Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của lá cây gai (boehmeria nivea l gaudich)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

TRẦN THỊ QUỲNH HOA

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ
ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO

CỦA LÁ CÂY GAI
( Boehmeria nivea L. Gaudich)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

TRẦN THỊ QUỲNH HOA

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA VÀ
ỨC CHẾ ENZYM XANTHINE OXIDASE IN VITRO

CỦA LÁ CÂY GAI
( Boehmeria nivea L. Gaudich)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa: QH.2015.Y
Người hướng dẫn 1: PGS.TS BÙI THANH TÙNG
Người hướng dẫn 2: ThS. NGUYỄN THỊ HUYỀN

HÀ NỘI - 2020


LỜI CẢM ƠN
Được làm và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, tôi cảm thấy
vô cùng biết ơn sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, bạn bè và người thân.
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tới
PGS.TS Bùi Thanh Tùng, ThS. Nguyễn Thị Huyền – hai thầy cô giáo đã luôn
quan tâm, giúp đỡ, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Y Dược đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi
được học tập trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường và cho phép tôi thực
hiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo bộ môn Dược lý
– Dược lâm sàng, Hóa dược – Kiểm nghiệm, Bào chế, Dược cổ truyền đã nhiệt
tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện
khóa luận.
Lời cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh,
ủng hộ, động viên, góp ý để tôi hoàn thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 10 tháng 06 năm 2020
Sinh viên

Trần Thị Quỳnh Hoa


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AMP

Adenosine monophosphate

ATP

Adenosine triphosphat

B.
nivea

Boehmeria nivea (L.) Gaudich

DMSO
DPPH
FAD
GMP
HPLC

Dimethyl sulfoxid
1,1-Diphenyl-2 picrylhydrazyl
Dinucleotide adenine flavin
Guanine monophosphate
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(high-performance liquid chromatography)

Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose)
LD50
OD
PNP
XO
XOR
TCNSX

Mật độ quang
Purine nucleoside phosphorylase
Xanthine oxidase
Xanthin oxyoreductase
Tiêu chuẩn nhà sản xuất


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Acid uric.................................................................................................3
Hình 1.2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể........................................... 4
Hình 1.3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase...................................................8
Hình 1.4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase.................................................9
Hình 1.5: Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich)........................................... 15
Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B. Nivea...............................................17
Hình 2.1: Cây lá gai tại Mê Linh, Hà Nội............................................................21
Hình 2.2: Cao toàn phần ethanol lá Gai...............................................................22
Hình 2.3: Quy trình chiết xuất dược liệu.............................................................23
Hình 2.4: Sơ đồ quy trình thí nghiệm.................................................................. 29
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử................32
Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của Acid ascorbic………...33

Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử……......35
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của Allopurinol…….......35


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các thuốc và hóa chất cần thiết……………………………………...23
Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các
mẫu thử................................................................................................................ 27
Bảng 3.1: Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử..........................................31

Bảng 3.2: Bảng giá trị IC50 tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử..............343
Bảng 3.3: Tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử………………………..34
Bảng 3.4: Bảng giá trị IC50 tác dụng ức chế XO của các mẫu thử…………… ..36


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ..........................................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ....................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ............................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG .......................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG I - TỔNG QUAN...............................................................................3
1.1. Tăng acid uric máu....................................................................................3
1.1.1. Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric..................................................3
1.1.2. Tăng acid uric máu................................................................................ 4
1.2. Enzym xanthine oxidase..........................................................................6
1.2.1. Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric6
1.2.2. Cấu trúc, đặc điểm lý hóa......................................................................7
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase .....9
1.2.4. Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase...................................10
1.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro .10
1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa......................11
1.3.1. Khái quát..............................................................................................11
1.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro......................13
1.4. Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich)............................................ 14
1.4.1. Tổng quan............................................................................................14
1.4.2. Đặc điểm thực vật................................................................................14
CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............21
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 21
2.1.1. Dược liệu nghiên cứu.......................................................................... 21

2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu..............................................................21
2.1.3. Thuốc, hóa chất....................................................................................23


2.1.4. Máy móc, thiết bị, dụng cụ..................................................................24
2.2. Nội dung nghiên cứu...............................................................................24
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................... 25
2.3.1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai
theo phương pháp DPPH...............................................................................25
2.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn
dịch chiết từ lá cây gai...................................................................................26

