Một số đặc điểm sinh hóa và giá trị dinh dưỡng của trùn biển 4

Chương 2


bo
LA

2.1. VAT LIEU
Trùn

bién

(Sipunculus

nudus)

huyện Ninh Hòa,

tỉnh Khánh

Hòa

được

thu nhận

tại vùng

ven bờ biển thuộc

vào các thời điểm khác nhau trong mùa

khô và

mùa mưa 2 năm 2065 - 2004.

Chuột nhất trắng Aus musculius var, Albino 3 tuần tuổi được cùng cấp bởi
Viện Pasteur Tp.HCM.

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp định đanh trùn biển [32]
Tiến hành thu nhận và xử lý mẫu trùn biển bằng cách cho vào hộp nhựa kích

thước 1§x12cm chứa 1⁄3 lớp cát biển lấy tại khu vực đánh bắt, chuyển đến phịng thí
nghiệm Động vật, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM

trong

vòng 24 giờ để định danh mẫu động vật dựa trên hình thái và cấu trúc cơ thể,
Mẫu trùn biển được rửa bằng nước cất, ngâm trong dung dịch MgCI; 10% đến
khi xúc tu của trùn biển bung ra ngồi cơ thể, sau đó cố định bằng alcol 70%. Tiến
hành định danh theo khóa phân loại động vật cua Linnaeus (1766).

2.2.2. Phương pháp xác định một số chỉ tiêu sinh lý của trùn biển
2.2.2.1. Hàm lượng nước trong cơ thể[§], [L7]

Chọn mẫu mội cách ngẫu nhiên cân tổng trọng lượng tươi, sau đó sấy khơ
mẫu ở nhiệt độ cố định 70 °C cho đến khi xác định được trọng lượng khô không đối.
Ở các thời điểm

2,3, 4... giờ sau khi sấy, lấy mẫu ra khỏi tủ sấy, cho ngay vào bình

hút ẩm, để nguội, cân lại trọng lượng mẫu. Người ta xem sự bốc hơi nước hoàn toàn
khi hai lần cân thứ chỉ cách nhau vài mg (tối đa là 5mg).

Từ kết quả trọng lượng tươi trước khi sấy và trọng lượng khô không đổi tính
ra tỷ lệ nước trong co thé tran biển.


2.2.2.2. Xác định pH dịch cơ thể và pH môi trường sống của trùn biển [17]

- Chọn mẫu ngẫu nhiên, rửa mẫu bằng nước cất, mổ khoang bụng thu dịch cơ
thể. Sử dụng máy đo pH (pH 526) ghi nhận giá trị pH của dịch cơ thể trùn biển.
- Sử dụng pH kế cầm tay (ECO pH - Singapore) đo trực tiếp giá trị pH của
mẫu nước trong khu vực đánh bắt trùn biển,

2.2.2.3. Khảo sát khả năng điều hòa muối của cơ thể trùn biển [17]
Tạo 3 môi trường lỏng khác nhau với cịng một dung tích.
-

Mơi trường Ï:

-

Mơi trường lÏ: dung dịch muối NaCl từ 15- 30%o.

-

Môi trường HT: nước cất.

Chọn

dung dich Ringer.

mẫu ngẫu nhiên và xác định trọng lượng của mdi con Vat.

Cho mẫu trùn biển vào ba mơi trường nói trên sao cho chúng ngập trong dung
dịch 120 phút, sau đó cân và xác định lại trọng lượng mỗi con, đồng thời kiểm tra lại

nổng độ muối của ba mơi trường trên.
Thí nghiệm

được thực hiện trên nhiều lô, mỗi lô 10 con, ghi nhận số liệu

thống kê và tính trị số trung bình.
2.2.3. Phương pháp thu mẫu và phân tích mẫu phiêu sinh vật

Trùn biển sinh sống ở các vùng biển triểu, chúng bắt mồi bằng các xúc tu bao
quanh miệng, vì thế thức ăn của trùn biển chủ yếu là các phiêu sinh lơ lửng trong
môi trường nước biển.
Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ phiêu sinh thực vật và phiêu sinh động vật
trong môi trường nước biển vùng triểu và trong hệ tiêu hóa trùn biển nhằm tìm hiểu

về thành phân thức ăn của chúng.
Tiến hành thu nhận mẫu nước biển (hệ phiêu sinh được thu nhận bằng lưới
vớt chuyên dụng kiểu lJuday, cố định bằng formalin 5% ngay tại hiện trường thu
mẫu) và mẫu nước cất hòa tan các thành phần trong ruột trùn biển (được cố định


