Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng aspergillus niger tái tổ hợp​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH
VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE
TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - Năm 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH
VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE
TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP
Chuyên ngành:

Sinh học thực nghiệm

Mã số:

8420101.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Thị Tuyên
PGS.TS Nguyễn Quang Huy

Hà Nội – Năm 2020


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin trân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng
CNSH Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, lên
kế hoạch, tận tình theo sát hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ dạy kiến thưc
chuyên môn và tạo điều kiện tốt nhất để em có thể học tập và thực hiện luận văn tại
phòng Công nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và công nghệ Việt Nam.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy.
Người thầy, không những chỉ bảo tận tình cho em về mặt kiến thức, mà thầy còn
cho em những lời khuyên bổ ích và định hướng giúp đỡ cho em trong suốt quá trình
làm luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ sinh học enzyme –
Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn em trong
quá trình học tập, nghiên cứu.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân trong gia
đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em để
em vững bước và hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 3 tháng 12 năm 2019
Học viên

Nguyễn Thị Kim Thu


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1. Sơ lược về enzyme xylanase……………………………………………………………………3
1.1.1. Định nghĩa .............................................................................................. 3
1.1.2. Phân loại ................................................................................................. 4
1.1.3. Cấu trúc .................................................................................................. 4
1.1.4. Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác ........................................................... 6
1.2. Ứng dụng của enzyme xylanase ........................................................................ 10
1.2.1. Các chế phẩm xylanase trên thị trường quốc tế .................................. 10
1.2.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ....................................... 11
1.2.3. Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 11
1.2.4. Trong công nghiệp giấy và bột giấy .................................................... 12
1.2.5. Các ứng dụng khác .............................................................................. 13
1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase.................................................... 13
1.3.1. Trên thế giới ........................................................................................ 13
1.3.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 18
CHƢƠNG II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 20
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị............................................................................. 20
2.1.1. Chủng giống ........................................................................................ 20
2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 20
2.1.3. Môi trường ........................................................................................... 22
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 23
2.2. Phương pháp ................................................................................................... 24
2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase ............................................. 24
2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase ..................................................... 24

2.2.3. Xác định hàm lượng protein ................................................................ 26
2.2.4. Tinh sạch xylanase .............................................................................. 27
2.2.5. Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 30


2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase ............................................... 31
2.2.7. Xử lý số liệu ........................................................................................ 34
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 36
3.1. Nuôi biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng
hợp xylanase .......................................................................................................... 36
3.2. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp ........................... 39
3.2.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ ...................................................... 39
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH .................................. 40
3.2.3. Dung môi hữu cơ ................................................................................. 41
3.2.4. Chất tẩy rửa ......................................................................................... 42
3.2.5. Ion kim loại .......................................................................................... 43
3.3. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp ......... 43
3.3.1. Tinh sạch enzyme tự nhiên .................................................................. 44
3.3.2. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp 45
3.3.3. Khả năng phân giải cơ chất của xylanase tự nhiên và tái tổ hợp ........ 46
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 52
CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ .............................................................................. 61


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase ..................................................14
Bảng 1.2: Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật ...........................................15
Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng ...............................................................................20
Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch ...................................................21

Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng .................................................................................23
Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách .................................................................31
Bảng 3.1: Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng
A. niger VTCC017/ pANXlG2 .................................................................39
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp ..........42
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính của xylanase .........................43
Bảng 3.4: Tóm tắt quá trình tinh sạch xylanase từ chủng gốc A. oryzae VTCC-F-187 ...45


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy phân
xylan .............................................................................................................3
Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran ..........5
Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 .......................................6
Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng ..............................................................7
Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm ..............................................................7
Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ ......................................8
Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase .............................................................10
Hình 2.1: Đường chuẩn xylose ................................................................................26
Hình 2.2: Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn ................................27
Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger tái tổ hợp ....28
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. oryzae tự nhiên ....28
Hình 3.1: Điện di đồ protein tổng số của các mẫu protein và hoạt tính xylanase tái
tổ hợp trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất xylan 0,5% ................................36
Hình 3.2: Hình ảnh hoạt tính enzyme xylanase từ (A) chủng tự nhiên A. oryzae
VTCC-F187; (B) chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp .........37
Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sau khi qua cột histag xylanase G2 ........38
Hình 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của
xylanase tái tổ hợp .....................................................................................39
Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của

