Nghiên cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU KHỬ KHOÁNG TRONG THU NHẬN
CHITIN BẰNG LÊN MEN LACTIC
TỪ VỎ ĐẦU TÔM SÚ

Ngành:

Công nghệ sinh học

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện
MSSV: 0851110242

: Nguyễn Thị Ngọc Thu
Lớp: 08DSH2

TP. Hồ Chí Minh, 2012.


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Với hiện trạng các nhà máy sản xuất thuỷ sản, đặc biệt là tôm lột vỏ, đã thải ra
môi trường hàng tấn vỏ tôm như là nguồn chất thải đã gây ô nhiễm môi trường trầm

trọng. Hơn thế nữa, vỏ tôm là một nguồn tài nguyên quý nếu ta biết cách sử dụng.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tái sủ dụng vỏ tôm như làm thức ăn
gia súc, gia cầm và đặc biệt là thu nhận các hợp chất quý trong vỏ tôm như chitin,
carotenoid. Các hợp chất này có rất nhiều ứng dụng trong cuộc sống. Vì vậy, em
nhận thấy vấn đề thu nhận chitin từ vỏ tôm là việc vô cùng quan trọng hiện nay. Nó
vừa giúp cải thiện môi trường mà còn đem lại một nguồn lợi vô cùng lớn cho con
người.
Tuy nhiên, các quy trình sản xuất chitin trước đây thường dùng công nghệ hoá
học, vì vậy nó không những không góp phần bảo vệ môi trường mà còn gây hại
thêm bởi một lượng lớn các chất hoá học với nồng độ cao thải ra ngoài môi trường
trong quá trình chế biến.
Trước thực tiễn trên, em nhận thấy cần phải nghiên cứu thêm về các quy trình
thu nhận chitin bằng phương pháp sinh học để tránh các thiệt hại cho môi trường
đồng thời thu về nguồn lợi quý từ chitin. Do đó, em đã thực hiện đề tài “Nghiên
cứu khử khoáng trong thu nhận chitin bằng lên men lactic từ vỏ đầu tôm sú”.
2. Tình hình nghiên cứu
Có rất nhiều công trình nghiên cứu về vấn đề này trên thế giới, đặc biệt là ở
Ấn Độ, Nhật Bản, Anh, Pháp… đều tìm được điểm chung là phương pháp lên men
lactic vỏ tôm sẽ thu được nguồn chitin dễ dàng tinh sạch và hiệu suất cao hơn.
3. Mục đích nghiên cứu
Xác định các thành phần trong quy trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng
phương pháp lên men lactic với chủng L. acidophilus. Acid lactic sinh ra trong quá
trình lên men sẽ loại các ion khoáng trong nguyên liệu vỏ tôm như: Ca2+, Mg2+,
đồng thời các vi khuẩn lactic sẽ phân huỷ một phần protein trong vỏ tôm.
1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Tìm ra tỉ lệ nước và đường D – glucose thích hợp cho quá trình lên men.

So sánh phương pháp xử lý vỏ tôm bằng hoá học và bằng sinh học.
5. Phương pháp nghiên cứu
a. Phương pháp luận
Trước khi thực hiện đề tài này, em đã được biết qua rất nhiều các ứng dụng
của chitin – chitosan được ứng dụng trong cuộc sống và đã tham khảo nhiều quy
trình thu nhận chitin của các tác giả trong và ngoài nước. Em nhận thấy quy trình
thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phương pháp lên men lactic vừa an toàn đối với môi
trường vửa dễ dàng áp dụng vào cuộc sống. Vì vậy em đã chọn vi khuẩn
Lactobacillus acidophilus, một chủng vi khuẩn sản sinh nhiều vi khuẩn lactic vừa
thân thiện với con người để lên men vỏ tôm thu nhận chitin.
b. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.
Sử dụng phần mềm Statghraphics để xử lý số liệu.
6. Các kết quả đạt được của đề tài
Xác định tỉ lệ nước:vỏ tôm và tỉ lệ đường:vỏ tôm thích hợp cho quy trình lên
men, từ đó hoàn thiện đề nghị quy trình khử khoáng vỏ đầu tôm sú để sản xuất
chitin với Lactobacillus acidophilus.
7. Kết cấu của ĐATN
Đồ án gồm có 4 chương:
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và biện luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

2


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.

Tổng quan về Lactobacillus

1.1.1.

Giới thiệu về Lactobacillus acidophilus

1.1.1.1. Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillilales
Họ: Lactobacillaceae
Chi: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus acidophilus.
Vi khuẩn này được mô tả lần đầu tiên do công của một bác sĩ là Bruno Oppler
và một nhà nghiên cứu dạ dày ruột là Ismar Isidor Boas. Tên gọi Lactobacillus
acidophilus bắt nguồn từ lacto có nghĩa là sữa, bacillus chỉ hình dáng giống cây gậy
và acidophilus nghĩa là một “acid đằm thắm” (acid loving).
L. acidophilus là vi khuẩn Gram (+), hình que, không sinh bào tử. Nó có khả
năng lên men cả hiếu khí lẫn kỵ khí. Trong trường hợp lên men đồng hình, glucose
được sử dụng để tạo acid lactic, hoặc tạo thành nhiều sản phẩm khác nhau như acid
acetic, ethanol, CO2…trong trường hợp lên men dị hình.

