Phân tích tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 liên quan đến khả năng chịu mặn ở cây lúa (Oryza Sativa)

,d,

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--

Trần Xuân An

PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN
OsHKT1;5 LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở CÂY LÚA
(Oryza sativa)

Chuyên ngành

: Di truyền học

Mã số

: 60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

H N i - 2018

TS. ĐỖ THỊ PHÚC


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ
LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ Thị Phúc, người thầy, người
hướng dẫn, đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô công tác tại Bộ môn Di
truyền học, Khoa Sinh học đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này.
Trong quá trình học tập và nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Di
truyền học, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ và chia sẻ tận tình về chuyên môn
của bạn, các anh chị trong phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh
học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Tôi xin chân
thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Cuối cùng, tôi vô cùng cảm ơn gia đình, đồng nghiệp tại Trung tâm Chiếu xạ
Hà Nội và tất cả các bạn bè đã động viên và chia sẻ khó khăn cùng tôi trong suốt
thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn!

Trần Xuân An


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ
BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

Bp

Basepair

Cặp bazơ

cDNA

Complementary DNA

ADN bổ sung

DNA

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

Deoxyribonucleoside
triphosphate

dS/m

deci Siemens per meter

Deci Siemen trên mét

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

Axit etilenediamin-tetraaxetic

gDNA

Genomic DNA

ADN Hệ gen

Gly

Glycine

Glyxin

HKT

High-Affinity K+ Transporter

Kênh vận chuyển K+ ái
lực cao

mRNA

Messenger RNA

ARN thông tin

Os

Oryza sativa

Lúa

PCR

Polymerase Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng
hợp

ppm

part per million

Một phần nghìn

Ser

Serine

Serin

QLT

quantitative trait loci

Locus tính trạng số
lượng

TF

Transcription factor

Nhân tố phiên mã


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ
MỤC LỤC

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3
1.1. Đất nhiễm mặn và ảnh hƣởng đến năng suất cây trồng ...............................3
1.1.1. Giới thiệu về đất nhiễm mặn ...................................................................3
1.1.2. Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam .....................................................3
1.1.3. Ảnh hƣởng của mặn tới năng suất, chất lƣợng cây lúa ..........................4
1.2. Cơ chế tác động của đất nhiễm mặn đến cây trồng ......................................4
1.3. Các họ protein vận chuyển ion Na+ ở cây trồng ...........................................8
1.3.1. Vai trò của protein NHX và SOS trong việc duy trì nồng độ Na+ thấp
trong tế bào chất ..................................................................................................8
1.3.2. Protein HKT đóng vai trò chính trong khả năng chịu mặn của thực vật
và ngăn chặn Na+ vận chuyển từ rễ đến thân....................................................10
1.4. Họ gen OsHKT ở cây lúa ............................................................................12

1.5. Gen OsHKT1;5 ............................................................................................14
1.6. Nghiên cứu đa hình sử dụng phƣơng pháp PCR kết hợp giải trình tự gen ...16
1.6.1. Kĩ thuật PCR ............................................................................................16
1.6.2. Giải trình tự gen ......................................................................................17
1.6.3. Phân tích tin sinh học ..............................................................................19
1.7. Nghiên cứu biểu hiện của gen sử dụng phƣơng pháp Realtime-PCR ...........21
2.1. Đối tƣợng và vật liệu nghiên cứu ..................................................................24
2.2. Phƣơng pháp phân tích đa hình gen ..............................................................25
2.2.1. Trồng và thu mẫu .....................................................................................25
2.2.2. Tách chiết DNA tổng số ...........................................................................25
1


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

2.2.3. Khuếch đại gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu ............................26
2.2.4. Điện di trên gel Agarose ..........................................................................27
2.2.5. Tinh sạch và giải trình tự gen ..................................................................28
2.2.6. Phân tích trình tự gen bằng các công cụ tin sinh ....................................28
2.3. Phƣơng pháp phân tích mức độ biểu hiện gen ..............................................28
2.3.1. Trồng lúa thủy cảnh và thu mẫu ..............................................................29
2.3.2. Tách chiết ARN tổng số ...........................................................................29
2.3.3. Tổng hợp cDNA dùng mồi oligo T...........................................................30
2.3.4. Phản ứng Realtime-PCR .........................................................................30
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................33
3.1. Phân tích đa hình gen OsHKT1.5 ở các giống lúa ........................................33
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số ...........................................................................33
3.1.2. Phản ứng PCR nhân bản trình tự promoter và trình tự mã hóa của gen

OsHKT1.5 ..........................................................................................................33
3.1.2.1. Thiết kế mồi...........................................................................................33
3.1.2.2. Nhân vùng Promoter của gen OsHKT1.5.............................................36
3.1.2.3. Nhân vùng CDS của gen OsHKT1;5 ....................................................36
3.1.3. Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;5 ............................37
3.2. Đánh giá mức độ biểu hiện gen OsHKT1;5 đáp ứng điều kiện mặn ............43
3.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ mô lá .............................................................43
3.2.2. Thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ................................................44
Realtime-Actin ...................................................................................................45
2