=1

ba

bang formalin 5%). Sau d6, đem đến phịng thí nghiệm Thực vật, khoa Sinh học,
trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM

tiến hành quan sát hình thái dưới kính

hiển vị (vế, chụp hình) và định danh các lồi phiêu sinh thực vật dựa trên đặc điểm

hình thái [25]. Đồng thời, tiến hành định lượng mẫu phiêu sinh thực vật theo phương
phdp Sedgewick — Rafter (sử dụng buồng đếm tế bào có thể tích 50x20xÏ ram)
Tương

tự, tiến hành quan sát và xác định các lồi phiêu sinh động vật tại

phịng thí nghiệm

Động

vật, khoa

Sinh học, trường Đại học Khoa

học Tự nhiên

Tp.HCM dựa trên đặc điểm hình thái.
Thực hiện thu nhận

và phân tích (định tính và định lượng)

3 đợi mẫu

phiêu

sinh vật trong mơi trường nước biển vùng triểu và trong hệ tiêu hóa trùn biển.

2.2.4. Phương pháp chuẩn bị mẫu vật trùn biển
Trùn biển được làm sạch, thu nhận vách cơ thể và sấy khô (50°C), Nghiền

trần trong cối sứ hoặc xay bằng máy cho nhuyễn và sấy lại lần nữa. Bột trùn được
bảo quần trong bình hút ẩm để thực hiện thí nghiệm phân tích sinh hóa.
Đối với các thí nghiệm về vi sinh và sinh hóa, trần được làm sạch với côn 70”
và nước cất vô trùng. Giải phẫu và thu nhận ống tiêu hóa (ruộp) trong điều kiện vơ
trùng. Tiến hành phân lập vi sinh và khảo sát hoạt tính enzym protease, cellulase.
2.2.5. Phương pháp xác định hoạt tính enzym protease (theo Anson) [8]

* Nguyên tắc

Casein bị phân giải trong môi trường kiểm dưới tác dụng của protease tạo sản
phẩm là các đoạn pepHd ngắn hòa tan trong trichloroacetic acid (TCA), xác định

lượng tyrosin và tryptophan hòa tan bởi thuốc thứ Folin.
*Các hước thực hiện
Bước 1: Dung đồ thị chuẩn tyrosin.


28

Dung dịch hóa chất

Ống nghiệm

l

2

3

4

5

6

1,0
1,0

0
0

Dung dịch tyrosin chuan ImM/ (ml) |
Lượng tyrosin tương ứng (uM)

0,2
0,4 | 0,6 | 0,8 |
02 | 04 | 0,6 | 0,8 |

Dung dich HCl 0,2N (ml)

48 | 46 | 44 | 42 | 4,0 |

5,0

Dung dich NaOH 0,5N (ml)

10

10

10

10

10

10

Thuốc thử Folin (ml)
3
3
3
3
3
3
Lắc mạnh, sau 10 phút đo mật độ quang ở bước sóng 660nm hoặc 720nm
Bước 2: Xác định lượng tyrosIn trong dung dịch nghiên cứu.

Dung dịch hóa chất

Ống nghiêm
1

2

Dung dich casein 1% (ml)

5

5

Dung dich TCA 5% (ml)

0

10

Enzyme protease (ml)

1

l

Dung dich TCA

10

0

Lắc đều và giữ ở 35,5°C

5% (ml)

Để yên 30 phút, lọc lấy dung dịch bên dưới

Lấy 2 ống nghiệm sạch đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ
ống nghiệm 1, ống B 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin. Lac mạnh, sau
10 phút đo mật độ quang tại bước sóng 66Ơnm hoặc 720nm. Tính AOD

= ODA -

ODạ, dựa vào đồ thị chuẩn suy ra UM tyrosin.
*Tính kết quả
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong
điểu kiện chuẩn

(25,%5C, pH 7,6..) thủy phân

casein trong

1 phút tạo thành sản

phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho độ hấp thu OD ở bước
sóng 660nm tương ứng với 1uM tyrosin trong đồ thị chuẩn.
uM Tyrosin. V.L
Hd P=

(dvht)


Với V: tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm l hoặc 2 (ml).
v: thể tích dịch lọc đem phân tích (ml).

m: trọng lượng mẫu enzym xác định hoạt tính (g).

L: độ pha loãng mẫu enzym.
uM tyrosin: lượng HM tyrosin trong vứm]) suy ra từ đồ thị chuẩn.
2.2.6. Phương phap xac dinh hoat tinh enzym cellulase [8]

* Nguyên lắc
Cellulase

thuộc

nhóm

enzym

thủy phân

(hydrolase),

là enzym

thủy phân

cellulose thanh cellobiose.
Để xác định hoạt tính hệ enzym cellulase,
thích hợp

- CMC

(carboxyl

methyl

cellulose)

enzym cellulase sẽ tác dụng lên CMC,

với

cho enzym tác dụng với cơ chất
những

điều

kiện

xác

định.

