Luận văn: Đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin của một số giống đậu xanh

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (15.52 MB, 59 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

Luận văn

Đánh giá chât lượng hạt, khả

năng chịu hạn và phân lập gen

cystatin của một sô giỗng đậu

xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek)

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

1. DAT VAN DE

Cay dau xanh (Vigna radiata (L.) Wllczek) là một loại cây công nghiệp

quan trọng của nên nông nghiệp châu Á. Cây đậu xanh được trồng chủ yếu lẫy hạt để chế biến thức ăn. Đậu xanh còn được xem như là một thứ dược liệu q có tác dụng giải độc, thanh nhiệt, bớt sưng phù, điều hoà ngũ tạng, chữa bệnh cho con người. Hạt đậu xanh còn là một mặt hàng nông sản xuất khâu có gia tri.

Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây đậu xanh được dùng làm thức ăn cho gia súc.

Trồng đậu xanh cịn có tác dụng chống xói mịn, cải tạo đất. Hệ rễ của cây đậu xanh có nốt sân chứa vi khuân cố định đạm. Trồng đậu xanh không những

mang hiệu quả về mặt kinh tế và dinh dưỡng mà cịn có tác dụng cải tạo đất [6],

[8].

Hạt đậu xanh có chứa protein, lipid, glucid va nhiều loại chất khoảng cùng các loại vitamin. Chất lượng protein của đậu xanh được đánh giá dựa trên

chỉ tiêu quan trọng là thành phần amino acid. Protein đậu xanh chứa đầy đủ các

loại amino acid không thay thế. Nghiên cứu hàm lượng các loại amino acid không thay thế và các loại amino acid giới hạn trong protein đạt dinh dưỡng của FAO/WHO là một trong các hướng chiến lược trong chọn tạo giống đậu xanh chất lượng cao hiện nay.

Ở Việt Nam, cây đậu xanh được phân bố ở nhiều vùng địa lí khác nhau

trong cả nước. Các giống đậu xanh hiện nay đang trồng ở nước ta có 2 nguồn sốc chính: một là các giống nhập từ AVRDC, qua chọn lọc, lai tạo, tuyên chọn,

hai là các giống được người nông dân chọn lọc theo phương pháp truyền thống

qua nhiều năm tại các địa phương.

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Trong những năm gần đây, diễn biến khí hậu của nước ta ngày càng phức tạp, lượng mưa phân bố không đều giữa các vùng và các thời kì trong năm, hạn

hán kéo dài cùng với sự biến đổi của các yếu tố môi trường khác đã tác động

bắt lợi đến sự sinh trưởng và phát triển, làm giảm năng suất và chất lượng hạt

đậu xanh, gây suy giảm khả năng chống chịu của cây đậu xanh.

Đậu xanh là loại cây tương đối mẫn cảm với điều kiện ngoại cảnh và thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Vì vậy, việc tuyển chọn giống đậu xanh có chất lượng cao, có khả năng chịu hạn là yêu cầu thực tiễn đặt ra cho ngành chọn giống đậu xanh.

Ở Việt Nam, những nghiên cứu trên đối tượng đậu xanh cũng đã và đang được tiễn hành. Các nội dung được đề cập đến là: chọn tạo giống thích nghi với thời vụ và điều kiện sinh thái, nghiên cứu quy trình trồng và chăm sóc đậu xanh

thích hợp, đánh giá chất lượng hạt và một số đặc điểm hóa sinh, phân lập gen

liên quan đến khả năng chịu hạn,... Mục tiêu chung trong công tác chọn giống đậu xanh là: giống năng suất, chất lượng cao, chín tập trung, chống chịu tốt với

điều kiện bất lợi của môi trường [7], [10, [13].

Nững cơng tr ình nghiên cứu về cây đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam

và ngày càng nhiều. Mặc dù vậy, sự hiểu biết về gen liên quan đến khả năng

chịu hạn của đậu xanh vẫn còn là giới hạn. Vấn đề cần đặt ra là cần tìm hiểu mối quan hệ giữa đặc điểm sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử liên quan đến tính trạng chịu hạn của cây đậu xanh. Trên cơ sở đó có định hướng cho cơng tác

chọn giống và cải tạo giống phù hợp nhăm tạo được các giống đậu xanh có khả

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

Cystatin là chất ức chế có bản chất protein. Sự biểu hiện của các gen cystatin thường trong điều kiện hạn, lạnh, mặn và ở các pha riêng rẽ của quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật [17], [20], [21]. Pernas M. và cs (2000) cho rằng khi ré cay dé (Castanea sativa) gap lạnh, sốc muối, stress nóng thì mức độ

phiên mã tăng mạnh ở cả tế bào rễ và tế bào lá, cystatin ở cây đẻ không chỉ liên

quan đến phản ứng tự vệ với các mầm bệnh và sâu hại mà còn liên quan đến

khả năng chống lại tác động bất lợi của môi trường [34].

Xắt phát t ừ những lí do trên chúng tơi đã tiến hành đề tài: “Đánh giá chất

lượng hạt, khả năng chịu hạn và phân lập gen cystatin của một số giống dau xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek)”.

2. MUC TIEU NGHIEN CUU

- Đánh giá chất lượng hạt của một số giống đậu xanh trên phương diện hoá sinh. - So sánh khả năng chịu hạn của một số giống đậu xanh ở giai đoạn cây non và

phân lập, xác định trình tự gen cystatin ở một số giống đậu xanh có mức độ chịu

hạn khác nhau.

3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân tích một số đặc điểm hình thái hạt như: màu sắc vỏ hạt, màu gốc thân và khói lượng 1000 hạt của 7 giống đậu xanh.

- Xác định hàm lượng protein, lipid và thành phần amino acid trong hạt ở 7 giống đậu xanh.

- Nghiên cứu tác động của hạn đến cây đậu xanh non ở giai đoạn 3, 5, 7, 9, ]I]

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

Chương 1. TÔNG QUAN TÀI LỆU

1.1. CAY DAU XANH

1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cây đậu xanh

Đậu xanh có tén khoa hoc la Vigna radiata (L.) Wilczek (2n=22). Trong lịch sử phan loai, dau xanh con co tén la Phaseolus radiatus hay Phaseolus aureus Roxb. Dau xanh co nguồn sốc từ Ấn Độ, phân bố rộng ở các nước thuộc

châu Á, Đông Nam Á hoặc khu vực Đông Dương và Myama sau đó nó được mang tới hầu hết các châu lục khác.

