng viêm được đánh giá bằng phương pháp biến tính
albumin trong đó cao MeOH từ lá ở mức liều 1 mg/ml, ức chế 89,24% trong
khi nhóm chứng dương sử dụng natri diclofenac ức chế 96,77% ở mức liều
tương đương [17].
Nghiên cứu của Kim B. và cs. (2018), cho thấy, các hợp chất triterpen
glycosid (TG1-3,5) phân lập từ T. palmata thể hiện các hoạt động chống nấm
mạnh, chống lại mầm bệnh đạo ôn M. oryzae với giá trị nồng độ ức chế 50%
(IC50) = 2 - 5 μg/ml. Đặc biệt, khi cây được xử lý bằng hợp chất TPG1 (500
μg/ml), giá trị kiểm soát bệnh chống bệnh đạo ôn, nấm mốc xám cà chua, bệnh
sương mai cà chua và lần lượt là 84, 82 và 88%, so với chứng không điều trị
TG [15].
Một số saponin phân lập từ T. palmata có tác dụng bảo vệ tế bào gan
chuột in vitro khi gây tổn thương bằng carbon tetrachlorid [18]. Các saponin có
aglycon là AO có độc tính rất thấp [19] và thể hiện tác dụng bảo vệ gan, chống
viêm, chống khối u, hạ lipid máu, kháng khuẩn, hạ glucose máu, chống các tác
nhân gây ung thư, chống thụ thai, bảo vệ tế bào tim trước tác hại của đường

máu cao [20] làm tăng tiết insulin của tế bào β tuyến tuỵ [21]. Hederagenin có
hoạt tính kháng bổ thể [22] và chống viêm [23].
1.1.4. Công dụng
Ở nước ta, ĐĐR đã được sử dụng từ lâu. Lõi thân dùng chữa phù thũng,
đái dắt, tê thấp và làm thuốc hạ nhiệt, thanh phế nhiệt và được dùng


8

làm thuốc bổ. Lá được dùng nấu nước xông chữa tê liệt, bại người và giã đắp
chữa gãy xương (ở Trung Quốc người ta dùng lá chữa ngã tổn thương hay dao
chém thương tích) [11]. Ngoài ra, ĐĐR có tác chữa các bệnh khó tiêu, táo bón,
thấp khớp, đau bụng, viêm phổi [24].
Loài T. palmata cũng được sử dụng trong công thức tắm thảo dược sau
sinh của cộng đồng Miên (Yao) của Thái Lan [14]; dân tộc Kry ở Lào sử dụng
nước sắc của thân cây và rễ để phục hồi sau sinh, co tử cung, giảm đau bụng và
tăng tiết sữa [25]. Ở Malaysia dùng để chữa gẫy xương và liền da
[25].Ở Ấn Độ, lá ĐĐR được sử dụng làm rau ăn [26]; quả dùng như là 1 chất
làm say cá để dễ đánh bắt [27].
Liều dùng: 20 - 30 g dạng thuốc sắc. Dùng riêng hay phối hợp [11].
1.2. CAO THUỐC
1.2.1. Định nghĩa, phân loại
* Theo Dược Điển Việt Nam (DĐVN) V [28], cao thuốc là chế phẩm
được điều chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất qui định các dịch chiết thu
được từ dược liệu thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp. Cao thuốc
được chia làm 3 loại:
- Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử
dụng, trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo quản
hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác, qui ước 1 ml cao lỏng tương ứng với
1g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc.

- Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm lượng dung môi sử dụng còn lại
trong cao không quá 20 %.
- Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao
khô không được có độ ẩm lớn hơn 5 %.
* Khái niệm cao trong dược điển châu Âu [29] được chia làm 3 loại tùy
thuộc vào các thành phần có hoạt tính đã biết hoặc các thành phần liên quan
khác.


9

- Cao định chuẩn (hoặc cao chuẩn hóa) “standardised extracts”: cao
chiết xuất được điều chỉnh hàm lượng một số thành phần nhất định (đã biết tác
dụng điều trị) trong một giới hạn dung nạp được. Sự tiêu chuẩn hóa phải đạt
được sau khi phối hợp cao chiết xuất với tá dược trơ hoặc bằng cách trộn các lô
chiết xuất với nhau. Khối lượng các thành phần khác của cao có thể thay đổi.
Kết quả là hàm lượng cao sẽ được tính trong một khoảng tương ứng với một
lượng xác định của các hoạt chất có tác dụng điều trị. Ví dụ cao chiết lá senna
chuẩn hóa: 50-65 mg tương ứng với 12,5 mg hydroxy anthracen glycosid được
tính theo sennoside B.
- Cao định lượng “quantified extracts”: là cao chiết xuất có khoảng hàm
lượng xác định của các thành phần (hoạt chất). Sự điều chỉnh chủ yếu được
thực hiện bằng cách trộn các lô mẻ với nhau. Kết quả là hàm lượng cao luôn
phải được nêu tương ứng với hàm lượng của các chất được định lượng trong
một khoảng; ví dụ, chiết xuất từ lá Ginkgo định lượng: 60mg chứa 13,216,16mg flavonoid dưới dạng flavon glycosid; 1,68-2,04mg ginkgolides A, B
và C và 1,56-1.92mg bilobalide.
- Các chế phẩm cao khác: các thành ph ần có hoạt tính (trị liệu) chưa
được xác định, cũng không được điều chỉnh theo một lượng xác định của các
chất đánh dấu. Chúng chủ yếu được kiểm soát chất lượng bởi qui trình sản xuất
và các thông số kỹ thuật của qui trình. Trong trường hợp này, hàm lượng cao sẽ

được công bố là một giá trị nhất định. Để đánh giá phân tích hàm lượng cao với
một chất phân tích đánh dấu có thể được lựa chọn bởi nhà sản xuất, nếu không
sẽ được xác định trong chuyên luận Dược điển tương ứng. Nếu trong quá trình
sản xuất cao định lượng hoặc chuẩn hóa, quá trình tinh chế được áp dụng làm
tăng tỷ lệ các thành phần đã được mô tả trong các chất chiết được tới một giá
trị kỳ vọng, dược điển châu Âu sẽ coi đó là một cao được “tinh chế”, ví dụ cao
Bạch Quả, định lượng hoặc tinh chế.