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

3.2.3. Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 bằng phƣơng pháp Realtime PCR ............................................................................................................45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................50
Kết luận .................................................................................................................50
Kiến nghị ...............................................................................................................50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................51
Phụ lục 1. Kết quả phân tích các yếu tố cis trình tự promoter (-1500kb tính từ mã
khởi đầu ATG) giống Nipponbare bằng công cụ PlantCARE .................................59

3


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Các con đƣờng điều hòa chống chịu stress mặn ở thực vật ......................7
Hình 1.2. Hai phân họ của họ gen HKT ..................................................................10
Hình 1.3. Cấu trúc gen một số thành viên họ gen lúa .............................................13
Hình 1.4. Mô hình gen AtHKT1;1 và OsHKT1;5 tách Na+ khỏi lá cây bằng cách
loại bỏ Na+ khỏi xylem. ............................................................................................14
Hình 1.5. Các giai đoạn trong phản ứng PCR ........................................................16
Hình 1.6. Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp Sanger...................................18
Hình 1.7. Sơ đồ giải trình tự gen theo phƣơng pháp giải trình tự tự động .............19
Hình 1.8.Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR .....................................................22
Hình 3.1. Kết quả điện di DNA tổng số tách từ các giống lúa nghiên cứu .............33
Hình 3.2 Sơ đồ cấu trúc gen và các đoạn sản phẩm trong PCR .............................34
Hình 3.3. Kiểm tra độ đặc hiệu các các cặp mồi sử đụng để nhân bản Promoter và
CDS gen OsHKT1;5 .................................................................................................35
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng promoter của gen OsHKT1;5 .......36
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR vùng CDS của gen OsHKT1;5 ..............37
Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự axit amin của Protein OsHKT1;5 ....................41
Hình 3.7. Kết quả mô phỏng cấu trúc protein OsHKT1;5 (A. Mô hình cấu trúc
protein TrkH; B và C. Mô hình cấu trúc protein OsHKT1;5 và các vị trí đột biến
làm thay đổi axit amin). ...........................................................................................42
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số của giống lúa Pokkali
..................................................................................................................................44
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu các các mồi sử dụng để xác định độ biểu
hiện của gen OsHKT1;5...........................................................................................45
4


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

Hình 3.10. Biểu hiện của gen OsHKT1;5 ở lá 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali..
..................................................................................................................................46
Hình 3.11. Biểu hiện của gen OsHKT1;5 ở rễ 2 giống lúa Nipponbare và Pokkali.
..................................................................................................................................47

5


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng ................................................5
Bảng 1.2. Các thành viên họ gen HKT ở lúa [39]. ..................................................13
Bảng 2.1. Một số giống lúa sử dụng trong nghiên cứu ...........................................24
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gene ..........................................26
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene .....................................27
Bảng 2.4. Thành phần và quy trình tổng hợp cDNA ...............................................30
Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng nhân bản vùng promoter và CDS của gene
OsHKT1;5 ................................................................................................................34
Bảng 3.2. Sơ đồ kết quả so sánh trình tự nucleotide và thay đổi yếu tố cis trên
promoter của gen OsHKT1;5...................................................................................38
Bảng 3.3. Các yếu tố Cis thay đổi do đa hình promoter gen OsHKT1;5 ................39
Bảng 3.4. Sơ đồ kết quả so sánh trình tự nucleotide của CDS gen OsHKT1;5 ......40
Bảng 3.5. Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng Realtime-PCR ................................44

6

Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ
MỞ ĐẦU

Hiện nay, dưới tác động của biến đổi khí hậu, vấn đề đất nhiễm mặn ngày
càng trầm trọng hơn, đặc biệt là các khu vực ven biển. Đất nhiễm mặn gây ảnh
hưởng xấu tới sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại cây trồng.
Lúa là cây lương thực chủ yếu và quan trọng nhất đối với người dân Việt
Nam. Lúa là loài cây trồng mẫn cảm với các tác động đến từ bên ngoài (điều kiện
ngoại cảnh). Hàng năm, thiệt hại về lương thực do thiên tai, ngoại cảnh bất lợi là
không hề nhỏ. Đây cũng được xem là những yếu tố chính làm giảm năng suất lúa.
Do vậy, việc lựa chọn và chọn tạo giống cây lúa thích nghi với điều kiện
mặn là cần thiết để đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, cũng như sự tăng trưởng
của kinh tế Việt Nam.
Từ lâu, ngoài việc lựa chọn lúa có năng suất cao dựa vào đặc điểm hình thái
của cây, việc lựa chọn lúa có kiểu gen chống chịu với ngoại cảnh bất lợi ngày càng
được quan tâm nghiên cứu. Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh
học, các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng nhiều vào việc sàng
lọc, lai tạo, nhân dòng gen có tính chống chịu cao.
Để tạo ra các giống cây trồng chịu mặn thì việc nghiên cứu các gene quy
định các tính trạng chống chịu mặn là hết sức quạn trọng, đặc biệt là các gene mã
hóa cho các kênh vận chuyển ion Na+, K+ như họ gene HKT. Trong đó, gene
OsHKT1;5 là một gene quan trọng tham gia vào quá trình cân bằng ion của tế bào
trong quá trình chống chịu mặn ở cây lúa.
Hiện nay, chưa có nghiên cứu nào về gen OsHKT1;5 ở cây lúa được tiến
hành ở Việt Nam. Vì những lý do trên chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân tích tính
đa hình v mức đ biểu hiện của gen OsHKT1;5 mã hóa cho protein vận

chuyển ion ở cây lúa (Oryza sativa)” với mục đích:

1


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

- Phân tích đa hình gen OsHKT1;5 ở một số giống lúa có khả năng chịu
mặn khác nhau.
- Nghiên cứu mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;5 đáp ứng với điều kiện
mặn ở lúa.