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.1.1.2. Hình thái

L. acidophilus là trực khuẩn, có kích thước rộng 0,6 - 0,9 µm, dài 1,5 – 6 µm,
lên men đồng hình, nhiệt độ phát triển tối ưu là 37 - 42 oC. Trong tự nhiên, chúng
tồn tại riêng lẻ, đôi khi tạo thành chuỗi ngắn có khả năng chuyển động.
Lên men cellobiose, galactose, lactose, maltose và sucrose. Không lên men
được mannitol, melezitose, rhamnose, sorbitol, và xylose.

a.

b.

c.
Hình 1.1. Hình thái L. acidophilus
a. Hình thái khuẩn lạc L. acidophilus nằm nghiêng
b. Hình thái khuẩn lạc L. acidophilus
c. Hình thái tế bào L. acidophilus khi nhuộm Gram

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.1.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hóa
L. acidophilus có thể phát triển ở nhiệt độ cao như 45 oC nhưng tối ưu là 35 –
40 oC. Tính chịu acid của nó từ 0,3 - 1,9 % chuẩn độ acid, với pH tối ưu từ 5,5 - 6.
Chúng có những yêu cầu phát triển phức tạp như: áp lực oxygen thấp, có thể lên
men carbohydrate, protein và các phần tử bị phá vỡ từ các chất này, một số vitamin
và khoáng như B-complex, acid nucleic, Mg, Mn, Fe cần cho sự phát triển.
L. acidophilus phát triển ở pH thấp < 3,5 và lên men trong điều kiện yếm khí.
L. acidophilus sử dụng đường như một cơ chất cho sự lên men và sống được ở môi
trường phong phú đường. Mỗi phân tử glucose trải qua sự lên men trong L.
acidophilus tạo ra năng lượng là 2 ATPs. Ngoài glucose, L. acidophilus còn sử

dụng aesculin, cellobiose, galactose, lactose, maltose, salicin, sucrose và trehalose
cho sự lên men.
1.1.1.4. Đặc điểm sinh thái.
L. acidophilus được biết như một loài có vai trò probiotic. Sự bám dính và khả
năng liên kết với nhau tạo thành một tập đoàn của vi khuẩn lactic là cơ chế hữu hiệu
để hạn chế vi khuẩn có hại. Khi vi khuẩn lactic vào trong cơ thể, định cư ở đường
ruột, chúng cạnh tranh vị trí gắn kết trên thành ruột với vi sinh vật có hại, làm hạn
chế số lượng tế bào vi sinh vật có hại trong đường ruột. L. acidophilus có khả năng
sinh tổng hợp một số chất có khả năng kháng khuẩn như acid lactic, hydrogen
peroxide, diacetyl và bacteriocin làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn có hại.
Ngoài ra, L. acidophilus còn có vai trò như một chất bổ trợ cho những người không
chịu được lactose. Chúng tập hợp ở đường tiêu hóa, góp phần chuyển hóa và phân
giải lactose trong quá trình tiêu hóa thức ăn ở dạ dày và ruột.
1.1.1.5. Cơ chế kháng khuẩn của L. acidophilus
Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức
chế sự phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm. Chateau et al (1993) phân
lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp)
thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella. Khoảng 47 %
5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Lactobacillus của sản phẩm A và 70 % của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6
serotype E. coli.
Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L. acidophilus,
L. casei vàL. faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella. Jin
et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát
triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E. coli.
Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và
hydroperoxyd. Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thành

phần protein sinh học chủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976). Các chủng
Lactobacillus có ở đường ruột của người và một số động vật thí nghiệm khác cũng
sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al., 1995).
Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không mẫn cảm với các hoạt động xúc tác.
Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp,
Salmonelle spp, E.coli và Staphylococcus spp vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất
rộng.
Cơ chế hoạt động cơ bản của bacteriocin chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng
tế bào chất và enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đổi chất của vi
khuẩn khác.
Hoạt tính kháng vi sinh vật nhờ cơ chế biểu diễn trên hình 1.2 (Cotter et al.,
2005). Trong đó Bacteriocin class I (đại diện: Nisin của Lactococcus lactics) gắn
vào lớp lipid II, ngăn sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptidglycan từ tế bào chất đến
vách tế bào, do đó ngăn tổng hợp vách tế bào hoặc do bám được vào lớp lipid II,
các phân tử nisin tạo lỗ xuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; Bacteriocin class II
(đại diện: Sakacin của Lactobacillus sakei) là các peptid lưỡng tính có khả năng
xuyên màng tế bào tạo kênh trên lỗ trên màng. Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như
lysostaphin) – protein bền nhiệt, tác động trực tiếp lên vách tế bào đích.

