Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của tinh dầu loài vương tùng (murraya glabra (guillaumin) swingle) thu hái ở sơn la
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.9 MB, 50 trang )
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
----
----
ĐỖ MINH HIẾU
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CỦA TINH DẦU LOÀI VƯƠNG TÙNG
(MURRAYA GLABRA (GUILLAUMIN) SWINGLE)
THU HÁI Ở SƠN LA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
Hà Nội – 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
----
----
Người thực hiện: Đỗ Minh Hiếu
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA
HỌC CỦA TINH DẦU LOÀI VƯƠNG TÙNG (MURRAYA
GLABRA (GUILLAUMIN) SWINGLE) THU HÁI Ở SƠN LA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(NGÀNH DƯỢC HỌC)
Khóa
: QH2015.Y
Người hướng dẫn
: PGS. TS. Phạm Thanh Huyền
PGS. TS. Đinh Đoàn Long
Hà Nội – 2020
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã may mắn nhận được rất nhiều
sự giúp đỡ quý báu cả về vật chất, tinh thần của thầy cô, bạn bè. Lời đầu
tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Đinh
Đoàn Long - Phó Chủ nhiệm Khoa Y dược (Đại học Quốc gia Hà Nội),
PGS.TS. Phạm Thanh Huyền - Trưởng Khoa Tài nguyên dược liệu (Viện
Dược liệu), những người thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tôi, chỉ dạy tận
tình trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Phạm Thị Ngọc, ThS. Nguyễn Quỳnh Nga
và các cán bộ Khoa Tài nguyên dược liệu (Viện Dược liệu) đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi
trong quá trình làm khóa luận. Trong quá trình học tập và làm việc tại đây, tôi đã
học tập và tích lũy được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và được truyền cảm hứng
về tình yêu, niềm say mê và nhiệt huyết với công tác nghiên cứu về cây thuốc.Tôi
xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y Dược học cơ sở đặc biệt là
ThS. Phạm Thị Hồng Nhung đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt
nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình,
người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này.
Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020
Tác giả
Đỗ Minh Hiếu
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
Viết đầy đủ
GC-MS
Gaschromatography – mass spectrometry (sắc
ký khí kết hợp khối phổ)
M. glabra
Loài Vương Tùng (Murraya glabra)
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
1
Bảng 2.1: Chương trình nhiệt độ
2
Bảng 3.1: Kết quả phân tích tinh dầu
Vương tùng
Trang
20
30-31
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
Tên hình
Trang
1
Hình 1.1: Cấu trúc một số thành phần
thường gặp trong tinh dầu chi Murraya
6
2
Hình 1.2: Tổng quát về Vương tùng
12
3
Hình 1.3: Một số hợp chất chính trong tinh
dầu Vương tùng
13
4
Hình 1.4: Phân bố Vương tùng ở Việt Nam
14
5
Hình 2.1: Bộ dụng cụ cất tinh dầu
19
6
Hình 3.1: Hình thái chung của Vương tùng
(Murraya glabra (Guillaumin) Swingle)
21
7
Hình 3.2. Lá kép Vương tùng (Mặt trên
(A), Mặt dưới (B))
22
8
Hình 3.3: Các dạng lá chét của Vương tùng
(Murraya glabra (Guillaumin) Swingle).
(Mặt trên (A), Mặt dưới (B))
Hình 3.4: Gân lá chét mặt trên (A); mặt
dưới (B)
22
Hình 3.5: Lỗ tiết tinh dầu trên bề mặt lá,
Mặt trên (A), Mặt dưới (B)
23
9
10
22
11 Hình 3.6: Lỗ tiết tinh dầu ở mép lá, Mặt
trên (A), Mặt dưới (B)
23
12 Hình 3.7: Cuống lá
23
13 Hình 3.8: Chùm hoa cấp 1 (A), cấp 3 (B),
bông hoa (C)
24
14 Hình 3.9: Giải phẫu hoa (Mặt dưới (A),
Mặt trên (B))
24
15 Hình 3.10: Nhị vòng trong (A), nhị vòng
ngoài (B)
24
16 Hình 3.11: Chùm quả non
25
17 Hình 3.12: Mặt cắt ngang quả non (A), Hạt
(B)
25
18 Hình 3.13: Vi phẫu lá Vương tùng
26
19 Hình 3.14: Phần gân lá
26
20 Hình 3.15: Phần phiến lá
27
21 Hình 3.16: Vi phẫu thân Vương tùng
28
22 Hình 3.17: Vi phẫu thân Vương tùng phóng
to
28
23 Hình 3.18: Vi phẫu rễ Vương tùng
29
24 Hình 3.19: Vi phẫu rễ phóng to
30
25 Hình 3.20: Kết quả sắc ký khí Vương tùng
30
26 Hình 3.21: Một số thành phần chủ yếu
trong tinh dầu Vương tùng Murraya glabra
(Guillaum.) Swingle
31
Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN............................................................................................... 2
1.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................................ 2
1.1.1.Chi Murraya........................................................................................................ 2
1.1.2.Cây Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle. .9
1.2.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam............................................................. 10
1.2.1.Chi Murraya..................................................................................................... 10
1.2.2.Các nghiên cứu về loài Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin)
Swingle............................................................................................................................ 11
1.3.Giới thiệu về phương pháp sắc ký khí khối phổ........................... 14
1.3.1.Nguyên tắc....................................................................................................... 14
1.3.2.Ứng dụng trong kiểm nghiệm tinh dầu....................................... 14
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................16
2.1.Vật liệu nghiên cứu............................................................................................. 16
2.1.1.Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 16
2.1.2.Hóa chất sử dụng........................................................................................ 16
2.1.3.Thiết bị sử dụng........................................................................................... 16
2.2.Nội dung nghiên cứu......................................................................................... 16
2.3.Phương pháp nghiên cứu.............................................................................. 17
2.3.1.Phương pháp khảo cứu, kế thừa tài liệu................................... 17
2.3.2.Phương pháp hình thái so sánh....................................................... 17
2.3.3.Phương pháp nghiên cứu giải phẫu............................................. 17
2.3.4.Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học....................18
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................................. 21
3.1.Xác định tên khoa học của loài Vương tùng thu hái ở Sơn La
.................................................................................................................................................... 21
3.2.Đặc điểm hình thái............................................................................................... 21
3.3.Đặc điểm giải phẫu.............................................................................................. 26
3.3.1.Lá............................................................................................................................ 26
3.3.2.Thân...................................................................................................................... 28
3.3.3.Rễ............................................................................................................................ 29
3.4.Thành phần hóa học trong tinh dầu....................................................... 30
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................. 33
4.1.Kết luận........................................................................................................................ 33
4.2.Kiến nghị.................................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................ .