2


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Đất nhiễm mặn và ảnh hƣởng đến năng suất cây trồng

1.1.1. Giới thiệu về đất nhiễm mặn
Đất mặn là đất có chứa nhiều muối hòa tan như là: NaCl, Na2SO4, CaCl2,
CaSO4, MgCl2, NaHCO3… Nguồn gốc của những loại muối này rất khác nhau
(nguồn gốc lục địa, biển hay nguồn gốc từ sinh vật,… ), nhưng nguồn gốc ban đầu

của những loại muối này đều xuất phát từ các thành phần khoáng của đá núi lửa.
Những loại muối này có nguồn gốc từ muối hòa tan trong quá trình phong hóa đá,
chúng di chuyển tập trung ở những dạng địa hình trũng không thoát nước, kết hợp
với các yếu tố như đá mẹ, khí hậu khô hạn, mực nước mặn nông và sinh vật ưa
muối,… hình thành lên đất mặn [2].
Ở Đồng bằng Sông Cửu Long, cũng như các vùng đất bằng phẳng ven biển
khác ở nước ta, đất mặn là loại đất khá phổ biến. Quá trình đất bị mặn hóa có liên
quan chặt chẽ với vị trí địa lý, địa hình, tác động các của dòng chảy, sự hình thành
sự xâm lấn, mức độ mặn của nước biển và các hoạt động sản xuất của con người.
Ở Việt Nam, đất mặn được hình thành do nước biển dâng lên bởi thủy triều hoặc
do nước mặn từ các dòng chảy ngầm di chuyển lên mặt đất, một nguyên nhân khác
của sự mặn hóa là vấn đề sử dụng nước mặn từ các kênh tiêu dẫn vào đồng ruộng
khi thiếu nước ngọt. Ở một số vùng Việt Nam, có các dòng nước mặn ngầm rất gần
với mặt đất, trong canh tác cây trồng cạn sự bốc hơi cũng là nguyên nhân kéo nước
mặn lên làm nhiễm mặn đất tầng mặt [2].
1.1.2. Tình hình đất nhiễm mặn ở Việt Nam
Việt Nam là nước có bờ biển dài 3.260 km (không kể các đảo). Hiện nay,
dưới tác động của biến đổi khí hậu, băng tan, mực nước biển dâng cao, làm vấn đề
mặn hóa có nguy cơ trầm trọng hơn. Theo công bố của Bộ Tài nguyên và Môi
trường năm 2012 thì Việt Nam là 1 trong 5 nước trên thế giới chịu ảnh hưởng nặng
nề nhất của biến đổi khí hậu. Chỉ tính riêng mực nước biển nếu dâng 75 cm đã làm
cho 19% diện tích khu vực Đồng bằng sông Cửu Long bị ngập. Nếu nước biển
3


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

dâng 1m vào năm 2100, sẽ làm ngập gần 38% diện tích khu vực Đồng bằng sông

Cửu Long. Theo Hồ Quang Đức (2010) cả nước có khoảng trên 1 triệu ha đất mặn,
chủ yếu ở các tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu Long, ngoài ra có một ít đất mặn nội
địa phân bố ở Binh Thuận và Bình Thuận, gọi là đất mặn kiềm [2].
1.1.3. Ảnh hưởng của mặn tới năng suất, chất lượng cây lúa
Diện tích gieo trồng những năm gần đây có xu hướng giảm, do ảnh hưởng
của biến đổi khí hậu (hạn hán, nhiễm mặn), do chuyển đổi mục đích sử dụng đất,
chuyển đổi cơ cấu cây trồng.
Theo báo cáo số 152/BC-TCTK ngày 28/6/2017 của Tổng cục Thống kê,
tính riêng vụ đông xuân 2017, hai vùng có diện tích đất lúa giảm nhiều nhất là
vùng Đồng bằng sông Hồng và Đồng bằng sông Cửu Long vốn được coi là hai vựa
lúa của cả nước. Tại vùng Đồng bằng sông Hồng, diện tích gieo trồng lúa đông
xuân 2017 đạt 536,2 nghìn ha, giảm 10,1 nghìn ha, bằng 98,2% so vùng kỳ năm
trước. Trong đó có đến 1,9 nghìn ha là diện tích bỏ hoang, ô nhiễm. Tại vùng Đồng
bằng sông Cửu Long, diện tích xuống giống lúa đông xuân năm nay đạt 1.539,4
nghìn ha, giảm 16,3 nghìn ha, bằng 99,0% so cùng kỳ; diện tích không sản xuất
(bỏ hoang, ô nhiễm,...) là 1,4 nghìn ha [1]. Nguyên nhân chủ yếu của việc giảm
diện tích trồng lúa là do biến đổi khí hậu, chuyển đổi mục đích sử dụng đất, trong
đó là nhiễm mặn được coi là một tác hại trực tiếp do biến đổi khí hậu gây ra.
1.2.