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.2. Cơ chế kháng vi sinh vật nhờ khả năng sinh bacteriocin.
Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm
cuối của quá trình trao đổi chất. Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi
do Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm).
Các sản phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic,
acid acetic (Trammer, 1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et

al, 1952; Dahiafa và Speck, 1968; Price và Lee, 1970). Các acid acetic, lactic ức chế
sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970;
Herrick, 1972; Adams và Hall, 1988) phát hiện ra các hoạt động của các acid này
phụ thuộc vào độ pH. Nếu độ pH thấp sẽ tăng mức độ acid ở dạng không hòa tan.
Khả năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh ở chủng L. acidophilus rất quan
trọng trong đề tài này. Vì phải lên men trong môi trường vỏ tôm chứa nhiều dinh
dưỡng, nếu L. acidophilus có khả năng đối kháng cao sẽ ức chế các VSV cây mùi
hôi thối trong quá trình lên men, đồng thời ngăn các VSV có thể gây hại cho sức
khoẻ con người.
1.2.

Tổng quan về tôm sú và nghề nuôi tôm sú tại Việt Nam

1.2.1.

Vị trí phân loại

Tôm sú được định loại là:
Ngành: Arthropoda
7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Lớp: Crustacea
Bộ: Decapoda
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
Loài: monodon
Tên khoa học: Penaeus monodon Fabricius

1.2.2.

Vùng phân bố của tôm sú trên thế giới

Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ Án Độ Dương qua hướng Nhật Bản,
Đài Loan, phía đông Tahiti, phía nam châu Úc và phía tây châu Phi (Racek, 1955;
Holthuis và Rosa, 1965; Motoh, 1981, 1985).
Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30 oE đến 155 oE, từ vĩ độ 35 oN đến
35 oN xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaysia,
Philippines và Việt Nam.
Tôm bột, tôm giống và tôm gần trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và
vùng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành, chúng di chuyển xa bờ vì thích sống
ở vùng nước sâu hơn.
1.2.3.

Các vùng nuôi tôm chủ yếu tại Việt Nam

Theo Tổng cục Thủy sản (Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn), năm 2011,
cả nước thả nuôi được 656.425 ha tôm nước lợ, với sản lượng đạt 495.657 tấn, tăng
2,71 % về diện tích và 5,48 % về sản lượng so với năm 2010. Trong đó, diện tích
nuôi tôm sú là 623.377 ha, đạt sản lượng 319.206 tấn, bằng 95,81 % năm 2010.
Riêng khu vực đồng bằng sông Cửu Long, tổng diện tích thả nuôi tôm là
602.416 ha (bao gồm 588.419 ha nuôi tôm sú và 18.498 ha nuôi tôm thẻ chân
trắng), chiếm 91,8 % diện tích nuôi tôm của cả nước.
Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam cho biết, tổng giá trị xuất
khẩu tôm của Việt Nam trong năm 2011 đạt 2.396 tỷ USD, tăng 13,7 % so với năm
8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

2010 và đã vượt qua mốc 2 tỷ USD. Trong đó, xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ
USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị, xuất khẩu tôm chân trắng đạt 704 triệu USD,
chiếm 29,3 % tỷ trọng, 12 % còn lại là tôm các loại khác.
Về thị trường xuất khẩu, tôm Việt Nam đã thâm nhập sâu hơn và các thị
trường khác ngoài 3 thị trường trọng điểm truyền thống là Mỹ, Nhật Bản và châu
Âu. Năm 2010, giá trị xuất khẩu tôm sang 3 thị trường này chiếm hơn 71 % tổng
sản lượng xuất khẩu tôm cả nước. Sang năm 2011, tỷ trọng này còn 66 %.
Trong khi đó, xuất khẩu sang một số thị trường khác như Hàn Quốc, các nước
Đông Nam Á… và đặc biệt là sang Nga tăng mạnh, xuất khẩu tôm sang Nga tăng
124 % so với năm 2010. Xuất khẩu tôm sang Hàn Quốc tăng 23 %, sang các nước
Đông Nam Á tăng 54,7 %.
Năm 2011, tôm sú vẫn giữ vị trí chủ đạo trong cơ cấu xuất khẩu tôm Việt
Nam. Tuy nhiên, tỷ trọng về khối lượng và giá trị đang giảm dần, đặc biệt là các
mặt hàng tôm sú sống, tươi hoặc đông lạnh.
1.2.4.

Các sản phẩm chủ yếu được sản xuất từ tôm sú

Tôm tươi được chế biến lạnh đông dưới nhiều dạng như sau:
 Tôm nguyên con còn đầu và còn vỏ.
 Tôm bỏ đầu: tôm bỏ đầu và còn vỏ.
 Tôm bỏ đuôi: tôm bỏ đầu, bỏ ruột và bóc một phần vỏ.
 Tôm xẻ lưng, bóc vỏ đến đốt áp chót.
 Tôm cánh bướm, bóc vỏ đến đốt áp chót, cắt dọc theo chiều dài sống
lưng, xẻ banh ra.
 Tôm có 4 đốt đầu được bóc vỏ và cắt theo chiều dài.
 Tôm bóc noãn: tôm bỏ đầu, bỏ vỏ và bỏ ruột.
 Tôm bóc noãn.
 Tôm bóc noãn, xẻ lưng.
 Tôm bóc noãn không nguyên vẹn.