Cay dau xanh thudc ho Fabaceae chi Vigna, chi phu Ceratotropis. Hién nay, chi Vigna dugc biét téi c6 7 chi phu: Vigna, Plectotropis, Ceratotropis, Lasionspron, Sigmoidotropis, Haydonia, Macrohynchus. Trong do, dau xanh la mot trong s6 16 loai cua phan chi Ceratotropis [6], [14].

Bên cạnh những cây lương thực như lúa, ngơ, lạc... thì đậu xanh cũng là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, ới nhiều th ành phần quan trọng chứa trong hạt đậu xanh như protem, glucid, các loại vitamin, các loại khống chất. Vì thế, đậu xanh được con người sử dụng với nhiều mục đích khác nhau. Mỗi vùng miền ở Việt Nam có những cách chế biến riêng để từ đậu xanh tạo ra các món ăn đặc sản. Ngồi ra, đậu xanh cịn có thê được sử dụng làm thuốc chữa bệnh... Hệ thống rễ của đậu xanh có những nốt sẵn, trên nốt sằn có chứa các vi khuẩn

có định đạm giúp tăng giá trị dinh dưỡng cho đất [3], [8].

Đậu xanh là cây trồng cạn thu quả và hạt, bao gồm các bộ phận rễ, thân, la, hoa, qua. Cay dau xanh là cây thân thảo, mọc thang đứng hoặc hơi nghiêng,

thân yếu có lớp lơng mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình từ 40-70 cm,

đường kính trung bình từ 8-12 mm. Thân cây gồm 7- § đốt. Thân phân cành

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

muộn và trung bình có từ 2-5 cành, một số giống có 9, 10 cành phụ thuộc vào

giống và điều kiện chăm sóc.

Lá đậu xanh là là kép mọc cách, lá chét có 3 thuy với nhiều hình dạng như ơvan, thn dài, lưỡi mác. Trên thần chính của cây có 7-8 lá. Khi cây có lá thứ 5 nụ hoa được hình thành. Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính, mọc thành chùm trên trục hoa. Hoa đậu xanh thường nở rải rác nên người ta chia hoa đậu xanh

thành 3 nhóm chính:

- Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp trong 30 ngày. - Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài trong 16 ngày trở lại. - Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở trong vòng 16-30 ngày.

Dện tích của các lá tăng từ lá d ưới lên các lá giữa thân rồi giảm dần lên

các lá phía ngọn. Số lá và hình dạng lá thay đối tuỳ giống, đất trông và thời vụ [6]. Chỉ số diện tích lá (m” lá/m” đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp

và năng suất thu hoạch.

Rễ đậu xanh bao gồm rễ chính và rễ con, rễ chính sâu khoảng 20-30 cm, có

khi sâu đến 70-100 cm. Rễ cây đậu xanh có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định

đạm. Từ các kẽ nhánh rễ, đặc biệt gần sát rễ chính có chứa nhiều nốt sần (30-40 nốt sần/cây).

Qả đậu xanh thuộc loại quả giáp, h ình trụ, dang tron hoi det, dài từ 8-10

cm, đường kính từ 4-6 mm, có 2 gân nổi dọc theo 2 bên cạnh quả. Quả chín có

màu vàng, nâu hoặc đen nhưng chủ yếu vẫn là màu đen. Mỗi cây có từ 8-35 quả, mỗi quả có từ 8-15 hạt [6], [14]. Vỏ quả nếu chín gặp nhiệt độ cao có thể

tách cho hạt rơi ra. Vỏ quả đậu xanh thường mỏng hơn so với vỏ quả của một

số cây đậu đỗ khác.

Hạt đậu xanh có hình trụ, thn, trịn đều, có màu xanh xám, xanh bóng, vàng môc, đen xám... năm ngăn cách nhau băng những vách xơp của quả. Sơ

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

hạt trên quả và khối lượng hạt có tương quan tỷ lệ thuận với năng suất. Đậu xanh là cây trồng ngăn ngày, trồng vào mùa ấm áp, nhiệt độ tối ưu cho cây sinh

trưởng và phát triển từ 20-30C. Thi gian sinh tr ưởng của cây đậu xanh phụ

thuộc vào từng giống, dao động khoảng 60-100 ngày.

Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh được chia thành 2 giai

đoạn: sinh trưởng sinh dưỡng (V) và sinh trưởng sinh thực (R) [15].

- Giai đoạn sinh trưởng sinh đưỡng được chia làm nhiều giai đoạn. Rễ đầu tiên

phát sinh từ phần nhô ra của hạt kéo dài và đâm xuyên vào đất phát triên thành

rễ chính của cây. Song song với sự phát triển của rễ là sự phát triển của thân mâm, sau khi nảy mam lá mâm tự teo đi. Khi cây cao 15-18 cm trên thân có

một đốt lá đơn và 2 đốt lá kép, thì rễ bắt đầu hình thành các nốt sẵn. Khi cây

cao 23-27 cm, cây có 3 đốt mang lá kép mở rộng. Khi cây cao 37-41 cm, cây có 6 đốt mang lá kép mở rộng. Cứ sau khoảng 5 ngày, cây lại chuyển sang một giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng mới.

- Giai doan sinh trưởng sinh thực: Được chia làm 8 gia1 đoạn cơ bản

+ Giai đoạn cây bắt đầu ra hoa. + Giai đoạn hoa phát triển đầy đủ.

+ G1ai đoạn hình thành quả. + Giai đoạn quả phát triển. + GIa1 đoạn hình thành hạt. + Giai đoạn quả chắc.

+ Giai doan qua chin sinh lý. + Giai doan qua chin hoan toan.