Cơ chế tác đ ng của đất nhiễm mặn đến cây trồng

Việc dư thừa muối trong đất đã làm tăng áp suất thẩm thấu của các dung
dịch trong đất. Ở điều kiện nồng độ muối tan trong đất nhỏ hơn nồng độ dịch tế
bào trong rễ, cây có thể dễ dàng lấy được nước và chất khoáng từ đất do áp suất
thẩm thấu và sức hút nước của rễ cây lớn hơn áp suất thẩm thấu và sức hút nước
của đất. Nếu nồng độ muối tan trong đất tăng cao dẫn đến mức sức hút nước của
đất cao hơn sức hút nước của rễ thì chẳng những cây không lấy được nước trong
đất mà còn mất nước vào đất. Do đó, cây không hấp thu được lượng nước cần thiết
cho quá trình sinh trưởng và phát triển, nhưng quá trình thoát hơi nước của lá vẫn

diễn ra bình thường làm mất cân bằng nước gây nên hạn sinh lý. Vì vậy, việc tăng
4


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

nồng độ muối hòa tan trong đất quá mức là nguyên nhân quan trọng nhất gây hại
cho cây trồng trên đất mặn.
Các đáp ứng sinh lý ở các loại cây khác nhau là khác nhau, dẫn đến khả
năng chịu mặn khác nhau của một số loại cây trồng. Dưới đây là bảng trình bày
khả năng chịu mặn của một số loại cây trồng theo nồng độ muối.
Bảng 1.1. Khả năng chịu mặn một số loại cây trồng [46]
Ngƣỡng chịu mặn

STT

Cây trồng

Tên khoa học

1

Bắp

Zea mays L.

1,7

1,088

2

Đậu phộng

Arachis hypogaea L.

3,2

2,048

3

Lúa

Oryza sativa L.

3,0

1,92

4

Đậu nành

Glycine max (L.) Merrrill

5,0

3,2

5

Củ cải đường

Vulgaris Beta L.

7,0

4,48

6

Mía

Saccharum officinarum L.

1,7

1,088

7

Cải bắp

B. oleracea L. (Capitata Group)

1,8

1,152

8

Cà rốt

Daucus carota L.

1,0

0,64

9

Đậu đũa

Vigna unguiculata (L.) Walp.

4,9

3,136

10

Dưa leo

Cucumis sativus L.

2,5

1,6

11

Cà tím

Solanum
melongena L. varesculentum Nees.

1,1

0,704

12

Tỏi

Allium sativum L.

3,9

2,496

13

Bí xanh

C. pepo L. var melopepo(L.) Alef.

4,9

3,136

14

Khoai lang

Ipomoea batatas (L.) Lam.

1,5

0,96

Cà chua

Lycopersicum Lycopersicon(L.)
Karst. ex Farw. [syn.Lycopersicon
esculentumMill.]

2,5

1,6

15

5

EC
Nồng đ
(dS/m) muối tan (‰)

Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

16

Nho

Vitis Vinifera L.

1,5

0,96

17

Bưởi

Citrus x paradisi Macfady.

1,2

0,768

18

Ổi

Psidium guajava L.

4,7

3,008

19

Cam

Citrus sinensis (L.) Osbeck

1,3

0,832

Chống chịu mặn ở thực vật là cơ chế được điều khiển bởi nhiều yếu tố. Đối
với những loài nhạy cảm với độ mặn như Arabidopsis thaliana và Oryza sativa, ức
chế sinh trưởng thường xảy ra ở nồng độ 100 mM NaCl, trong khi loài Atriplex
amnicola có thể phát triển ở 600 mM NaCl [48]. Thực vật có nhiều cách khác nhau
để thích ứng với stress mặn. Khi tiếp xúc với điều kiện stress mặn, cây thường biểu
hiện kiểu hình già yếu như cháy xém lá. Một số phản ứng bên trong như giảm sự
thoát hơi nước ở các lá bị cháy xém, chuyển hướng các nguồn năng lượng và dinh
dưỡng đến cho lá non, đỉnh sinh trưởng và bảo vệ các cơ quan quan trọng bởi sự
tích lũy các ion gây độc trong các lá già yếu [12].
Khả năng chịu mặn trong nhiều thực vật tỷ lệ nghịch với mức độ tích lũy
Na+ trong thân, đặc biệt là ở các cây lương thực như lúa mì và gạo, là những cây có
khả năng chịu mặn kém [60]. Có rất nhiều yếu tố dẫn đến khả năng chịu mặn khác
nhau giữa các loài, trong đó các protein vận chuyển chất tan là một yếu tố đặc biệt
quan trọng, điển hình như các protein vận chuyển Na+ [38; 44]. Ion Na+ được phát

hiện là có sự tích lũy khác nhau giữa các loại tế bào của lá. Sự tích lũy Na+ ở các tế
bào biểu bì lá do hoạt động của các kênh cation không chọn lọc, tránh gây độc cho
các mô quang hợp [32].
Dựa vào cơ chế tác động của stress mặn do tích lũy/vận chuyển ion Na + nên
protein tham gia vận chuyển Na+ đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa cân
bằng nội môi Na+ (homeostasis). Ở thực vật, có thể nhận thấy nhóm gen tham gia
mã hóa protein vận chuyển các ion Na+ bao gồm 3 họ gen chính là HKT, NHX và
SOS [63].