2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu...................................................................30
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ...................................................................................31
3.1. Kết quả chiết xuất dược liệu.....................................................................31
3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá
cây gai theo phương pháp DPPH.....................................................................31
3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của cao
chiết phân đoạn lá Gai......................................................................................33
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN.................................................................................37
4.1. Về kết quả chiết xuất dược liệu.................................................................37
4.2. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ
lá cây gai theo phương pháp DPPH.................................................................37
4.3. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các
phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai....................................................................38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT...............................................................................41
KẾT LUẬN..........................................................................................................41
ĐỀ XUẤT............................................................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong vài thập kỷ qua, tỷ lệ tăng acid uric máu đang gia tăng nhanh chóng
trong dân số thế giới. Bằng chứng nổi bật cho thấy tăng acid uric máu phổ biến
không chỉ ở các nước phát triển [55, 71] mà còn gia tăng ở các nước thu nhập
thấp và trung bình với tần suất cao [24, 38], trong đó có Việt Nam. Một số
nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng acid uric máu có liên quan đến một số
bệnh bao gồm đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết áp, bệnh
tim mạch và hội chứng chuyển hóa [25, 32, 70, 72]. Đặc biệt, tăng acid uric máu
đã được biết từ rất lâu là yếu tố nguy cơ hàng đầu của bệnh gout [45, 66].
Ngoài ra, khi tăng acid uric máu sẽ gây ra tình trạng stress oxy hóa ở bệnh
nhân gout [13]. Xanthine oxidase (XO) là một enzym quan trọng, xúc tác phản
ứng chuyển hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric. Hoạt
động của enzym XO là nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do, góp phần
gây tổn thương đến nhiều quá trình bệnh lý bao gồm viêm, xơ vữa động mạch,
ung thư, lão hóa và bệnh gout [49, 50]. Do đó, ức chế hoạt động của XO dẫn đến
giảm nồng độ acid uric và giảm sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS).
Từ xa xưa con người đã khám phá được sức mạnh thiên nhiên, biết sử
dụng nhiều loài thực vật nhằm mục đích chữa bệnh và được đúc kết trong các
kinh nghiệm dân gian trong những bài thuốc y học cổ truyền dùng để điều trị các
chứng bệnh, trong đó có thống phong (bệnh gout). Cây lá gai có tên khoa học là
Boehmeria nivea (L.) Gaudich có chứa nhiều hợp chất như phenolic, flavonoid,
vitamin, khoáng chất…[14, 21, 23, 61] xuất hiện trong các bài thuốc y học cổ
truyền để điều trị các bệnh như lợi tiểu, cầm máu và biết đến với tác dụng chống
viêm, bảo vệ gan.
Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu khoa học được công
bố về tác dụng điều trị bệnh gout, khả năng chống oxy hóa cũng như ức chế
enzym XO của lá cây Gai. Vì vậy, chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Đánh giá
tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym Xanthine Oxidase in vitro của lá cây
Gai (Boehmeria nivea L. Gaudich) với mục tiêu:

1


1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây
gai theo phương pháp DPPH.
2. Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các phân đoạn dịch chiết
từ lá cây gai.

2


CHƯƠNG I - TỔNG QUAN
1.1. Tăng acid uric máu
1.1.1. Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric
Acid uric là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng từ nhóm purin ngoại sinh và
chuyển hóa purin nội sinh [74]. Trong số các yếu tố bên ngoài ảnh hưởng đến
việc sản xuất acid uric, chế độ ăn uống đóng vai trò quan trọng. Thực tế này đã
được các nhà điều tra châu Âu ghi nhận từ kinh nghiệm của họ trong hai cuộc
chiến tranh thế giới và được chứng minh thông qua sự gia tăng của bệnh gout ở
Nhật Bản kể từ Thế chiến thứ II (Lượng protein trên đầu người đã tăng gấp đôi
trong thời kỳ hậu chiến ở nước này) [56]. Việc sản xuất acid uric nội sinh chủ
yếu từ gan [42, 69, 74], ruột và các mô khác như cơ bắp, thận và nội mô mạch
máu [69, 74]. Ở người bình thường, acid uric được bài tiết chủ yếu qua thận
(chiếm 2/3 tổng lượng acid uric được tạo ra mỗi ngày) [69, 74]. Tuy nhiên, một
tỷ lệ nhỏ hơn nhưng đáng kể, acid uric được bài tiết trong dịch tiêu hóa vào ruột.
Ít hơn 1% của tổng lượng acid uric được bài tiết qua mồ hôi [56].
Acid uric là một hợp chất hữu cơ dị vòng có công thức C 5H4N4O3 (7,9dihydro-1H-purine-2,6,8 (3H) -trione), trọng lượng phân tử 168 Dalton.