Đậu xanh sinh trưởng và phát triển trong phạm vi nhiệt độ khả rộng l6- 36°C, nang suat dat cao nhat trong khoang nhiét d6 22-27°C. Su ra hoa cua dau xanh có mơi quan hệ chặt chẽ với nhiệt độ môi trường và thời gian chiêu sảng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

1.1.2. Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh

Cây đậu xanh (Vigna radiafa (L.) Wilczek) là loại cay trồng có giá trị kinh

tế cao. Về đinh đưỡng, hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 24-

28%), ngồi ra cịn lipid 1,3%, glucid 60% va các chất khoảng như Ca, Fe, Na, K... cùng nhiều vitamin tan trong H;O như A, Bị, B;, C... Giá trị sinh học của

đậu xanh (phần đạm ma co thé hap thy va giữ lại được) khoảng 40,66%.

Hàm lượng protein dự trữ trong hạt đậu xanh trung bình khoảng 241%.

Chức năng của protein dự trữ là cung cấp nguồn amino acid và nitơ cho quá trình nảy mam cua hat. Protein du tri trong hat cua cay ho dau chu yếu là

globulin (60%), albumin (12%), glutein (21%), prolamin (1%). Protein của hạt

đậu xanh chứa đầy đủ các loại amino acid và amino acid không thay thế như lysine, methionine, phenylalanine, threonine, valine, leucine, isoleucine, tryptophan. Hat dau xanh có hàm lượng lysine cao, nhưng hàm lượng

methionine thấp [3], [6].

Đậu xanh có hàm lượng lipid thấp hơn so với các cây họ đậu khác. Hàm lượng lipid thay đôi tuỳ thuộc vào giống, hệ gen. Hàm lượng lipid của đậu xanh trung bình khoảng 1,3%. Lipid trung tính chiếm phần lớn. Ngoài ra, trong đậu

xanh cịn có glycolipid, phospholipid ....

œ-amylase thuộc nhóm hydrolase có trong cơ thê động vật (nước bọt, tụy tạng), thực vật (hạt hoà thảo nảy mầm), nắm mốc, vi khuẩn. œ-amylase phân giải các liên kết 1,4-glycoside ở giữa chuỗi mạch polysacharide, tạo thành các dextrin phân tử thấp. Do đó, dưới tác dụng của enzyme này làm dung dich tinh bột nhanh chóng bắt màu với dung dịch 1ot và bị giảm độ nhớt mạnh. lon canxi

có tác dụng làm bên cấu trúc không gian của phân tử enzyme. œ-amylase tương đối bền với nhiệt hơn amylase khác nhưng lại kém bên với acid. Trình tự DNA

của gen œ-amylase ở đậu xanh đã được phân lập [27].

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

Protease đóng vai trị rất quan trọng trong cơ thê thực vật và trong quá trình nảy mầm của hạt. Sự có mặt của protease trong hạt đang nảy mầm 1a bang chứng về sự tham gia của chúng trong quá trình phân giải protein. Protease cũng tham gia vào phân giải các protein lạ hoặc bị biến tính khi sặp điều kiện cực đoan (hạn, lạnh, mặn.,...) .

1.2.GEN CYSTATIN VÀ KÑ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU XANH

1.2.1. Hạn và ảnh hưởng của hạn tới cây đậu xanh

Hạn là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nước của thực vật do môi trường

gây nên làm ảnh hưởng đến sinh trưởng của thực vật. Hạn cũng có thể được

định nghĩa là sự thiếu nước do mưa hoặc tưới nước trong một thời gian dài tạo sự cạn kiệt độ âm trong đất và gầy nên tồn thương cho thực vật.

Có hai loại hạn cơ bản là hạn thật (hạn đất và hạn khơng khí) và hạn sinh

lí. Hạn đất là do lượng nước trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy nước từ đất vào tế bào dẫn đến cây bị héo. Hạn khơng khí là do nhiệt độ cao và

độ âm thấp gây nên héo tạm thời vì cây khơng hút đủ nước mà lại thoát hơi

nước nhanh. Hạn sinh lí là do mất cân bằng áp suất thâm thấu giữa mơi trường bên ngồi và tế bào nên cây không hút được nước mặc dù nước vẫn được cung cấp đầy đủ.

Khnăng thực vật có thể giảm thiêu mức tốn thương do thiếu hụt nước gây

ra gọi là tính chịu hạn. Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển trong điều kiện khô hạn gọi là cây chiu han [39], [40].

Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của

mơi trường như hạn, nóng, lạnh... Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học. Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn của cây đậu tương, ngô, lúa, đậu xanh

[1], [5], [10], [12], [13].

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

Khi nhiệt độ tăng lên trên ngưỡng nhất định của từng loại cây trồng thì q trình hơ hấp diễn ra mạnh dẫn đến sự mắt cân bằng trao đổi chất làm ảnh hưởng đến nguồn cacbonhydrat dự trữ trong cây. Phản ứng của cây đối với hạn là sự đóng của khí khơng, giảm tỷ lệ thốt hơi nước của mơ, giảm quang hợp và tăng tích luỹ abscisic acid (ABA), proline, manitol, sorbitol, sự câu thành nhóm ascobat, ølutathion, ... và sự tổng hợp protein mới [28], [29]. Hạn còn dẫn đến

một số biển đổi trong mô và tế bào, phá huỷ hệ thống quang hoá II trên màng thylacoid.

Co ché chéng chiu han 6 thuc vat rat phức tạp liên quan tới các đặc điểm sinh lý, hóa sinh và các gen trong cơ thê thực vật. Nghiên cứu tính chịu hạn ở

thực vật người ta thấy có nhiều biến đổi ở các mức độ khác nhau trong các giai đoạn phát triển khác nhau. Tính chống chịu của đậu xanh do nhiều gen quyết

định. Cho đến nay người ta vẫn chưa tìm thấy một gen nào quyết định tính chịu hạn của thực vật nói chung và của đậu xanh nói riêng.

Nghiên cứu khả năng chịu hạn của đậu xanh là rất cần thiết nhằm chọn tạo các giống đậu xanh có khả năng chỊu hạn tốt. Tuy nhiên, số cơng trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn và các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh còn hạn chế. Với mục tiêu nghiên cứu cơ sở phân tử của tính chịu hạn, các gen liên quan đến khả năng chịu hạn như HSC70, Rubisco, LEA, PLC và

cystatin ở đậu xanh cũng đã được thảo luận trên các tạp chí chuyên ngành [19],

[30], [31, [32], [41].