PHỤ LỤC ............................................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước có khí hậu nóng ẩm mưa nhiều. Đây là điều kiện thuận lợi
cho các loài thực vật sinh trưởng và phát triển, tạo nên một thảm thực vật vô
cùng phong phú và đa dạng với rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực. Đặc biệt
trong số đó là họ Cam với gần 30 chi, 140 loài trải rộng khắp Việt Nam. Các cây
trong họ này không chỉ mọc hoang mà còn có thể được trồng để lấy quả như:
Cam, bưởi, quýt, chanh, … hay làm cảnh như Cam canh, quất, … hoặc làm gia vị
như hồng bì, sẻn, chanh, …. Đặc biệt hơn có một số loài thường
được dùng làm thuốc như ba chạc, bưởi, chanh, hoàng bá, kim
sương, phật thủ, cửu lý hương, ….
Trong số các chi thuộc họ Cam, có một chi được biết đến với với khả
năng chiết suất tinh dầu rất cao từ lá. Đặc biệt nhất là cây Murraya Glabra,
hay còn được gọi là Vương tùng. Từ năm 1965, cụ Đào Đình Khuê đã sử
dụng tinh dầu của Vương tùng để chữa cảm mạo, sốt rét, đau nhức. Không
chỉ thế, tinh dầu Vương tùng còn có trong công thức cao xoa Lam Sơn
(Công ty dược phẩm Thanh Hóa) và dầu xoa Thăng Long xuất khẩu (Viện
Dươc liệu và Xí nghiệp dược phẩm trung ương 2 kết hợp sản xuất).
Cho đến nay, loài này mới chỉ được ghi nhận là phân bố ở Việt Nam.
Tuy có nhiều ứng dụng như vậy nhưng Vương tùng vẫn chưa được nghiên
cứu một cách cụ thể. Vì vậy chúng tôi thực hiên đề tài “Nghiên cứu đặc
điểm thực vật và thành phần hóa học của tinh dầu loài Vương tùng
(Murraya glabra (Guillaumin) Swingle) thu hái ở Sơn La” nhằm mục đích:
1.
2.
Xác định đặc điểm hình thái và đặc điểm vi phẫu của Vương
tùng (Murraya glabra (Guillaumin) Swingle.
Xác định thành phần hóa học trong tinh dầu Vương tùng
(Murraya glabra (Guillaumin) Swingle.
1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.1.1.
Chi Murraya
1.1.1.1. Vị trí phân loại
Qua nghiên cứu các tài liệu [2, 41, 47, 58] về chi Murraya, các
tác giả đều thống nhất xác định vị trí phân loại của chi Murraya
theo hệ thống phân loại của A. Takhtajan (1997) [46] như sau:
Giới Thực Vật (Plantae)
Ngành Thực Vật Hạt Kín (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân Lớp Hoa Hồng (Rosidae)
Bộ Cam (Rutales)
Họ Cam (Rutaceae)
Chi Murraya
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Theo 2 tác giả Dianxiang Zhang và Thomas G. Hartley trình
bày trong Thực vật chí Trung Quốc [53] là tài liệu đầy đủ nhất về
chi Murraya hiện nay, chi Murraya được mô tả đầu tiên bởi J.
Koenig ex Linnaeus vào năm 1771, có đặc điểm chung như sau:
Cây gỗ nhỏ hoặc cây nhỡ, không có gai, không có lông tơ hay vảy trên ngọn,
chồi nách hoặc cụm hoa non. Lá mọc so le, lá kép lông chim lẻ. Cụm hoa
ở ngọn hoặc ở nách, kiểu chùm kép hoặc cắt giảm thành xim hai ngả hoặc xim
một ngả. Hoa lưỡng tính, hình bầu dục tới hình trứng khi còn là nụ. Đài 4 hoặc 5,
rời hoặc hàn liền đến một nửa chiều dài của chúng. Tràng hoa 4 hoặc 5, tiền khai
hoa kiểu vặn hoặc lợp. Nhị từ 5 đến 8 hoặc 10, rời, không giống nhau về chiều dài,
chỉ nhị mảnh hoặc rất mảnh, thẳng hoặc không thẳng. Đĩa hình nhẫn, phồng lên
hoặc hình cột. Bộ nhụy 2-5 lá noãn, hàn liền, vách ngăn thẳng đi từ trung tâm trở
ra, mỗi lá noãn chứa 1-2 noãn. Vòi nhụy 3-7 cho một bầu nhụy, rụng đồng loạt
hoặc rụng không hết khi tạo quả. Quả mọng cùng với thịt nhầy, không có các
khoảng trống trong quả, vỏ quả trong mọng nước. Hạt có lớp vỏ mỏng hoặc dầy,
nội nhũ ít, cây mầm thẳng, lá mầm hình elip, một bên lồi một
2
bên phẳng, không cuộn vào cũng không gập lại, thân cây mầm
phân ra ở giữa gắn các lá mầm.