xylanase tái tổ hợp .....................................................................................40
Hình 3.6: Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ hữu cơ methanol (MtOH), ethanol
(EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) và n-butanol (n-BtOH) lên
hoạt tính xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng) ...................................41
Hình 3.7: (A) Sắc kí đồ trên cột Sephadex G200, (B) Điện di đồ SDS-PAGE của A.
oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sephadex G200, (C) Điện di đồ SDSPAGE của A. oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sắc kí trao đổi ion
DEAE ......................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.8: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân arabinoxylan lần lượt thương
mại và hãng của enzyme xylanase tự nhiên và enzyme tái tổ hợp với hệ
dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1) ........................................46


Hình 3.9: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân cơ chất của enzyme xylanase tự
nhiên và enzyme tái tổ hợp sạch với hệ dung môi n-butanol : acid acetic :
H2 O =
(3:1:48)…………………………………………………………………..……49


BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ

APS

Ammonium persulfate

ARN

Acid ribonucleic

BLAST

Basic local alignment search tool

BSA

Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

Bp

Base pairs

cDNA

Complement DNA

DNA

Acid Deoxyribonucleic

dNTP

2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate

ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

kDa

Kilo dalton

M

Marker (thang chuẩn)

μg

Microgam

μl

Microliter

OD

Optical density

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS- PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine

TTH

Tái tổ hợp

VTCC

Vietnam Type Culture Collection (Trung tâm bảo tàng giống VTCC)

v/v

Volume/ volume

w/v

Weight/ volume


MỞ ĐẦU
Xylan một loại polysacharid chiếm phần lớn trong thành phần hemicellulose của
thành tế bào thực vật. Để phân giải hoàn toàn xylan thành xylose cần có sự phối hợp
của nhiều loại xylanase khác nhau với các chức năng khác nhau (endo-β-1,4-Dxylanase, EC 3.2.1.8; β-D-xylosidase, EC3.2.1.37; α-L-arabinofuranosidase, EC
3.2.1.55; α-D-glucuronidase, EC 3.2.1.1; acetyl xylan esterase; EC 3.1.1.6).
Endoxylanase có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase
dùng cho công nghiệp bột giấy, hỗ trợ quy trình tẩy trắng, giúp giảm hóa chất độc
(chlorine) thường dùng để tẩy lignin trong giấy [14], làm trong nước hoa quả, rượu

vang, bia, tạo đường xylitol cho công nghiệp bánh kẹo [67]. Xylanase thủy phân
hemicellulose tạo arabinoxylan (AX) và chuỗi oligosaccharid arabinoxylan ngắn hơn
(arabinoxylanoligosaccharid-AXOS). Arabinoxylan (AX) là một thành phần chất xơ
chính được tìm thấy trong một loạt các loại ngũ cốc, được dùng cho chế độ ăn kiêng có
tác dụng tốt đối với sức khỏe con ngườ. Nên arabinoxylan được định hướng dùng làm
phẩm chức năng [71, 61, 57].
Rất nhiều chủng vi sinh vật tự nhiên từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi được công
bố có khả năng sản xuất xylanase, trong đó nấm mốc là sinh vật tiềm năng có khả năng
tổng hợp xylanase hoạt tính cao [38]. Vì những lý do ứng dụng khác nhau, rất nhiều
loại xylanase được sản xuất từ chủng Bacillus [14] và chủng nấm Aspergillus như
Aspergillus awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus giganteus, Aspergillus nidulans,
Aspergillus niger và Aspergillus sydowii đã được tinh sạch và đánh giá một số tính chất
lý hóa của xylanase [33, 34, 49, 57, 62, 85]. Các nghiên cứu trong nước cũng như trên
thế giới đã tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp xylanase như
E. coli [88], Bacillus [85], Pichia pastoris [16]. Chủng Aspergillus niger
VTCC017/pANXlnG2 đã được tạo ra từ việc nhân đoạn gen xylanase từ chủng
Aspergillus oryzae VTCC F187, gen mã hóa xylanase được chèn vào vector biểu hiện
pAN7.1GluA với cặp mồi đặc hiệu, plasmid tái tổ hợp được đưa vào A. niger VTCC
1