Hình 1. 1: Acid uric
Nhiều enzym có liên quan đến việc chuyển đổi hai purin acid nucleic là

adenin và guanin thành acid uric như deaminase, nucleotidase (NT), purin
nucleoside phosphorylase (PNP), xanthin oxidease (XO), hypoxanthine-guanin
phosphoribosyl transferase (HGPRT) [33, 74]
3


Hình 1. 2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [33].
1.1.2. Tăng acid uric máu
1.1.2.1. Định nghĩa
Tăng acid uric máu khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn tối đa của độ
hòa tan của urat trong dung dịch có nồng độ natri như huyết tương, cụ thể là:
Trên 7,0 mg/dl (tức trên 420 mol/l) đối với nam giới và trên 6,0 mg/dl (360
mol/l) đối với nữ giới [5].
1.1.2.2. Dịch tễ học
▪ Tại Mỹ, tỷ lệ tăng acid uric máu (> 0,40 mmol/l hoặc 6,8 mg/dl) là 14,6%
dân số (ước tính 32,5 triệu người), phổ biến hơn ở nam giới (24,7%) so
với nữ giới (5,2%). Tăng acid uric máu ở người Mỹ gốc Mexico ít phổ
biến hơn so với người da trắng và người Mỹ gốc Phi [55].
▪ Tại Trung Quốc, tỷ lệ tăng acid uric máu chiếm 18,1% dân số, trong đó,
16,0% đối với nam giới và 19,4% đối với nữ giới. Tỷ lệ tăng acid uric máu
4


của người Hán thấp hơn một chút so với các nhóm dân tộc khác (18,0% so
với 19,5%) [41].
▪ Tại Nhật Bản, trong nghiên cứu Yamagata (2016) về “Nồng độ acid uric
huyết thanh và tỷ lệ tử vong trong dân số Nhật Bản” đã chỉ ra rằng tỷ lệ
tăng acid uric máu là 17,4% ở nam giới và 2,2% ở nữ giới [73].
▪ Tại Việt Nam, nghiên cứu về mối liên hệ giữa tăng acid uric máu với bệnh
tiểu đường type 2 trong dân số Việt Nam, nhóm tác giả đã chỉ ra rằng tăng

acid uric máu cao hơn nhiều trong nhóm người bị rối loạn đường huyết lúc
đói, nhóm rối loạn đường huyết lúc đói kết hợp với rối loạn dung nạp
glucose, nhóm người tiểu đường so với nhóm dung nạp glucose bình
thường. Nồng độ acid uric không có sự khác biệt đáng kể giữa hai nhóm
dung nạp glucose bình thường và nhóm dung nạp glucose kém. Nam giới
có tỷ lệ tăng acid uric máu cao hơn so với nữ giới trong nhóm dung nạp
glucose bình thường, nhóm rối loạn đường huyết lúc đói và nhóm tiểu
đường [68].
Như vậy, sự tăng acid uric có sự khác nhau giữa các quốc gia, tộc người,
giữa người bình thường và những người có bệnh lý mắc kèm. Tuy nhiên, đa
số tỷ lệ tăng acid uric ở nam giới cao hơn nữ giới.
1.1.2.3. Nguyên nhân tăng acid uric máu
Nguyên nhân gây tăng acid uric máu là do tăng sản xuất acid uric, thận
giảm bài tiết acid uric hoặc kết hợp cả hai nguyên nhân trên [42, 74].
Tăng tổng hợp acid uric (dưới 5%) bao gồm: khiếm khuyết enzym, hoạt
động quá mức của phosphoribosilpyrophosphate synthetase, giảm hoạt động của
hypoxanthine phosphoribosiltransferase, bệnh lưu trữ glycogen (loại I, III, V,
VII), tình trạng bệnh dẫn đến sản xuất quá mức purine, rối loạn tủy, bệnh ác tính,
tan máu, bệnh vẩy nến, tăng dị hóa hoặc giảm tổng hợp ATP, nghiện rượu, thiếu
oxy mô, tập thể dục cơ bắp quá mức, liên kết với thuốc hoặc thói quen ăn uống,
vitamin B12, fructose, tiêu thụ purine quá mức.

