Tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (Florescence In Situ Hybridization) trên vi sinh vật
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (684.65 KB, 62 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỒ ÁN MƠN HỌC CHUN NGÀNH
TÌM HIỂU KỸ THUẬT LAI
HUỲNH QUANG TẠI CHỖ_FISH
(FLORESCENCE IN SITU
HYBRIDIZATION) TRÊN VI
SINH VẬT
GVHD : Th.s NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN
SVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠT
MSSV : 60604096
TPHCM, tháng 6/2010
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả sự thành kính, tơi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến:
Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Huyền – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường
Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã gợi ý đề tài, hướng dẫn tận tình, động viên và
giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện đồ án này.
Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tơi những
kiến thức q báu có liên quan đến đề tài.
Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM –
đã cùng học tập, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm việc.
ii
TÓM TẮT NỘI DUNG
Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ_ FISH (fluorescence in situ hydridization) ra
đời từ năm 1989 và đến nay được xem là công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của
nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là sinh thái học, mơi trường học, chẩn đốn và
phát sinh loài. Bằng 5 bước xử lý cơ bản: chuẩn bị mẫu và đầu dò, cố định mẫu, lai,
rửa mẫu, quan sát ta có thể thu được các thơng tin chính xác về hình thái, số lượng,
khơng gian phân bố hay thành phần môi trường của đối tượng nghiên cứu. Trên thế
giới đã ứng dụng FISH trong nhiều lĩnh vực, trong tương lai FISH sẽ sử dụng để
tăng cường hiệu quả biểu hiện của nhiều công cụ nghiên cứu khác. Ở Việt Nam
những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng trong chẩn đoán
các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật này ở nước ta trong
tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và chẩn đốn vi sinh
vật so với phương pháp ni cấy cổ điển.
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... ii
TÓM TẮT NỘI DUNG........................................................................................ iii
MỤC LỤC
....................................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH VẼ ..................................................................................... vi
DANH SÁCH BẢNG BIỂU ................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................... vii
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1
CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH................................ 3
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH ............................................ 5
3.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH ........................................................... 5
3.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang .................................................. 6
3.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ .................................................................. 10
3.4. Lai giữa đầu dị và trình tự đích đặc hiệu ............................................... 11
3.5. Quan sát và xử lý tín hiệu ....................................................................... 11
CHƯƠNG 4. NHỮNG TRỞ NGẠI ĐỐI VỚI KỸ THUẬT FISH .................... 14
4.1. Kết quả khơng chính xác ........................................................................ 14
4.1.1. Các chất tự phát huỳnh quang......................................................... 14
4.1.2. Đầu dị thiếu tính đặc hiệu .............................................................. 15
4.2. Kết quả âm tính ....................................................................................... 16
4.2.1. Số lượng đầu dị q ít .................................................................... 16
4.2.2. Những cấu trúc phức tạp của đầu dị hay trình tự đích ................... 17
4.2.3. Hàm lượng rRNA thấp ................................................................... 17
iv
4.2.4. Ảnh chụp bị mất màu...................................................................... 18
4.3. Biện pháp khắc phục............................................................................... 18
CHƯƠNG 5. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT FISH ........................................ 19
5.1. Sự đa dạng của vi sinh vật ...................................................................... 19
5.2. Hệ vi sinh vật trong nước thải ................................................................ 22
5.3. Vi khuẩn cộng sinh ................................................................................. 23
5.4. FISH trong y học .................................................................................... 24
5.4.1. Các quần thể vi khuẩn phức tạp ...................................................... 24
5.4.2. Phát hiện mầm bệnh trong các mô cấy và dụng cụ vô trùng ........... 29
5.4.3. Nấm ................................................................................................ 30