1.2.2. Cơ sở hoá sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn

Chịu hạn ở thực vật thường là kết quả của nhiều cơ chế đáp ứng stress hoạt động cùng đồng thời. Các nghiên cứu gần đây đưa ra một số cơ sở hoá sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn gồm: các gen chức năng (LEA, HSP, LTP,...), các gen điêu khiên phiên mã, vai trò của bộ rê, khả năng điêu chỉnh áp

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

suất thấm thấu, abscisic acid (ABA), sự truyền tín hiệu và các nhân tố ức chế

<small>protease. </small>

1.2.2.1. Các gen chức nang

Các gen chức năng có liên quan đến khả năng chịu hạn được biết đến là: LEA, chaperons, HSP, LTP....

* HSP (Heat Shock Protein) và môi giới phân tử (Chaperons): HSP chiém

khoảng 1% protein tổng số trong lá và có ở hầu hết các loài thực vật. Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá huỷ của stress. HSP xuất hiện trong cả các quá trình sinh trưởng bình thường, các giai đoạn biệt hố

mơ và trong thời kì sinh trưởng của thực vật. Chúng được tông hợp thêm trong

điều kiện cực đoan của môi trường. Dựa vào khối lượng phân tử người ta phân

loại HSP ở thực vật ra làm 6 nhóm: HSP 110, HSP90, HSP 70, HSP ó0, HSP

20, HSP 8.5. Trong nhóm HSP có rất nhiều đại điện của chất môi giới phân tử

(MGPT) la HSP 70, HSP 60, nhưng cũng có những HSP khơng phải là môi giới phân tử (HSP8.5- Ubiquitin). Ubiquitin được mệnh danh là người bảo vệ tế bào,

chúng có hoạt tính protease, thực hiện chức năng phân giải các protein bị biến tính khơng có cấu trúc đúng, ngăn chặn các protein này gây độc cho tế bào. MGPT la mot nhom gom nhiéu loai protein khac nhau. Phân lớn các MGPT có hoạt tính ATPase. Chức năng chính của MGPT là tham gia tạo câu trúc không gian đúng cho protein mới được tông hợp, chuyền protein qua màng, duy trì cau trúc đặc hiệu của protein, ngăn chặn sự huy hoại protein chưa tạo cầu trúc không gian, khởi đầu cho sự phân huỷ protein biến tính [13], [41]. MGPT có 5 ho chinh la: HSP 70 (Dnak), HSP 60 (Chaperonin), HSP 90, HSP 100 va sHSP

(small HSP). Các phân tử HSP được định vị trong bào chất và nội bào quan như

là nhân, ty thể, lạp thê và lưới nội chất [38].

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

* LEA (Late embryogenesis abundant protein- protein tich luy véi sé luong lớn ở giai đoạn cuỗi của quá trình hình thành phơi)

LEA là protein có vai trò bảo vệ thực vật bậc cao khi môi trường xảy ra stress, đặc biệt là hạn. Gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi như hạn, muối cao,

nóng, lạnh dẫn tới tế bào bị mắt nước. LEA là một trong những nhóm gen liên

quan đến sự mất nước của tế bào thực vật. Protein LEA hạn chế sự mất nước do

điều kiện ngoại cảnh bất lợi và nó cũng đóng vai trị quan trọng trong điều

chỉnh quá trình mat nước sinh lý khi hat chin. Protein LEA dugc tao ra hang

loạt trong gia1 đoạn muộn của quá trình hình thành phơi. Mức độ phiên mã của

gen LEA được điều khiển bởi ABA, độ mất nước của tế bào và áp suất thâm thấu [35].

* Các protein van chuyén lipid (LTP- Lipid Transfer Proteins)

Gen LTP lién quan dén sinh téng hợp lớp biểu bì. Khi stress hạn, LTP được kích thích tăng tổng hợp ngoại biểu bì làm thực vật có thể giảm mắt nước nhờ tăng độ dày lớp vỏ ngoài. Ở đậu xanh (Vigna radiata), gen LTP ciing được

phân lập và được công bố trên ngân hàng gen quốc tế [32]. 1.2.2.2. Các gen điều khiến phiên mã

- Các gen điều khến phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của

các gen chức năng thông qua việc bám vào trật tự DNA diéu khién (cis acting

element) trên vùng khởi động gen (promotor) và tương tác với RNA

polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã các gen chức năng.

- Có nhiều nhân tố khởi đầu phiên mã điều khiển tính chịu hạn như: DREB,

ABEB, NAC, MYB, MYC, bZIP, WRKY.

- Mỗi nhóm nhân tô khởi đầu phiên mã tham gia điều khiển tính chịu hạn có trật tu cis acting element riéng biét.

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

- Promotor trên mỗi gen chức năng chứa một hoặc nhiều nhóm nhân tố khởi đầu phiên mã.

1.2.2.3. Vai trò của bộ rễ

Kh năng nhận n ước của cây phụ thuộc vào bộ rễ. Nhiều nghiên cứu cho

thấy cây nào có bộ rễ dài, khoẻ, mập thì có khả năng hút nước ở những tầng đất

sâu. Khi bị hạn thì nước thường được giữ ở tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài thì mới có khả năng lẫy nước. Hình thái rễ của cây đậu xanh rất đa dạng.

Các cây đậu xanh giống địa phương thường có bộ rễ dài hơn các giống khác.

KA nang thu nhận n ước và cung cấp đủ nước thông qua rễ tới các bộ phận của

cây trong điều kiện khó khăn về nước được coi là chỉ tiêu để đánh giá khả năng

chịu hạn. Trong chọn giống theo hướng tăng cường tính chịu hạn người ta thường hướng tới mục tiêu tăng cường kích thước và khả năng đâm xuyên của

bộ rễ.