017 với chất cảm ứng hygromycin sau 72 giờ nuôi cấy chủng có khả năng sinh tổng
hợp enzyme xylanase cao. Với mong muốn ứng dụng chủng vào thực tế sản xuất
enzyme xylanase tái tổ hợp định hướng nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan
và các chế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch
và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp” với mục
tiêu sau:
1. Tinh sạch được enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp
2. Đánh giá các tính chất lý hóa của xylanase tái tổ hợp
3. Thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme xylanase tái tổ hợp và enzyme

xylanase tự nhiên.

2


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lƣợc về enzyme xylanase
1.1.1. Định nghĩa
Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of
Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 có [67]:
Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase
Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanase;
xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-Dxylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β- xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase;
endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase
Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase
Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan
tạo thành các oligosacharid ngắn (oligoxylose) và xylose (Hình 1.1) [67].

Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy
phân xylan [67]
3


1.1.2. Phân loại
Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật. Chúng được
phân chia thành hai nhóm dựa vào sự tương đồng về đặc tính lý hóa như là khối lượng
phân tử, điểm đẳng điện và các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng:
Enzyme endo-xylanase họ 10 gồm các enyzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm
mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (trước đây gọi là họ F).
Enzyme endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi

khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được (trước đây gọi là họ G) [52,
73].
Sự khác biệt về đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase là endo-xylanase của họ 10
có khả năng thủy phân các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu
không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó [41]. Trong khi
endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì
endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế.
Ngoài việc phân loại enzyme xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng
đã tiến hành nghiên cứu, phân chia enzyme xylanase thành những nhóm nhỏ hơn.
Sapag và cộng sự (2002) chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và III
chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc. Các enzyme nhóm I và II thường là các
enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và
Basidiomyceta. Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị
pI ở phía axit. Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí.
Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C. Nhóm
A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn
toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương. Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ
yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [73].
1.1.3. Cấu trúc
4


Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các
enzyme [81], từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans
có nét đặc trưng của họ 11 [41]. Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạo thành
(A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và tương tự như
một phần bàn tay phải được đóng lại [73]. Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của
các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba
của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β.
Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ

được tạo thành từ 8 mảnh.

Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran [39]

Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β cái mà
làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác. Vũng lõm này được so sánh
với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay phải.
Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân tử isoleusin [41].

5


Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [Jeffries1996]

Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc
tác. Meagher và cộng sự (1998) nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei có thể
liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3
vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác [59]. Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên
kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [21, 80].
1.1.4. Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác
1.1.4.1. Đặc điểm cơ chất
Xylanase chủ yếu thủy phân xylan và một phần nhỏ cellulose. Xylan là thành
phần chính cấu tạo hemicellulose tập trung chủ yếu ở cấu trúc thứ cấp của thành tế bào
thực vật, và là một trong số polysaccharid quan trọng trong tự nhiên [48].
Ở cây gỗ cứng, xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan (Hình
1.4), còn ở cây gỗ mềm là arabino-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.5). Ở các loài
ngũ cốc, thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete
4-Omethylvà arabinose.

6

Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng [48]

Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm [48]

1.1.4.2. Phức hệ enzyme phân cắt xylan
Có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân hoàn toàn xylan. Sử
dụng kiềm mạnh hoặc axit mạnh là những biện pháp đang được sử dụng phổ biến hiện
nay bởi hiệu quả thủy phân và giá trị kinh tế. Nhưng vấn đề ô nhiễm môi trường đang
ngày càng gia tăng, đòi hòi các nhà khoa học phải tìm tòi, nghiên cứu ra phương pháp
thủy phân polysaccharide nói chung và xylan nói riêng bằng enzyme sinh học. Phân
huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme [68], trong đó endoβ-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện nhiệm vụ phân
cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các
oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β- 1,4-D-xylan xylohydrolase EC
3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer. Các nhóm bên có mặt
trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase,
galactosidase và acetyl xylan esterase.
7


Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [68]

Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylooligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử. Sự thủy phân liên kết α1,2 -glycosidic bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan. Tương tự như
liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase với
xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng
hợp α-glucuronidase [39].
Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết của
các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose với axit
acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose với axit ferulic

(feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p- coumaroyl
esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho
sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự phân cắt các liên
kết este giữa lignin và hemicellulose. Nếu sử dụng cùng với xylanase và các enzym

8


phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase có thể phá vỡ và làm lỏng
lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [19].
Enzyme quan trọng nhất trong hệ thống enzyme thủy phân cơ chất xylan là
enzyme xylanase [67]. Vì nó là enzyme khởi đầu cho hệ thống phản ứng phân cắt các
liên kết của xylan.
1.1.4.3. Cơ chế xúc tác
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase [23, 41, 50,
53]. Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa qua
Hình 1.7:
(a) Xylanase nhận diện xylan và liên kết nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần
cánh trái (cuộn xoắn lại 3 lần); cơ chất xylan hình xoắn ốc được đặt ở vị trí
đối diện với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 (a); [41]
(b) Hai gốc glutamat (Glu) được định vị cho phù với vị trí hoạt động (khoảng 5,5
Å). Glu 172 là chất xúc tác acid/base, Glu 78 là chất cho điện tử [41];
(c) Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác (Glu 78),
liên kết glycosidic bị kéo căng và bẻ gãy tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị
enzyme – cơ chất (b) [53];
(d) Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, nó tách thành
ion 𝐻+ gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi 𝑂𝐻− gắn vào đầu khử
của mạch xylan vừa tạo theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm
được giải phóng (c), (d) [50];
(e) Enzym dịch chuyển đến vị trí tiếp theo trên cơ chất nhờ sự phân tách và phân

tán các đường (xylose) [41].

9


Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase

1.2. Ứng dụng của enzyme xylanase
1.2.1. Các chế phẩm xylanase trên thị trƣờng quốc tế
Enzym xylanase được sử dụng thương mại trong một số ngành công nghiệp như
tẩy trắng bột giấy, thực phẩm, thức ăn và sản xuất bia. Ứng dụng chính của xylanase
là tẩy trắng bột giấy và được sản xuất bởi các công ty khác nhau trên thế giới với
nhiều tên thương mại khác nhau như Bleachzyme (Biocon, Ấn Độ), Cartzyme
(Sandoz, US), Cartzyme MP (Clarient, UK), Ecozyme (Thomas Swan, UK), Ecopulp
(Alko Rajamaki, Phần Lan…. Xylanase được sản xuất thương mại bởi một số ngành
công nghiệp quốc tế để ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn
chăn nuôi. Sankyo từ Nhật Bản, Ciba Giegy từ Thụy Sĩ sản xuất xylanase với tên
thương mại lần lượt là Sanzyme và Albazyme-10A, và đã được sử dụng thương mại
10


trong ngành công nghiệp thực phẩm và làm bánh. Một công ty Đan Mạch Novo
Nordisk, 2017) [82]. Một công ty Mỹ Alltech, Inc., sản xuất thương mại xylanase với
tên thương mại Allzym PT và Fibrozyme và đã được sử dụng để nâng cấp thức ăn
chăn nuôi. Hầu hết các xylanase thương mại được sản xuất bởi nguồn nấm do tiềm
năng sản xuất cao.
1.2.2.

Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc

Xylanase đóng vai trò quan trọng trong thức ăn chăn nuôi bằng cách phá vỡ
thành phần thức ăn arabinoxylan và làm giảm độ nhớt của nguyên liệu thô. Chủng A.
japonicus C03 với khả năng sản xuất endoxylanase và cellulase tốt với độ ổn định
cao trong môi trường dạ cỏ dê, cho thấy các ứng dụng đối với động vật nhai lại
[32]. Một số nghiên cứu đã cho thấy sự sẵn có xylanase trong các sản phẩm chưng
cất hạt khô có thể hòa tan (DDGS) được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi và sử dụng
xylanase ngoại sinh trong chế độ ăn của gia cầm để xử lý hàm lượng chất xơ cao hơn
[66, 83]. Bổ sung xylanase cho thấy sự cải thiện cân nặng và tăng tỷ lệ chuyển đổi
thức ăn vì sự cải thiện khả năng tiêu hóa arabinoxylan trong chế độ ăn của động vật
[78]. ECONASE XT một quảng cáo nổi tiếng endo -1,4-xylanase đã được sử dụng
làm phụ gia thức ăn cho gà vỗ béo, heo con cai sữa và vỗ béo cho lợn [72].
1.2.3.