5.4.4. Thuốc thú y ..................................................................................... 31
5.4.5. Các mầm bệnh ở thực vật ............................................................... 31
5.4.6. Phát hiện các mầm bệnh bằng phương pháp lai không sử dụng chất
huỳnh quang ................................................................................................ 32
CHƯƠNG 6. TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CỦA FISH................................... 33
6.1. Trên thế giới............................................................................................ 33
6.2. Tại Việt Nam .......................................................................................... 36
CHƯƠNG 7. TỔNG KẾT................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 40
v
DANH SÁCH HÌNH VẼ
Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH .....................................................4
Hình 2: Các cách đánh dấu đầu dị...........................................................................7
Hình 3: Kính hiển vi qt laze đồng tiêu .........................................................................11
Hình 4: Sự tự phát huỳnh quang của Paraformaldehyde trong các tế bào Candida
albicans ....................................................................................................................... 12
Hình 5: Kết quả hiển thị cho quá trình lai để phát hiện các vi khuẩn Bacillus ribotype
DA001 với ba chất nhuộm khác nhau trên một mẫu đất ............................................19
Hình 6: Nhuộm huỳnh quang các lớp vi khuẩn từ bệnh nhân viêm răng ......................... 22
Hình 7: FISH quan sát trên một màng sinh học sử dụng đầu dò EUB338 và TRE I .......23
DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dị tìm vi sinh vật bằng phương
pháp FISH ...........................................................................................................8
vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
ISH
:
In Situ Hybridization
FISH
:
Florescence In Situ Hybridization
rRNA
:
Ribosomal Ribonucleic Acid
DNA
:
Deoxyribonucleic Acid
PCR
:
Polymerase Chain Reaction
CCD
:
Charged Coupled Device
CLSM
:
Confocal Laser Scanning Microscope
TSA
:
Tyramid Signal Amplification
vii
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
Việc nhận biết sự có mặt của vi sinh vật trong mơi trường tự nhiên chủ yếu sử
dụng kỹ thuật nuôi cấy cổ điển bằng phương pháp cấy chuyền kết hợp với lựa chọn
môi trường đặc hiệu gặp khó khăn trong nghiên cứu các lồi vi sinh vật có tốc độ
sinh trưởng chậm hoặc chưa phân lập. Một nhược điểm nữa là tốn nhiều thời gian
và có tính chọn lọc cao. Hơn nữa, kỹ thuật này không phản ánh được sự mối tương
quan giữa đối tượng nghiên cứu với môi trường xung quanh [9].
Từ thực tế trên, nhiều kỹ thuật hiện đại ra đời như PCR, lai liên tiếp, lai trình tự,
tuy nhiên vẫn khơng khắc phục hồn tồn những nhược điểm kể trên của kỹ thuật
ni cấy cổ điển. Ngun nhân chính là để thực hiện những kỹ thuật này địi hỏi
phải có một lượng mẫu lớn, điều này nghĩa là cũng phải đi qua giai đoạn cấy
chuyền mất nhiều thời gian; và quan trọng hơn là các phương pháp hiện đại này chỉ
chứng minh sự có mặt của đối tượng nghiên cứu mà khơng cung cấp chính xác
thơng tin về hình thái, số lượng, không gian phân bố hay mối tương quan với môi
trường sống của vi sinh vật.
Kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hydridization) ra đời từ năm 1961 do hai nhóm
nghiên cứu độc lập Pardue, Gall và John đề xuất đã khắc phục được tất cả các vấn
đề kể trên. Tuy nhiên do tính khơng an tồn đối với con người, môi trường và khá
phức tạp trong thao tác mà kỹ thuật ISH đã được cải tiến thành FISH. Lai huỳnh
quang tại chỗ FISH (fluorescence in situ hydridization) từ khi ra đời đã trở thành
một công cụ mạnh nhất trong nghiên cứu của nhiều ngành khoa học, nổi bật nhất là
sinh thái học, mơi trường học, chẩn đốn và phát sinh loài.
FISH là một kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế bào
vi khuẩn. FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết môi
trường nuôi cấy đặc hiệu mà còn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ về
điều kiện và môi trường ni cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệ
thống phức tạp của các quần thể vi sinh vật. FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ
1
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình
dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô
bệnh. Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở
thành công cụ nghiên cứu hữu hiệu nhất.
Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong
môi trường tự nhiên, nổi bật là hệ vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden [88], tại vịnh
hẹp ở Na-uy [115], sinh vật phù du ở sông hoặc biển [6,52,73,82], tuyết hồ trên núi
cao [155], trong đất [37] và trên bề mặt rễ thực vật [92]. FISH đặc biệt phổ biến
trong y học, ngồi mục đích xác định các mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các
bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnh lây qua đường máu, ung thư…) FISH
cịn được sử dụng để chẩn đốn thường qui sự bất thường về cấu trúc và số lượng
nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của thai nhi.
Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng
trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật
này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và
chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển.
Nhận thức được vai trò, tầm quan trọng và triển vọng phát triển của FISH trong
nghiên cứu về thế giới vi sinh vật, tơi tiến hành đi vào tìm hiểu kỹ thuật này trong
khuôn khổ bài báo cáo đồ án môn học.
2
CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU
CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT FISH
Năm 1969 : kỹ thuật lai tại chỗ ISH (in situ hydridization) ra đời bởi hai nhóm
nhà khoa học độc lập Pardue, Gall và John. Trong phương pháp này, DNA hoặc
28S-RNA có đánh dấu phóng xạ được đem lai với DNA có trong nỗn bào chủng
vi khuẩn Xenopus, sau đó được dị tìm bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Kỹ thuật này
cho phép các chuỗi acid nucleic xâm nhập vào trong tế bào mà không làm chết tế
bào, làm thay đổi đến hình thái của tế bào hay tính tồn vẹn của các bộ phận bên
trong tế bào.
Khi phân tích ở cấp độ đơn bào bằng phương pháp lai tại chỗ có thể cung cấp
một bức tranh chi tiết hơn về vi sinh vật so với lai dot blot. Nó khơng chỉ xác định
được hình thái tế bào của một loài vi sinh vật chưa từng được ni cấy mà cịn
phân tích được sự phân bố khơng gian của chúng. Xác định số lượng các tín hiệu
phát ra bằng các oligonucleotide rRNA đích cho phép ước tính được tỷ lệ tăng
trưởng của các tế bào riêng lẻ.
Từ khi ra đời, ISH không ngừng được cải tiến nhằm nghiên cứu sự tiến hóa của
nhiễm sắc thể, phân tích các nhiễm sắc thể của các khối u, tế bào ung thư bạch cầu
và nghiên cứu di truyền học tế bào ở các loài.
Cuối cùng vào năm 1988, Giovanoni và cộng sự đã áp dụng thành công phương
pháp này trên vi khuẩn, họ là những người đầu tiên sử dụng các đầu dò
oligonucleotide rRNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ để phát hiện vi khuẩn
thơng qua kính hiển vi. Những năm sau đó, cùng với sự phát triển của các chất dán
nhãn huỳnh quang [76,109,110], kỹ thuật đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ đã dần
dần được thay thế bởi thuốc nhuộm huỳnh quang.
Năm 1989, DeLong lần đầu tiên sử dụng oligonucleotide được đánh dấu chất
huỳnh quang để dị tìm các vi sinh vật đơn bào. So với các đầu dị phóng xạ, đầu dị
huỳnh quang sử dụng an tồn hơn, ít gây hại đối với mơi trường và sức khỏe con
người, kết quả thu được chính xác hơn và khơng cần phải thực hiện bước dị tìm (vì
3
CHƯƠNG 2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU
nhìn thấy trực tiếp). Hơn thế nữa, các đầu dị huỳnh quang có thể được đánh dấu
với nhiều chất nhuộm, phát xạ tại những bước sóng khác nhau, vì vậy có thể dị tìm
một vài trình tự đích chỉ với một lần lai. Độ nhạy, sự chính xác và thời gian tiến
hành ngắn là những ưu điểm nổi trội của FISH, giúp nó ngày càng phổ biến và
được áp dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học nghiên cứu về vi sinh vật.
4
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH
3.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH
FISH dị tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật
mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với
các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần
phá vỡ tế bào).
Quy trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản sau:
-
Chuẩn bị mẫu và đầu dò.
-
Cố định mẫu.
-
Lai giữa đầu dị và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào.
-
Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dị khơng được lai.
-
Dị tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang
trực tiếp).
-
Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.
Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH
5
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
3.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang
Lựa chọn đầu dò: Như đã được đề cập từ trước, các trình tự đích được sử dụng
phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng
bản sao nhiều và cấu trúc được bán bảo tồn. Các đầu dò oligonucleotide ứng với
mỗi cấp độ phân loại, giữa các loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, cho đến các
chi và lồi cụ thể đều có thể thiết kế được dựa theo kích thước của rRNA đích
[10,53]. Với sự tăng lên nhanh chóng của các đoạn thơng tin di truyền trong các cơ
sở dữ liệu chung và thương mại [93,145], đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận
biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác. Điều này đặc
biệt có ý nghĩa khi tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay các sinh vật chưa
từng nuôi cấy đặc hiệu. Số lượng lớn các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần sao
chép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào ln cung cấp đủ số
lượng các trình tự đích để hiển thị được các dịng tế bào cụ thể, ngay cả các
oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH. Việc lựa
chọn vị trí trình tự đích và q trình thiết kế đầu dị phải được tiến hành với sự thận
trọng cao nhất. Gần đây, các trình tự đích khác như rRNA 23S [10,82,94,104,143],
rRNA 18S [83,86,87,133] và gần đây là mRNA cũng đã được xác định thành cơng
bởi thí nghiệm FISH.
Việc lựa chọn đầu dị để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ
nhạy và khả năng xâm nhập vào trong tế bào. Một đầu dị oligonucleotide điển hình
thì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tự
động. Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiếp cận được với trình tự đích, nhưng chúng lại
mang được ít các trình tự đánh dấu. Trong FISH, các trình tự đích thơng dụng nhất
là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và
số lượng các bản sao nhiều. Do đó, các đầu dị được lựa chọn thường là các
oligonucleotide rRNA 16S để đảm bảo sự liên kết bổ sung đạt hiệu quả cao nhất
trong quá trình lai. Các đầu dò oligonucleotide huỳnh quang ngày nay đã có một số
sản phẩm được thương mại hóa. Chúng có thể lưu trữ được ở -200C trong tối
khoảng vài tháng.
6
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
Có nhiều cách để đánh dấu đầu dò, đánh dấu trực tiếp chất nhuộm huỳnh quang
lên đầu dị là cách thơng dụng nhất, nhanh nhất, rẻ nhất và dễ dàng thực hiện nhất
bởi vì chúng khơng địi hỏi phải tiến hành các bước dị tìm sau quá trình lai. Một
hoặc nhiều phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được liên kết trực tiếp với
oligonucleotide trong suốt q trình tổng hợp thơng qua liên kết amino ở đầu 5’
của đầu dị (hình 2a), hoặc sử dụng enzyme Terminal transferase để gắn các
nucleotide có đánh dấu huỳnh quang vào đầu 3’ của đầu dị (hình 2b) [100]. Ngồi
ra, một số thuốc nhuộm như Flourescein-Isothiocyanate (FITC) nếu được gắn vào
oligonucleotide theo một dải đệm 18 carbon thì có thể làm tăng cường độ tín hiệu
so với các đầu dị được đánh dấu trực tiếp [31]. Sự tăng lên về tín hiệu huỳnh
quang cũng được biểu hiện trên những đầu dò được gắn nhãn chất huỳnh quang
trên cả hai đầu, một phân tử ở đầu 3’ và 4 phân tử ở đầu 5’ được sử dụng như
những miếng đệm thích hợp để ngăn chặn sự che khuất lẫn nhau của các tín hiệu
huỳnh quang [133].
Trong một số trường hợp, việc dị tìm theo cách gián tiếp thì có hiệu quả hơn.
Người ta thấy rằng, có thể tăng độ nhạy của thí nghiệm FISH lên bằng cách kết hợp
các đầu dị với những chất chỉ thị như Digoxygenin (DIG), sau đó chúng sẽ được
dị tìm thơng qua một chất phản huỳnh quang (Hình 2c) [162]. Độ nhạy của FISH
cịn có thể được tăng lên đáng kể khi sử dụng enzyme nhằm khuếch đại tín hiệu.
Phương pháp này được phát triển bởi Kagiyama và cộng sự (1993) khi nghiên cứu
về di truyền học tế bào, sau đó được Yamaguchi và cộng sự thay đổi để áp dụng
vào định danh vi khuẩn (1996). Ban đầu, mỗi oligonucleotide vẫn sẽ được đánh
dấu bằng digoxygenin như trên, sau đó được dị tìm bằng một thể kháng
digoxygenin, kháng thể này tiếp tục được liên kết với enzyme phosphatase kiềm.