Ngoài ra chi Murraya còn được Guillaumin mô tả trong Thực vật chí
Đông Dương năm 1912 với 3 loài là M. alata, M. koenigii và M. exotica [55].
1.1.1.3. Phân loại chi Murraya
Theo Dianxiang Zhang và Thomas G. Hartley trình bày trong Thực vật chí
Trung Quốc [53], khóa phân loại chi Murraya được thể hiện như sau:
1a. Cánh hoa 1-2 cm, hạt có lông nhỏ
2a. Cuống lá chét cấp 1 có cánh……………………….……..1. M. alata
2b. Cuống lá chét cấp 1 không có cánh
3a. Phiến lá chét hình từ gần tròn đến hình ovan đến hình elip rộng
1,5 đến 6 cm ………………………………………2. M. paniculata
3b. Phiến lá chét hình trứng, ngọn phiến lá rộng hơn
phần gốc phiến lá, rộng từ 0,5 đến 3 cm
…………………………………………3. M. exotica
1b. Cánh hoa không dài quá 0,8 cm, hạt không có lông
4a. Tràng hoa 4 (hoặc 5) – nhiều, bộ nhị 8 hoặc 10
5a. Phiến lá chét hình mũi mác, rộng 0,8-2 cm, gân phụ không rõ
………………………………………………………………4. M. tetramera
5b. Phiến lá chét hình ovan đến elip hoặc hiếm khi là hình mũi mác
hoặc hình trứng ngược; rộng từ 2-4 cm, gân phụ ở mặt trên hơi nhô ra
……………………………………………………………5. M. euchrestifolia
4b. Tràng hoa 5 - nhiều, bộ nhị 10.
6a. Lá kép 11-31 lá chét
7a. Phiến lá chét rộng 3-6 mm, đỉnh lá tròn 6. M.microphylla
7b. Phiến lá chét rộng 5-20mm, đỉnh lá có một mũi nhọn
ngắn nhô ra …………………………………………………………7. M. koenigii
6b. Lá kép 3-11 lá chét
8a. Mặt dưới phiến lá có nhiều lông ngắn 9. M. kwangsiensis
8b. Phiến lá không có lông
3
9a. Phiến lá chét 5-6 x 2-3 cm. 8. M.crenulata
9b. Phiến lá chét 7-18 x 4-10 cm 9. M. kwangsiensis
Tuy nhiên, hiện nay người ta đang đề xuất một hệ thống phân loại mới
cho chi này đó là chia chi Murraya ra làm 2 phân chi là Murraya và Bergera [26,
29, 49, 57]. Sự phân đôi này được chứng minh bằng sự khác biệt đáng chú
ý của các chất chuyển hóa thứ cấp với 3-prenylindoles ở Murraya và
carbazole ở Bergera. Đối với các chất chuyển hóa khác của chi
Murraya, coumarin được tìm thấy trong cả 2 phân chi, nhưng khác
nhau rõ ràng về thành phần, 8-prenylcoumarin được tìm thấy trong
toàn bộ phân chi Murraya trong khi fur furmarin geranylated được
biết đến từ một số loài của phân chi Bergera. Về tính chất hóa học,
phân chi Bergera gần với chi Clausena hơn phân chi Murraya. Đây
chính là yếu tố quyết định để phân biệt M. exotica và M. panticulata.
1.1.1.4. Thành phần loài và phân bố
Trên thế giới có khoảng 12 loài thuộc chi Murraya J. Koenig
ex Linnaeus phân bố ở phía Đông, Nam và Đông Nam của châu Á,
Australia, khu vực Tây Nam Thái Bình Dương gồm : Murraya alata
Drake, Murraya crenulata, Murraya euchrestifolia Murraya koenigii
(L.) Sprengel, Murraya kwangsiensis, Murraya microphylla,
Murraya ovatifoliolata (Engl.) Domin, Murraya paniculata (L.),
Murraya stenocarpa (Drake) Swingle, Murraya tetramera [53].
1.1.1.5. Thành phần hóa học
Thành phần hóa học được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Murraya là
các nhóm hợp chất sau: tinh dầu, alcaloid, flavonoid, coumarin.
Tinh dầu
Một nghiên cứu của QianLi, Liang-FengZhu và các cộng sự vào năm 1988
đã tách được khoảng 60 chất từ tinh dầu của 6 loài thuộc chi Murraya (gồm M.
alata; M. exotica; M. kwangsiensis; M. koenigii; M. micmphylla; M. paniculate),
sự tương phản về thành phần của 2 phân chi là rất rõ nét. Trong 3 loài từ phân
chi Bergera thì tinh dầu chủ yếu chứa monoterpene. Trong M. microphylla,
hơn 60% là 2-phellandrene và các thành phần quan trọng khác cũng là
monoterpen monocyclic. Tinh dầu của M. kwangsiensis bao gồm phần lớn các
hợp chất oxy hóa acyclic neral, geranial và geranyl acetate. Trong cả hai
trường hợp, Sesquiterpene chiếm ít hơn 10% tổng số. M. koenigii thì khác một
chút; thành phần phong phú nhất là O-pinene và monoterpen chiếm hơn
4
50% tinh dầu nhưng các hợp chất sesquiterpene cũng rất phong phú, đáng chú
ý là t-caryophyllene và y-elemene. Ngược lại, ba loài từ phân chi Murraya đã
cho các loại dầu chủ yếu hoặc hoàn toàn là Sesquiterpene. Hợp chất chính
(30%) từ M. alata được xác định là l-gurjunene trong khi 50% dầu của M.
exotica là caryophyllene. Tinh dầu từ M. paniculata chứa y-elemene là thành
phần chính (30%) với nerolidol và t-caryophyllene đều đóng góp hơn 10% [29].
