Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương

Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương

ĐỀ TÀI: Phân tích chỉ tiêu Aspergillus
trong sản xuất nước tương

GVHD: Phạm Minh Nhựt
3


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
LỜI MỞ ĐẦU
Ngày nay, gia vị được sử dụng nhiều trong chế biến thực phẩm và bữa ăn hàng
ngày của người Việt. Trong đó có rất nhiều sản phẩm gia vị được làm từ các phương
pháp lên men truyền thống như nước mắm, nước tương,… Nước chấm từ thực vật
ngoài vai trò cung cấp mùi vị, nó còn cung cấp cho cơ thể người một lượng protein
nhất định và một số khoáng chất cần thiết cho cơ thể. Nước tương lên men là một loại
nước chấm giàu chất dinh dưỡng, có hương vị thơm ngon. Từ xưa con người đã biết
cách sản xuất nước tương bằng cách lên men truyền thống từ đậu nành. Tuy nhiên
phương pháp này cho năng suất thấp, thời gian lên men kéo dài và chất lượng không
ổn định, đôi lúc còn nhiễm loại nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin gây
ung thư (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Mặt khác phổ biến trên thị trường hiện nay là
nước chấm được sản xuất bằng phương pháp hóa giải, hàm lượng dinh dưỡng thấp,
chứa chất bảo quản và chứa hàm lượng cao chất 3-MCPD, 1.3-DCP, độc tố
Aflatoxin… là các chất gây ung thư. Để khắc phục những nhược điểm trên người ta đã
tìm ra chủng Aspergillus oryzae có hoạt tính cao về các enzyme Amylase và
Proteinase rất thích hợp cho việc làm tương. Mặc dù, nấm sợi Aspergillus orysae có
hình thái, màu sắc gần giống với nấm sợi Aspergillus flavus, nhưng Aspergillus
oryzae không sản sinh độc tố gây ung thư như nấm sợi Aspergillus flavus (Nguyễn Lân
Dũng, 2007). Loài nấm mốc Aspergillus oryzae này đã tạo nên một hướng mới cho
công nghệ làm tương trong tương lai.

GVHD: Phạm Minh Nhựt
4


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
MỤC LỤC
Chương I: Tổng quan ...................................................................................................... 5
I.1. Giới thiệu về Aspergillus oryzae .............................................................................. 5
I.2. Lịch sử phát hiện ...................................................................................................... 5
I.3. Phân loại ................................................................................................................... 6
I.4. Đặc điểm ................................................................................................................... 7
Chương II: Quy trình phân tích chỉ tiêu vi sinh .............................................................. 9
II.1. Sơ đồ quy trình phân tích ........................................................................................ 9
II.2. Thuyết minh quy trình phân tích ........................................................................... 10
II.2.1. Nguồn mẫu ......................................................................................................... 10
II.2.2. Phân lập .............................................................................................................. 10
II.2.3. Xác định vi sinh vật............................................................................................ 11
II.2.4. Khảo sát các đặc tính có lợi của Aspergillus oryzae .......................................... 14
II.2.5. Định danh Aspergillus oryzae bằng kỹ thuật sinh học phân tử .......................... 15
Chương III: Ứng dụng Aspergillus oryzae trong sản xuất nước tương ........................ 16
Chương IV: Kết luận và đề nghị ................................................................................... 20
Tài liệu tham khảo ........................................................................................................ 21

GVHD: Phạm Minh Nhựt
5


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Chương I: Tổng quan
I.1. Giới thiệu về Aspergillus oryzae