1.2.2.4. Khả năng điều chỉnh áp suất thâm thấu

Kh năng điều chỉnh áp suất thâm thấu l à một đặc tính của tế bào khi bị

mất nước do hạn, nóng, lạnh... Trong điều kiện hạn, áp suất thâm thâu tăng lên

giúp rễ cây nhận được một lượng nước rất nhỏ còn lại trong đất. Nghiên cứu các chất có khả năng tạo áp suất thâm thấu cao trong tế bào để cạnh tranh nước với

môi trường xung quanh gồm: proline, đường, glycinebetain, KỶ”, các dạng oxy

hoạt hoá và các chất truyền tin nội bào... [29]. Các chất này có chức năng điều

chỉnh áp suất thắm thấu nhờ khả năng giữ nước và lấy nước vào tế bào hoặc

ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na”, ngồi ra chúng cịn thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tương tác với các protein và lipid mang, ngan chặn sự phá huỷ màng. Một trong các chất liên quan đến thâm thấu là proline. Sự tích luỹ proline được nghiên cứu ở nhiều loài thực vật trong điều kiện stress.

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh proline có thê tăng khi thực vật bị stress.

1.2.2.5. Abscisic Acid (ABA)

Tic vat sinh tr wong va phat triển là do sự điều chỉnh bởi các tín hiệu nội

bào và điều kiện mơi trường bên ngồi. ABA là hormone thực vật liên quan đến

sự điều chỉnh sinh lý, sinh trưởng và phát triển, đáp ứng với môi trường của

thực vất bậc cao. Mức độ ABA trong mơ thực vật có thể nâng cao phản ứng trả lời stress môi trường, chủ yếu do hạn. ABA được tổng hợp ở rễ cây do phản

ứng với stress [28].

ABA đóng vai trị quan trọng trong nhiều quá trình của tế bào thực vật như: sự phát triển của hạt, sự ngủ, sự nảy mam, sinh trưởng phát triển, đáp ứng VỚI stress của môi trường. Các nghiên cứu về đặc tính di truyền, đặc điểm sinh hoá, con đường tổng hợp ABA của thực vật bậc cao đã được hiểu rõ. Gần đây,

các gen chính và các enzyme trong con đường tông hợp ABA đã được xác định. ABA có vai trò điều chỉnh sự trao đổi nước trong cây hạn chế sự mất nước và

làm cây thích ngh1 được với điều kiện khô hạn. Về cơ chế tác động người ta cho

rang ABA âm bi ến đổi điện hoá qua màng và đo đó điều tiết sự tiết ion K” [29].

Nhóm gen phản ứng với ABA được gọi tên chung là RAB (Responsive to Abscisic acid).

1.2.2.6. Sự truyền tín hiệu canxi

Gen phosphoinosit- specific phospholipase C (PI- PLC) goi tắt là PLC. Sự

truyén tin hiéu canxi trong suốt stress hạn và muối đã được nghiên cứu nhiều ở thực vật bậc cao. Canxi hòa tan sinh ra được xem như chất truyền tin thứ cấp

truyền đến ngoại bào kích thích các tế bào phản ứng bảo vệ. Huy động canxi

liên quan đến các gen phospholipase A2, C và D [31], [40].

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

1.2.2.7. Các nhân tô gây ức chế profease

Khi stress hạn xảy ra, các protein bị biến tính và tốn thuong. Cysteine protease tham gia loại bỏ các protein biến tính. Q trình này có thể bị cản trở bởi các chất ức chế cysteine protease (được gọi là cystatin) [23], [26].

1.2.3. Cystatin va gen cystatin 1.2.3.1. Cystatin

Cysteine protease la enzyme cé vai tro thiét yêu trong quá trình sinh trưởng

và phát triển của thực vật, sự già và chết theo chương trình của tế bào, trong sự tích lũy protein dự trữ trong hạt, huy động protein dự trữ và khả năng chống chịu với những stress của môi trường. Cysteine protease tham gia vào sự hoàn thiện protein, tái tạo protein và loại bỏ protein biến tính nhằm giúp cây thích ứng với những tác động của môi trường bên ngoài. Các chất ức chế cysfeine protease gôm 3 họ: stefn, cystatin, kininogen [36], [37].

Cystatin là chất ức chế có bản chất protein [23]. Chúng có mặt trong vi

sinh vật, động vật, thực vật [17], [18], [20], [21]. [22]. Cystatin thực vật được

mô tả lần đầu tiên ở lúa vào năm 1987 bởi Abe và cs. Các cystatin được tìm

thấy có mối liên quan với nhau tạo thành một siêu họ cystatin. Hiện nay người

ta chia cystatin thành 3 ho nho [26]. Cystatin ho 1 con có tên là họ stefin, không chứa liên kết disunfit hoặc nhóm carbonhydrate với khối lượng phân tử khoảng 11kDa gồm khoảng 100 amino acid. Cystatin họ 2 cịn có tên họ là cystatin, họ

này chứa 2 liên kết disunfit trong chuỗi ở gần cacbon cuối cùng và được

glycosyl hoá. Khối lượng phân tử của cystatin họ 2 vào khoảng 13-24 kDa voi

115 ammo acid. Cystatin họ 3 cịn có tên họ là kimmogen với trọng lượng phân

tử khoảng 60-120 kDa, gồm khoảng 355 amino acid. Các kininogen đóng vai

trị quan trọng trong quá trình đông máu ở động vật. Ngoài 3 họ trên, người ta

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

còn bồ sung thêm một họ cystatin 4 có tên là phytocystatin gồm tất cả các chất

ức chế cysteine protease thực vật. Các cystatin họ 4 có nhiều đặc điểm giống họ 1 va ho 2 [33].

1.2.3.2. Gen cystatin

Ở cây đậu xanh, gen cystatin được Kang và cs (2002) phân lập, đọc trình

tự từ mRNA và công bố tại ngân hàng gen Quốc tế có mã số AF454396 với

kích thước 304 nucleotide, đoạn mã hoá gồm 267 nucleotide ma hoa 88 amino

acid [15]. Khi điều kiện bất lợi xảy ra như hạn hán thì protein thường bị biến

tính, tế bào bị tốn thương nên cysteine protease tham gia vào quá trình loại bỏ

protein biến tính làm cho cây thích nghi với tác động của hạn. Hoạt động của cysteine protease lai bi wc chế bởi cystatin. Vi vay, phan lap gen cystatin nham

tạo cơ sở cho việc nghiên cứu làm giảm sự tích luy cystatin la rat can thiét.