Enzyme này chuyển hóa HNPP (2-hydroxy-3-naphtoic acid-2’-phenylanilide
phosphate) thành dạng Dephosphoryl, thể này tạo ra màu huỳnh quang đỏ sáng khi
kết hợp với Fast Red TR. Tín hiệu huỳnh quang thu được theo cách thực hiện này
có cường độ mạnh hơn 8 lần so với tín hiệu của các oligonucleotide chỉ gắn nhãn
huỳnh quang duy nhất. Phương pháp khuếch đại tín hiệu bằng enzym ngày càng
7
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
được cải tiến tốt hơn nhờ vào một kỹ thuật được gọi là “hệ thống khuếch đại tín
hiệu Tyramide” (TSA) (Hình 2d). Hệ thống TSA làm tăng cường độ tín hiệu lên
khoảng 10 – 20 lần. Tuy nhiên, số lượng các tế bào được lai thành công đã giảm đi
một cách rõ ràng so với việc sử dụng đầu dị thơng thường được đánh dấu duy nhất
một chất huỳnh quang. Điều này xảy ra là do quá trình xâm nhập của các chất cao
phân tử vào trong tế bào vi khuẩn bị hạn chế hơn những chất nhuộm thông thường.
Mặc dù enzyme lysozyme đã giúp cải thiện tính thấm của các đầu dị vào trong tế
bào, dẫn tới cường độ tín hiệu được nâng cao, nhưng phương pháp này dường như
không áp dụng được với một số lồi vi khuẩn Gram dương, do đó phương pháp này
chủ yếu được dùng để phân tích các quần thể vi khuẩn tạp.
Hình 2: Đánh dấu trực tiếp (a) và (b); đánh dấu gián tiếp sử dụng DIG (c), TSA (d) hay đầu dò
polyribonucleotide (e) (Moter et al., 2000).
Độ nhạy của FISH khi áp dụng trên các mẫu tự nhiên sẽ tăng lên đáng kể khi sử
dụng đầu dò polyribonucleotide được đánh dấu bằng một số phân tử huỳnh quang
[30].
Có lẽ phương pháp hiệu quả nhất là kết hợp việc sử dụng các đầu dò
polyribonucleotide, được đánh dấu với digoxygenin, đồng thời sử dụng hệ thống
8
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
khuyếch đại tín hiệu tyramide (TSA). Kỹ thuật này đã được ứng dụng thành công
khi dị tìm và phát hiện trực quan các độc tố trong Listeria (Hình 2e) [149].
Lựa chọn thuốc nhuộm huỳnh quang: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang
đều có các mức năng lượng kích thích và phát xạ tối đa khác nhau nên cho phép
phát hiện đồng thời hai hoặc nhiều vi sinh vật khi chỉ lai một lần duy nhất. Cùng
với việc quan sát trực quan bằng kính hiển vi đa màu FISH, các bộ lọc màng nhiều
dải cũng có thể được sử dụng. Các chất huỳnh quang tổng hợp có những điểm phát
xạ sắc nét khác nhau nên sẽ loại bỏ được hiện tượng các phổ huỳnh quang chồng
lên nhau giữa các đầu dò, đồng thời hạn chế các vấn đề về màu nền và sự dây,
nhem màu. Chất màu huỳnh quang có màu sáng nhất và bền quang học nhất nên sử
dụng để dị tìm các trình tự đích mà lượng mẫu rất ít. Các chất nhuộm thường sử
dụng cho FISH trong vi sinh vật học là fluorescein-derivates (FluoresceinIsothiocyanate
(FluoX))
(FITC),
và
5(6)carboxyfluorescein-N-hydroxysuccimide-ester
rhodamine-derivates
(Tetramethyl-Rhodamine-Isothiocyanate
(TRITC), Texas Red), ngồi ra cịn có các loại thuốc nhuộm cyanine khác như là
Cy3 và Cy5 (Bảng 1).
Bảng 1: Một số thuốc nhuộm được sử dụng để dị tìm vi sinh vật bằng phương pháp FISH
Tên thuốc nhuộm
Bước sóng
Màu
Kích thích (nm)
Phát xạ (nm)
AMCA
351
450
Xanh dương
FITC*
492
528
Xanh lá cây
FluoXE**
488
520
Xanh lá cây
TRITC***
557
576
Đỏ
Texas Red
578
600
Đỏ
Cy3
550
570
Cam/Đỏ
Cy5
651
674
Hồng ngoại
Bước sóng có thể thay đổi ít nhiều tùy thuộc vào nhà sản xuất. Quang phổ phát xạ
có thể thay đổi trong các dung mơi khác nhau hoặc đặc tính của mẫu.