Giống nấm Aspergillus có thể lên đến 200 loài, trong đó có khoảng 20 loài gây
hại cho con người. Aspergillus thuộc nhóm vi nấm, không có chất diệp lục do vậy
chúng không thể tự tổng hợp được các chất dinh dưỡng cho bản thân mà phải lấy từ
các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để sinh trưởng và phát triển. Một số giống
Aspergillus được sử dụng trong công nghệ lên men, sản xuất enzyme (amylase,
protease, pectinase,…) và các acid hữu cơ (acid citric, acid glucomic,…) trong đó có
Aspergillus oryzae.
Chủng Aspergillus oryzae là loại nấm sợi quan trọng trong công nghiệp, cách
đây hàng trăm năm nó được dùng để lên men rượu sake, pate đậu phộng, nước tương
ở Nhật. Người ta nhận ra rằng A.oryzae lên men tương ngon hơn so với một số chủng
khác vìchúng có khả năng biến đổi tinh bột của gạo nếp thành đường làm tương có vị
ngọt. Hiện nay, A.oryzae đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ lên men
truyền thống ở nhiều nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Philippin, Indonesia
và Việt Nam. Cho đến thời điểm này thìchủng nấm mốc A.oryzae đã được sử dụng
rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme (α-amylase, glucoamylase) trong các
ngành chế biến thực phẩm.
I.2. Lịch sử phát hiện:
Năm 1729, Pier Antonio Micheli nhà thực vật học người Ý đã khai sinh ra nấm
học qua tài liệu công bố “giống cây lạ” theo Nguyễn Văn Bá (2009).
Từ năm 1794-1874, Elias Fries là người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc
theo Nguyễn Văn Bá (2009).
Elizabeth Tootyll cho rằng nấm mốc có khoảng 5100 giống và 50000 loài được
mô tả, tuy nhiên ước tính có trên 100000 đến 250000 loài nấm hiện diện trên trái đất
theo Nguyễn Văn Bá (2009).
Aspergillus đã trở thành một trong những chi nổi tiếng nhất và được nghiên cứu
nhiều nhất theo Nguyễn Thị Thanh Kiều (2011).

GVHD: Phạm Minh Nhựt
6

Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Năm 1950, A.oryzae được phân lập lần đầu bởi Jokichi Takamine một nhà khoa
học Nhật Bản và được gọi là RIB40 hoặc ATCC 42149 theo wikipedia (2014).
Năm 2001, bộ gen di truyền của A.oryzae đã được phân tích và giải mã. Hệ gen
gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base theo Machida et al. (2005).
Đến nay, loài A.oryzae đang được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực ở các quốc
gia khác nhau, đặc biệt là các nước châu Á .

Hình 1: Bộ gen di truyền của A.oryzae

I.3. Phân loại:
Loài Aspergillus oryzae thuộc:
Lãnh Giới (Domain)

Eukarya

Giới (Kingdom)

Fungi

Ngành (Phylum)

Ascomycota

Lớp (Class)

Eurotiomycetes

Bộ (Order)

Eurotiales

Họ (Family)

Trichocomaceae

Chi (Genus)

Aspergillus

Loài (Species)

Aspergillus oryzae

GVHD: Phạm Minh Nhựt
7


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Ngoài A.oryzae thì trong chi Aspergillus còn có một số loài đặc trưng như:
A.flavus, A.parasiticus, A.niger, A. fumigatus, A.versicolor.

Hình 2: Hình thái khuẩn lạc của một số loài thuộc chi Aspergillus

I.4. Đặc điểm:
I.4.1. Đặc điểm hình thái
A.oryzae là nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi, có bào tử, là vi sinh vật hoàn toàn
hiếu khí, không có khả năng di động, không thể tổng hợp chất hữu cơ từ CO2 mà phải
sử dụng trực tiếp các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để phát triển và đảm bảo

hoạt động bình thường.
Cơ thể sinh trưởng của A.oryzae là một hệ bao gồm những sợi mỏng chiều
ngang 5-7µm, phân nhánh rất nhiều, có vách ngang và sợi hình thành nhiều bao tế bào
(nấm đa bào). A.oryzae sinh sản bằng bào tử đính (conidia) đây là hình thức sinh sản
vô tính. Bào tử đính phát triển từ thành tế bào rất dày, bên trong hệ sợi nấm gọi là tế
bào chân đế. Nó tạo thành sợi cuống dài và kết thúc là một cấu trúc phồng hình củ
hành gọi là bọng (túi). Xung quanh bọng là một hay hai bộ cuống để đính bào tử gọi
là cuống đính bào tử hay thể bình. Từ bộ cuống ngoài cùng, những bào tử được sinh

GVHD: Phạm Minh Nhựt
8


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
ra đính vào nhau, nên gọi là bào tử đính. Đính bào tử của A.oryzae có màu vàng lục
hay màu vàng hoa cau, đây chính là màu đặc trưng ở nấm mốc (Nguyễn Đức Lượng
et al., 2003).