Hệ

phóng thích các phân tử glucose, dựa vào

hàm lượng glucose xác định hoạt tính của enzym.
*+Các bước thực hiện

Bước 1: dựng đồ thị chuẩn glucose.

Bước 2: tạo hỗn hợp phần ứng gồm 3ml dung dich CMC, Im] dung dịch đệm

acetat và Iml dung dich enzym, ú ở 40°C trong 1 giờ. Đun cách thủy 5 phút. Sau đó
thêm ngay (hoặc pha lỗng với độ pha lỗng là L¿) các hóa chất dùng định lượng

đường khứ theo phương pháp Schaffer-Hartmanmn (mục 2.2.15)
Thực hiện tương tự với ống thử khơng.

Đựa vào hiệu số thể tích dùng để định lượng ống thử không và thử thật, căn
cứ vào đồ thị chuẩn suy ra lượng glucose (x) tao thành,

* Tính kết quả
Mội đơn vị hoạt tính của enzym cellulase là lượng enzym sau Ì giờ thủy phan

cellulose tao thanh Img glucose (6 điều kiện chuẩn pH 5,0, 40°C).


30

HdC=x.V.L,.b:

(dvht)

Với x : số mg glucose suy ra từ đường chuẩn.
V : tổng thể tích phần ứng thủy phân (ml).

L, : dd pha loãng mẫu enzym.
L¿: độ pha loãng dung dịch sau phản ứng thủy phân.
2.2.7. Phương

pháp

khảo

sát hoạt tính enzym

thủy phân

protein và cellulose

trong hệ tiêu hóa trùn biển [S]
Mẫu

trùn

biển

được

thu

nhận

tại khu

vực

khảo

sát và

chuyển

nhanh

đến

phịng thí nghiệm (khoảng 8 giờ sau đánh bất). Chúng tơi tiến hành mổ và lấy tồn
bộ đoạn ruột, nghiền trong cối sạch, thu dịch chiết và tiến hành các phan ứng định
lượng hoạt tính enzym protease và cellulase theo mục 2.2.5 và 2.2.6. Tại thời điểm

này bên trong ruột trần biển vẫn cịn thức ăn từ mơi trường tự nhiên.
Bên

cạnh

đó,

mẫu

trùn biển

sau đánh

bắt sẽ được

ni

trong phịng

thí

nghiệm và sứ dụng tảo Spirulina làm nguồn thức ăn. Sau thời gian nuôi 72 giờ, tiến
hành khảo sát hoạt tính của các hệ enzym thủy phần nều trên.

2.2.8. Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí và ky khí (theo Koch) [6]
* Nguyên tắc
Cấy một thể tích xác định dịch huyển phù cần nghiên cứu lên mơi trường đặc
trưng và sau đó đếm khuẩn lạc mọc lên. Mỗi khuẩn lạc được xem là kết quả của sự
phát triển từ một tế bào.
Mỗi trường cao thịÈt - pepton (cao thịt 0,5%, pepton

1%, NaC] 0,5% agar 2%,

nước biển 1000 ml), Mật độ vi sinh vật được biểu diễn bằng đơn vị khuẩn lạc CFU/
gram mau.
* Các bước tiến hành

Bước 1: chuẩn bị dịch pha lỗng theo bậc 10
Bước 2: cấy trên mơi trường thạch trong đĩa petri.


3

Bước

3: tính số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian điều kiện nuôi xác

định, phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng của loại vi sinh vật cần phát hiện.

*1ính kết quả
Số lượng vi sinh vật trong 1g cơ chất ban đầu với mức xác suất tin cậy là 99% (Py)

1
(x £ 2,7 8x) . K .——(CFU/g)
V
Với x: số khuẩn lạc trung bình mọc từ độ pha lỗng được chọn.

ơx: độ lệch bình phương trung bình.
NO

,7 là chuẩn tin cậy t khi P= 0,99.

K: độ pha loãng đã được dùng để cấy.

V: thể tích địch huyền phù được dùng để cấy.
2.2.9. Phương pháp định danh một số ching vi khuẩn hiếu khí phân lập từ hệ
tiêu hóa trùn biển
- Đối với các chủng vị khuẩn hiếu khí Gr(+), tiến hành quan sát hình thái
khuẩn lạc và tế bào, ghi nhận

một số đặc điểm sinh lý và sinh hóa, dựa vào khóa

phân loại của Bergey để định danh chúng vi khuẩn [30].
- Đối với các chủng vi khuẩn hiếu khí Gr(-), s¥ dung bé kit Bisl4 GNE (Cơng
ty Nam Khoa, TP. HCM)

để khảo sát một số đặc điểm sinh hóa của các ching vi

khuẩn, từ đó định danh đến giống hoặc đến loài (nếu được).