Trong công nghiệp thực phẩm

Xylanase tìm thấy ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm như công
nghiệp bánh mì. Bánh mì được tạo thành từ lúa mì bao gồm hemicelluloses như
arabinoxylan. Xylanase có thể hòa tan arabinoxylan không thể tách rời thành
arabinoxylan chiết xuất được trong nước [24]. Điều này giúp phân phối nước đồng đều
và cải thiện sự hình thành mạng gluten bột trong suốt. Butt et al. (2008) đã chứng minh
vai trò của GH11 endoxylanase từ B. subtilis trong việc hòa tan arabinoxylan
[22]. Điều này làm tăng độ nhớt và khối lượng bột và giảm sự kết tụ gluten và độ cứng
của bột làm cho các mảnh vụn đồng đều và mịn. GH11 xylanase (0,12 U/g bột)
từ Penicillium constitanis Pol6 cải thiện quá trình sản xuất bánh mì như giảm sự hấp
thụ nước (8%) và tăng bột nhào (36,8%), khối lượng (17,8%), cụ thể khối lượng
11


(34,9%) và độ kết dính. Bánh mì đã được cải thiện tính chất lưu biến và cảm quan (kết
cấu, hương vị, hương vị, độ mềm). Xylanase được tinh chế một phần để sản xuất bánh

mì có đặc tính cảm quan tốt hơn (màu sáng hơn) [36]. Việc bổ sung xylanase cũng dẫn
đến tăng khối lượng riêng và thời hạn sử dụng, với độ cứng thấp hơn và thuận tiện
trong quá trình bảo quản. Tương tự, xylanase tái tổ hợp (r-XynBS27) thu được
từ Pichia pastoris (gen xynBS27 từ Streptomycessp. S27) được sử dụng làm phụ gia
trong quá trình làm bánh mì.
Quá trình sử dụng enzyme trong chiết xuất và làm trong nước ép trái cây được sử
dụng rộng rãi. Nước ép trái cây thô chứa polysacaride như cellulose, hemicellulose,
pectin tinh bột và lignin liên kết bề mặt và làm giảm chất lượng của nước ép, ví dụ,
màu đục và độ nhớt cao. Việc sử dụng enzyme làm giảm độ nhớt và tránh sự hình
thành các cụm, bằng cách loại bỏ chất rắn lơ lửng và không hòa tan bằng phương pháp
ly tâm và lọc. Điều này làm tăng độ trong, mùi thơm và màu của nước ép
[26]. Xylanase được tinh chế một phần từ Streptomyces sp AOA40 đã được sử dụng
trong ngành công nghiệp nước ép trái cây để tăng độ trong của nước ép từ táo (17,8%),
cam (18,4%) và nho (17,9%) [10]. Xylanase cố định hoạt hóa glutaraldehyde được sử
dụng để làm trong nước ép cà chua. Xylanase từ P. acidilactici GC25 đã được sử dụng
cho kiwi, táo, đào, cam, mơ, nho và lựu trong đó tăng lượng đường và giảm độ đục của
nước ép [11].
1.2.4. Trong công nghiệp giấy và bột giấy
Quá trình loại bỏ lignin từ bột gỗ để tạo ra giấy thành phẩm trắng sáng được gọi
là tẩy trắng [17]. Theo truyền thống, các chất tẩy trắng hóa học (như clo) được sử
dụng để tẩy trắng [75]. Việc sử dụng các enzyme ligno-hemiaellulolytic để tẩy trắng
đã trở nên phổ biến trên toàn thế giới. Xylanase có khả năng thủy phân xylan được
liên kết với cellulose và lignin của sợi bột giấy. Do đó, sự gián đoạn xylan cuối cùng
sẽ dẫn đến sự phân tách giữa các thành phần này, cải thiện việc chiết xuất lignin từ
bột giấy [77]. Do đó, xylanase kết hợp với enzyme phân giải lignin giúp tăng độ sáng
của bột giấy [65]. Sự tiếp xúc của sợi cellulose với quá trình nghiền enzyme giúp
12