Hình 3: Hình thái học Aspergillus oryzae

Chú thích hình:
Foot cell

Tế bào chân đế

Stipe

Cuống

Phialides

Bọng (túi)

Metulac

Thể bình (cuống đính bào tử)

Conidia

Đính bào tử

I.4.2. Đặc điểm sinh lý
Nấm Aspergillus oryzae có những đặc điểm sinh lý sau:
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử: 45%
Nhiệt độ thích hợp cho sự hình thành và phát triển bào tử: 27-32oC
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme: 55-58%.
Độ ẩm không khí: 85-95%
pH môi trường: pH 5.5-6.5

GVHD: Phạm Minh Nhựt
9


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
I.4.3. Đặc điểm sinh hóa
A.oryzae có các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào như amylase,
glucoamylase, protease, pectinasa, xylanase, hemycenlulase,... Trong đó hệ enzyme
amylase tổng hợp từ A.oryzae có hoạt lực cao hơn so với một số chủng nấm mốc và vi
khuẩn khác. Ngoài ra A.oryzae có khả năng tổng hợp cả ba loại enzyme protease (acid,
kiềm và trung tính). Các protease acid, trung tính được ứng dụng để sản xuất bia và

công nghiệp bánh kẹo. Protease kiềm được ứng dụng trong công nghệ thuộc da.
Bào tử của A.oryzae có màu vàng hoa cau, không chứa độc tố aflatoxin.
A.oryzae tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như cellulase, pectinase, xylanase
và hemicellulase khi sống trên môi trường có nguồn cơ chất cảm ứng như cellulose,
pectin, xilan và hemicellulose. Vì thế, A.oryzae được ứng dụng rộng rãi trong sản
xuất, chế biến thực phẩm và trong công nghiệp sản xuất enzyme.

Chương II: Quy trình phân tích chỉ tiêu vi sinh
II.1. Sơ đồ quy trình phân tích

Lấy 10g mẫu cho vào 90ml nước cất vô trùng, sau đó đồng nhất mẫu, ta
được nồng độ pha loãng 10-1
Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ pha loãng thích hợp
Hút 0.1ml mẫu cấy trang vào môi trường PGA
Ủ ở nhiệt độ 32oC từ 5-7 ngày
Quan sát sự phát triển của nấm mốc cấy chuyển tiếp những khuẩn lạc
khác nhau về hình thái vào các đĩa môi trường PGA
Ủ ở nhiệt độ 27-32oC trong 7 ngày
GVHD: Phạm Minh Nhựt
10


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương

Cấy chuyển nhiều lần cho đến khi mẫu chỉ còn các dòng khuẩn lạc hoàn
toàn thuần chủng
Cấy các khuẩn lạc khác nhau vào các đĩa petri chứa môi trường Czapek
Ủ ở nhiệt độ 25oC trong 7 ngày
Khuẩn lạc đặc trưng của A.oryzae trên môi trường Czapek: có màu vàng
lục, dạng bột rời, tâm lồi, rìa thấp dần, ngoài là lớp tơ trắng

Kiểm tra khả năng sinh độc tố aflatoxin
II.2. Thuyết minh quy trình phân tích
II.2.1. Nguồn mẫu
Nguồn mẫu: lấy 50g mẫu đậu phộng giữ lâu trong kho  cho vào túi nylon vô
trùng  bỏ vào thùng đá chuyển về phòng thí nghiệm, giữ lạnh ở 4oC. Các mẫu cần
phân lập ngay không giữ quá 24 giờ.
Lý do thu mẫu: mẫu đậu phộng để lâu ngày dễ sản sinh một số loại nấm. Bên
cạnh đó, nó còn là một nguồn giàu enzyme amylase là nguồn mẫu thích hợp cho việc
phân lập các chủng nấm mốc, đặc biệt là Aspergillus.
II.2.2. Phân lập
a) Chuẩn bị mẫu:
Cân chính xác 10g mẫu đậu phộng cho vào bao PE vô trùng, sau đó cho 90ml nước cất
để pha loãng mẫu. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Tất cả
các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch
có nồng độ pha loãng 10-1. Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng
cách dùng micropipette vô trùng, hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào 9ml nước cất vô
trùng  đồng nhất, ta sẽ có được nồng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục thực hiện đến khi
đạt được độ pha loãng cần thiết.