Nghiên cứu này cho thấy thành phần dễ bay hơi trong lá của chi Murraya cung
cấp 1 đặc điểm hóa học khác để phân biệt 2 phân chi trong chi này.
Năm 2015, Chun-xue You và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc
ký khí khối phổ để xác định một số thành phần tinh dầu trong chi Murraya
(trong đó bao gồm Murraya tetramera, Murraya euchrestifolia, Murraya
koenigii, Murraya kwangsiensis, Murraya exotica, và Murraya alata) đã được
nghiên cứu. Từ các mẫu cành mang lá của chúng, thu hái tại tỉnh Quảng Tây
và Vân Nam Trung Quốc vào tháng 5,6,7 năm 2014, tinh dầu thu được bằng
cách cất kéo hơi nước với hàm lượng không cao, đạt từ 0,03 đến 0,23 %. Tất
cả 36 thành phần được xác định bởi GC-MS từ các mẫu tinh dầu. Các thành
phần có hàm lượng tương đối cao hơn bao gồm α-cedrene (4,22 - 21,82%), βcaryophyllene (8,15 - 27,73%), γ-elemene (4,38–12,65%), γ-selinene (3,80–
21,09%), α-selinene (2,60–10,68%), α-zingiberene (2,08–12,68%), spathulenol
(3,08– 11,80%), caryophyllene oxit (1,58–10,59%), β-eudesmol (1,33–25,32%),
vv. Hơn nữa, tám hợp chất , được công nhận là thành phần quan trọng trong
tinh dầu của M. tetramera và M. kwangsiensis, đã được phân lập xác định là αterpinene, β-caryophyllene, α-caryophyllene, alloaromadendrene, spathulenol,
β-eudesmol, camphene và oxit caryophyllene [51].
5
Hình 1.1: Cấu trúc một số thành phần thường gặp trong tinh
dầu chi Murraya
Alkaloid
Năm 1986, Yun-Cheung Kong và cộng sự đã tiến hành phân tích 8 loài
trong chi này và phát hiện ra chúng đều có chứa alkaloid ở bộ phận nào đó
[28]. Hầu hết các alkaloid trong chi này đều thuộc nhóm Carbazole alkaloid
nhưng cũng có một phần nhỏ thuộc nhóm indo alkaloid.
6
Đặc biệt là các carbazole alkaloid đầu tiên được phân lập từ
M. koenigii, hơn nữa M. euchrestifolia là nguồn carbazole rất dồi
dào. Rất nhiều cacbazole đều được phân lập từ loài này [18].
Người ta đã phát hiện ra được Yuehchukene – 1 indol alkaloid ở
trong 4 loài thuộc chi Murraya là M. paniculata, M. paniculata var.
omphalocarpa (Hay.) Tanaka, M. exotica và M. alata Drake. Ở một số
loài còn lại thì gần như không thấy được thành phần này [52].
Flavonoid
Flavonoid được tìm thấy trong 1 số loài thuộc chi Murraya điển hình
như trong lá, quả của M. paniticula [20, 27, 39]; lá của M. koenigii [21, 22];
lá, thân của M. tetramerrra [54], M.exotica [25]. Tuy đã có một số nghiên
cứu về flavonoid thuộc chi này nhưng người ta không đi vào quá sâu mà
chỉ nghiên cứu qua về cấu tạo và một vài tác dụng sinh học của flavonoid.
Courmarin
Cũng như Flavonoid thì Courmarin cũng được tìm thấy trong hầu hết các
loài thuộc chi Murraya như: lá của M. paniculata[43], M. koenigii [45], M.
exotica [15], Murraya siamensis [24], M. alata [31] và M. tetramera [50] nữa.
1.1.1.6. Tác dụng
Kháng khuẩn
Mini Priya Rajendran và các cộng sự đã nghiên cứu về tinh dầu của M.
koenigii vào năm 2014 và nhận ra rằng khả năng kháng khuẩn cũng được thấy là
rất mạnh với các chủng Corynebacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa,
Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia và Enterobacter aerogenes [37].
Các carbazole alcaloid từ M. koenigii cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ chống
lại các vi khuẩn kháng kháng sinh như Staphylococcus aureus, Psedomonas
aeruginosa, Klebsiella , Escherchia coli và các dòng tế bào ung thư [35]. Cả trên
loài M. exotica cũng có khả năng kháng khuẩn rất mạnh, có thể so sánh với một
số kháng sinh như gentamicin, erythromycin và nystatin
[19]. Dựa trên nghiên cứu về tính kháng khuẩn của tinh dầu M. paniculata với
4 loại vi khuẩn là Staphylococcus aureus , Escherichia coli, Salmonella
typhimurium và Enterococcus faecallis cho thấy hoạt động kháng khuẩn yếu
đối với Staphylococcus aureus và kháng khuẩn trung bình cho tất cả các
chủng vi khuẩn khác với kết quả MIC lần lượt là 1,0;0,5;0,5;0,5 (mg/mL) [42].
Kháng nấm
7
Cũng trên thử nghiệm kháng khuẩn của tinh dầu M. paniculata
người ta thực hiện kiểm tra khả năng kháng nấm của nó với 4 loại nấm
là Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticum và
Fusarium Solani thì thu được MIC là 0,2;0,2;0,1;0,2 (mg/ml). Từ đó có
thể thấy được khả năng kháng nấm mạnh của tinh dầu này [33].