5


Giảm bài tiết acid uric ở thận (trên 95%) bao gồm: khiếm khuyết di
truyền của chức năng ống thận (không xác định), tình trạng bệnh dẫn đến giảm
bài tiết acid uric, suy thận, mất nước, nhiễm toan (thiếu oxy mô), bệnh cường
cận giáp, suy giáp, hội chứng Bartter, sản giật, liên kết với thuốc hoặc thói quen
ăn uống, thuốc lợi tiểu, ethanol, pyrazinamid, lạm dụng thuốc nhuận tràng,

salicylat (liều thấp).
Tăng tổng hợp và giảm đào thải acid uric bao gồm: nghiện rượu, thiếu
men Glucose-6-phosphatase, thiếu men Fructose-1-phosphate-aldolase.
1.1.2.4. Hậu quả tăng acid uric máu
▪ Tăng acid uric máu và bệnh gout
Khi nồng độ acid uric trong máu lớn hơn 7 mg/dl, vượt quá nồng độ hòa
tan tối đa, urat kết tủa thành các vi tinh thể mono sodium urat. Sự lắng đọng của
các hạt này ở các vị trí khác nhau gây ra các tổn thương khác nhau. Các vi tinh
thể urat lắng đọng tại mô mềm, bao gân tạo nên hạt tophi. Sự khởi phát cơn gout
cấp xảy xa khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ; sự lắng đọng vi tinh thể cạnh
khớp, màng hoạt dịch khớp, trong mô sụn và mô xương sẽ dẫn đến bệnh xương
khớp mạn tính do gout, và cuối cùng, viêm thận kẽ (bệnh thận do gout) là do tinh
thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận [5].
▪ Tăng acid uric máu và các bệnh khác liên quan
Một số nghiên cứu dịch tễ học chỉ ra rằng tăng acid uric máu có liên quan
đến một số bệnh bao gồm đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết
áp, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa [25, 32, 70, 72].
Như vậy, hạ acid uric máu là một mục tiêu điều trị trong bệnh gout và các
bệnh lý khác liên quan đến tăng acid uric máu.
1.1.3. Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric
Năm 1902, Schardinger và các đồng nghiệp đã báo cáo về một chất chưa
xác định có trong sữa tươi nguyên chất có thể làm mất màu xanh metylen khi bổ
sung formaldehyd. Gần 20 năm sau, chất này cũng được tìm thấy trong sữa bò,
6


trong gan, thận, lá lách và phổi của chuột, có khả năng oxy hóa hypoxanthin
thành xanthin và sau đó xanthin thành urate trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí.
Những phát hiện này đã thúc đẩy rất nhiều sự quan tâm từ các nhà nghiên cứu
enzym và sinh hóa, dẫn đến sự phân lập, tinh chế và nghiên cứu về xanthin

oxyoreductase (XOR) [43].
Thực tế, enzym XO được tìm thấy trên nhiều động vật có vú [15, 47],
chim, bò sát, vi khuẩn. Trong tất cả các động vật có vú được nghiên cứu, enzym
XO có trong gan, ruột, thận, phổi, cơ tim, não, huyết tương và hồng cầu, và các
mô khác. Trong đó, gan và ruột có hoạt động XOR cao nhất [19] .
.Xanthine oxidase là một enzym có vai trò quan trọng trong quá trình tạo
ra acid uric. Dưới tác dụng xúc tác của enzym XO, hypoxanthin được chuyển
thành xanthin và xanthin được chuyển hóa thành acid uric. Ức chế XO sẽ làm
giảm nồng độ acid uric, dẫn đến tác dụng chống tăng acid uric [67]. Ngày nay,
việc kiểm soát nồng độ acid uric là một yếu tố quan trọng trong phòng ngừa và
điều trị các bệnh liên quan đến tăng acid uric và gout [27].
1.2. Enzym xanthine oxidase
1.2.1. Cấu trúc, đặc điểm lý hóa
Xanthine oxidase là một protein có khối lượng khoảng 300 kDa, gồm 2 tiểu
đơn vị [18, 30]. Mỗi tiểu đơn vị gồm 4 trung tâm oxy hóa khử : một phần phụ
molybden (Mo-co), một FAD và hai Fe2S2 (trung tâm Fe/S). Phần phụ của
molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tử
lưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxy và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác.