GVHD: Phạm Minh Nhựt
11


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
b) Cấy mẫu:
Dùng micropipette hút 0.1 ml dung dịch mẫu đã pha loãng cho vào môi trường PGA.
Dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho tới khi khô. Ủ ở nhiệt độ phòng
(30oC) trong vòng từ 5-7 ngày.
c) Phân lập và làm thuần:
Quan sát sự phát triển của nấm mốc (hình dạng khuẩn lạc). Cấy chuyển những khuẩn

lạc khác nhau về hình thái vào các đĩa môi trường PGA khác nhau. Ủ ở nhiệt độ 2732oC trong 7 ngày. Cấy chuyển tiếp nhiều lần cho đến khi thu được ở mỗi đĩa petri là
một dòng khuẩn lạc hoàn toàn thuần chủng.
Cấy các dòng khuẩn lạc từ các đĩa petri khác nhau vào các đĩa petri khác có chứa môi
trường Czapek, ủ ở 25oC trong 7 ngày. Nhiệt độ thích hợp cho sự hình thành và phát
triển A.oryzae là 27-32oC.
Khi cấy vào môi trường Czapek thìnhiệt độ do nấm mốc tỏa ra có thể lên tới 40oC. Vì
thế cần hạ nhiệt độ xuống 25oC để giữ được nhiệt độ thích hợp cho nấm mốc A.oryzae
phát triển.
d) Quan sát:
Quan sát các khuẩn lạc thuần từ các đĩa chứa môi trường Czapek. Tìm ra khuẩn lạc
đặc trưng của A.oryzae trên môi trường Czapek.
II.2.3. Xác định vi sinh vật
a) Quan sát khuẩn lạc (đại thể):
Kích thước: khuẩn lạc có kích thước khoảng 5-6cm.
Hình dạng: khuẩn lạc tâm lồi, dạng bột rời, rìa thấp dần, ngoài là lớp tơ.
Màu sắc: khuẩn lạc ban đầu có màu vàng lục, sợi tơ có màu trắng. Sau thời gian khuẩn
lạc chuyển thành màu vàng lục nâu, sợi tơ hình thành bào tử có màu nâu.

GVHD: Phạm Minh Nhựt
12


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương

a)

b)

Hình 4: Khuẩn lạc Aspergillus oryzae có màu vàng lục (a) sau 3 ngày.
Màu vàng lục nâu (b) sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường Czapek

b) Quan sát bào tử (vi thể):
Các bước tiến hành làm tiêu bản:
Cách 1: Làm tiêu bản nấm mốc không nhuộm màu:
 Nhỏ 1 giọt lactophenol lên lame
 Dùng que cấy lấy khuẩn lạc nấm mốc và dàn mỏng
 Đậy lamelle và quan sát ở vật kính X10 và X40
Cách 2: Làm tiêu bàn nấm mốc nhuộm màu:
 Nhò 1 giọt dung dịch xanh cotton lên lame
 Lấy 1 ít sợi nấm dàn đều trên lame
 Đậy lamelle và quan sát ở vật kính X40
Hình dạng sợi nấm quan sát dưới kính hiển vi:
Đầu:

Lúc đầu có dạng hình cầu, sau một thời gian sẽ bị tách thành
những chuỗi bào tử rất dài.

Cuống

Bề mặt cuống có gai mịn.

Bọng

Dạng hình cầu.

Thể bình

Có thể bình một tầng và thể bình hai tầng.
Thể bình một tầng: có dạng hình chai.

GVHD: Phạm Minh Nhựt
13


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Thể bình hai tầng: lớp 1: dạng hình trụ; lớp 2: dạng hình chai.
Dạng hình cầu, bề mặt có gai mịn, có kích thước lớn, màu vàng

Bào tử

nâu, sau một thời gian nuôi gai trở nên xùxì, vách dày.

b)

a)

Hình 5: A.oryzae lúc đầu có bông hình cầu (a), sau một thời gian
bị tách thành những chuỗi bào tử rất dài (b).