Theo một nghiên cứu khác, dịch chiết methanol của lá M. koenigii có
khả năng ức chế tăng trưởng sợi nấm với Rhizoctonia solani (70%) và
Fusarium oxysporum (58%), còn dịch chiết ethanol thì là Fusarium
oxysporum (61,07%) và Rhizoctonia solani (53,77%). Trong khi đó thì tinh
dầu của M. koenigii chỉ có khả năng ức chế trung bình với 2 loại nấm là
Fusarium oxysporum (55,69%) và Rhizoctonia solani (48,38%) [38].
Chống viêm
Tác dụng của các nhóm hợp chất khác: Yuehchukene – một indol
alcaloid được phát hiện chỉ trong bốn trong số chín loài thuộc chi Murraya
được phân tích (M. paniculata , M. paniculate var. omphalocarpa, M.
exotica và M. alata) với hoạt tính chống viêm nổi bật [17, 52] .
Các thử nghiệm trên chuột đã chứng minh được rằng dịch chiết của M.
koenigii có khả năng chống viêm, giảm đau [23], có được các tác dụng này là
do nó có khả năng chứa nguồn alkaloid carbazole rất phong phú [14].
Ngoài M. koenigii thì còn có 2 loài M. paniculate [36] và M.
exotica [48] cũng có khả năng giảm đau và chống viêm đáng kể.
Chống oxi hóa
Năm 2015, Tejal K Gajaria, Dipak K Patel, Ranjitsinh V Devkar và các cộng
sự đã chỉ ra rằng dịch chiết của M. koenigii đã ngăn chặn quá trình oxy hóa,
cải thiện về khả năng sống của tế bào và điện thế màng ty thể của các tế bào
được điều trị Ox-LDL. Sự gia tăng Ox-LDL trong khi mất cân bằng oxy hóa nội
bào, ngưng tụ nguyên tử và chết rụng tế bào đã được ngăn chặn một cách
hiệu quả nhờ dịch chiết M. koenigii có thể có các chất chống oxy hóa và gốc
tự do được coi là sự hiện diện của flavonoid có trong chiết xuất. Điều này
cung cấp bằng chứng sơ bộ về tiềm năng chống xơ vữa động mạch của nó và
đảm bảo làm sáng tỏ và xác nhận thêm cho việc sử dụng in-vivo và có thể hữu
ích như một thực phẩm chức năng bổ sung và một loại thuốc thay thế để ngăn
chặn quá trình oxy hóa LDL và độc tính gây ra oxy hóa LDL [21].
Năm 2016, Davinder Kaur, Arvinder Kaur và Saroj Arora đã sử dụng
UHPLC để xác định để kiểm tra thành phần của dịch chiết M. exotica. Họ đã
8
nhận ra được rằng dịch chiết từ phân đoạn ethyl acetat có khả năng
chống gốc tự do rất tốt cũng như giảm khả năng đột biến của gen [25].
Diệt côn trùng
Từ các mẫu của 6 loài thuộc chi Murraya: Murraya tetramera, Murraya
euchrestifolia, Murraya koenigii, Murraya kwangsiensis, Murraya exotica và
Murraya alata, các thành phần tinh dầu của chúng đã được phân tích và
chứng minh tác dụng chống lại Tribolium castaneum [51].
Lá của M. koenigii làm giảm buồn nôn, khó tiêu, nôn mửa. Ngoài ra,
người ta còn ăn như một phương thuốc chữa tiêu chảy và kiết lỵ [17]. Lá
của M. paniculata có chứa các nhóm chất kích thích có tác dụng làm se
được sử dụng trong điều trị tiêu chảy, kiết lỵ và các bệnh về răng và nướu;
phòng chống bệnh thấp khớp, ho và hysteria, nó còn được chứng minh là
có khả năng kháng khuẩn vừa phải và kháng nấm rất mạnh [42].
Nghiên cứu so sánh tinh dầu giữa M. paniculate và M. exotica
đã chứng minh rằng β-caryophyllene có trong 2 loài này có tác
dụng gây tê cục bộ có thể so với procaine. Ngoài ra nó còn có tác
dụng chống viêm và giảm đau do viêm [30].
Một số nghiên cứu đã chỉ ra hoạt tính kháng khuẩn, chống tiểu
đường, chống oxy hóa, chống bài tiết, chống ung thư từ M. paniculata
[33, 40]. Hoạt tính chống viêm bởi các coumarin và benzocoumarin
chiết xuất từ loài M. alata cũng đã được chứng minh [31].
Tác dụng khác
Ngoài việc sử dụng để chữa bệnh thì một số loài trong chi Murraya
còn thường được sử dụng làm gia vị, cây cảnh hoặc hương liệu.
1.1.2.
Cây Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle
Trên thế giới hiện chỉ có một số tài liệu đề cập đến cây M.
glabra và chỉ ra tiêu chí để phân biệt chứ chưa thấy có tài liệu chi
tiết nào về đặc điểm thực vật, vi phẫu, tinh dầu của loài này [41].