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

2.1. VAT LIEU

2.1.1. Vật liệu thực vật

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Sử dụng 7 giống đậu xanh (do Trung tâm nghiên cứu và phát triển đậu đỗ-

Viện cây lương thực và thực phẩm cung cấp) làm vật liệu nghiên cứu. Đặc điểm của các giống được trình bày trong bảng 2.

Bảng 2.1. Đặc điểm của 7 giống đậu xanh

<small>1 DX208 Phục tráng giỗng địa Có thời gian sinh trưởng | Kháng bệnh vàng lá </small>

phương của Miền ngắn 59 - 62 ngày; cây cấp 1, bệnh đốm lá cấp

<small>Nam cao từ 60 - 70 cm. Ra hoa | 2. Khả năng thích ứng </small>

<small>và chín tập trung. rộng. </small>

<small>2 Đỗ Quê Hải Dương Hạt nhỏ Chưa đánh giá </small>

3 DX14 Thái Lan Nhập vào Việt Nam năm | Ging triên vọng . 2000, năng suất cao. Chống chịu khá 4 DX04 Trường Đại học Nông | Cây cao 45 — 50cm, sinh | Ít nhiễm bệnh đồm lá,

nghiệp I chọn lọc từ trưởng khỏe, nhiều quả, | phấn trắng, khả năng giống nhập nội của chín tập trung. Thời gian | chịu nóng tốt. Khả năng

<small>Trung tâm nghiên cứu: | sinh trưởng vụ xuân 80— | thích ứng rộng. </small>

và phát trần rau đậu 86 ngày, vụ hè 75 — 80 Châu Á. ngày, vụ thu 90 ngày.

5 V123 Đợc chọn lọc từ Cây cao trung bình 65cm. | Nhiễm trung bình với dịng hạt to, xanh mỡ = | Qua chin mau den, det. bệnh đốm lá, phấn của tổ hợp lai Sinh trưởng khoảng 70 trắng, kháng cao với vi

<small>6 T185 Đợc chọn lọc từ Cây cao trung bình 60cm. | Kháng trung bình với </small>

dòng hạt to, xanh mốc | Quả chín màu đen, dài sâu đục hoa, quả, bệnh của tổ hợp lai 10cm. Sinh trưởng đốm lá. chịu hạn khá.

<small>VC2768A/VHB nam khoang 70-75 ngay. </small>

7 PAEC3 Philippin Nhập năm 2001. là giống | Chống chịu kém đột biến. Cây cao trung

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

Hình 2.1. Hạt của 7 giống đậu xanh nghiên cứu

2.2. HOA CHAT VA THIET BI 2.2.1. Hoá chất

Sử dụng các loại hoá chất của các nước và các hãng nổi tiếng như: Tag-

polymerase, Buffer PCR, cặp mỗi đặc hiệu của các hang Invitrogen, EDTA,

SDS, Tris.. cua Duc, b6 kit thd1 gel (QIA quick Gel Extraction), b6 kit tach

plasmid (QIA prep Spin Miniprep) cua hang QIA gen.

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

- Bề ôn nhiệt.

- Tu say.

- Tu lanh.

- Một số các thiết bị cần thiết khác. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1. Phương pháp sinh lí, hố sinh

2.3.1.1. Dánh giá nhanh khả năng chịu hạn

Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn theo phương pháp của Lê Trần Bình và cs

(1998) [1].

Hat đỗ xanh được gieo vào trong các chậu trồng cây chứa cát vàng sạch.

Sau khi cây có 3 lá thật, tiến hành gây hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước

đến khi cây héo, trong quá trình gây hạn cho cây che không cho nước mưa có

thể vào chậu thí nghiệm, thời điểm tiến hành thí nghiệm được thực hiện vào mùa khô từ tháng 9 đến tháng 1 1 âm lịch. Khi cây non 3 lá thật bắt đầu héo, tiễn hành theo dõi mức độ héo của cây trong vòng 3, 5, 7, 9, 11 ngày kê từ khi lô thí

nghiệm bắt đầu có cây héo, tỉ lệ cây phục hồi sau 3, 5, 7, 9, 11 ngày. Các chỉ tiêu phân tích gồm:

- Tỷ lệ cây không héo.

- Tý lệ cây phục hồi.

- Chỉ số chịu hạn tương đối.

Kh năng chịu hạn tương đối của cây được biểu hiện băng đồ thị rada, gồm các

trục a, b, c, d, e, g, h, i, k, lm và mang các trị số tương ứng An, Das Cn, Un, Cn, Zn,

hạ, in, kạ,lạ, mạ và chỉ số chịu hạn tương đối được tính bằng đồ thị rada theo công

thức:

Sn = 4 Sin Œ (an bạ + bạ ca + Cạ dạ + daen † ©nfØn T Ønhạ + ha1a + 1nka tkal„†lama) Góc ơ được tạo bởi 2 truc mang tri số gần nhau và œ= 360/6 + 60

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

S$„: chỉ số chịu hạn tương đỗi.

n: ký hiệu các giống nghiên cứu.

Các chỉ tiêu theo đõi gồm:

a: ?%o cây không héo sau 3 ngày hạn.

b: % cây phục hồi sau 3 ngày hạn.

c: ?%o cây không héo sau 5 ngày hạn.

d: % cây phục hồi sau 5 ngày hạn.

ø: % cây không héo sau 7 ngày hạn. h: % cây phục hồi sau 7 ngày hạn. 1: % cây không héo sau 9 ngày hạn. k: % cây phục hồi sau 9 ngày hạn. l: % cây không héo sau 1] ngày hạn. m: % cây phục hôi sau 11 ngày hạn.

Chỉ số chịu hạn càng lớn thì khả năng chịu hạn càng cao.