Hình 6: Cấu tạo bông lớn với thể bình
hai tầng và bọng có hình cầu

Hình 7: Cấu tạo bông
nhỏ với thể bình một tầng

c) Thử nghiệm sinh độc tố aflatoxin:
Có thể xác định độc tố aflatoxin bằng 2 phương pháp: phương pháp sắc ký và phương
pháp hóa miễn dịch:
Các phương pháp sắc ký dùng trong phân tích aflatoxin gồm: TLC, HPLC, GCMS, LC, LC-MS. Và hiện nay có rất nhiều kỹ thuật mới được phát triển từ những
phương pháp này như LC/APCI-MS/MS, HPLC-FLD, LC/APPI-MS,...

Có 3 phương pháp hóa miễn dịch để xác định aflatoxin là thử nghiệm miễn dịch
phóng xạ (RIA), thử nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) và thử
nghiệm cột ái lực miễn dịch.

GVHD: Phạm Minh Nhựt
14


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Phát hiện độc tố bằng phương pháp sắc kícột (sắc kícột mini)
Phương pháp sắc kí cột mini của Romes (1975) về sau được Davis et al., (1980),
Holaday và Lansden (1975) cải tiến nhằm phát hiện nhanh aflatoxin trong mẫu.
Mục đích: xem vi sinh vật có khả năng sản sinh độc tố aflatoxin hay không
Cách tiến hành: Lấy một ít sinh khối từ môi trường Czapek hòa vào một lượng nhỏ
benzen được một hỗn hợp dịch. Cho hỗn hợp trên vào cột. Pha tĩnh sử dụng cột sắc kí
chứa bột nhôm trung tính, florisil ở đáy cột, canxi sunfat ở đầu và đáy cột và silicagel
làm chất hấp thụ. Sau đó cho hỗn hợp thôi cột (pha động) chloform và aceton (9:1) để
giữ aflatoxin và thôi các chất khác ra khỏi cột. Quan sát dưới ánh sáng UV (365nm) để
xác định màu huỳnh quang xanh, kết luận dương tính với aflatoxin.
Đối với Aspergillus oryzae: không sản sinh độc tố aflatoxin nên không phát huỳnh
quang  âm tính (-)
III.2.4. Khảo sát các đặc tính có lợi của Aspergillus oryzae
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có khả năng thủy phân liên kết β-glucoside,
endo-β-1.4- glucanase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:
_ Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy: các loại enzyme được bổ sung trong
khâu nghiền bột, tẩy trắng và xeo giấy có vai trò rất quan trọng, gỗ được xử lý với các
endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng
khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin. Trong công nghệ tái chế
giấy, endoglucanase và hemicellulase được dùng để tấy trắng mực in trên giấy. Kỹ
thuật này mở ra triển vọng đầy hứa hẹn trong ngành công nghiệp giấy và bột giấy

(Đặng Thị Thu et al., 2004).
_ Trong công nghiệp chế biến thực phẩm: enzyme glucanase và pectinase sẽ phá
hủy hoàn toàn màng tế bào, làm giảm độ nhớt và tăng độ đồng thể của các loại nước
quả có thịt tốt hơn.
_ Trong công nghệ sản xuất bia: các chế phẩm enzyme amylase, protease và
glucanase được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, giúp rút ngắn thời
gian để ủ bia.

GVHD: Phạm Minh Nhựt
15


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
_ Trong sản xuất cà phê ở Việt Nam: sử dụng kết hợp phức hệ enzyme cellulase và
pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và tăng khả năng ly trích dịch quả trong công nghệ
sản xuất cà phê.
_ Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: bổ sung enzyme β-glucanase trực
tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.
_ Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: bổ sung enzyme phá hủy thành tế
bào như cellulase, hemicellulase giúp tăng lượng đường tạo ra dẫn tới tăng hiệu suất
thu hồi rượu lên 1.5% (Đặng Thị Thu et al., 2004).
_ Trong công nghệ sử lý nước thải và sản xuất phân bón vi sinh: sản xuất enzyme
cellulase thủy phân cellulose trong rác thải. Vìvậy, nước thải của các nhà máy giấy,
các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung chế phẩm chứa phức hệ cellulase
đem lại hiệu quả cao (Trần Đình Toại và Trần Thị Hồng, 2007).
III.2.5. Định danh Aspergillus oryzae bằng kỹ thuật sinh học phân tử
Để định danh chủng nấm mốc mà ta đã nuôi cấy bằng kỹ thuật sinh học phân tử
người ta thường dựa trên đoạn gene 28S rRNA của mẫu nấm, được thực hiện theo các
giai đoạn sau:
_ Đầu tiên, lấy DNA của mẫu nấm mốc được tách chiết trên nền đệm TENS đem kết