Loài này còn được cho là có tên khoa học là Micromelum
glabrum Guillaumin. Nó được mô tả lần đầu năm 1910 trong thực
vật chí Đông dương bởi Guillaumin như sau:
Cây bụi nhỏ 1 mét. Cành cây hoàn toàn đẹp, với các tuyến rất thơm. Lá dài
12-46 cm; lá chét xen kẽ từ 3-9, nhẵn, hình ovan hoặc thuôn dài (kích thước 5-17
cm x 2-9 cm) không đều nhau và phình ở gốc, nhọn ở đỉnh, hầu như không
9
có răng cưa; gân lá 6-9 đôi, nhô ra bên dưới, tĩnh mạch không chặt lắm
và không nhô ra bên dưới; cuống lá hình trụ, nhẵn, dài 3-4 mm; cuống
lá hình trụ, nhẵn, tuyến. Cụm hoa ngắn hơn lá, có lông rất ngắn; cuống
nhỏ dài hơn hoa, được cung cấp ở gốc hoặc ở phần dưới thấp hơn với
2 nhánh nhỏ; Hoa dài 4 mm, màu trắng. Tràng với 4 lá đài hợp nhất,
giống nhau, rất ngắn. Cánh hoa dài 4-6 mm, nhẵn, hình mũi mác. Nhị 8,
gồm 4 nhị dài và 4 nhị ngắn; chỉ nhị mở rộng và có lông; bao phấn đính
lưng, hình bầu dục, có một số lông. Đĩa ngắn. Bầu hình trụ, nhiều nốt
sần, không có lông; vòi nhụy dài hơn bầu, ở đỉnh là nhụy hình cầu [55].
Tuy nhiên tên này không được chấp nhận và sau đó loài này được Walter
T. Swingle nhắc đến lần đầu trong bài báo "A new taxonomic arrangement of
the orange subfamily, Aurantioideae" và được đăng lần đầu vào ngày
3/11/1938 trên tạp chí Journal Of The Washington Academy Of Sciences [44].
Theo tác giả Tyozaburo Tanaka thì M. glabra có chỉ nhị dài và có lông
mịn. Lá kép gồm 5-11 lá chét, rất lớn, làm cho nó khác với các loại cây khác
[56]. Ngoài ra, thành phần hóa học của M. glabra được dự đoán là
sẽ chứa carbazole [28].
1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
1.2.1.
Chi Murraya
1.2.1.1. Đặc điểm thực vật
Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, không có gai. Lá kép lông chim lẻ, lá chét mọc
cách, cuống lá đôi khi có cánh. Cụm hoa xim hình ngù, mọc ở đỉnh hoặc nách
lá. Nụ hoa hình trụ hay trứng-thuôn. Đài gồm 5(4) thùy, dính nhau ở gốc. Tràng
5(4) cánh hoa, có tuyến tinh dầu ; tiền khai hoa lợp. Bộ nhị có 10(8) nhị, chỉ nhị
hình sợi dài, rời nhau ; bao phấn nhỏ ; triển mật rõ. Các lá noãn dính nhau
hoàn toàn ; bầu 2-5 ô, mỗi ô có 1-2 noãn ; vòi nhụy dài hơn bầu, nhẵn, tồn tại;
đầu nhụy phồng; cuống bầu rất ngắn hoặc không có. Quả mọng,không có
lông hình túi mọng nước (tép) ; vỏ hạt nhẵn hoặc có lông dài, màu trắng, mềm
; lá mầm màu xanh sẫm, có tuyến tinh dầu [2].
1.2.1.2.
Phân loại
Hiện nay, chi Murraya mới ghi nhận được 4 loài có ở Việt Nam. Trong
luận văn nghiên cứu về phân loại các loài trong họ Cam – Rutaceae, TS.
Bùi Thu Hà đã phân loại chi Murraya của họ này như sau :
1a. Cuống lá có cánh ................................................................... M. alata
1b. Cuống lá không có cánh
10
2a. Số lượng hoa trong cụm hoa ít, cánh hoa dài hơn
1,5cm M. paniculata
2b Số lượng hoa trong cụm hoa nhiều, cánh hoa ngắn hơn 1cm
3a. Số lượng lá chét từ 17-31………………………M. koenigii
3b. Số lượng lá chét từ 5-9…………………………..M. glabra
1.2.2. Các nghiên cứu về loài Vương tùng - Murraya
glabra (Guillaumin) Swingle
1.2.2.1. Đặc điểm thực vật
Đặc điểm thực vật của Vương tùng được mô tả ở nhiều sách, cụ thể là:
Theo Danh lục thực vật Việt Nam do Nguyễn Tiến Bân làm chủ biên thì
Vương tùng là cây dạng bụi nhỏ, cao 1-1,5m. Mọc rải rác trên núi đá vôi.
Theo cuốn Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi (2004)
thì đặc điểm thực vật của Vương tùng là cây nhỏ mọc thành bụi, cao 1-2m,
đặc biệt có thể cao từ 3-4m. Lá kép lông chim lẻ gồm 5-9 lá chét có cuống dài
5-7mm, màu tía, trên cuống lá chét dôi khi có đốt, phiến lá hình trứng dài 46,5cm, rộng 1,8-3,8cm mặt trên màu xanh xám, mặt dưới xanh nhạt, nổi rõ ở
mặt dưới, mép lá có rang cưa giả do túi tiết tinh dầu gợn lên. Hoa nở vào mùa
xuân, mọc thành chum xim, hoa rất nhỏ. Quả chin già vào tháng 8-9, to bằng
hạt ngô. Vỏ quả chứa rất nhiều tinh dầu. Lá, vỏ quả rất thơm, mùi dễ chịu.
Theo Sách đỏ do Nguyễn Tiến Bân làm chủ tịch hội đồng biên soạn thì
Vương tùng là cây gỗ nhỏ, thường mọc thành bụi, cao 2 - 4m. Ngọn cành và
cuống lá non màu đỏ tím. Lá kép hình lông chim, mọc so le, dài 10 - 25cm, có 3
- 9 lá chét. Lá chét hình mũi mác, dài 3,5 - 7,5cm, rộng 1,5 - 3,5cm, đầu lá thuôn
hẹp tạo thành mũi nhọn, cuống lá dài 3 - 5mm. Mặt trên phiến lá bóng, soi lên
ánh sáng thấy rõ nhiều túi tiết tinh dầu. Mép lá nguyên, có nhiều túi tiết nằm
sát mép lá trông như có răng cưa nhỏ. Cụm hoa là một chùm xim ở đầu cành,
mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, mùi thơm. Hoa mẫu 4. Cánh hoa dài 4 - 6mm,
rộng 1,5mm. Nhị 8, bốn nhị ngoài dài 5mm, bốn nhị trong dài 4mm. Bộ nhuỵ
dài khoảng 3mm, bầu sần sùi. Quả hình cầu hay bầu dục, đường kính 7 - 9mm,
chứa 1 - 2 hạt; vỏ quả có nhiều túi tiết tinh dầu, khi chín màu đỏ.
