Nghiên cứu sự tồn tại và nảy mầm của bào tử Bacillus aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng và ảnh hưởng của bào tử lên một số chỉ tiêu miễn dịch của tôm : Luận văn ThS. Sinh học: 84201

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
Nhung
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------

Nguyễn Thị Hương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ NẢY MẦM CỦA
BÀO TỬ Bacillus aquimaris SH6 TRONG RUỘT TÔM THẺ
CHÂN TRẮNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA BÀO TỬ LÊN MỘT
SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH Ở TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------

Nguyễn Thị Hương

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ NẢY MẦM CỦA
BÀO TỬ Bacillus aquimaris SH6 TRONG RUỘT TÔM THẺ
CHÂN TRẮNG VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA BÀO TỬ LÊN MỘT
SỐ CHỈ TIÊU MIỄN DỊCH Ở TÔM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Phạm Thị Thu Hường
PSG.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội - 2018


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, tôi luôn nhận được rất nhiều
sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ dẫn tận tình từ phía thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và gia
đình.
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị
Thu Hường và PGS. TS. Nguyễn Thị Vân Anh đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ, tập thể nhóm nghiên cứu và các bạn
sinh viên tại phòng Sinh học Nano và Ứng dụng, phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng
Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym & Protein của Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, những người đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi
rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ; các thầy cô giáo trong Bộ
môn Vi sinh vật học và các thầy cô thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt những kiến thức quý báu và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Luận văn được thực hiện dưới sự tài trợ kinh phí của Quỹ TWAS (Viện Hàn lâm
Khoa học Thế giới), đề tài mã số 16-549 RG/BIO/AS_G - FR3240293311 do PGS.TS.
Nguyễn Thị Vân Anh làm chủ nhiệm.

Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè
đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành
luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2018

Học viên
Nguyễn Thị Hương


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................. 1
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. 3
DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT .................................................................. 4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 7
1.1. Tôm thẻ chân trắng .................................................................................................... 7
1.2. Probiotic và vai trò của chúng trong nuôi trồng thủy sản ......................................... 8
1.2.1. Giới thiệu chung về probiotic ................................................................................. 8
1.2.2. Các nghiên cứu về vai trò và ứng dụng của Bacillus probiotic trong nuôi tôm ..... 9
1.3. Nghiên cứu về carotenoid và vi khuẩn sinh carotenoid .......................................... 11
1.3.1. Carotenoid .......................................................................................................... 11
1.3.2. Vi khuẩn sinh carotenoid ...................................................................................... 12
1.3.3. Astaxanthin .......................................................................................................... 12
1.4. Hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng ........................................................... 13
1.5. Bào tử B. aquimaris SH6 và tác dụng probiotic của chúng đối với tôm thẻ chân

trắng

............................................................................................................. 15

1.5.1. Thực trạng nghiên cứu vai trò probiotic của bào từ B. aquimaris ....................... 15
1.5.2. Khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris ...................................................... 16
1.6. Đặt vấn đề nghiên cứu và thiét kế thí nghiệm ......................................................... 17
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................. 19
2.1. Nguyên liệu ............................................................................................................. 19
2.1.1. Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) ....................................................... 19
2.1.2. Bào tử B. aquimaris SH6 ..................................................................................... 19


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
2.1.3. Thức ăn cho tôm ................................................................................................... 20
2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ........................................................................... 20
2.1.5. Hóa chất ............................................................................................................. 21
2.1.6. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................... 23
2.2. Phương pháp ............................................................................................................ 23
2.2.1. Chuẩn bị bào tử B. aquimaris SH6 và tách chiết carotenoid ............................... 23
2.2.2. Chuẩn bị thức ăn cho tôm..................................................................................... 26
2.2.3. Bố trí các nhóm thi ghiệm và quy trình nuôi tôm ................................................ 26
2.2.4. Xác định số lượng B. aquimaris SH6 và tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột
tôm

.......................................................................................................... 28