*FITC : Fluorescein–isothiocyanate
9
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
**FluoXE : 5-(-6-)carboxyfluorescein–N-hydroxysuccimideester
***TRITC : Tetramethyl–rhodamine–isothiocyanate
3.3. Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ
Trước khi tiến hành lai, mẫu chứa vi sinh vật và các đầu dò phải được ngâm
trong các hợp chất tạo tủa như ethanol hoặc methanol, hợp chất tạo được liên kết
ngang như aldehyde hoặc hỗn hợp các chất trên để các đầu dị huỳnh quang có thể
thấm vào bên trong tế bào và bảo vệ các rRNA khơng bị biến tính bởi các RNAse
nội bào. Các điều kiện và phương pháp cố định mẫu có thể khác nhau tùy thuộc
vào vi sinh vật đích và loại mẫu. Q trình cố định mẫu tối ưu sẽ đưa được số
lượng lớn các đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối đa số lượng các trình tự đích
RNA, đồng thời bảo quản tồn vẹn cấu trúc tế bào và hình thái của chúng. Cố định
đầu dò vào mẫu hiệu quả sẽ ảnh hưởng rất tích cực đến kết quả của FISH, nhưng
việc cố định rất khó để có thể tối ưu hóa. Thơng thường một lượng dung dịch
formaldehyde hoặc paraformaldehyde 3-4% (v/v) thì phù hợp cho hầu hết các loại
vi khuẩn Gram âm. Đối với các vi khuẩn Gram dương, sử dụng ethanol (50%), hỗn
hợp ethanol/formalin (tỉ lệ 9:1 v/v) hoặc xử lý nhiệt là những biện pháp thơng dụng
nhất; ngồi ra có thể bổ sung thêm bước xử lý sơ bộ để tăng tính thấm của đầu dị.
Trong một số trường hợp, như trong các tế bào Gram dương, khi xử lý bằng
enzym lysozyme, lysostaphin, hoặc hỗn hợp các enzyme có thể sẽ cần thiết để tách
peptidoglycan. Đối với lồi Actinomycetales có chứa acid mycolic như phức hệ
Mycobacterium, Norcardia hoặc Microthrix parvicella, hiệu quả khi sử dụng các
kỹ thuật thẩm thấu như thủy phân bằng acid yếu HCl 1M hoặc xử lý với
Mutanolysin hay 1,4 dithio-L-threitol [35,91,127] đã được kiểm định. Đối với các
mẫu có tỷ lệ G + C cao, quá trình cố định mẫu và thao tác xử lý sơ bộ phụ thuộc
vào giống vi sinh vật, và kỹ thuật phân tích các mẫu nhiễm tạp tự nhiên có chứa
các vi khuẩn này vẫn cịn gặp khó khăn [91,116].
Khi áp dụng phương pháp FISH trên mẫu chứa nhiều đoạn mô khác nhau, các
quá trình tiền xử lý bắt buộc phải được áp dụng để tăng khả năng tiếp cận của các
đầu dị đối với các trình tự đích tương ứng, đồng thời hạn chế được các liên kết
10
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
không đặc hiệu. Gần đây, FISH đã được áp dụng trên các mẫu mô tế bào được
ngâm trong dung dịch keo lạnh [101]. Trong các chất dẻo này, sự hiển thị của vi
khuẩn và sự bảo vệ cấu trúc của mô của các tế bào rất hồn chỉnh mà khơng hề có
bất cứ q trình tiền xử lý nào.
3.4. Lai giữa đầu dị và trình tự đích đặc hiệu
Trước khi tiến hành lai, các tế bào sau giai đoạn xử lý kể trên được cố định vào
một mặt kính. Để q trình gắn mẫu vào mặt kính được tốt hơn, người ta khuyên
nên xử lý bề mặt kính trước bằng cách phủ lên mặt kính một lớp chất tráng kính
ngồi. Các hóa chất được sử dụng cho hiệu quả tốt là gelatin [8], poly-L-lysine [80]
hay các hợp chất tạo muối [101].