7


Hình 1. 3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase
FAD (màu đỏ), Fe2S2 (màu cam), phần phụ molypden (màu vàng)
Cơ chế hoạt động:
Enzym XO xúc tác quá trình hydroxyl hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành
acid uric tại trung tâm Mo-co. Ở trạng thái oxy hóa, proton từ nhóm VI
Mo-OH tấnIVcông trung tâm ái
nhân của cơ chất, hai electron được chuyển đến nguyên tử Mo (Mo đến Mo ) của Mo-co. Sự
vận chuyển electron đến FAD thông qua hai trung tâm Fe/S được chuyển tiếp nhanh chóng và tạo

V
ra Mo . Sau đó, được tái sinh bởi hydroxyd từ dung môi khi kết thúc phản ứng [57].

8


Hình 1. 4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase [20]
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase
Nồng độ cơ chất: Khi nồng độ cơ chất xanthin tăng thì tốc độ phản ứng
tăng, lượng acid uric tạo ra càng nhiều. Tuy nhiên đến một mức nào đó, tốc độ
phản ứng sẽ không tăng thêm nữa khi enzym đã bão hòa cơ chất [7].
Nồng độ enzym: Khi nồng độ enzym tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy
nhiên, nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ
tác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng bão hòa và tốc độ phản
ứng sẽ không tăng lên nữa [7].
Nhiệt độ: Hoạt động của enzym phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Thông thường, khi tăng 100C thì tốc độ phản ứng tăng lên 2-3 lần [35]. Tuy
nhiên, nhiệt độ quá cao enzym sẽ bị biến tính. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng trong quá trình bảo quản enzym. XO được bảo quản ở nhiệt độ 2- 8oC [54].

9


pH: pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym. Với XO, pH thích hợp từ
7,5-8,0 [16].
1.2.3. Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase
Allopurinol (1,5-dihydro-4H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-one) ban đầu
được Falco tổng hợp vào giữa những năm 50 của thế kỷ trước trong một nỗ lực
để tạo ra các chất chống ung thư mới, nhưng nó đã được tìm thấy có hoạt tính ức
chế xanthine oxidase, làm giảm cả nồng độ acid uric trong huyết thanh và nước
tiểu. Năm 1963, Rundles và đồng nghiệp lần đầu tiên đã thử nghiệm lâm sàng
thành công về việc sử dụng allopurinol trong điều trị bệnh gout. Thuốc đã được

FDA chấp thuận vào năm 1966 [19].
Cả allopurinol và oxypurinol (chất chuyển hóa chính của nó) đều ức chế
enzym xanthine oxidase, do đó làm giảm sinh tổng hợp acid uric dẫn đến giảm
nồng độ acid uric máu, thúc đẩy sự thanh thải hypoxanthin và xanthin qua nước
tiểu, vì vậy giảm hình thành sỏi thận và các cơn đau thận hơn [8, 19].
Allopurinol có ứng dụng lâm sàng trong điều trị bệnh gout và các trường
hợp tăng acid uric thứ phát (do dùng thuốc chống ung thư, thuốc lợi tiểu
thiazid…) [8].
Tác dụng không mong muốn khi dùng thuốc có thể gây kích ứng tiêu hóa,
độc với gan và dị ứng da, có thể gặp cơn gout cấp ở giai đoạn đầu điều trị. Khắc
phục bằng cách dùng kết hợp với colchicin hoặc các thuốc chống viêm khác [8].
1.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro
Các phương pháp xác định hoạt hoạt độ enzyme XO in vitro thường đo
lượng các sản phẩm chuyển hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành
axit uric, cũng như sản xuất gốc superoxide, hydro peroxide hoặc NADH.
Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric
Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình oxy hóa
xanthin dưới tác dụng xúc tác của XO theo phản ứng:

10


Xanthine oxidase

Xanthin + H2O + O2

Acid uric + H2O2

Lượng acid uric được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290
nm, lượng acid uric tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym [60].

Phương pháp này thường được dùng trong thử nghiệm in vitro do tính thuận tiện,
nhạy đối với enzym tinh khiết.
Phương pháp hóa phát quang phát hiện O2- gây ra bởi XO
Luminol là chất phát quang hóa học và đặc biệt các chất phát quang có nguồn
gốc lucigenin (LDCL) thường được sử dụng để phát hiện O 2- in vitro sản xuất
bởi hệ thống enzyme hoặc các tế bào nguyên vẹn [19].