tủa bằng iso-propanol. Tủa DNA được pha với đệm TE rồi cho chạy điện di trên gel
agarose 0.8% cho thấy DNA tinh sạch và đủ để tiến hành đọc trình tự. Vệt nucleic acid
được nhuộm bằng ethydium bromide cho vệt màu đỏ da cam khi chiếu UV (260nm).
Sau khi điện di một vạch có kích thước khoảng 614 bp xuất hiện (hình 8).

GVHD: Phạm Minh
Hình Nhựt
8: phân tách DNA bằng điện di trên agarose
16


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
_ Giai đoạn thứ 2: Đoạn DNA vừa tách được nhân lên bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi
AOIII.1.29. Những đoạn DNA này được dùng để giải trình tự Nucleotide bằng phương
pháp Sanger cải tiến.
_ Giai đoạn thứ 3: Từ trình tự Nucleotide vừa giải được và dữ liệu về gene của chủng
A.oryzea so sánh với trình tự gene 28S rRNA của các chủng nấm đã được công bố
trên ngân hàng gene bằng công cụ BLAST. Từ đó tính toán được sự tương đồng và xét
quan hệ họ hàng thông qua cây phân loại loài nhờ phần mềm DNAstar.
_ Cuối cùng, kết hợp giữa kết quả xét nghiệm sinh học phân tử vừa thực hiện với kết
quả quan sát về hình thái học của mẫu nấm mốc được thực hiện từ trước ta có thể định
danh chính xác tên của loài nấm mốc ta phân lập được.

Chương III: Ứng dụng Aspergillus oryzae trong sản xuất nước tương
Sơ đồ quy trình chế biến nước tương từ nấm A.oryzae

Gạo
nếp

Đậu

nành

Ngâm nước
(từ 8-12giờ)

Làm sạch
Sấy ở to=180-200oC

Mốc giống
Hấp

A. oryzae

Làm nguội
Cấy giống

Tạp chất

Nuôi mốc (từ 3638giờ, ở to=30oC)

( từ 45-60phút)
Nghiền thành bột

Thuỷ phân( tỷ lệ
nước 1:5, đun sôi từ
45-60 phút)
Để nguội

t0 = 30-350C

đậu nành:gạo nếp tỷ lệ (9:1)