6


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

Hình 1.1. Các con đƣờng điều hòa chống chịu stress mặn ở thực vật [64]
Trong hình 1.1, Na+ đi vào tế bào thông qua các kênh không chọn lọc cation
như NSCCs và hình thành con đường truyền tín hiệu làm biểu hiện vượt mức các
gen như họ HKT và kích hoạt các cơ chế giải độc tế bào (như hoạt động của các
kênh vận chuyển HKT1, NHX, SOS1) [22].
Các yếu tố phiên mã (transcription factor) cũng là một trong những yếu tố
quan trọng, chúng có mối liên hệ chặt chẽ với các cơ chế cảm ứng mặn, đóng góp
vào tính chống chịu của cây [22]. Các yếu tố phiên mã chính liên quan trong các
đáp ứng với stress mặn như bZIP [69], WRKY [30], AP2/ERF [33], MYB [11],
bHLH [31], và NAC [62]. Các yếu tố phiên mã này có vai trò trong điều hòa sự
biểu hiện của các gen ảnh hưởng đến các mức độ chống chịu stress mặn ở thực vật
(Hình 1.1). Khi có stress mặn, các gen liên quan đến các quá trình đáp ứng này
được biểu hiện ở mức cao như các gen liên quan đến hấp thu các ion vô cơ, các gen
7

Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

liên quán đến quá trình sinh tổng hợp các hormone thực vật [14] và sự tổng hợp
các osmolyte (các phân tử điều hòa tính thẩm thấu của tế bào) [21].
Dưới tác động của stress mặn, các yếu tố phiên mã có thể được kích hoạt
trực tiếp bởi kênh Ca2+ /calmodulin và bao gồm cả các yếu tố kích hoạt phiên mã
gắn kết với calmodulin như CAMTA [41], GTL [67] và MYB [70]. Sự thay đổi
lượng hormone ABA, JA, GA và BR xảy ra ở hai giai đoạn ức chế tăng trưởng và
phục hồi sau cảm ứng stress [21; 14]. Trong môi trường có nồng độ muối cao,
hormone ABA ngăn cản sự kéo dài của hệ thống rễ [16], Auxin giúp thực vật tránh
được môi trường có độ muối cao bằng cách thay đổi hướng tăng trưởng của rễ (sự
hướng động liên quan đến hiện tượng mặn) [18]. Ngoài ra, với việc quyết định thay
đổi tỉ lệ Na+ /K+ ở chồi, ethylene cũng đóng vai trò quan trọng quyết định sự chống
chịu mặn ở cây Arabidopsis. Các thay đổi hàm lượng etilen được tạo ra khi bất
hoạt gen ETO1 và qua đó kích thích quá trình sản xuất ROS ở vùng trụ rễ bởi yếu
tố RBOHF. Sự gia tăng ROS ở trụ giữa dẫn đến giảm dòng ion Na+ vào rễ, giảm
thu nhận Na+ ở xylem và duy trì ion K+ ở rễ giúp tăng cường khả năng chống chịu
mặn [28].
1.3.

Các họ protein vận chuyển ion Na+ ở cây trồng

1.3.1. Vai trò của protein NHX và SOS trong việc duy trì nồng độ Na+ thấp trong
tế bào chất
Hai yếu tố quan trọng duy trì nồng độ Na+ thấp trong tế bào chất là protein
NHX1 ở không bào và protein SOS (còn được gọi là NHX7) trên màng tế bào.

Trong khi NHX rất cần thiết cho giải độc Na+ thông qua cô lập Na+ trong không
bào, thì SOS có chức năng xuất Na+ ra khỏi tế bào. Sự biểu hiện quá mức của gen
AtNHX1 và gen tương đồng (orthologs) của nó ở cây Arabidopsis thaliana và các
loài thực vật khác, chẳng hạn như cà chua (Solanum lycopersicum) hoặc lúa, dẫn
đến tăng khả năng chịu mặn của cây trồng [4; 72]. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra
rằng họ protein NHX cũng rất quan trọng trong việc ngăn K+ trong không bào và
cân bằng pH nội môi [5]. Sự biểu hiện quá mức của gen AtNHX1 trong cà chua làm