 Tôm bóc noãn và cắt cánh bướm: tôm boc noãn được cắt dọc theo
chiều dài đến đốt cuối cùng.
9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
 Tôm bóc noãn có 4 đốt đầu tiên được cắt theo chiều dài.
1.2.5.

Các phương pháp xử lý vỏ tôm thải hiện nay

Trong các quy trình sản xuất tôm lột vỏ, một lượng lớn vỏ tôm bị thải ra
ngoài, gây ô nhiễm môi trường, đồng thời trong vỏ tôm thải vẫn còn rất nhiều hợp
chất có thể thu nhận lại. Các protein, khoáng chất, vi lượng… trong vỏ tôm thải có
thể chế biến thành thức ăn gia súc, gia cầm. Ngoài ra, các hợp chất quý như
carotenoid, chitin… thu nhận từ vỏ tôm có rất nhiều ứng dụng trong y học, công
nghiệp và nông nghiệp.
Đầu vỏ tôm, phụ phẩm trong ngành chế biến thuỷ hải sản, đã được nhiều tác
giả nghiên cứu và sử dụng làm thức ăn gia súc, có nhiều công trình nghiên cứu về
thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng của đầu và vỏ tôm.
Theo Vũ Duy Giảng (1995), bột đầu tôm được chế biến từ đầu, càng, vỏ tôm
là nguồn protein động vật rất tốt cho gia súc, gia cầm. Giá trị dinh dưỡng của bột
đầu tôm thấp hơn bột cá và bột máu. Bột đầu tôm có 33 – 34 % protein, trong đó có
4 – 5 % lysin và 2,7 % methionin.
Theo Dương Xuân Tuyển, đầu vỏ tôm tươi đem hấp cách thuỷ có chứa chất
khô là 26,40 % và protein thô khoảng 11,38 %, trong khi protein thô trong vỏ đầu
tôm muối chua là 11,20 %.
Chất xơ trong đầu vỏ tôm khá cao và biến động tuỳ theo thành phần đầu vỏ
tôm, hàm lượng thay đổi từ 3,3 – 6,0 %. Canxi, phospho là thành phần khá quan
trọng trong đầu vỏ tôm. Đầu vỏ tôm tươi đem hấp chứa 3,68 % canxi và 0,22 %

phospho, tro và đầu vỏ tôm ủ chua có hàm lượng canxi 2,15 % và phospho 0,44 %.
Bột đầu vỏ tôm sấy khô chứa 5,2 % canxi và 0,9 % phospho (Dương Xuân Tuyển,
1992).
Đầu vỏ tôm tươi ít được sử dụng nuôi heo nhưng được sử dụng khá phổ biến
như nguồn thức ăn bổ sung đạm trong chăn nuôi vịt đẻ. Vỏ đầu tôm tươi đem hấp
được Dương Xuân Tuyển (1992) sử dụng đến 46 % và lúa là nguồn thức ăn năng
lượng chính nuôi vịt đẻ CV super M tại trại Vigova, cho năng suất trứng 160

10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
quả/năm so với tiêu chuẩn của Anh về năng suất trứng đối với giống vịt bố mẹ 170
quả/năm.
Một vài tác giả cũng đã sử dụng vỏ đầu tôm ủ chua nuôi heo thịt. Lê Văn Liễn,
Nguyễn Thiện (1995), dùng 5 % đầu vỏ tôm ủ chua thay thế bột cá trong khẩu phần
thức ăn nuôi heo thịt cho kết quả tăng trọng và tiêu tốn thức ăn tương đương khẩu
phần có 10 % bột cá. (Theo Nguyễn Thị Thu Vân – 1997).
Tuy nhiên, các phương pháp trên vẫn chưa tận dụng hết các hợp chất trong vỏ
tôm như chitin hay carotenoid. Những năm gần đây, có rất nhiều nghiên cứu trên
toàn thế giới về việc thu nhận chitin trong vỏ tôm nhằm tránh lãng phí nguồn tài
nguyên này.
1.3.

Tổng quan về chitin – chitosan

1.3.1.