2.2.10. Phương pháp khảo sát khả năng phân giải protein, cellulose của các

ching vi khuẩn [24]
Chuẩn bị mơi trường thạch cao thị - pepton (mục 2.2.8) có chứa casein (để
phát hiện hoạt tính protease) hoặc CMC

(để phát hiện hoạt tính cellulase), chia đều

Cấy các chủng vi khuẩn cần khảo sát vào giữa hộp petri và ủ ở nhiệt độ
24 giờ, ghi nhận sự tăng trưởng của từng chúng vị khuẩn.


32

Tiến hành nhuộm mơi trường thạch có chứa casein bằng thuốc tht HgCl,
(15% HgCh, 20% v/v HCl) trong 5-10 phút. Ghi nhận và đo kích thước vịng phân

giải (nếu có) ở mỗi chủng vi khuẩn.
Tương tự, tiến hành nhuộm môi trường thạch có chứa CMC bằng thuốc thử
Lugol. Quan sát và đo đường kính vịng phân giải cellulose (nếu có) ở mỗi vi khuẩn.
2.2.11. Phương pháp thử nghiệm bổ sung vi khuẩn vào bể ni trùn biển trong

điều kiện phịng thí nghiệm
Chúng tơi tiến hành các lơ thử nghiệm bổ sung các chủng vi khuẩn đã được
phân lập từ chính các đoạn ruột của trùn biển vào môi trường nuôi ở điều kiện

phịng thí nghiệm nhằm chứng minh vai trị hỗ trợ quá trình phân giải thức ăn ở trần
biển của các chủng vi khuẩn chủ yếu phân lập từ hệ tiêu hóa trùn biển.
Trùn biển sau khi thu nhận được trải ra khay trong vòng 48 giờ để chúng thải
toàn bộ cặn bã và thức ăn thừa trong hệ tiêu hóa, sau đó mới tiến hành bố trí các lơ
thí nghiệm ni trùn biển trong các bể có kích thước 15x40x25em.

Các chúng vi khuẩn (5 ching vi khuẩn gồm 3 chủng hiếu khí và 2 chủng ky
khí) được ni cấy trên môi trường thạch nghiêng (môi trường cao thịt - pepton).
Sau 48 giờ thu nhận toàn bộ khuẩn lạc vi khuẩn vào nước cất vơ trùng (thể tích dịch

vi khuẩn 100ml tương ứng với 10 ống thạch nghiêng, 2 ống/chủng vi khuẩn).

Các thí nghiệm được bố trí như sau:
Thí nghiệm 1 (NTI): trùn biển (khơng cho ăn)
Thí nghiệm 2 (NT2): trùn biển + các chủng vi khuẩn.

Thí nghiệm 3 (NT3): trùn biển + tảo Spirulina.
Thí nghiệm 4 (NT4): trùn biển + tảo Špirulina + các chủng vi khuẩn.

Theo dõi ghi nhận khả năng sống của trùn biển cũng như biến động tổng số

vi khuẩn trong các nghiệm thức sau mỗi 24 giờ.


2.2.12. Phương pháp định lượng protein (theo Lowry) [3], [46]

* Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của những
acid amin này tùy thuộc vào loại protein, Vì vậy những protein cùng một loại với
nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau.

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành phức chất có màu.
Cường độ màu của phức chất này tỷ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng là
hàm lượng protein). Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm
lượng protem.
Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung địch

mẫu chifa vai chuc ug protein. Tuy nhiên, phương pháp này không dùng để định
lượng các protein không chứa acid amin vòng thơm như gelatn.
*Các bước thực hiện
Hút 0,4ml dụng địch protein cần xác định cho vào một ống nghiệm sạch và

sấy khơ. Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Dung dịch € là hỗn hợp dung dịch A (2g
Na¿CO; hòa tan trong NaOH 0,1N thành 10Ôm]) và dụng địch B (0,5g CuSO,.5SH;O
pha trong dung dich natri citrat 1% thành 100ml) theo tỷ lệ 49:1. Lắc đều và để yên

ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

Tiếp tục thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5-10 phúi, thêm nước
cất đủ 5ml. Đo mật độ quang ở bước sóng 750nm.
Lập đề thị chuẩn
Chuẩn

bị dung

dịch protein chuẩn

có các nồng

độ: 0, 59,

100,

150, 206,

250me/ml tt dung dich albumin chuẩn 0,1% pha loãng với nước cất theo các tý lệ
khác nhau.