8


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

tăng K+ không bào cũng như vận chuyển K+ từ gốc sang chồi [5; 6], điều này có lợi
vì tăng tỷ lệ nội bào K+/Na+, làm giảm sự stress Na+.
Khả năng chịu mặn của thực vật có được là nhờ một loạt các đáp ứng nhằm
hạn chế tích lũy ion Na+ ở thân và giảm sự vận chuyển Na+ lên thân, lá. Sự tích lũy
Na+ và Cl- vào không bào là cơ chế thích nghi ở thực vật được bảo tồn ở cả thực
vật nước ngọt và nước mặn [29]. Ở mức độ tế bào, nhờ hoạt động của các protein
NHX nên nồng độ Na+ tại không bào luôn được duy trì ở mức thấp hơn ngưỡng có
khả năng gây độc cho tế bào [49]. Kênh vận chuyển Na+/H+ và K+/H+ là hai kênh
vận chuyển đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều tiết duy trì cân bằng nồng
độ ion trong cơ chế chịu mặn của cây, trong đó vai trò vận chuyển Na+/H+ trong tế
bào do các protein được mã hóa bởi các gen thuộc họ gen NHX ở thực vật đảm
nhiệm. Trong những nghiên cứu nhằm phân tích đáp ứng của cây Arabidopsis với
stress mặn cho thấy họ protein NHX tham gia vào sự vận chuyển ion Na+/H+ và
K+/H+, protein NHX giúp tích lũy ion K + vào nội mô tế bào, tăng cường hàm
lượng ion Na+ vào bên trong không bào, giúp cây thực hiện chức năng điều tiết tốt

hơn trong quá trình chịu mặn. Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng NHX có nhiều
vai trò trong quá trình điều hòa áp suất thẩm thấu, tăng trưởng tế bào và phát triển
thực vật [5;6].
Ở độ mặn vừa phải, cây mang đột biến gen SOS1 tích lũy Na+ trong thân ít
hơn so với cây hoang dại, cũng chỉ ra rằng protein SOS1 tham gia vào việc nạp
Na+ vào xylem. Một số nghiên cứu đã chỉ ra chức năng quan trọng này trong cà
chua [40] và ở Thellungiella salsuginea. Ở điều kiện stress mặn, protein SOS1
cũng liên quan đến nồng độ K+ trong thực vật, điều quan trọng hơn đối với cây là
giữ tỷ lệ K+/Na+ cao. Đột biến gen SOS1 cho thấy sự hấp thu K+ có ái lực cao và
giảm đáng kể hàm lượng K+. Qi và Spalding (2004) đã chứng minh rằng protein
SOS1 có chức năng bảo vệ sự hấp thụ K+ thông qua AKT1 và nồng độ K+ bị mất đi
trong stress mặn [45]. Ngoài ra, protein ZxSOS1 kiểm soát vận chuyển đường dài
và duy trì cân bằng nội môi Na+, K+ đối với cây chịu hạn Zygophyllum
xanthoxylum. Protein SOS1 rất cần thiết cho cây trồng để đối phó với stress mặn
9


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

bằng cách duy trì cân bằng nội môi và kiểm soát vận chuyển đường dài Na+ thông
qua xylem [71].
1.3.2. Protein HKT đóng vai trò chính trong khả năng chịu mặn của thực vật và
ngăn chặn Na+ vận chuyển từ rễ đến thân
Việc xác định gen HKT1
(TaHKT2;1) trên lúa mì (Triticum
aestivum) có sản phẩm trung gian
vận chuyển cation Na+/K+ [49; 50]
đã dẫn đến việc xác định và mô tả

đặc tính của nhiều gen HKT từ các
loài thực vật khác nhau. Protein
HKT đã được chứng minh tham gia
vận chuyển ion K+ và hoặc ion Na+
qua màng. Một số thành viên mã
hóa cho việc vận chuyển có chọn
lọc Na+ (như trong Arabidopsis
thaliana gen AtHKT1;1) trong khi
một số thành viên khác mã hóa cho
việc đồng vận chuyển ion Na+/K+
(như gen TaHKT2 ở Triticum
aestivum) [58].

Hình 1.2. Hai phân họ của họ gen
HKT [43]

10


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

Dựa trên các phân tích về trình tự thì họ gen HKT được chia thành 2 nhóm
là phân họ I và phân họ II [64]. Phân họ I ứng với các gen tham gia quá trình vận
chuyển Na+ có chọn lọc còn phân họ II tham gia quá trình đồng vận chuyển Na +/K+
[50].
Các thành viên của họ protein HKT được tìm thấy ở rất nhiều loài thực vật
như: Arabidopsis, lúa mạch, bạch đàn, nho, một số thực vật vùng băng giá, lúa gạo
và lúa mì. Có nhiều bằng chứng cho thấy vai trò quan trọng của các thành viên họ