10

1.2.2. Kỹ thuật điều chế cao thuốc
Quá trình điều chế cao thuốc thường có 2 giai đoạn chính là chiết xuất
dược liệu và cô đặc, sấy khô, hoàn thiện chế phẩm.
1.2.2.1. Chiết xuất dược liệu
Chiết xuất là phương pháp tách một hoặc nhiều chất ra khỏi nguyên liệu
do sự phân bố các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau: một pha lỏng và
một pha rắn tạo cân bằng lỏng – rắn hoặc hai pha lỏng, tạo cân bằng lỏng - lỏng
[30]. Một qui trình chiết xuất điển hình gồm các bước sau:
a, Bước 1. Chuẩn bị dược liệu: Làm khô và chia nhỏ dược liệu phù hợp để tăng
hiệu xuất chiết mà hạn chế các tạp chất này đi vào dịch chiết [34].
b, Bước 2. Lựa chọn dung môi chiết: Cơ sở quan trọng trong lựa chọn dung
môi là tính phân cực của hợp chất chứa trong dược liệu và của dung môi. Về
nguyên tắc, dung môi phân cực sẽ chiết xuất các chất phân cực và dung môi
không phân cực sẽ chiết xuất các hợp chất không phân cực. Khi cần chiết toàn
bộ thành phần trong dược liệu với qui mô sản xuất thì dung môi thích hợp nhất
là EtOH có nồng độ thích hợp [30], [31].
c, Bước 3. Lựa chọn phương pháp chiết xuất: Có rất nhiều phương pháp chiết
xuất khác nhau, việc lựa chọn biện pháp chiết xuất cần căn cứ vào từng trường
hợp và yêu cầu cụ thể [32], [33].

* Phương pháp ngâm:
Chiết xuất bằng phương pháp ngâm là cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ mịn
thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, sau đó gạn, ép,
lắng, lọc thu lấy dịch chiết [32]. Tùy theo nhiệt độ chiết xuất, chia thành: - Ngâm lạnh: ngâm ở nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, thường áp
dụng với những dược liệu chứa hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt.
- Hãm: cho dung môi vào dược liệu đã chia nhỏ trong một thời gian xác
0

định, có thể khuấy trộn, nhiệt độ thường là ở 40 – 50 C.


11

- Hầm: ngâm dược liệu đã chia nhỏ với dung môi trong một bình kín,
giữ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi trong một thời gian nhất định.
- Sắc: đun sôi dược liệu với dung môi, áp dụng với dung môi ít bay hơi.
- Ngâm động: cũng giống ngâm tĩnh, chỉ khác là toàn bộ khối nguyên
liệu chiết được đặt trên một sàn chuyển động, nhằm tăng sự khuếch tán.
Ưu điểm của phương pháp là đơn giản dễ thực hiện, thiết bị có giá thành
thấp, có thể áp dụng cho cả chiết xuất thô và chiết xuất ở qui mô lớn. Nhược
điểm là tốn thời gian, tốn dun g môi, năng suất thấp, thao tác thủ công [34].
* Phương pháp ngấm kiệt:
Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt là cho dung môi chảy chậm qua
nguyên liệu chiết đựng trong “bình ngấm kiệt”. Sau một thời gian xác định, rút
nhỏ giọt dịch chiết phía dưới bình ngâm, đồng thời bổ sung thêm bằng cách
thêm dung môi mới với tốc độ chậm và liên tục đi qua lớp dược liệu không
khuấy trộn. Trong thời gian ngâm và dịch chuyển chậm, dung môi được giữ lại
và tiếp xúc với dược liệu, hoạt chất được hòa tan. Sau đó thêm dung môi mới,
lớp dung môi này ngấm vào trong khối dược liệu và đẩy dịch chiết (dung môi
cũ đã hòa tan dược chất) ra ngoài. Lớp dung môi mới tiếp tục hoà tan hoạt chất

còn lại trong dược liệu. Như vậy, dược liệu luôn được tiếp xúc với dung môi
mới nên có thể chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu [33].
Phương pháp có ưu điểm tốn ít dung môi và chiết kiệt được hoạt chất,
thu được dịch chiết đậm đặc, thích hợp cả với lượng nhỏ trong nghiên cứu và
chiết xuất thô và qui mô chiết lớn [31]. Nhược điểm là tốn thời gian, dịch chiết
có thể lẫn nhiều tạp chất.
*Phương pháp chiết hồi lưu và chiết Soxhlet
Trong chiết xuất hồi lưu, dược liệu được ngâm trong bình cầu, phía trên
có lắp với sinh hàn. Dung môi được làm nóng tới nhiệt độ sôi, bốc hơi sau đó
gặp sinh hàn ngưng tụ trở lại bình cầu. Nhược điểm của chiết hồi lưu là thành
phần hóa học có thể bị phân hủy bởi nhiệt [31].