Lấy 6 ống nghiệm, đánh số từ 0 - 5, cho vào đó các chất tham gia phản ứng
theo bảng sau:


34

Ống số | Protein 0,1% (ml)

0
1
2
3
4
5

|

0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5

HạO (ml) | Nồng độ protein (mg/ml)

|

10

9,5
9,0
8,5
8,9
7,5

!

0
50
100
150
200
250

Hút 0,4m] dung dịch protein có nơng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha

ở trên theo thứ tự từ O đến 5 vào bảy ống nghiệm sạch khác (gồm hai ống thử không
và năm ống từ 1 đến 5). Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ

phòng trong 5 phút. Sau đó, thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 — 10
phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, Đo mật độ quang ở bước sóng 750nm.

* Tính kết quả

Từ đồ thị chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein. Từ
đó suy ra hàm lượng protein nguyên liệu là a (y/mÙ).
Lượng protem (M) có trong Ígø ngun liệu được tính theo cơng thức:
a. 10°.n
M =——

m

(mg protein/g)

Với a: hàm lượng protein (y/ml dung dịch)

n: hệ số pha lỗng
m: khối lượng ngun liệu lấy phân tích
2.2.13. Phương pháp định lượng ammonlac [1ó]

* Nguyên tắc
Sử dụng chất kiểm mạnh hơn ammoniac để đấy muối amonl ra thể tự do
(kiểm quá mạnh

sẽ ảnh hưởng đến thực phẩm). Dùng hơi nước kéo ammoniac đã

được giải phóng

ra thể tự do sang bình chuẩn độ, định lượng bằng HạSO,0,1N

chất chỉ thị 1a alizarin natri sulfonat.
2NH,CI

+ Mg(OH);

_—>

2NH,

+ 2H»,O

+ MeCh

với


35

2NH3 + H,SO, —- (NH,).S80,

* Các bước thực hiện

Bước 1: Rửa máy cất ammonlac.
Bước 2: Chưng cất đạm

+ Tính kết quả
Hàm lượng NHạ trong 100 gram thuc pham:

1,7. (V-V,) . 100
1000. m

Vdi V: thé tich H)SO, 0,1N cho vao binh chuan dé,
V„: thể tích NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng H;SO/ thừa.
m: khối lượng mẫu dùng định lượng.
2.3.14. Phương pháp định lượng đường tổng số hòa tan bằng phan ung mau [8]
* Nguyên tắc
Đường

và nhiều chất hữu cơ với sự hiện điện của H;SO, sẽ cho phản ứng

màu đặc trưng. Sự chính xác của kết quả phụ thuộc vào :
-_

Độ sạch của các dụng cụ sử dụng.

-_ Độ tinh khiết của thuốc thử,
-_ Nhiệt độ phải cế định trong suốt thời gian Ổn nhiệt,
*Cách trích đường

Cho vào cốc thủy tỉnh (50ml) 0,5g ngun liệu và thêm lƠml cơn 90”. Dun
sôi cách thuỷ 3 lần. Khuấy đều, để nguội lọc qua lọc khơng tro.

Tiếp tục cho IƠml cồn §0” vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sôi cách thuỷ.
Để nguội, lọc. Chiết rút như vậy khoảng 3 lần, sau đó đưa bã lên lọc và tráng thêm

2- 3 lần bằng một ít cơn 80” nóng.
Cho bay hơi rượu bằng cách đun nhẹ sôi trên nồi cách thủy. Sau khi cho rượu

bay hơi, mẫu được giữ trong bình hút ẩm.


36

Pha lỗng cặn khơ thành 50ml. Khi đem làm hiện màu, dung dịch trên được

pha loãng thêm 5 lần.
Phản ứng màu của dung dịch đường thực hiện theo một trong ba cách: dùng
phenol, antron hoặc orcinol. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp
dùng phenol.
Thực hành: Lần lượt hút chính xác vào 7 bình định mức 100ml lượng dung dịch

saccharose mẫu 0,1% theo thứ tự: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7ml rồi cho nước cất tới vạch, lắc đều.
Sau đó cho Iml vào ống nghiệm và tiến hành nhuộm màu bằng phenol và H;SO/,.
Số ống

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 | 1]

ml saccharose 0,1% mau
ml nước cất

0
1

0
1

1
0

1
0

1
0

1
0

1
0

1
0

1
0

0
|0

Nông độ đường trong mỗi|

0 | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50

ml đường định nồng độ

ống (ug/ml)

0

010101010

};0 4}

0 4]

0

1 | 1

10
10

|60|70 | x | x

Dung dich phenol 5%

]

]

1

l

]

1

]

l

1

]

l

HaS0a đậm đặc

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

Để yên 10 phút rồi lắc đều. Sau đó được ổn nhiệt ở 25 — 30 °C tạo màu. Màu
bén trong vai gid. Đo mật độ quang ở bước sóng 490nm.
* Tính kết quả
Trị số mật độ quang (OD) của những ống chuẩn sau khi trừ đi trị số của ống
thử không sẽ xác định được đồ thị mẫu. Với dung dịch cần định nồng độ, trừ đi trị số

ống thử không rồi chiếu vào đồ thị mẫu để suy ra nồng độ x, từ đó tính được %
lượng đường có trong mẫu nguyên liệu.
% đường

=

Mp

m

Với mp: khối lượng đường.
m: khối lượng nguyên liệu.