Cấu trúc chitin - chitosan

Về mặt lịch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào 1821, trong cặn
dịch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn
gốc của nó. Năm 1823, Odier phân lập một chất từ bọ cách cứng mà ông gọi là
chitin hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra
sự có mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận
chitin có dạng công thức giống như cellulose.
Chitin là polysaccharide phổ biến thứ 2 trên đất sau cellulose, được tìm thấy
trong xương người cũng như trong các bộ phận của động vật không xương sống.
Nó là sự kết hợp giữa liên kết β (1→4) với 2 – acetamido – 2 – deoxy – β – D
– glucose (N – acetylglucosamine).
Chitin thường được coi là dẫn xuất cellulose và có chứa 6,9 % là N (Black và
Schwartz, 1950). Nó có cấu trúc giống hệt cellulose vì có gốc acetamide (-NH-COCH3) ở vị trí C2. Một dẫn xuất khác của chitin, chitosan là 1 polymer tuyến tính
α (1 → 4) 2 – annino – 2 – deoxy – β – D – glucopyranose

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Hình 1.3. Công thứ cấu tạo của chitin
1.3.2.

Tính chất hoá học của chitin - chitosan

Chitin là 1 polysaccharide chứa nitơ, trắng, cứng, không đàn hồi, không tan
trong nước và acid yếu, chỉ tan trong một số dung môi, bền trong môi trường kiềm
nhưng kém bền trong môi trường acid.
Chitin ở thể rắn có độ kết tinh cao do gốc –NHCOCH3 ở vị trí cacbon thứ hai,
làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau.
Chitin ổn định với các chất oxy hoá khử như KMnO4, H2O2, NaClO hay

Ca(ClO)2,... có thể lợi dụng tính chất này để khử màu chitin.
Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bị khử bởi gốc acetyl tạo
thành chitosan.

a.

b.

Hình 1.3. Cấu tạo của chitin (a) và chitosan (b)

12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Phản ứng của chitosan linh hoạt hơn so với cellulose nhờ nhóm -NH2, có thể
liên kết với chất béo.
Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với
iod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích định tính
chitosan.
Tính chất chung của chitin và chitosan:
 chuỗi polymer bền,
 các nhóm amin phản ứng,
 có nhóm hydroxyl phản ứng tồn tại, và
 giữ nhiều ion thu kim loại chuyển đổi.
Thuộc tính sinh học của chitosan:
a. Thích ứng sinh học:


chuỗi polymer tự nhiên,



có thể phân hủy sinh học,



an toàn và không độc.

b. Có phản ứng liên kết.
c. Tái tạo các phản ứng keo liên kết.
d. Tăng hệ hình thành chất osteoblast chịu trách nhiệm cho xương hình
thành.
e. Cầm máu.
f.

Diệt nấm, vi khuẩn, virus.

g. Diệt tinh trùng.
h. Ngừa sưng tấy.
i.

Chống các tác nhân gây dị ứng.

j.

Ngừa chotesterol, ngừa tăng huyết áp.

k. Tăng khả năng tái tạo xương.
l.

Ức chế sự đau đến hệ thần kinh trương ương.

m. Bổ trợ miễn dịch.

13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
1.3.3.

Tình hình sản xuất chitin – chitosan hiện nay

1.3.3.1. Các quy trình sản xuất cổ điển
Có rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về sản xuất chitin – chitosan bằng
phương pháp hoá học, nhưng nhìn chung phải thực hiện qua các bước sau:
Khử protein → Khử khoáng → Khử màu → Loại gốc acetyl.
Ví dụ về một số quy trình sản xuất chitin – chitosan tiêu biểu:
 Quy trình sản xuất chitin từ tôm sông nước ngọt của Mayer và Lee, đại
học Louisiana, Hoa Kỳ (1989).
 Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc
Anh (1998).
 Quy trình sản xuất của PGS.TS Trần Thị Luyến, đại học Nha Trang.
 Ngoài ra còn nhiều nghiên cứu khác đến từ các nước như Ấn Độ, Nhật
Bản, Anh, Pháp, Thái Lan…

14


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Ví dụ: Quy trình sản xuất của Robert, đại học Nottingham Trent, Vương quốc

Anh (1998)
Nguyên liệu
NaOH 5 %
Ngâm trong NaOH

to = 100 oC
τ=4h

Khử protein
Rửa trung tính

HCl 0,275 N
Ngâm trong HCl

to phòng
τ=1h

Khử khoáng

Rửa trung tính
to phòng
Ngâm trong HCl

τ=24h

Rửa trung tính

Tẩy bằng NaOCl hoặc H2O2
NaOH 35 - 50 %

Khử màu
Nấu
Rửatrong
trungNaOH
tính
Khử gốc acetyl

to = 80 – 140 oC
τ = 0,5 – 10 h

RửaChitin
trung tính
Sấy khô

Chitosan
Nhận xét:
Đây là quy trình tổng hợp từ cá quy trình sản xuất trước đó. Sản phẩm
chitosan được sản xuất theo quy trình này có màu sắc đẹp, các chất màu được loại
bỏ sạch trong quá trình tẩy màu. Hàm lượng protid và khoáng chất còn lại trong
chitin thấp.
15