tăng cường lực liên kết của giấy và cải thiện độ bền của giấy thông qua sự thoái biến

của xylan và loại bỏ lignin trong quá trình xử lý enzyme [55]. Hệ thống enzyme đã
được lựa chọn rất cao, không độc hại, thân thiện với môi trường để tẩy trắng sinh học
[15].
Tiền xử lý Paenibacillus campinasensis BL11 xylanase cho thấy độ sáng và độ
nhớt của bột giấy gỗ cứng tăng lên [47]. S. thermophilum xylanase hoạt động ở nhiệt
độ cao (50-70°C) đã được sử dụng để tẩy trắng bã mía [43]. T. lanuginosus VAPS24
xylanase ổn định ở phạm vi pH rộng có thể hữu ích trong cả hai chế phẩm sinh học
kiềm và axit [51]. Các đơn vị sản xuất giấy của các quốc gia khác nhau, tức là Nhật
Bản, Nam Mỹ, Bắc Mỹ và Châu Âu đang dần thay thế tẩy trắng bột hóa học bằng tẩy
trắng bột qua trung gian xylanase. Canada được biết đến là nhà sản xuất bột giấy hàng
đầu và họ đang tẩy trắng hơn 10% bột giấy thông qua xylanase [28].
1.2.5.

Các ứng dụng khác

Xynalase được ứng dụng rộng rãi trong việc làm mềm rau quả, gạn lọc chất xơ
trong công nghiệp nước hoa quả và rượu vang, hóa lỏng chất nhày trong quá trình tạo
café lỏng, tách chiết hương liệu và chất màu, dầu thực vật và tinh bột…Ngoài ra
xynalase còn được dùng trong các nghiên cứu khoa học. Như trong việc mô tả một vài
xylanase có được sử dụng nhằm cải thiện khả năng làm mềm thành tế bào đối với quá
trình tạo tế bào trần.
1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase
1.3.1. Trên thế giới
1.3.1.1. Xylanase tự nhiên
Xylanase được sinh tổng hợp chủ yếu bởi các vi sinh vật, nhiều loại vi khuẩn và nấm
được công bố là có khả năng sản xuất xylanase [17, 70, 84].

13

Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase [75]

Vi sinh vật

Hoạt tính enzyme xylanase (IU/ml)
Nấm mốc

Aspergillus awamori VTT-D-75028

12,00

Aspergillus niger KKS

138

Aspergillus niger

250

Fusarium oxysporum VTT-D-80134

3,70

Phanerochate chrysosporium

15-20

Piromyces sp. strain E2

7,96

Thermomyces lanuginosus

650-780

Trichoderma reesei

960
Vi khuẩn

Bacillus SSP-34

506

Bacillus circulans

400

Bacillus stearothermophilus StrainT6

2,33

Bacillus sp.

120

Bacillus sp. strain NCL 87-6-10

93

Bacillus circulans AB 16

19,28

Streptomyces sp. QG-11-3

96

Thermoactinomyces

thalophilus

sub

group C

14

42


Bảng 1.2: Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật [76]
Điều kiện tối ƣu

Độ bền

KLPT
Vi sinh vật

(KDa)

pH

Nhiệt độ pH (giờ)

Nhiệt độ

pI

Km (mg/ml)

(giờ)

Vmax (µmol
/ phút /

Nấm mốc
Acrophialophora

22

7,0

55

-

60 (1)

-

16 -

-

39

5,5-6

55

-

-

5,7-6,7

1,0

10000

23

5,0

50

-

-

3,7

0,33

3333

26

4,0

45-50

-

-

3,3-3,5

0,09

455

34

6

56

4,0-6,7

56

3,4

0,97

1091

25

4,8

54

4,5

50

9,4

7,6

2650

35

7,5-

50

-

-

6,3

5,26

118,4

24

7,5-

50

-

-

4,4

4,16

145,2

Erwinia chrysanthemi

42

5,5

55

4-7

35

8,8

-

-

Penicillium

33

7,0

60

6,0-7,5

40 (3)

8,6

-

-

purpurogenum

23

3,5

50

4,5-5,5

40 (3)

5,9

-

-

Trichoderma viride

22

5

53

-

-

9,3

4,5

160

20

5,0

50

-

40

-

0,58

0,106

7,1

9,4

4330

0,7

145

Aspergillus awamori

Aspergillus nidulans
Aureobasidium
pullulans
Cephalosporium sp.