.100%

37

2.2.15. Phương pháp định lượng đường khử (theo Schaffer-Hartmamn) [§]

* Nguyên tắc
Theo định luật tác dụng khối lượng, pha trộn dung dich ion Cu”? với KI thì ta

có một cân bằng hóa học sau: 2 Cu” + 47 2 2 Cu’ +2041
Nếu có một chất nhận hết ion Cu”, ví dụ oxalat kali, thì trong dung dịch lúc
này chỉ có chất oxalo Cu” va I, khơng có iod tự do. Nếu thêm vào một lượng thừa
KIO; va acid hóa dung dich, 10, gap I sé phong thich mội lượng thừa iod là A. Nếu

ta khử một phần hóa hợp oxalo Cu”” thành Cu” (ví dụ bởi một đường khử).

2 Cu”” + 2OH > 2 Cu* +H,O0 +0
-CHO +0

-— -COOH

Va acid hoa sau:
SKI + KIO, + 3H,SO, > 1, + 3 HạO + 3 K;SO¿
lon Cu” sẽ kết hợp với một lượng T cho ra Cul. Do đó khi acid hóa, chỉ phần
T còn lại tác dụng với KIO¿ thừa để phóng thích một lượng iod là a. Vì vậy hiệu số
(A-a) tương ứng với lượng đường tham dự vào phản ứng trên.
* Các hước thực hiện

Thực hiện 7 ống nghiệm theo bang sau:

Ông số

L7

Dung dich glucose mau (0,2mg/l) (ml)
0
Nude cat (ml)
5
Nông độ đường trong mỗi Ong (mg/ml) | 0
Dụng địch đường cần định phân (ml)

0

2 | 3 | 4. ]

]
4
(0/04
0

2
3
3
2
0,08 | 0,12
Q

0

5)

6

|7

4
I
[0,16

5
0
9,20)

0
0
x

0

0

5

Cho vào mỗi ống 5ml thuốc thử Schaffer- Hartmann, lắc đều, đun sôi cách
thủy trong

15 phút, làm lạnh đưới vịi nước,

sau đó thêm

vào mỗi ống 5ml H;SỊ,

2N, lắc đều và để yên trong 1 phút để hòa tan Cu¿O.
Định phân l; phóng thích với Na;S5;O; N/200 với chỉ thị là hồ tình bột.


38

* Tính kết quả

Lập hiệu số giữa ống thử khơng va` thử thật. Vẽ đồ thị mẫu với hiệu số của
các ống 2, 3, 4, 5, 6 rồi suy ra nồng độ (x) của dung dịch đường trong ống 7.
2.2.16. Phuong phap dinh lugng lipid thé (theo Soxhlet) [8]

* Nguyên tắc
Ngun liệu đã được làm khơ, trích lipid bằng diethy] ether (máy Soxhlet)

và xác định khối lượng chất béo.
* Các bước thực hiện

Giấy lọc và bột trùn đã được sấy khô tuyệt đối. Cân và ghi nhận khối lượng
(khoảng 3 gram).

- Cho mau vao may Soxhlet. Dé diethyl ether vao binh cau (3/4 thé tích bình
cầu). Lắp cột làm lạnh và cho nước hoàn lưu.

-_ Tiến hành đun cách thủy (nhiệt độ 40 — 44 °C) trich lipid khoảng 12 giờ.
-_ Gắn bình cầu vào một ống hồn lưu để thu hồi dung môi.
-_

Đổ cặn lipid vào 1 cốc đốt 100ml khơ, sạch và đã cân chính xác trọng lượng.

Tráng kỹ bình cầu 3 lần bằng 10ml ether và đổ vào cốc đốt.
-_

Đun cách thủy nhẹ đuổi ether, sau đó sấy 100 — 105 °C trong 1 giờ.

-_ Để nguội, đặt trong bình hút ẩm, cân chính xác khối lượng cốc.
* Tính kết quả
Hàm lượng lipid thơ trong ngun liệu :
% lipid =

Với

100 (m,; - mạ)

m

m¡: khối lượng cốc đốt có chứa lipid.
mạ: khối lượng cốc đốt khơng.
m : khối lượng nguyên liệu.