Phối trộn

Nước

GVHD: Phạm Minh Nhựt
17

lượng nước = (60-70%) /
tổng ng.liệu


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương

Ủ

t = 3-7 ngày
t0= 37-450C mốc vàng hoa cau

Nước

Thủy phân

t0= 40-500C

bổ sung 40-50%

Lọc thô

Phụ
gia
t0= 90-1000C

t = 3-4 ngày

Bã

Phối chế

Thanh trùng

t = 20 phút

Để nguội

Chất bảo
quản

Chai, nút
Lắng

Cặn

Rửa sạch

Lọc tinh

Thanh trùng

Làm nguội
Chiết chai

Nước
tương

GVHD: Phạm Minh Nhựt
18

Bã


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Quy trình chế biến nước tương từ nấm A.oryzae gồm 5 giai đoạn chính:
Giai đoạn 1: Quy trình nuôi mốc gồm các bước: tạo môi trường nuôi mốc, cấy giống,
nuôi mốc và phối trộn.
Tạo môi trường nuôi mốc với nguyên liệu là gạo nếp, sau đó ngâm nước từ 8-12
giờ rồi hấp từ 3-4 giờ ở áp suất thường và từ 1-2 giờ với áp suất cao, với nhiệt độ là
lớn hơn hơn hoặc bằng 100oC. Sau đó làm nguội ở 30-32oC, đây là nhiệt độ để nấm
mốc phát triển rồi cấy nấm mốc vào.
Cấy nấm mốc vào nuôi trong khoảng thời gian từ 36-38 giờ, vì sau đó ta còn thuỷ
phân nên nuôi ở thời gian này, hoạt động của amylase và protease cực đại.
Cuối cùng thực hiện phối trộn để chuản bị cho quá trình ủ và thuỷ phân. Phối trộn
đậu nành đã qua xử lý sơ bộ và gạo nếp có nấm mốc theo tỷ lệ (9:1). Sau đó thêm 6070% nước so với tổng nguyên liệu (trộn nước có tác dụng làm cho nguyên liệu có độ
ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc).
Giai đoạn 2: Xử línguyên liệu gồm các bước: làm sạch, sấy, nghiềng, để nguội.
Đậu nành được làm sạch để loại bỏ tạp chất có trong hạt hay bám trên bề mặt vỏ.
Sau đó, đậu nành được làm ráo nước và sấy ở nhiệt độ từ 180-200oC trong thời
gian từ 45-60 phút nhằm hạn chế sự hư hỏng đậu trong môi trường ẩm.
Nghiền đậu thật nhuyễn để chuẩn bị cho việc hoà tan đậu trong nước. Tiếp tục

trộn nước với tỷ lệ 1:5, đun sôi ở thời gian 45-60 phút để đậu thật mềm.
Cuối cùng là làm nguội ở 30-35oC, mục đích là tạo nhiệt độ thích hợp cho nấm
mốc phát triển khi phối trộn.
Giai đoạn 3: Quá trình lên men gồm các bước: ủ và thuỷ phân.
Quá trình ủ nhằm tăng sinh khối của nấm và chuẩn bị cho quá trình thuỷ phân. Ủ
có tầm quan trọng trong việc nuôi mốc (nếu xử lý nguyên liệu tốt, nuôi mốc đúng kỹ
thuật mà lên men không bảo đảm thì nước chấm vẫn không đạt yêu cầu  hiệu suất
thu hồi thấp  giá thành cao). Nhiệt độ khi ủ rất quan trọng vìnó tạo điều kiện cho
enzyme của mốc xúc tác các quá trình thủy phân tinh bột, protein thành đường và các

GVHD: Phạm Minh Nhựt
19


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
acid amin. Nhiệt độ khi ủ nên giữ là 37- 450C trong suốt quá trình lên men. Thời gian
ủ là 3-7 ngày.
Quá trình thuỷ phân nhằm tạo pH thích hợp cho enzyme protease và amylase của
nấm mốc hoạt động. Biến đổi thành phần nguyên liệu theo hướng tạo ra sản phẩm
nước tương. Lượng nước cho vào tạo môi trường cho quá trình phân giải protein thành
acid amin. Thường lượng nước trộn vào 40 – 50% so với nguyên liệu tương đương.
Nguyên liệu sau khi đã ủ xong (lên mốc vàng hoa cau), làm tơi, để ủ đống tới khi nhiệt
độ đạt 37-450C thìbắt đầu cho nước vào. Khi cho nước vào nên dùng nước ở 600C để
khi cho vào bể lên men, nguyên liệu có nhiệt độ 530C. Khi trộn nước phải trộn nhanh
rồi cho ngay vào bể lên men, trên mặt nguyên liệu rải một lớp muối kín đề phòng tạp
khuẩn xâm nhập. Đậy nắp để hơi nước không bay đi và nhiệt độ không bị giảm.
Giai đoạn 4: Giai đoạn sau khi lên men gồm: lọc, phối chế, thanh trùng, để nguội,
lắng và lọc tinh.
Quá trình lọc thô với mục đích loại bỏ bã, chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo.
Giai đoạn phối chế được bổ sung phụ gia và hương liệu vào để tăng hương vị