protein HKT trong vận chuyển Na+ và Na+/K+, cụ thể là trong việc kiểm soát sự
tích lũy Na+ và do đó xác định được khả năng chịu mặn [43].
Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bởi trình tự mã hóa của các gen và
trình tự axit amin của protein HKT cho thấy họ gen được chia thành 2 phân họ
chính (Hình 1.2). Sự phân chia của họ gen HKT thành hai phân họ chính được kết
hợp với sự thay thế Glycine/Serine trong cấu trúc lỗ lọc của protein [34; 20].Tất cả
các thành viên của phân họ 1 có một phân tử Serine ở vị trí này, trong khi các
thành viên của phân họ 2 (ngoại trừ khả năng phục hồi gen OsHKT2;1) có glycine.
Phân tích chức năng của gen TaHKT2;1, AtHKT1;1 và các gen lúa cho thấy cấu
trúc đặc biệt này có thể đóng vai trò trung tâm trong việc xác định khả năng chọn
lọc Na+ của kênh vận chuyển [34; 20]. Do đó, việc chia thành hai phân nhóm chính
cũng có thể gọi là phân chia theo chức năng.
Vai trò chính của gen AtHKT1;1 và gen tương đồng của nó trên lúa
(OsHKT1;5) là mã hoá protein tham gia vào quá trình loại bỏ Na+ khỏi dòng mạch
xylem từ rễ lên lá và chuyển các Na+ vào các tế bào nhu mô xung quanh, thông qua
quá trình này sẽ bảo vệ mô lá khỏi độc tính của Na+. Sự biểu hiện vượt mức gen
AtHKT1;1 trong mô giúp tăng cường tính chống chịu mặn [7].
Các phân tích sinh lý học invivo trên các tế bào rễ đã cho thấy protein
AtHKT1;1 hỗ trợ vận chuyển Na+ thông qua các kênh vận chuyển thụ động. Sự
loại bỏ Na+ khỏi mạch xylem được hỗ trợ bởi protein AtHKT1;1 cũng giúp kích
thích quá trình vận chuyển ion K+ vào mạch xylem thông qua các kênh K+, làm gia
11


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

tăng tỉ lệ K+/Na+ trên lá giúp cây chống lại stress do Na+ gây ra [47; 57]. Gen
TaHKT1;4 được chứng minh là thuộc nhóm I trong họ gen HKT mã hóa cho

protein có chức năng loại bỏ Na+ ra khỏi mạch mô lá.
Các phân tích so sánh giữa các giống lúa Indica chống chịu mặn và các
giống Japonica đã đưa ra giả thuyết rằng gen OsHKT1;4 giúp giảm sự vận chuyển
Na+ từ bẹ lá lên phiến lá lúa khi cây gặp stress mặn [10]. Như vậy, các gen HKT
nhóm I mã hóa sản phẩm có chức năng giúp thực vật tránh khỏi sự tích tụ quá
nhiều Na+ trong suốt quá trình stress mặn.
Sự duy trì K+ và loại bỏ Na+ ở mô lá cho thấy có mối tương quan rất mạnh
đến sự chống chịu mặn ở thực vật. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu về
HKT nhóm I như là các yếu tố chính trong việc xác định tỉ lệ K +/Na+ ở thực vật.
Tuy nhiên, nghiên cứu sâu trên các mô chồi và kỹ thuật “genome-wide
association” đã chỉ ra ở những cây có khả năng phát triển trên các vùng đất nhiễm
mặn như các vùng đất ven biển có sự tích tụ Na+ với nồng độ cao ở lá. Nồng độ
Na+ cao ở lá có liên quan đến một alen của gen AtHKT1;1. Alen này làm giảm sự
biểu hiện của gen AtHKT1;1 ở rễ [64].
1.4.

Họ gen OsHKT ở cây lúa

Họ gen HKT ở lúa bao gồm 9 gen, được phân chia thành 2 phân họ dựa vào
sự lựa chọn vận chuyển các ion [43]:
- Phân họ 1 bao gồm: các gen OsHKT1;1 – OsHKT1;5 mã hóa cho sản phẩm
có chức năng vận chuyển Na+.
- Phân họ 2 bao gồm: các gen OsHKT2;1 – OsHKT2;4, mã hóa cho sản phẩm
có chức năng vận chuyển theo 2 hướng, cả Na+ và K+, và chỉ vận chuyển
Na+ khi nồng độ Na+ cao.
Cụ thể các thành viên họ gen HKT ở lúa được trình bày trong hình 1.3 và bảng 1.2.

12

Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

Hình 1.3. Cấu trúc gen m t số thành viên họ gen lúa [43]
màu trắng: Exon, màu xanh: Intron

Bảng 1.2. Các thành viên họ gen HKT ở lúa [43].
Tên cũ

Nucleotide

Locus

Mã protein

Tên sửa đổi

OsHKT4

AJ491816

Os04g51820

CAD37183

OsHKT1;1

OsHKT5

AJ506745

-

Gen giả

OsHKT1;2

OsHKT6

AJ491818

Os02g07830

CAD37185

OsHKT1;3

OsHKT7

AJ491853

Os04g51830

CAD37197

OsHKT1;4

OsHKT8, SKC1

AK108663

Os01g20160

BAB93392

OsHKT1;5

OsHKT1

AB061311

Os06g48810

BAB61789

OsHKT2;1

OsHKT2

AB061313

-

BAB61791

OsHKT2;2

OsHKT3

AJ491820

Os01g34850

CAD37187

OsHKT2;3

OsHKT9

AJ491855

Os06g48800

CAD37199

OsHKT2;4

13


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

Các gen này mã hóa cho các protein màng, tham gia vào việc vận chuyển
các ion qua màng tế bào thực vật, có vai trò quan trọng đối với khả năng chống
chịu mặn ở lúa.
1.5.