39

2.2.17. Phương pháp xác định các chỉ số của lipid [20]
2.2.17.1. Chỉ số acid

* Nguyên tắc
Độ acid của dâu (mỡ) hay chỉ số acid của dầu (mỡ), là số miligram (mg)

KOH cần thiết để trung hòa những acid béo tự đo có trong Í gram mỡ.
* Các bước thực hiện
Cho vào erlen 1 gram lipid, 5ml ethanol, 2 giọt phenolphtalem 0,5% trong côn.

Chuẩn độ bằng dung địch KOH 0,1N cho đến khi dung địch chuyển sang màu hồng.
* Tinh két qua
im] KOH 0,1N tudng ng 5,6mg KOH

Do đó, lượng KOH dùng để chuẩn độ acid béo tự do có trong 1 gram chất béo
(lipid) la C = 5,6.V.f

Với C: chỉ số acid
V: lượng dung dịch KOH 0,IN đã dùng để chuẩn độ

f: hệ số điều chinh cha dung dich KOH 0,1N.
2.2.17.2. Chi s6 iod

Chỉ số iod là số gram iod c6 thé phan ting hét vdi 100 gram chat béo (lipid)
* Nguyên tắc
Xác định chỉ số iod đựa trên khả năng iod kết hợp được với acid béo ở chỗ

những liên kết kép:
R-CH=CH-R + lạ + HO = RCH-CH-R

m
[

OH

* Các bước thực hiện
Cho vao erlen 0,1- 0,2 gram lipid va 10m! ethanol 96%, sau dé cho chinh xac

LOml iod 0,1N trong cén. Lac déu, dé yén 15 phút. Sau 15 phút, chuẩn độ bằng


40

Na;SzO; 0,1N, có màu

vàng nhạt, rồi thêm

1ml hồ tinh bột 1%, chuẩn độ tiếp cho

đến khi mất màu xanh.
Thực hiện thử không với lượng lipid được thay bằng nước cất,

* Tính kết quả
1ml Na;5;O; 0,IN tương ứng 12,69mg I,

Chỉ số iod tính theo cơng thức
(Vi- V2). f . 12,69 . 100
C=

m

. 1000

Véi V: lugng Na2S,03 0,1N da ding để chuẩn độ bình thử khơng (mì).

V¿ạ: lượng Na;S;Os 0,1N dùng chuẩn độ bình thử thật (ml).
f: hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Naz§zOs 0,1N.
m: lượng lipid dùng cho thí nghiệm (ø).
2.2.18. Phương pháp phân tích thành phần acid amin trong protid trùn biển
Sắc ký lỏng cao 4p (HPLC- High performance liquid chromatography) là một

kỹ thuật tách dựa vào sự phân bố khác nhau của các hợp chất ở hai pha: pha tĩnh và
pha động [35].

Thành

phần

acid amin

trong protid trùn biển được phân

tích theo phương

pháp sắc ký lồng cao áp tại Trung tâm Dịch vụ và Phân tích thí nghiệm TP.HCM

Các điều kiện và thông số vận hành của máy HPLC:
-

Pha

động:

gồm

pha

động

A

(940ml

dung

dich

CH;COONa

+ TEA

(triethylamin) pha với 60m] acetomitril nguyên chất) và pha động B (dung
dich acetonitril 60%)

-

T6c độ dịng: 1,0ml/phút

- _ Bước sóng hấp thu: A= 254nm
- - Loại cột: PIcoTag 150x3,9mm


4

-

Đầu dò: UV

-

Bơm: LC 10AD (Shimadzu)

-_

Nhiệt độ cột: 40— 43C

- _ Thể tích mẫu nạp: 20Hl
-

thời gian phân tích: 30 phút.

2.2.19. Phương pháp phân tích thành phần các nguyên tố khoáng trong vách cơ
thể trùn biển
Thành phần các nguyên tố khoáng hiện diện trong vách cơ thể trần biển được
phân tích theo phương pháp quang phổ phát xạ tại Trung tâm Phân tích thí nghiệm

thuộc Liên đồn Bán đổ Địa chất Miền Nam.
2.2.20. Phương pháp bố trí thí nghiệm khảo sát một số chỉ tiêu sinh lý của chuột

nhất trắng khi được sử dụng thức ăn bổ sung bột đạm trịn biển
Tiến hành các thí nghiệm bổ sung bột đạm trùn biển (sinh khối vách cơ thể
trùn biển) vào khẩu phần ăn của chuột nhất trắng và đánh giá hiệu quả tác động dựa
vào một số chí tiêu sinh lý của chuột như: khả năng tăng trọng; số lượng hồng cầu,
hàm lượng hemoglobin;

hàm

lượng protein toàn phần, albumin

va globulin trong

huyết thanh, trạng thái sinh lý hoạt động của chuột.
Chuột nhất trắng 3 tuần tuổi, khơng phân biệt giới tính, được ni ổn dinh |

tuần trước khi tiến hành thử nghiệm.
Bố trí 4 lơ thí nghiệm, mỗi lơ 6 con, được bố trí khẩu phần ăn như sau:
®-