nước tương phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng.
Thanh trùng nhằm tiêu diệt những vi sinh vật còn sót lại, kéo dài thời gian bảo
quản. Thanh trùng bằng cách dùng hơi của nồi hơi. Khi thanh trùng phải dùng nhiệt độ
vừa phải 90-1000C trong khoảng 20 phút để không ảnh hưởng chất lượng nước tương.
Với loại nước tương nồng độ thấp, để tránh bị váng và chua, trong quá trình bảo quản
có thể thanh trùng bằng cách đun sôi. Thanh trùng gần kết thúc thìcho natri benzoat
vào để chống váng mốc. Hàm lượng natri benzoat thêm vào khoảng 0,07- 0,1% so với
lượng nước tương.
Lắng nhằm tách các cặn mịn, khó lắng ra khỏi dung dịch, tiếp tục tạo hương làm
tiền đề cho giai đoạn thành phẩm.
Và cuối cùng là lọc tinh nhằm tách triệt để các cặn có kích thước nhỏ ra khỏi
dung dịch để rót vào chai.
Giai đoạn 5: Tạo chế phẩm nước tương gồm: chiết chai và dán nhãn

GVHD: Phạm Minh Nhựt
20


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Vô chai: chai và nút được rửa bằng nước  rửa lại bằng cồn 98o để ráo  đem
thanh trùng 10-20 phút để loại bỏ bụi bẩn và vi sinh vật bám trên chai  sản phẩm
được rót vào chai theo dung tích qui định.
Dán nhãn: nhãn in theo mẫu và đúng qui cách, có đầy đủ thông tin cần thiết cho
người tiêu dùng

Chương IV: Kết luận và đề nghị
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào
như amylase, glucoamylase, protease, pectinasa, xylanase, hemycenlulase,... được ứng
dụng trong rất nhiều lĩnh vực. Đặc biệt trong số đó thì enzyme protease và amylase
được tạo ra nhiều nhất và được ứng dụng chủ yếu trong sản xuất nước tương.

Aspergillus oryzae đã làm cho nước tương trong vị mặn lại có chút vị ngọt, chính điều
đó đã tạo nên hương vị đặc trưng cho loại nước chấm này.
Cần phân lập Aspergillus oryzae trong các nguồn mẫu khác nhau. Qua đó có thể so
sánh hàm lượng các enzyme từ các loài Aspergillus oryzae sống các môi trường khác
nhau. Và tùy theo mục đích sử dụng sẽ tìm ra chủng Aspergillus oryzae thích hợp.

GVHD: Phạm Minh Nhựt
21


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Tài liệu tham khảo
Tài liệu Tiếng Việt:
Nguyễn Văn Bá (2009), Đại cương về nấm mốc, OpenStax_CNX, 23 July 2009,
link: />Nguyễn Lân Dũng (2007), Cách làm tương men, Nhịp cầu bạn đọc, 24 June
2007,

link:

/>Lê Hoàn (2012), Quy trình chế biến tương, link: />Nguyễn Hoài Hương (2009), Bài giảng thực hành công nghệ lên men, Đại học
công nghệ TP.HCM.
Nguyễn Thị Thanh Kiều (2011), Thư viện bài giảng điện tử, 16 October 2011,
link: />Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ vi sinh vật thực phẩm lên men truyền
thống. NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM.
Nguyễn Thu Mai (2007), Phân lập và định danh một số loài Aspergillus trên hạt
đậu phộng, Đại học Cần Thơ.
Phạm Minh Nhựt (2014) Bài Giảng thực hành các phương pháp phân tích vi
sinh, Đại học công nghệ TP.HCM.
Phạm Minh Nhựt (2013). Các phương pháp phân tích vi sinh, Đại học công
nghệ TP.HCM.

Võ Văn Quốc (2013) , Các phương pháp sản xuất nước tương và thiết kế phân
xưởng sản xuất 20000lit/ngày, Tailieu.ebook, 24 April 2013, link:
/>GVHD: Phạm Minh Nhựt
22


Phân tích chỉ tiêu Aspergillus trong sản xuất nước tương
Võ Văn Thanh (2013), Xác định aflatoxin trong nông sản thực phẩm,
Tailieu.ebook, 22 April 2013, link: />Tài liệu Tiếng Anh:
Machida M (2005), Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae,
Nature, 438: 1157-1161.
Wikipedia (2014), Aspergillus oryzae, 3 March 2014, link:
/>
GVHD: Phạm Minh Nhựt
23