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Tuy nhiên, nhược điểm của quy trình này là sử dụng quá nhiều hoá chất nồng
độ cao với số lượng lớn, dẫn đến tăng giá thành sản xuất, đồng thời nếu quá trình xử
lý nước thải không tốt sẽ ảnh hưởng rất lớn đến môi trường.
1.3.3.2. Quy trình sản xuất chitin hiện đại
Hiện nay, việc bảo vệ môi trường đang là vấn đề lớn và được nhiều người
quan tâm. Vì vậy, việc tìm ra một quy trình sản xuất chitin ít gây ô nhiễm môi

trường đang được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới. Thay vì sử dụng các hoá chất
với nồng độ cao, các nhà khoa học đang ứng dụng sinh học vào quy trình sản xuất
và đã đem lại nhiều thành công trong vấn đề này.
Nguyên liệu

Làm sạch

Nghiền nhỏ < 5 mm
NaCl 2 %

Trộn đều

Sucrose 15 %
H2O 1:1(w/v)
Giống 5 %w/v

Lên men
72 h, to = 32 oC
Ly tâm 4000 rpm, 10 m

Dịch lên men

Bã lên men

Sấy 48 oC, 16 – 18 h
Chitin thô

16

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Hình 1.4. Quy trình lên men vỏ tôm thu nhận chitin của Bhaskar,viện nghiên
cứu công nghệ thực phẩm, Ấn Độ, 2010.
Trong phương pháp này, người ta chủ yếu dùng vi khuẩn lên men lactic để ủ
tôm. Acid lactic sinh ra sẽ khử khoáng trong nguyên liệu, đồng thời ngăn không cho
các vi sinh vật gây hôi thối phát triển. Đồng thời các vi sinh vật này sẽ phân huỷ
một phần protein còn lại trong nguyên liệu. Ngoài ra, có thể sử dụng các enzyme
thuỷ phân protein từ Aspergillus oryzea để thúc đẩy hiệu suất quá trình cao hơn.
1.3.4.

Ứng dụng của chitin – chitosan

1.3.4.1. Ứng dụng trong công nghiệp
Do có tính chất vật lý và hóa học ưu việt, chitosan đang được sử dụng trong
một mảng lớn các sản phẩm và ứng dụng khác nhau, từ dược phẩm, mỹ phẩm và
bảo vệ thực vật.


Mỹ phẩm

Thông thường, các acid hữu cơ được sử dụng làm dung môi cho các ứng dụng
mỹ phẩm như là aminopolysaccharide, chitosan được bao phủ trong lớp keo
hydrocolloid, tuy nhiên không giống các loại keo hydrocolloid khác, chitosan tạo
tính nhớt khi được trung hòa acid. Chúng tạo điều kiện tương tác với da và tóc tốt
hơn. Ngoài ra chitin và chitosan diệt và kháng nấm rất tốt. Chitosan cũng có thể hấp
thụ các chất độc hại như tia UV hoặc các loại thuốc nhuộm khác do có thể dễ dàng
liên kết chung với gốc amino của chitosan.
Chitin và chitosan và các dẫn xuất của chúng được sử dụng trong ba lĩnh vực
mỹ phẩm bao gồm:
-Tóc: dầu gội, dầu xả, thuốc nhuộm tóc, kem tạo kiểu tóc, thuốc xịt tóc, nước

dưỡng tóc.
-Da: kem dưỡng da, sữa tắm, son môi, phấn nền, phấn mắt, mascara, sơn
móng tay, sữa dưỡng ẩm…
-Chăm sóc răng: kem đánh răng, nước súc miệng, kẹo cao su, ngoài ra còn
được áp dụng như một chất độn nha khoa.
17


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP


Xử lý nước

Do tích chất polycationic tự nhiên, chitosan được sử dụng như một tác nhân
kết bong, hoặc kết tủa chất bẩn.
Weltroswki et al, sử dụng chitosan N_benzyl dẫn xuất sulphonat như các chất
hấp thụ để loại bỏ ion kim loại trong môi trường acid. Năm 1999, Bhavani và dutta
sử dụng chúng như chất hấp phụ loại bổ màu từ nước thải xưởng nhuộm.
Ngoài ra, chitosan còn dùng để loại khỏi chất thải các chất như: kim loại nặng,
asen, plutoniun, methyl acetate – thủy ngân, acetaldehyd, kể cả dầu mỏ và dầu khí.


Công nghiệp giấy

Do có khả năng phân hủy sinh học nên chitin – chitosan được sử dụng trong
ngành sản xuất giấy tái chế thân thiện với môi trường và bao bì thực phẩm.


Công nghiệp dệt

Dẫn xuất chitosan được sử dụng để chống tĩnh điện, chống bám bẩn. Ngoài ra
chitin có thể sử dụng trong quá trình in ấn hoàn thiện sản phẩm. Chitosan có khả
năng xử lý màu nhuộm trong nước thải.