Phương pháp xác định O2.- bằng thử nghiệm Cytochrom c
Việc sản xuất O2.- có thể được phát hiện trong các tế bào nguyên vẹn nhờ dạng
sắt có trong cytochrom c:

Các tế bào được ủ với Fe3+-Cyt c và độ hấp thụ là đo ở 550 nm [19].
1.3. Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa
1.3.1. Khái quát
Chất chống oxy hóa là một chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do
các chất khác gây ra. Trong cơ thể, chúng bảo vệ các thành phần tế bào quan trọng
bằng cách trung hòa các gốc tự do (là sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa
tế bào. Các gốc tự do được tạo ra khi oxy được chuyển hóa hoặc hình thành

11


trong cơ thể.) Các gốc tự do có electron chưa ghép cặp vỏ ngoài của phân tử.
Đây là lý do, tại sao các gốc tự do có khả năng phản ứng cao và có thể phản ứng
với protein, lipid, carbohydrate và DNA. Những gốc tự do này tấn công các phân
tử ổn định gần nhất để “đánh cắp” electron để trở thành trạng thái bền vững. Khi
phân tử bị tấn công mất điện tử, nó sẽ trở thành một gốc tự do mới, bắt đầu phản
ứng dây chuyền, cuối cùng dẫn đến phá hủy tế bào.
Các gốc tự do có thể là dẫn xuất oxy (ROS, các loại oxy phản ứng) hoặc
có nguồn gốc nitơ (RNS, các loại nitơ phản ứng). Các phân tử có nguồn gốc oxy

là O-2 (superoxide), HO (hydroxyl), HO2 (hydroperoxyl), ROO (peroxyl), RO
(alkoxyl) là gốc tự do và H2O2. Các nitơ phản ứng chủ yếu là NO (oxit nitric),
ONOO (peroxy nitrate), NO2 (nitơ dioxide) và N2O3 (dinitrogen trioxide).
Trong một tế bào bình thường, chất chống oxy hóa và chất oxy hóa cân bằng.
Tuy nhiên, sự cân bằng này có thể được thay đổi, khi các chất oxy hóa tăng hoặc
khi mức độ chất chống oxy hóa bị giảm. Giai đoạn này được gọi là stress oxy hóa.
Stress oxy hóa dẫn đến tổn thương các phân tử sinh học bao gồm axit nucleic,
protein, axit béo không bão hòa đa (PUFA) và carbohydrate. Peroxid hóa lipid là sự
suy giảm oxy hóa của lipid không bão hòa đa và nó liên quan đến ROS và các ion
kim loại chuyển tiếp. Đây là một cơ chế phân tử của tổn thương tế bào dẫn đến một
loạt các sản phẩm gây độc tế bào, hầu hết là các aldehyd, như malondialdehyd
(MDA), 4 hydroxynonrnal (HNE), stress oxy hóa gây ra tổn thương tế bào nghiêm
trọng dẫn đến nhiều loại bệnh ở người như bệnh Alzheimer, Parkinson, xơ vữa động
mạch, ung thư, viêm khớp, suy giảm miễn dịch và rối loạn thoái hóa thần kinh,...
Thiếu hụt chất chống oxy hóa tự nhiên cũng dẫn đến stress oxy hóa, biểu thị các
chất chống oxy hóa tự nhiên có trong cơ thể người chết.
Có 2 loại chất chống oxy hóa là chất chống oxy hóa enzym và không enzym.

Trong chất chống oxy hóa enzym có chất chống oxy hóa sơ cấp và thứ cấp [46].
Chất chống oxy hóa sơ cấp là các chất chống oxy hóa phá vỡ chuỗi phản
ứng với các gốc lipid và chuyển chúng thành các sản phẩm ổn định hơn. Chất
chống oxy hóa của nhóm này chủ yếu là các phenolic, trong cấu trúc và bao gồm
12


các chất sau: Khoáng chất chống oxy hóa, vitamin chống oxy hóa, các chất hóa
học thiên nhiên bao gồm các flavonoid, catechin, carotenoid, -carotene,
lycopene, diterpene, tiêu đen, tỏi.
Chất chống oxy hóa thứ cấp là những hợp chất phenolic thực hiện chức
năng thu giữ các gốc tự do và ngăn chặn các phản ứng dây chuyền. Các hợp chất

bao gồm: butylated hydroxy anisole (BHA), butylated hydroxy toluene (BHT) và
propyl gallate (PG).
1.3.2. Phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro
Có nhiều phương pháp để đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro. Dựa trên
phản ứng hóa học giữa các hợp chất chống oxy hóa và các gốc tự do, các phương
pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa được phân loại thành hai loại [26].