2.3.1.2. Định lượng lipid tổng số

Xác định hàm lượng lipid dựa trên nguyên tắc hoà tan của lipid trong dung

môi hữu cơ là ete dau hoa (petroleum ether). Tach chiét lipid o 4°C, li tam 12000 vòng/phút. Mẫu đã loại lipid được sấy khô ở 70°C đến khối lượng không đổi. Hàm lượng lipid tính bằng hiệu số khối lượng mẫu trước và sau khi chiết phần trăm khối lượng khô.

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

lượng protein là phần trăm khối lượng khơ [2].

Cách tính hàm lượng protem:

Aly

% Pr = 247 *100 %

Trong đó: a: số đo trên máy quang phố H: hệ số pha loãng

G : số mg mẫu phân tích

2.3.1.4. Xác định hàm lượng amino acid

Xác định hàm lượng amino acid trén may phân tích ammo acid tự động

HP- Amino Quant Seriese II của hãng Hewlet Packard tại Viện Công nghệ Sinh

học. Sử dụng OPA(ortho-phtalandehyt) tạo dẫn xuất đối với amino acid bậc I và FMOC99-fluoreryl methyl chloroformate) đối với các amino acid bậc II. Mẫu được xử lý thuý phân trong pha lỏng theo hưỡng dẫn của máy phân tích amino acid tự động. Thành phần ammno ac1d được tính theo đơn vị gam amino ac1d/100

gam bột.

2.3.1.5. Xác định hoạt độ của a- amylase

Xác định hoạt độ của œ- amylase theo phương pháp Heinkel được mô tả theo tài liệu của Nguyễn Lân Dũng và cs (1979) [4].

Nguyên tắc: Xác định lượng tinh bột bị phân giải đựa trên cơ sở xác định

mức giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iot. Đơn vị hoạt

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

dong cua enzyme la lugng enzyme co kha nang phan giai 1 mg tinh bot sau 30 phut o 30°C. Gid tri mat độ quang do trên may quang phd UV Visible Spectophotometers Cintra 40 voi budc song 560 nm.

Hạt độ œ- amylase được tính theo cơng thức

Trong do: A: hoat dé a- amylase (DVHD/ml) K: số đo được ở ống kiểm tra

t: số đo được ở ống thí nghiệm

H:h ệ số pha loãng

ø: số mg mẫu phân tích

2.3.1.6. Xác định hoạt độ của profease

Xác định hoạt độ của protease theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi và Nguyễn

Lan Ding [4], [11].

Nguyên tắc: Dùng cazein làm cơ chất, sau đó diệt enzyme và kết tủa protein chưa bị phân hủy bằng trichloacetic acid. Xác định hoạt độ phân giải protein cla enzyme trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành trong phan ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin-Ciocalteau.

Hạt độ của protease được tính theo cơng thức:

P= ((n-k)*HD)/(Vtg)

Trong do: P: hoat d6 cua protease (DVHD/ml)

n: số đo trên máy ở ống thí nghiệm k: số đo trên máy ở ống kiểm tra

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

V: số ml dịch chiết đem đo G: số gam mẫu phân tích

t: thời gian ủ enzyme với cơ chất

2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử

2.3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Phương pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs năm 1991 có cải tiến [24]

như sau:

(1) Lấy 200mg lá non nghiền trong nito lỏng thành bột mịn.

(2) Bồ sung 0,8 ml đệm rita (Tris HCl 1M, EDTA 0,5M, pH=8, Sobitol 2M, NaH;PO¿ 0,4 %, H;O), li tâm 15 phút tốc độ 12000 vòng /phút, loại bỏ dịch nồi.

Thêm 700 ul dém tach (Tris HCl 1M, pH=8, NaCl 5M, EDTA 0,5M, CTAB

4%, HO), tron nhe. U 65°C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lẫy ra để ở nhiệt

độ phòng 5Š phút.

(3) Thêm 600 kịc hloroform : isoamyl (24:1), trộn đều 20 phút. (4) L1 tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.

(5) Hút 500 kl dịch trong sang ống 1,5 ml, b tủa.

(6) Thêm 500 hl isoprropanol, tộn nhẹ đặt n én da cho co ta trang.

(7) Li tâm 13000 vòng /phút trong 5 phút, ö dịch, úp xuống giấy cho khô.

(8) Bồ sung 300 lic ồn 70% búng nhẹ.

(9) Li tam 13000 vòng/phút, 5 phút, loại bỏ cồn.

(10) Lam khé DNA bang may speed vac. (11) Hoà tan DNA trong HO khử 1on.

2.3.2.2. Định lượng và kiểm tra độ tỉnh sạch cia DNA tong sé

Kiểm tra độ tỉnh sạch của DNA bằng 2 phương pháp:

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

(1) Phương pháp quang phổ hấp thụ: Kiểm tra nông độ và độ tinh sạch của

DNA trên máy quang phố ở bước sóng 260nm va 280nm. Nong d6 DNA trong

dung địch tách chiết được tính theo công thức:

Nong d6 DNA (ng/ul) = A260 x 50 x hệ số pha loãng.

Độ sạch của DNA được xác định bằng tỷ lệ A260/A280. Dung dịch chứa

DNA có tỷ lệ A260/A280 là 1,8- 2,0 được coi là đảm bảo chất lượng.

(2) Phương pháp điện di: Điện đi kiểm tra DNA của các mẫu thí nghiệm trên

gel agarose 0,8%. San pham diện đi được nhuộm bằng ethidium bromide, soi va chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tỉnh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.

2.3.2.3. Kỹ thuật PCR

Nhân gen bằng kỹ thuật PCR theo Mullis và cs năm 1985. Dựa vào sự

phân tích trình tự gen mã hóa tổng hợp cystatin ở đậu xanh được công bố ở

ngân hàng gen Quốc tế, chúng tôi đã thiết kế cặp mỗi cystatin (C) gồm 2 mài: môi xuôi (Cr) và mỗi ngược (Ca) để nhân và phát hiện sự có mặt của gen mã

hóa cystatin ở 2 giống đậu xanh là DX208§ và PAEŒ.

PCR được tiễn hành trên máy PCR System 9700 (Applied Biosystem - Mỹ) với tổng thể tích 50ul. Chu trình nhiệt nhân gen cystatin bao gồm các bước sau:

94°C-3 phút; 94”C-50 giây, 56°C-1 phút, 72”C-I phút 30 giây lặp lại 30 chu kì; 72°C-10 phút và lưu giữ ở 4°C.