Gen OsHKT1;5
OsHKT1;5 là thành viên được
nghiên cứu nhiều trong phân họ 1. Biểu
hiện OsHKT1;5 được tìm thấy ở nhiều cơ
quan khác nhau nhưng chủ yếu là ở tế bào
nhu mô của rễ và lá. Ở lúa, hệ thống loại
Na+ phụ thuộc HKT1;5 tương tự với cơ
chế trung gian của AtHKT1;1 trong
Arabidopsis [24].
Hình 1.4. Mô hình gen AtHKT1;1 và
OsHKT1;5 tách Na+ khỏi lá cây bằng
cách loại bỏ Na+ khỏi xylem.
(a) gen AtHKT1;1 và OsHKT1;5 tách Na+ từ
các mạch xylem tại màng tế bào nhu mô
xylem. Chức năng thu nhận Na+ của gen
AtHKT1;1 và OsHKT1;5 ngăn ngừa sự tích tụ
Na+ trong thân và lá, do đó bảo vệ quá trình
quang hợp trong điều kiện mặn. (b) Giả
thuyết cho việc ghép nối Na+ từ xylem bằng
các kênh vận chuyển HKT nhóm 1, đưa K+
vào các ống xylem qua các kênh K+ kích hoạt
khử cực. Sự hấp thụ Na+ do trung gian HKT
từ các mạch xylem sẽ làm cho sự khử cực
màng tế bào màng xylem, do đó có thể kích
hoạt các kênh K+ dẫn ra ngoài. Cơ chế này có
thể dẫn đến việc tích lũy K+ tích tụ trong thân
và lá, góp phần bảo vệ lá khỏi mặn [24].
14

Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

Các phân tích sâu hơn đã chứng minh vai trò chính của gen OsHKT1;5 trong
quá trình loại bỏ Na+ khỏi dịch xylem (dòng dung dịch di chuyển trong xylem từ rễ
lên lá) và chuyển các Na+ vào các tế bào nhu mô xylem xung quanh, thông qua quá
trình này sẽ bảo vệ mô lá khỏi độc tính của Na +. Biểu hiện vượt mức gen
OsHKT1;5 trong mô giúp tăng cường tính chống chịu mặn [8].
Ở lúa, gen OsHKT1;5 đã được chứng minh là một yếu tố quyết định khả
năng chịu mặn bằng các phân tích tính trạng số lượng (QTL) [47]. Các locus từ
một giống chống chịu ban đầu được nhắm mục tiêu như QTL dẫn đến tích lũy K+
cao hơn trong thân trong quá trình đáp ứng mặn được gọi là SKC1 (shoot K+
content 1- tên gọi khác của OsHKT1;5). Một trong những QTL chịu mặn chính của
cây lúa là vùng locus Saltol, liên quan đến cân bằng nội môi Na+/K+ trong quá trình
stress mặn [61], trong vùng này người ta đã tìm thấy vị trí của SKC1 [26]. Sản
phẩm gen OsHKT1;5, chọn lọc ưu tiên vận chuyển Na+ trong các tế bào biểu hiện
dị tật (heterologously), được chứng minh là có ảnh hưởng lớn đến việc giảm nồng
độ Na+ trong thân [47].
Những nghiên cứu trên phần nào dự đoán được chức năng của gen
OsHKT1;5 mã hóa cho sản phẩm protein OsHKT1;5 đối với việc loại bỏ Na+ trong
thân. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về gen OsHKT1;5, cũng
như chưa có nghiên cứu nào về giải trình tự gen OsHKT1;5 trên các giống lúa địa
phương. Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện phân tích đa hình gen
OsHKT1;5 bằng phương pháp PCR- Giải trình tự, kết hợp với nghiên cứu biểu
hiện gen bằng phương pháp Realtime-PCR. Nghiên cứu được thực hiện dựa trên
kết quả của một số nghiên cứu trước đó của TS. Đỗ Thị Phúc và cộng sự trên đối
tượng cây lúa như: trên gen OsHKT1;1 [42], gen OsHKT1;2 [15], gen OsHKT2;4
[39]. Những kết quả này cho thấy phương pháp sử dụng để nghiên cứu là phương
pháp phù hợp và có tính chính xác cao.

15


Trần Xuân An

Luận văn thạc sĩ

1.6. Nghiên cứu đa hình sử dụng phƣơng pháp PCR kết hợp giải trình tự gen
1.6.1. Kĩ thuật PCR
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi
trùng hợp). Kỹ thuật PCR được nhà khoa học người Mỹ – Kary Mullis và cộng sự
phát minh năm 1985, là kỹ thuật của sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn
bản gốc DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao
ở điều kiện invitro.
Kỹ thuật tổng hợp DNA invitro cũng phải tuân thủ đầy đủ những nguyên tắc
cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể, tuy nhiên có vài điểm khác biệt sau: Dùng
nhiệt độ cao biến tính tách mạch DNA thay cho enzym helicase; Sử dụng enzym
DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới trong môi trường nhiệt độ cao;
Sử dụng hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ
động để nhận lên một đoạn DNA đích xác định [37].

Hình 1.5. Các giai đoạn trong phản ứng PCR [37]
Từ việc khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của enzym DNA
polymerase được tìm thấy trong vi khuẩn sống trong các suối nước nóng. Phần lớn
các DNA polymerase chỉ hoạt động ở nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này,
DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không thể biến tính phần lớn các phần của
16