2.2.5. Đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm ........ 29
2.2.6. Đánh giá các chỉ số miễn dịch của tôm ................................................................ 34
2.2.7. Xác định tốc độ tăng trưởng, nồng độ astaxanthin và màu sắc của tôm .............. 38

2.2.8. Phân tích dữ liệu ................................................................................................... 39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 40
3.1. Khả năng lưu trú của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng ...... 40
3.2. Thiết kế mồi và probe đặc hiệu cho Real-time PCR gen BaqA-SH6 ...................... 43
3.3. Khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng .. 45
3.4. Vai trò của bào tử B. aquimaris SH6 trong tăng cường miễn dịch của tôm thẻ chân
trắng

............................................................................................................. 48

3.5. Tăng trưởng về trọng lượng của tôm khi ăn bào tử B. aquimaris SH6. .................. 53
3.6. Nồng độ astaxanthin và màu sắc của tôm ............................................................... 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 58


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
Kết luận

............................................................................................................. 58

Kiến nghị

............................................................................................................. 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 60


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018

Luận văn thạc sĩ khoa học 2018

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 2.1: Bào tử B. aquimaris SH6. ............................................................................. 19
Hình 2.2: Thức ăn cho tôm thẻ chân trắng. ................................................................... 20
Hình 2.3: Đường chuẩn nồng độ Astaxanthin............................................................... 25
Hình 2.4 : Mô hình bể nuôi tôm trong quy mô phòng thí nghiệm ................................ 27
Hình 2.5: Bể nuôi tôm trong điều kiện phòng thí nghiệm. ............................................ 28
Hình 2.6: Trình tự tương đồng đoạn gen BaqA giữa chủng B. aquimaris MKSC 6.2 và
một số chủng Anoxybacillus spp. ................................................................................... 31
Hình 2.7: Mô hình vector biến nạp pTOP TA V2 (3807 bp) [80] ................................ 32
Hình 3.1: Số lượng B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng sau 28 ngày (CFU
× 105/g ruột tôm). ........................................................................................................... 40
Hình 3.2: Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong ruột tôm thẻ chân trắng sau 28 ngày (CFU
× 106/g ruột tôm). *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 ................................................... 41
Hình 3.3: Thành phần loài trong quần xã vi sinh vật ruột tôm ở ngày 28 ở các nhóm thí
nghiệm ............................................................................................................................ 43
Hình 3.4: Điện di gel biến tính sản phẩm PCR mồi M13 để sàng lọc khuẩn lạc mang
gen tái tổ hợp. ................................................................................................................. 44
Hình 3.5: Trình tự BaqA-SH6, mồi và probe đặc hiệu.................................................. 44
Hình 3.6: Điện di gel electrophoresis sản phẩm PCR nhân đoạn gen BaqA-SH6........ 45
Hình 3.7: Đánh giá sự nảy mầm trong ruột tôm. Đường tín hiệu huỳnh quang FAM của
phản ứng Real-time PCR nhân đoạn gen đặc hiệu BaqA-SH6 trên một số mẫu đại diện:
0 h, 4 h, 24 h, 7 d và các điểm chuẩn 100%, 20%. ........................................................ 47
Hình 3.8: Tỷ lệ nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng
(%). ................................................................................................................................. 48
Hình 3.9: Số phận của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng .......... 48
Hình 3.10: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28. A - Mức độ biểu hiện mRNA
Rho. B - Mức độ biểu hiện mRNA Ran. *P<0,05, **P<0,01. ....................................... 49

1


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
Hình 3.11: Chỉ số miễn dịch ở tôm tại ngày 0 và ngày 28. A - Hoạt tính enzyme PO. B
- Hoạt tính enzyme SOD. *P<0,05; **P<0,01. ............................................................. 52
Hình 3.12: Tốc độ tăng trưởng (%/ngày) của tôm thẻ chân trắng ở các nhóm thí
nghiệm khác nhau. Giá trị trung bình với cỡ mẫu n = 20 **P < 0,01 ................................54
Hình 3.13: Nồng độ astaxanthin của tôm tại thời điểm 28 D. *P<0,05 ....................... 55
Hình 3.14: Màu sắc của tôm sau khi luộc tại thời điểm 28 D ....................................... 56