Lơ thí nghiệm

Í (TNI): chuột được nuôi bằng thức ăn viên do Viện Pasteur

TP.HCM cung cấp, với thành phần gồm bột cá, bột đậu nành...
e

L6 thi nghiém 2 (TN2): chuột được nuồi bằng viên cám gạo.

e®

Lơ thí nghiệm 3 (TN3): chuột được ni bằng viên cấm gạo có bổ sung

10% đạm casein (Trung Quốc)


42

e©_ Lơ thí nghiệm 4 (TN4): chuột được ni bằng viên cám gạo có bổ sung
10% bột đạm trùn biển.
Đánh dấu từng con trong lơ thí nghiệm, sau mỗi 7 ngày tiến hành khảo sát

đặc điểm sinh lý từng con, thời gian theo dõi là 4 tuần và thí nghiệm lập lại 5 lần.
2.2.21. Phương pháp định lượng protein huyết thanh bằng phản ứng Biure [28]

* Nguyên tắc
Protein (có các liên kết pep0d) tác dụng với CuSO¿ và NaOH

tạo thành phức

chất có màu tím hồng. So với biểu đồ mẫu để tính lượng protein.
*Các bước thực hiện

Bước 1: Dựng đơ thị chuẩn.
Bước 2: Định lượng protein toàn phần của huyết thanh.
Cho vào ống nghiệm 0,05ml huyết thanh và 0,95m] NaCl1 9%, sau đó cho 4ml
thuốc thử Gocnan.

Trộn đều, để 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang với

bước sóng 550nm.

Thực

hiện tương tự với ống thử khơng

(1ml NaCl 9% và 4ml

thuốc thử Gocnan).

* Tính kết quả
So với đồ thị chuẩn tính ra lượng protein trong 100ml huyết thanh.
2.2.22. Phương pháp định lượng albumin và globulin trong huyết thanh [28]
* Nguyên tắc

Globulin được kết tủa bằng natrisulphat (Na;SO,) và được tách riêng bằng ly
tâm sau khi bảo hòa dung dịch với ether ethylic.
*Các bước thực hiện

Cho 0,2ml huyết thanh vào ống ly tâm và 4ml Na;SO¿ 23%, lắc đều. Lập tức
đong ngay

đó thêm

1ml hỗn hợp trên để định lượng protein toan phan

theo muc 2.2.21. Sau

1ml ether vào hỗn hợp còn lại. Đậy nút, lắc mạnh trong 20 giây. Ly tâm

nhanh 10 phút. Globulin đóng thành bánh giữa lớp ether và dung dịch NaaSO..


43

Ống P: 1ml hỗn hợp huyết thanh và Na;SOu,
Ống

A:

Iml

dung

dich Na;SÔ¿

(dùng

pipet xuyên

qua

lớp bánh

globulin

xuống lớp Na;SO/ bên dưới).

Ong T: Iml dung dich Na SO, 23%.
Thêm vào mỗi ống trên 3ml thuốc thử Gocnan, lắc đều, để tiếp xúc 30 phút.
Đo mật độ quang với bước sóng 55Ơnm.

* Tính kết quả
Gọi E là mật độ quang học

E (ống P). hệ số albumin = protein toàn phần (g)/ 100m1.
E (ống A). hệ số albumin = albumin (g)/ 100m.

Protein toàn phần — albumin = globulin (g)/ 100ml.
Hệ số albumin = hé s6 protein toan phan. 2" _
81

2.2.23. Phương pháp xác định số lượng hồng cầu bằng phịng đếm [15], [2§]
* Ngun tắc
Pha lỗng máu ở một tỷ lệ nhất định, sau đó cho máu vào phịng đếm đã biết

rõ kích thước, rồi đếm dưới kính hiển vi ở một thể tích nhất định, từ đó tính ra số
lượng hồng cầu có trong lmm” mấu.
* Các bước thực hiện
Bước L: sát trùng và chích máu

Bước 2: hút máu và pha loãng trong ống trộn hồng cầu.
Hút máu vào ống trộn đến vạch 0,5, hút một lần lên tục tránh không để cột

máu bị ngắt quãng bởi bọt khí. Tiếp tục hút dung dịch đếm hồng cầu đến đúng vạch
101. Lắc ống trộn thật đều.