Còn theo Bùi Thu Hà thì Vương tùng là cây gỗ nhỏ, thường mọc thành bụi,
cao 2 - 4m. Ngọn cành và cuống lá non màu đỏ tím. Lá kép hình lông chim, mọc so
le, dài 10 - 25cm, có 3 - 9 lá chét. Lá chét hình mũi mác, dài 3,5 - 7,5cm, rộng 1,5 3,5cm, đầu lá thuôn hẹp tạo thành mũi nhọn, cuống lá dài 3 - 5mm. Mặt trên phiến
lá bóng, soi lên ánh sáng thấy rõ nhiều túi tiết tinh dầu. Mép lá
11
nguyên, có nhiều túi tiết nằm sát mép lá trông như có răng cưa nhỏ.
Cụm hoa là một chùm xim ở đầu cành, mang nhiều hoa nhỏ màu trắng,
mùi thơm. Hoa mẫu 4. Cánh hoa dài 4 - 6mm, rộng 1,5mm. Nhị 8, bốn
nhị ngoài dài 5mm, bốn nhị trong dài 4mm. Bộ nhuỵ dài khoảng 3mm,
bầu sần sùi. Quả hình cầu hay bầu dục, đường kính 7 - 9mm, chứa 1 - 2
hạt; vỏ quả có nhiều túi tiết tinh dầu, khi chín màu đỏ. Mùa ra hoa tháng
3-4, quả chín vào tháng 9-10. Tái sinh bằng hạt. Ưa sáng chịu hạn.
Hình 1.2: Tổng quát về Vương tùng ([3])
1.2.2.2. Thành phần hóa học
Theo Đỗ Tất Lợi, trong Vương tùng có các nhóm hợp chất:
tinh dầu, imperatozin, dentatin, nondetatin [3].
Đa số các nghiên cứu ở Việt Nam về loài này thường tập trung vào
tinh dầu do nó có nhiều tiềm năng để nghiên cứu hơn các phần còn lại.
Đây là thành phần hóa học chính phân bố chủ yếu ở quả già và lá chét, ở
cuống lá hoặc cành thì hàm lượng tinh dầu không đáng kể. Hàm lượng
tinh dầu trong M. glabra rất giàu menthon và isomenthon (85-95%) [13].
12
Năm 1989, Lê Tùng Châu và các cộng sự đã sử dụng một số phương
pháp như sắc ký khí, sắc ký khí chế tạo, đo phổ khối tử ngoại, hồng ngoại,
cộng hưởng từ piroson, sắc ký khí khối phổ, sắc ký khí hồng ngoại và làm
các phản ứng hóa học và đã xác định được trong tinh dầu Vương tùng có
chứa menthon, isomenthon, limonen, p.cymen và hydroxymenthon [5, 6].
Menthon
Isomenthon Limonen
P. cymene Hydroxymenthon
Hình 1.3: Một số hợp chất chính trong tinh dầu Vương tùng
1.2.2.3. Tác dụng dược lý và ứng dụng
Lê Tùng Châu và cộng sự đã công bố trên tạp chí dược học (1989) tinh
dầu Vương tùng có tác dụng diệt khuẩn khá mạnh, diệt được nhiễm trùng vi
khuẩn ở nồng độ 50 L/ml môi trường nuôi cấy được xác định bằng phương
pháp khuếch tán và phương pháp nồng độ. Ngoài ra tác giả còn nhận thấy
tinh dầu này còn có thể chữa cảm cúm, thấp khớp,nhức xương [6].
Theo tài liệu khác thì lá Vương tùng có khả năng chữa cảm cúm, sốt
rét, đau khớp, nắn bó gãy xương. Rễ chữa tê thấp, phù thũng [5, 12].
1.2.2.4. Phân bố
Theo Sách đỏ Việt Nam – Phần 2: Thực vật do Nguyễn Tiến
Bân làm chủ biên thì phân bố của loài Vương tùng là:
Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam) [8, 10]
Việt Nam: Quảng Ninh, Hải Phòng (Cát Bà), Hà Nam, Hoà Bình,
Ninh Bình, Thanh Hoá, Quảng Trị, Đà Nẵng [2, 3, 8-10].
13
Hình 1.4: Phân bố Vương tùng ở Việt Nam ([10])
1.3. Giới thiệu về phương pháp sắc ký khí khối phổ
Tinh dầu là một hợp chất chứa các chất thơm dễ bay hơi [16]. Vì
vậy, để có thể phân tích được thành phần của tinh dầu, người ta
thường dùng sắc ký khí khối phổ, vốn là phương pháp được tạo ra
nhằm xác định được thành phần của những chất dễ bay hơi.
1.3.1.
Nguyên tắc
Sắc ký khí là một phương pháp tách dựa trên sự phân bố khác
nhau của các chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau, trong đủ pha
động là chất khí (khí mang) đi qua pha tĩnh chứa trong cột. Sắc ký khí
được áp dụng để tách những chất hoặc dẫn xuất của chúng mà có thể
hóa hơi ở nhiệt độ phân tích. Phương pháp sắc ký khí dựa trên cơ chế
hấp phụ, phân bổ hoặc loại theo kích thước (dùng rây phân từ) [1].