1. Thử nghiệm dựa trên phản ứng chuyển nguyên tử hydro (HAT)
2. Thử nghiệm dựa trên phản ứng chuyển điện tử (ET)
Thử nghiệm ET bao gồm: phương pháp DPPH, phương pháp nhặt gốc
Superoxide anion, FRAP, TEAC sử dụng ABTS, thử nghiệm CUPRAC, FCR-xét
nghiệm tổng phenol, thử nghiệm DMPD, ức chế gốc oxit nitric, thử nghiệm
TBARS
Thử nghiệm dựa trên HAT bao gồm: ORAC, phương pháp ABTS, thử
nghiệm Crocin, TRAP, hoạt động quét gốc hydroxyl, HORAC, thử nghiệm LPIC,
quét các gốc H2O2, IOC, thử nghiệm PCL, thử nghiệm -carotene-axit linoleic
(linoleate)
Một số phương pháp chống oxy hóa in vitro khác: hàm lượng axit ascoric,
CAA, đo quang EPR, thử nghiệm phosphomolybdenum, phương pháp Xanthine
oxyase, hoạt động chelating kim loại.
Trong số các phương pháp nhặt gốc tự do, phương pháp 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) còn nhanh hơn, đơn giản (tức là không liên quan đến
nhiều bước và thuốc thử) và không tốn kém so với các mô hình thử nghiệm khác.

13


1.4. Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich)
1.4.1. Tổng quan
Cây lá gai (Boehmeria nivea (L.) Gaudich), còn có nhiều tên gọi khác là
Gai tuyết, Trữ ma, Tầm Ma,…[6, 10], là một loài thực vật có hoa thuộc họ

Urticaceae, được trồng rộng rãi ở các nước Đông Á như Hàn Quốc, Ấn Độ và
Trung Quốc [34, 40, 65]. Tại Việt Nam, cây mọc rải rác khắp nơi, được trồng ở
một số tỉnh miền Bắc, khu vực miền Trung đến các tỉnh Trung Nam bộ [1].
Trong dân gian, từ lâu đời, lá gai vẫn thường được sử dụng như một loại thuốc
lợi tiểu và cầm máu, và được cho là có đặc tính bảo vệ gan, chống oxy hóa và
chống viêm [11, 37].
1.4.2. Đặc điểm thực vật
1.4.2.1. Tên khoa học
Boehmeria nivea (L.)
Gaudich 1.4.2.2. Phân loại thực vật
Giới (regnum)

Plantae

Ngành (divisio)

Magnoliophyta

Lớp (class)

Magnoliopsida

Bộ (ordo)

Urticales

Họ (familia)

Urticaceae

Chi (genus)

Boehmeria

Loài (species)

B. nivea

1.4.2.3. Tên địa phương
Gai tuyết, Trữ ma, Tầm ma, Co pán (Thái), Bẩu pán (Tày), Chiểu đủ
(Dao)….[11].
1.4.2.4. Đặc điểm thực vật

14


Cây nhỏ cao 1,5-2m; gốc hoá gỗ. Rễ dạng củ, hình trụ thường cong queo,
màu vàng chứa nhiều nhựa gôm. Cành màu nâu nhạt, có lông. Lá lớn, mọc so le,
hình trái xoan dài 5-16 cm, rộng 9,5-14 cm, mép khía răng, mặt trên xanh, mặt
dưới trắng bạc phủ lông mềm và mịn; lá kèm hình dải nhọn, thường rụng, cuống
lá màu đo đỏ. Hoa đơn tính cùng gốc. Hoa đực có 4 lá đài và 4 nhị. Hoa cái có
đài hợp chia làm 3 răng. Quả bế mang đài tồn tại. Mùa hoa tháng 5-8, mùa quả
tháng 8-11 [6, 10].