Chế biến thực phẩm

Chitosan được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm vì tính không độc
đối động vật máu nóng của nó. Các hạt tinh thể chitin siêu nhỏ (MLL) có tính chất
nhũ hóa, làm dày và tạo gell cho thực phẩm. Nó còn được sử dụng như chất xơ
trong thực phẩm nướng. Việc sử dụng MLL giải quyết các vấn để như màu sắc, mùi
vị và hạn sử dụng dài hơn các loại chất xơ. Ngoài ra chitin – chitosan còn kháng vi
khuẩn, kháng nấm và cản trở sự hoạt động của enzyme.


Nhiếp ảnh

Trong nhiếp ảnh màu, Chitosan đã được sử dụng như một tác nhân cố định
màu thuốc nhuộm acid trong gelatin và hổ trợ khuyết tán.


Sắc ký phân cách

18


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Chitosan và chitin là một chất hỗ trợ hữu ích cho sự phân ly trong sắc ký do có
sự hiện diện của các nhóm tự do – NH2, - OH chính và – OH thứ cấp .
Rhee et al đã sử dụng chitin và chitosan làm vật liệu hấp thụ pha rắn trong

khai thác phenol và chloirophenol bằng sắc khí lỏng hiện năng cao HPLC . Ngoài ra
có thể sử dụng chitosan trong sắc khí lỏng phân tích nucleic acid.


Pin dạng rắn.



Chitin cho các ứng dụng đèn LED và NLO.

1.3.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp
 Xử lý hạt
Hạt giống xử lý bằng chitin trước khi gieo trồng sẽ thúc đẩy và nâng cao độ
tăng trưởng. Bổ sung chitin trong bầu đất sẽ dẫn đến giảm đáng kể sâu hại rễ, vi
khuẩn gây bệnh và nấm mốc.
 Chất mang trong sản xuất phân bón
Trong nông nghiệp, việc kéo dài thời gian tác dụng của phân bón, chất điều
hoà tăng trưởng hay chất dinh dưỡng là rất cần thiết. Chitosan được sử dụng như
chất mang tự nhiên để kết hợp và phóng thích từ từ các hợp chất mong muốn vào
trong đất. Chitosan bị phân huỷ sinh học trong đất khoảng hai tháng, kèm theo là sự
phogs thích các chất. Do đó, người ta tiết kiệm được đáng kể lượng chất sử dụng và
thời gian bón lặp khi sử dụng chitosan làm chất mang.
 Bảo quản nông sản
Trong bảo quản nông sản, chitosan không những phát huy khả năng kháng
khuẩn và nấm, mà còn giúp điều chỉnh môi trường bên trong rau củ thông qua kiểm
soát quá trình trao đổi khí giữa rau quả và môi trường. Ở Nhật, dung dịch chitosan
được phun lên táo và cam nhằm kháng nấm và vi khuẩn gây hư hỏng. André Bégin
cũng đề xuất quy trình bảo quản dâu bằng chitosan. Ngoài ra, chitosan còn được sử
dụng để làm bao bảo vệ chống sương giá.
1.3.4.3. Ứng dụng y sinh học

19


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Màng chitosan đã được đề xuất làm màng thận trong sản xuất thận nhân tạo vì
có độ thấm phù hợp và độ bền cao.
 Mô nhân tạo
Chitosan và một số dẫn xuất đã được nghiên cứu để sử dụng trong một số ứng
dụng y sinh bao gồm băng bó vết thương và làm đầy không gian cấy ghép. Chitosan
được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật mô xương và hệ thần kinh trung ương,
ngoài ra chúng còn được nghiên cứu để chữa sụn khớp.
Chitosan đã được nghiên cứu để sản xuất chỉ may vết thương và cho thấy tốc
độ chữa lành vết thương nhanh hơn bình thường.
 Điều trị bỏng
Do chitosan có thể hình thành màng thấm nước, có khả năng tương tác sinh
học. Màng phim có thể hình thành trực tiếp trên vết bỏng bằng cách sử dụng dịch
nước của chitosan acetate. Một lợi thế nữa của chitosan là khả năng thẩm thấu oxy
tốt đây là điều quan trọng để các mô bị thương không bị thiếu oxy. Ngoài ra, lớp
màng phim chitosan có khả năng hấp thụ nước và bị phân hủy tự nhiên bởi các
enzyme trong cơ thể nên không cần phải phẫu thuật loại bỏ.
 Da nhân tạo
Do nhiều tính chất như: tạo màng, có khả năng thẩm thấu oxy, thấm nước, diệt
khuẩn, làm mau lành vết thương… hiện nay chitosan đang được nghiên cứu để sản
xuất da nhân tạo phục vụ cho y học.
 Nhãn khoa
Sử dụng làm kính áp tròng do có đặc tính quang học rõ rang, ổn định cơ học ,
có độ thấm khí, có thể điều chỉnh quang, có thể thấm ướt, và có khả năng tương
thích với hệ miễm dịch, Ngoài ra khả năng kháng khuẫn và dễ chữa lành vết thương
cũng giúp ích rất nhiều trong trường hợp này
 Màng bao thuốc

Chitosan có đặc tính kháng khuẩn kháng nấm, không độc, chitosan là chất vô
cùng thích hợp để sản xuất màng bao thuốc.
20


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1

Vật liệu nghiên cứu

2.1.1.