Bảng 2.2. Cặp môi nhân gen cystatin

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện đi trên gel agarose 0,8% trong

đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidrum bromide 1% và chụp ảnh dưới

ánh sáng đèn cực tím.

Bang 2.3. Thanh phan phản ứng nhân gen cystatin

- Điện di sản phẩm PCR (1 giếng sản phẩm, 1 giếng đối chứng, l giếng

-U 650°C trong 15 phút, trộn nhẹ cho gel tan hoàn toàn.

- Chuyên hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, li tâm cực đại 1 phút, đỗ địch chảy

qua cột.

- Bồ sung 750 ul PE vao cot để ở nhiệt độ phòng 5 phút.

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

- L1 tâm cực đại l phút để loại bỏ PE. Li tam bé sung | lần nữa để loại bỏ PE hoàn toàn.

- Hoa tan DNA trong 30 ul nước khử ion, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Li tâm cực đại l phút.

- Điện di kiểm tra sản phẩm thôi gel. 2.3.2.3. XI thuật tách dòng gen

Phân lập gen theo phương pháp của Glick và cs [25]. Sản phẩm PCR đã được làm sạch gắn trực tiếp vào vector pTZ57R/T với thành phần phản ứng

trong bảng 2.4.

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector

Hãn hợp được ủ ở nhiệt độ 22C trong 1 giờ và sau đó được biến nạp vào

té bao kha bién chung E.coli DH5a.

Bién nap vector tai t6 hop vao té bao kha bién ching E.coli DH5a

Lay 7 wl vector da gan gen cho vao ống đựng, trộn nhẹ. Đặt hỗn hợp trong đá 30 phút, sau đó ủ ở 42°C đúng 1 phút và cho vào đá 5 phút. Bồ sung 400 ul

LB lỏng (pepton, cao nắm men, NaCl]) nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 1 giờ. Lấy ra cấy trải trên môi trường LB đặc (pepton, cao nam men, NaCl va

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

agar) có kháng sinh ampicilin (100 mg/Ù, IPTG (0,1 mM) và X-gal (40 mgi]).

Chọn khuẩn lạc có màu trắng ni trong môi trường LB lỏng (có bỗ sung ampicilin 100 mg/l) qua đêm.

Kiém tra san pham chon dong

Lấy dịch nuôi chứa vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chon dong bang phan ứng

PCR với cặp mỗi pUC18, đây là mỗi được thiết kế chung cho các vector tách dịng, nó nằm trên vector và nhân đoạn gen vừa biến nạp.

Phản ứng PCR với cặp mỗi pUC18 được tiễn hành với tổng thể tích phản img 25ul g6m: DNA plasmid 2 pl, primer (10 uM) 2 ul, dNTPs (2,5 mM) 2 ul, MgCl, (25 mM) 2,5 ul, Tag-polymerase (5 unit/ul) 0,4 ul, buffer (10X) 2,5 ul,

H,O khtr ion 13,6 pl. Chu trình nhiệt bao gồm các bước sau: 94°C-3 phút; 94°C- 40 giây, 53”C-50 giây, 72”C-1 phút 30 giây lặp lại 30 chu kì; 72”C-10 phút và

lưu giữ ở 4C. Sản phẩm PCR chọn dòng được kiểm tra bằng điện di trên gel

agarose 1% trong đệm TAE 1X. Sau đó nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím.

Tách plasmid

Sau khi kiểm tra sản phẩm chọn đòng tiễn hành tach plasmid bang bé kit

QlAprep ŠSpin Miniprep của hãng QIA gen. Các bước tach plasmid:

(1)Lấy dịch khuẩn li tâm 3000 vòng/phút, bỏ dịch, lấy cặn

(2) Hoa can trong 250 ul buffer P1, lắc nhẹ

(3)B6 sung 250 pl buffer P2 vao éng trén, lắc nhẹ

(4)B6 sung 350 ul buffer N3, lắc nhẹ tránh để kết tủa cục bộ

(5)Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột

tinh sạch plasmid của hãng QIA gen.

(6) L1 tâm 13000 vòng/phút trong I phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.

(7) Bỏ sung 500 ul buffer PB, li tam 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ

dịch chảy qua cột.

(8)B6 sung 750 pl buffer PE, li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột. Li tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết buffer PE.

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

(9)Đặt cột sang ống 1,5 ml, cho 50 ki EB vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ

phòng 2 phút va li tam 13000 vong/phut trong 1 phút.

Kém tra san pham tach plasmid tr én gel agarose 1% trong dém TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% va chup anh dudi anh sáng đèn cực tím.

Trình tự của gen cystatin được xác định trên máy đọc trình ty nucleotide tự dong ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) su

dung b6 hoa chat sinh chuan BigDye® Terminator v3.1 cycle sequencing. Gen cystatin dai khoang 1100 bp nên trình tự nucleotide được đọc cả hai chiều xuôi

Và ngược.

2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu

2.3.3.1. Phương pháp thơng kê bằng chương trình Excel

Xác định giá trị trung bình, phương sal, độ lệch chuẩn, sai số trung bình

mẫu ... băng chương trình Excel trên máy vi tính theo Chu Văn Mẫn (2003) [9].

2.3.3.2. Phương pháp xử lý trình tự gen

Sử dụng phần mềm DNAstar, BioEdit dé phân tích, so sánh, nối ghép trình

2.3.3.3. Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc

Các số liệu nghiên cứu sinh lý và hóa sinh sử dụng được đề xác định quan

hệ đi truyền của các giống đậu xanh dựa theo phần mềm NTSYSpc (USA,

1998).

2.4. Địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được hoàn thành tại các phịng thí nghiệm: Phịng thí nghiệm Di truyền - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái ngun, Phịng thí nghiệm Sïnh học - Khoa Khoa học Tự nhiên và Xã hội - ĐHTN và Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học.

<small>Số hóa bởi Trung tâm Học liệu — Đại học Thái Nguyên http:/Avww.Irc-tnu.edu.vn</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">