2


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Điều kiện của PCR nhân đoạn gen BaqA ...................................................... 31
Bảng 2.2: Chu trình phản ứng Real-time PCR, TaqMan probe .................................... 33
Bảng 2.3: Trình tự các cặp mồi và probe sử dụng trong nghiên cứu ............................ 35

3


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
CFU

Colony forming unit – Số lượng khuẩn lạc

cDNA

Complement DNA

D

Day (ngày)

DNA

Deoxyribonucleic acid

DSM

Difco sporulation medium

DW

Distiled water (Nước vô trùng)

ĐC

Đối chứng âm

Fw

Forward (Mồi xuôi)

g

Gram

ha

Hecta

h

Hour (giờ)

l

Lit

LB

Luria Bertani

L-DOPA

L-3-4-dyhydroxyphenylalanine

ml

Mililit

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp polymere)

PO

Phenoloxidase

RNA

Ribonucleic acid

Rv

Reverve (Mồi ngược)

RT

Reverse Transcriptase

SOD

Superoxidase dimutase

V

Thể tích

4


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
MỞ ĐẦU
Với đặc thù là một quốc gia có bờ biển dài, thủy sản đã và đang được chú trọng
đẩy mạnh phát triển và được xem là một trong các thành phần kinh tế mũi nhọn của

Việt Nam. Trong đó, tôm thẻ chân trắng là một đối tượng được quan tâm hàng đầu bởi
giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế phục vụ xuất khẩu của nó. Theo Báo cáo thực hiện
kế hoạch năm 2017, nhiệm vụ, giải pháp chủ yếu thực hiện kế hoạch năm 2018 của
Tổng cục Thủy sản - Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn, sản lượng nuôi trồng
thủy hải sản của nước ta trong năm 2017 đạt con số 3.858 nghìn tấn, trong đó, tôm thẻ
chân trắng đạt tới 427 nghìn tấn, chiếm 11.1% tổng sản lượng, tăng 108.5% so với
cùng kỳ năm 2016. Tương ứng với kim ngạch xuất khẩu đạt 2.535 triệu USD, tăng
129.5% so với cùng kỳ năm 2016 và chiếm 30.4% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy hải
sản của Việt Nam năm 2017. Năm 2018 ghi nhận báo cáo về tổng sản lượng nuôi trồng
tôm nước lợ 6 tháng đầu năm đạt 494 nghìn tấn, tăng 10,6% so với cùng kỳ nàm 2017
[1]. Những con số kể trên phần nào cho thấy giá trị thương phẩm to lớn và vai trò quan
trọng của tôm thẻ chân trắng trong tổng thể nền kinh tế - nông nghiệp nuôi trồng thủy
hải sản của Việt Nam. Đây cũng chính là lý do khiến tôm thẻ chân trắng đang ngày
càng trở thành mối quan tâm hàng đầu trong chiến lược phát triển kinh tế của Nhà nước
cũng như từ các nhà khoa học trong những nghiên cứu những biện pháp giúp cải thiện
năng suất và chất lượng cũng như hạn chế các tác nhân gây bệnh ảnh hưởng đến quá
trình nuôi trồng tôm thẻ chân trắng. Trong đó, có hai hướng nghiên cứu liên quan tới
sức khoẻ của tôm được nhiều nhà khoa học quan tâm là: (i) tìm ra các vắc xin và các
phương pháp phòng bệnh cho tôm thẻ chân trắng như bệnh đốm trắng, gan tuỵ, phân
trắng… (ii) phát triển các chế phẩm sinh học, ví dụ như probiotic, để tăng cường sức
khoẻ cho tôm thông qua các chỉ số về cân nặng, miễn dịch, dinh dưỡng…..
Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò của một số chủng vi khuẩn như
Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Lactobacillus plantarum, ... đối với tôm thẻ
chân trắng, liên quan đến tác dụng tăng trọng lượng, tăng khả năng sống sót và tăng
5