Hình 1. 5: Cây lá gai (Boehmeria nivea L. Gaudich)
1.4.2.5. Phân bố
Cây có nguồn gốc ở khu vực nhiệt đới châu Á, phân bố ở các nước
Bhutan, Campuchia, Trung Quốc (Nam An Huy, Phúc Kiến, Nam Cam Túc,
Quảng Đông, Quảng Tây Quý Châu, Nam Hà Nam, Hải Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam,
Giang Tây, Nam Thiên Tây, Tứ Xuyên, Vân Nam, Chiết Giang), Ấn Độ,

Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Nepal, Sikkim, Đài Loan, Thái Lan, Việt
Nam [17, 34, 40, 65]. Tại Việt Nam, cây mọc rải rác khắp nơi, thường mọc ở rìa
rừng, bụi cây, những nơi ẩm ướt dọc theo suối, ven đường, được trồng ở một số
tỉnh miền Bắc, khu vực miền Trung đến các tỉnh Trung Nam bộ [1].

15


1.4.2.6. Bộ phận dùng
Rễ củ-Radix Boehmeriae thường gọi là Trữ ma căn và lá-Folium
Boehmeriae.
Thu hái: rễ có thể thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa hạ hay mùa thu.
Ðào rễ, rửa sạch đất cát, bỏ rễ con, thái mỏng hoặc để nguyên, rồi phơi hay sấy
khô; có khi dùng tươi. Lá có thể thu hái quanh năm [10].
1.4.2.7. Thành phần hóa học
Kết quả định tính trong dịch chiết lá B. nivea chỉ ra các thành phần hóa
học có chứa trong dịch chiết bao gồm anthraquinon, phenol, tinh dầu, steroid,
terpen, acid amin, polysaccharid và acid hữu cơ, lacton và coumarin [63]. Theo
Yongsheng Chen và cộng sự (2014), lá Gai có chứa các hợp chất có tác dụng
chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm và tác dụng chống ung thư đối với
ung thư phổi và gan, trong đó bao gồm các phenolic và flavonoid [21].
Tại Hàn Quốc, các công trình nghiên cứu xác định thành phần hóa học của lá
gai bằng HPLC đã chỉ ra nhiều hợp chất có tác dụng dược lý: lá B. nivea chứa một
lượng lớn các hợp chất phenolic có khả năng ức chế men chuyển angiotensin; các
hợp chất polyphenolic hay flavonoid là epicatechin, epicatechin gallate và rutin,
acid chlorogenic được biết đến với các đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống
khối u, chống vi khuẩn, chống vi rút và chống dị ứng [22, 37, 59]. Bên cạnh đó,
theo 3 tác giả Mi-Ran Park và cộng sự (2010), Ah-Ra Kim và cộng sự (2014),
Sunghun Cho và cộng sự (2017) đều chỉ ra rằng lá Gai chứa nhiều loại amino acid,
acid béo, acid hữu cơ, carbohydrat, vitamin, khoáng chất [14, 23, 52].

Trong đó, các phenolic bao gồm: chlorogenic acid, caffeic acid, 4coumaric acid, ferulic acid, benzoic acid.
Các flavonoid bao gồm: epicatechin, rutin, isoquercetin, hyperoside
Các carbohydrate bao gồm: sucrose, glucose, fructose, galactose, mannitol
Các amino acid bao gồm: threonine, glutamic acid, proline, methionine,
tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine, arginine
16


Các acid béo bao gồm: palmitic acid, margaric acid, oleic acid, linoleic
acid, linolenic acid, arachidic acid, behenic acid, tricosylic acid, lignoceric acid
Các acid hữu cơ bao gồm: oxalic acid, citric acid, succinic acid
Các vitamin bao gồm: vitamin A (retinol), vitamin E (α- tocopherol),
vitamin C
Các khoáng chất bao gồm: Ca, Fe, K, Mg, Mn, Zn, Na

Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B. Nivea [22]
1. β-sitosterol, 2. Loliolide, 3. Rutin, 4. Pyrimidinedione
1.4.2.8. Công dụng cổ truyền
Trong y học cổ truyền ở Cộng hòa dân chủ Congo (DR Congo), toàn bộ cây
được nghiền nát và ngâm trong nước để được một loại thuốc bôi lên cơ thể điều trị
bệnh thấp khớp, bệnh phong, bệnh ngoài da và vết thương, thấm vào mắt để điều trị
bệnh về mắt, thấm vào mũi chống viêm mũi, và ngâm rượu để điều trị tiêu chảy và
giun sán. Ở Malaysia, lá gai được sử dụng để đắp mụn nhọt và chống đầy

17