Nguyên tắc của MS: Chất phân tích được chuyển sang thể khí và ion
hóa, tạo thành các ion dương hoặc âm. Phương pháp phổ khố dựa trên
việc đo trự tiếp tỉ số m/z, là tỉ số giữa khối lượng m và điện tích z của ion
phân tích. Từ phổ khối ta có thể có được thông tin về khối lượng phân tử
và cấu trúc các mảnh thu được giúp định tính hay định lượng [1].
1.3.2.
Ứng dụng trong kiểm nghiệm tinh dầu
Sắc ký khí- khối phổ là một kĩ thuật phân tích hiện đại và ngày càng được
ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là trong lĩnh vực kiểm nghiệm tinh dầu bởi ưu điểm
14
và độ phù hợp của nó. Bất chấp thiết bị đắt tiền và tốn nhiều thời
gian hơn so với một số kĩ thuật khác. Hiếm có kỹ thuật nào có độ
chính xác khi phân tích tinh dầu như sắc ký khí khối phổ[16].
Sự phù hợp của sắc ký khí đối với kiểm nghiêm tinh dầu: Do
thành phần tinh dầu chủ yếu là các terpenoid, dễ bay hơi, nên đặc
biệt phù hợp để sử dụng sắc ký khí phân tích. Sau khi đi qua cột sắc
ký các tinh dầu phức tạp có thể cho các peak chồng chất, khi đó,
khối phổ trở nên hiệu quả vì có thể nhận ra các peak chồng chất [32].
Tóm lại, các loại tinh dầu thường là một hỗn hợp phức tạp của rất nhiều
chất khác nhau, trong đó một số chất có cấu trúc hóa học tương tự nhau. Do
khả năng phân tách tốt các hỗn hợp chứa các thành phần dễ bay hơi như tinh
dầu nên GC-MS thường được ưu tiên sử dụng khi phân tích tinh dầu.
15
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1.
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu thực vật tươi và khô được thu hái ở Bản Lụa, Phường
Chiềng An, TP. Sơn La. Mẫu được cung cấp bởi khoa Tài nguyên
Dược liệu, Viện Dược liệu.
2.1.2.
Hóa chất sử dụng
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết
phân tích bao gồm:
Hóa chất làm tiêu bản: nước cất, nước Javen, acid acetic,
dd xanh methylene 0,05%, dd đỏ carmin 0,5%.
-
Dung môi chiết xuất: cloroform, ether dầu hỏa, EtOH 96%, nước cất.
-
Dung môi pha loãng tinh dầu: n-hexan
Pha động trong GC-MS: Heli
2.1.3.
Thiết bị sử dụng
Nghiên cứu đặc điểm thực vật:
Chụp ảnh mẫu nghiên cứu bằng máy ảnh Canon IXY 30S.
Kim mũi mác, dao lam, chổi lông, phiến kính, lamen, …
Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ 745T kết nối camera
Nikon DS-Fi2 và máy tính.
-
Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci kết nối camera Nikon DS-Fi2 và
máy tính.
Tủ sấy WiseVen.
Nghiên cứu thành phần hóa học:
-
Cân kỹ thuật Sartorius.
Cân phân tích hiện số Shimadzu AY 220.
-
Máy sắc ký khí khối phổ GC-MS-QP2010 Shimadzu (Nhật Bản),
2.2. Nội dung nghiên cứu
-
Xác định tên khoa học của mẫu thu thập được.
-
Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái cây Vương tùng thu hái ở Sơn La.
-
Mô tả đặc điểm vi phẫu của loài Vương tùng thu hái ở Sơn La.
16
Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu loài Vương tùng thu hái ở
-
Sơn La.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.
-
-
Phương pháp khảo cứu, kế thừa tài liệu
Tham khảo tài liệu để nắm được các thông tin cơ bản về:
+
Vị trí phân loại và danh pháp loài
+
Nguồn gốc và vùng phân bố(ở Việt Nam và trên thế giới)
+
Đặc điểm hình thái và sinh thái loài
+
Giá trị sử dụng của loài
+
Một số thành phần trong tinh dầu
Kế thừa tài liệu và các phương pháp nghiên cứu:
+ Kế thừa số liệu, kết quả từ các bài báo, các nghiên
cứu trong và ngoài nước
+ Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái,
nghiên cứu vi phẫu, tách chiết tinh dầu
2.3.2.
Phương pháp hình thái so sánh
Sử dụng phương pháp phân loại so sánh hình thái theo Nguyễn
Nghĩa Thìn (2007) [7] để xác định tên khoa học, nghiên cứu đặc điểm
hình thái và phân loại các taxon của các loài thu thập được. Phương
pháp này không đồi hỏi những thiết bị phức tạp, dễ tiến hành, đảm
bảo độ chính xác và phù hợp với điều kiện trong nước.
Đối chiếu các mẫu thu được với mẫu lưu trữ tại phòng tiêu
bản Dược liệu của Viện Dược liệu và ảnh type của mẫu tại Bảo
tàng Lịch sử tự nhiên Quốc gia Pháp.
2.3.3.
Phương pháp nghiên cứu giải phẫu
Nghiên cứu giải phẫu các phần lá, thân, rễ của các mẫu thu được
theo phương pháp nghiên cứu của Nguyễn Bá [4], Trần Văn Ơn [11].
Các bước thực hiện:
Cắt mẫu và tẩy nội chất
-
Cố định mẫu trên dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay microtome và cắt
bằng dao lam. Sử dụng phẫu thức cắt ngang. Cắt những lát mỏng qua rễ,
17