Trichoderma
harzianun

Vi khuẩn
Aeromonas caviae
ME1
Bacillus sp. Strain
SPS-0

20

7

50

3,0-4,0

6.5-8

99

6,0

75

-

70 (4)

Bacillus sp.W1

21,5

6

65

4,5-10

-

8,5

4,5

-

(JCM2888)

49,5

7,9

70

4,5-7,0

-

3,7

0,95

-

Streptomyces T-7

20,64

4,5-5,5

60

7,8

10

7600

5,5-6,5

60-65

5,5-6,5

55

7,1

9,1

-

5,0-6,0

60-65

5,0-6,0

55

10,06

-

-

5,0-6,0

60-65

5,0-6,0

55

10,26

11,2

-

6

80

-

-

-

0,36

1,18

7

90-

-

-

-

0,24

19,5

50
Streptomyces sp. No
25
3137
25
266b
Thermotoga thermarum

35C

5,0 (144) 37 (264)

15


1.3.1.2. Xylanase tái tổ hợp
Để có năng suất enzyme cao với các đặc tính cụ thể như độ ổn định cao trong
phạm vi nhiệt độ và pH rộng, độ đặc hiệu cơ chất cao và khả năng kháng mạnh đối với
các cation kim loại và hóa chất cho ứng dụng công nghiệp [35, 69]. Enzyme nội sinh

thường được sản xuất với số lượng thấp và cũng thiếu tất cả các đặc tính để đáp ứng
nhu cầu công nghiệp [13]. Do đó, các phương pháp công nghệ sinh học khác nhau
được sử dụng để cải thiện năng suất và truyền các đặc tính đặc trưng cho enzyme
mong muốn. Những phương pháp này liên quan đến thao tác di truyền liên quan đến
đột biến và công nghệ DNA tái tổ hợp.
Nhân bản gen và biểu hiện gen xylanase bằng DNA tái tổ hợp. Các xylanase tái
tổ hợp được thiết kế để có các đặc tính tương đương hoặc tốt hơn các enzyme tự nhiên
có năng suất cao trong hệ thống biểu hiện, để có thể được sử dụng trong ngành công
nghiệp lên men.
Một số nghiên cứu cho thấy gen xylanase mong muốn đã được nhân bản vào
vectơ phù hợp, sau đó là biểu hiện của nó trong các hệ vi sinh vật phù hợp như vi
khuẩn, nấm men và nấm [18, 37, 42, 44, 63, 79].
Biểu hiện ở vi khuẩn
Goswami và cộng sự (2014) đã nghiên cứu sự biểu hiện của một gen xylanase từ
Bacillus brevis trong E. coli BL21. Chủng tái tổ hợp chủ yếu tiết ra xylanase trong môi
trường nuôi cấy với hoạt tính xylanase đạt 30 IU/ml. Dịch lọc nuôi cấy không có hoạt
tính cellulase và được tìm thấy hoạt động trong khoảng rộng pH và nhiệt độ [37]. Một
gen mã hóa xylanase ổn định nhiệt kiềm (Mxyl) đã được lấy từ thư viện và nhân bản
vector pET28a biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3). Xylanase tái tổ hợp có thời gian
bán hủy lần lượt là 2 giờ và 15 phút ở 80°C và 90°C. Xylanase tái tổ hợp có pH tối ưu
và nhiệt độ tương ứng là 9,0 và 90°C [79].
Escherichia coli được sử dụng rộng rãi nhất do điều kiện tăng trưởng không tốn
kém, thao tác dễ dàng, yêu cầu kỹ thuật đơn giản, mức độ tích lũy sản phẩm cao trong
16