Quá trình lai phải được thực hiện trong những điều kiện hết sức nghiêm ngặt
nhằm kết hợp chính xác các đầu dị đánh dấu huỳnh quang với trình tự đích bổ
sung với chúng. Đối với thao tác quan trọng nhất trong thí nghiệm FISH, quá trình
làm nóng sơ bộ các phân tử lai phải được thực hiện để các đầu dò huỳnh quang kết
hợp bổ sung với các trình tự RNA đích tương ứng. Sự chính xác khi bắt cặp bổ
sung có thể được điều khiển bằng cách thay đổi nồng độ formamide hay nhiệt độ
của q trình. Formamide sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy của phân tử bằng cách
làm suy yếu liên kết hydro, từ đó cho phép tiến hành q trình nhuộm ở nhiệt độ
thấp những vẫn đảm bảo độ chính xác cao.
Q trình lai xảy ra trong mơi trường tối ẩm, nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC.
Thời gian lai có thể kéo dài từ 30 phút đến vài giờ. Sau đó, rửa mẫu bằng nước cất
để loại bỏ các đầu dị khơng liên kết được với trình tự đích. Cuối cùng, rửa lại với
nước một lần nữa, sấy và cố định các phân tử lai, có thể bổ sung thêm các chất
chống phai màu.
3.5. Quan sát và xử lý tín hiệu
Để có thể quan sát được các tín hiệu huỳnh quang đa sắc trong thí nghiệm
FISH, kính hiển vi thơng thường sẽ được trang bị thêm một bộ lọc dải hẹp nhiều
11
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
tần. Ngoài ra, để thu nhận và phân tích được các hình ảnh đó cần phải sử dụng một
máy ảnh CCD (charged coupled device) kết hợp với phần mềm phân tích xử lý ảnh
kỹ thuật số. Đây là hệ thống cảm biến chính xác nhất hiện nay và nó rất hữu dụng
khi quan sát những mẫu vi sinh vật quan trọng, những nơi có cường độ tín hiệu
thấp. Hệ thống này cũng đã được sử dụng để kiểm tra số lượng các tế bào vi sinh
vật [83] và xác định hoạt tính các dịng tế bào đơn trong màng sinh học thông qua
việc xác định hàm lượng rRNA [111]. Gần đây, phương pháp phân tích sự phân bố
không gian của vi khuẩn đã được cải tiến hơn nữa khi sử dụng kính hiển vi quan
sát huỳnh quang dải rộng [96]. Một loại kính hiển vi khác được sử dụng cho thí
nghiệm FISH là kính hiển vi quét laze đồng tiêu (CLSM). Thông qua việc hạn chế
hệ thống tín hiệu trong những khoảng hẹp của đối tượng nghiên cứu, các tín hiệu
huỳnh quang bị lệch tiêu sẽ bị loại bỏ, tạo ra những hình ảnh rõ nét. Điều này rất
hữu dụng cho mẫu có độ phân bố dày đặc, như các lớp bùn, màng sinh học hay
đoạn mơ [50,79,95,101,147,148]. Hiện nay, một số gói phần mềm được lập trình
sẵn cho phép tái tạo hình ảnh ba chiều. Tuy nhiên, do nhanh chóng tẩy trắng các tín
hiệu lệch tiêu, nên khi sử dụng kính hiển vi quét laze đồng tiêu thường địi hỏi chất
lượng tín hiệu huỳnh quang cao hơn. Các tín hiệu huỳnh quang trong phương pháp
FISH cịn có thể thu được khi sử dụng kỹ thuật đếm tế bào theo dòng chảy, đây là
một kỹ thuật cho đếm, kiểm tra, và phân loại các hạt nhỏ lơ lửng trong một dịng
chất lỏng. Do đó, phương pháp này không đưa ra được bất cứ thông tin về hình thái
hay sự phân bố khơng gian của vi sinh vật, nó chỉ thực sự phát huy hết khả năng
khi phân tích định lượng tự động, phân tích vi khuẩn trong dịch huyền phù hay hỗn
hợp vi sinh vật phù du và nó chỉ thực hiện được khi các đối tượng vi sinh vật có tần
số cao [7,131,150,152].
12
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN
Hình 4. Kính hiển vi
qt laze đồng tiêu
13