Địa điểm nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh thuộc trường Đại Học
Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM.
2.1.2.

Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ ngày 1/05/2012 đến ngày 20/07/2012.
2.1.3.

Giống vi sinh vật

Giống L. acidophilus được sử dụng trong các thí nghiệm được lấy từ dược
phẩm ANTIBIO. Đây là một dạng chế phẩm sinh học dạng bột, chứa 109 CFU/g
(theo như khuyến cáo của nhà sản xuất).

2.1.4.

Thiết bị và dụng cụ

2.1.4.1. Nguyên liệu và hoá chất
 Nguyên liệu
Nguyên liệu chính của đề tài này là vỏ tôm thu thập từ các chợ Bàn Cờ và Bà
Chiểu. Quá trình chuẩn bị vỏ tôm được trình bày trong sơ đồ hình 2.1.
Vỏ tôm

Rửa sơ
Xay nhuyễn ≤ 2 mm

Tiến hành thí nghiệm

Bảo quản ở -4 oC

Hình 2.1. Sơ đồ xử lý vỏ tôm trước khi thí nghiệm

21


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Vỏ tôm sau khi thu nhận được bảo quản trong thùng lạnh từ chợ về đến phòng
thí nghiệm, rửa sơ, loại bỏ các tạp chất như sỏi, đá nhỏ… sau đó được xay nhuyễn
(≤2 mm) và bảo quản lạnh -4 oC. Quá trình này cần làm nhanh để tránh vỏ tôm bị
hư hỏng. Nếu vỏ tôm có hiện tượng hỏng như có mùi hôi thối hay tăng pH, cần
chỉnh pH về 6 – 6,5 trước khi thực hiện lên men với L. acidophilus.
 Hoá chất
 Môi trường MRS

Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS
Thành phần môi trường MRS (1 l)
Peptone:

10 g

Meat extract :

10 g

Yeast extract:

5g

K2HPO4 :

2g

Triammonium citrate:

2g

Glucose :

20 g

Tween 80:

1 ml

Natri acetate :

5g

MgSO4.7H2O :

0,58 g

MnSO2.4H2O:

0,25 g

(Agar:

15 %)

 Hoá chất dùng cho lên men vỏ tôm:
D – glucose.
NaCl.
NaNO2.
 Xác định hàm lượng Nitơ tổng số:
22


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
H2SO4 đậm đặc.
NaOH 45 %.
H2SO4 0,1 N chuẩn.
NaOH 0,1 N chuẩn.
Thuốc thử Tashiro.

Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4:CuSO4 (3:1).
 Xác định protein hòa tan bằng phương pháp Bradford:
Dung dịch albumin 0,1 mg/ml: cân chính xác 10 mg albumin pha trong 100 ml
nước cất, lắc đều cho tan, giữ ở 20 0C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch
albumin có nồng độ 0,01 mg/ml.
Dung dịch thuốc thử Bradford:
-

Coomassie Brilliant Blue: 0,001 g.

-

Ethanl tuyệt đối 4,7 g.

-

Acid phosphoric 85%: 8,5 g.

Phẩm màu Coomassie Brilliant blue được làm tan trong ethanol trong chai
đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85 % và chỉnh tới 100ml bằng nước cất.
 Xác định hàm lượng N amin theo phương pháp chuẩn độ formol:
Dung dịch NaOH 0,05 N.
Dung dịch phenolphtalein 0,1% trong etanol 90%.
Dung dịch formaldehyde trung hòa 30 %: Lấy 50 ml dung dịch formaldehyde
30 % cho thêm vài giọt phenolphtalein và chỉnh bằng dung dịch NaOH 0,1 N cho
đến khi xuất hiện màu phớt hồng.
 Xác định lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men:
NaOH 0,1 N.
Thuốc thử phenolphtalein.
 Thí nghiệm xác định lượng đường khử có trong dịch lên men:

23


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Thuốc thử DNS.
2.1.4.2. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh (Brlad France).
Tủ ủ (Memmert Germany).
Máy chạy Kjeldahl.
Tủ lạnh Toshiba.
Kính hiển vi quang học (Olympus).
Autolave (Huxky Đài Loan).
Máy đo quang (Hach-Germany).
Máy ly tâm (Tuttligen Germany).
Máy đo pH (Hach-Germany).
Cân phân tích (Orbital Germany).
Bếp từ (Billy – England).
Máy nước cất (Branstead USA).
2.1.4.3. Dụng cụ
Ống nghiệm không nắp và có nắp.
Đĩa petri.
Cốc thủy tinh 100ml, 250ml, 1000ml.
Erlen 100ml, 250ml, 500ml.
Ống đong 50ml, 100ml, 500ml.
Pipet thủy tinh 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml.
Ống ly tâm eppendorf.
Que cấy, que gắp, que trang.
Đũa thủy tinh.
Giá đỡ ống nghiệm, rổ nhựa.
24