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
cường miễn dịch [16, 28]. Tuy nhiên, những năm gần đây, khi nhắc đến tôm thẻ chân
trắng thì cả nông dân lẫn doanh nghiệp và người tiêu dùng không chỉ quan tâm đến cân

nặng và sản lượng mà còn về giá trị dinh dưỡng của tôm. Giá trị dinh dưỡng và chất
lượng đó của tôm thẻ chân trắng phụ thuộc chủ yếu vào màu sắc và nồng độ các chất
chống oxy hóa có trong mô cơ tôm, như: astaxanthin, cantaxanthin, β-carotene, ...
Trong đó, astaxanthin được biết đến là một trong những chỉ thị quan trọng để đánh giá
giá trị và chất lượng của tôm [76], astaxanthin cũng giúp tích lũy lượng lớn carotenoid
và phòng ngừa “Hội chứng màu xanh” ở tôm. Vì thế, sự tăng trưởng về nồng độ
astaxanthin của tôm đang trở thành mối quan tâm rất lớn của các nhà khoa học. Trong
các công bố gần đây của nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh học Nano và Ứng dụng,
Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein (PTNTĐCNEP), Bacillus
aquimaris SH6 được biết đến có khả năng tăng hàm lượng astaxanthin, cân nặng và
hoạt tính enzyme PO [48]. Do vậy, SH6 hứa hẹn là chủng probiotic đem lại hiệu quả
cao khi sử dụng làm thức ăn cho tôm thẻ chân trắng. Tuy nhiên, nghiên cứu này chưa
đề cập tới số phận và cơ chế tác dụng của bào tử SH6 trong ruột tôm để phần nào giải
thích được các tác dụng có lợi mà SH6 mạng lại cho tôm. Ngoài ra, các số lượng chỉ
tiêu miễn dịch của tôm trong nghiên cứu này còn hạn chế. Vì vậy, chúng tôi tiến hành
“Nghiên cứu khả năng tồn tại và nảy mầm của bào tử Bacillus aquimaris SH6 trong
ruột tôm thẻ chân trắng và ảnh hưởng của bào tử lên một số chỉ tiêu miễn dịch của
tôm” với các mục tiêu sau:
 Chứng minh khả năng lưu trú và nẩy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong
ruột tôm thẻ chân trắng, và ảnh hưởng của nó tới sự đa dạng quần xã vi sinh vật
trong ruột tôm.
 Đánh giá mức độ tăng trưởng của các chỉ số miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng
khi cho ăn bào tử B. aquimaris SH6, kèm theo các chỉ số tăng trọng và tăng hàm
lượng astaxanthin ở tôm.

6


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Tôm thẻ chân trắng
Tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) là loài bản địa ở phía đông Thái

Bình Dương, được khai thác chủ yếu làm thực phẩm. Nhiều năm gần gây, nuôi tôm thẻ
chân trắng trong điều kiện nước lợ phát triển rất mạnh mẽ ở một số quốc gia như Trung
Quốc, Đài Loan, Việt Nam,… không chỉ phục vụ nhu cầu thực phẩm trong nước mà
còn nhằm phát triển xuất khẩu ra một số nước Châu Âu, Châu Mỹ, … đem lại hiệu quả
kinh tế cao cho người nuôi trồng thủy sản và đóng góp một phần đáng kể cho kinh tế
quốc gia.
Trên thế giới, trong giai đoạn năm 1980, các nước như Trung Quốc, Equado là
các nước nuôi trồng và sản xuất tôm lớn nhất trên thế giới. Tuy nhiên, đến nay thì vị trí
đó đã thuộc về bốn nước Đông Á là Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan và Indonesia,
chiếm 75% sản lượng tôm toàn cầu. Trong đó, đối tượng nuôi chủ lực là tôm thẻ chân
trắng.
Tại Việt Nam, tôm thẻ chân trắng bắt đầu phát triển mạnh mẽ từ sau năm 2000,
do trước đó nông dân lo ngại việc du nhập tôm thẻ chân trắng sẽ làm lây lan mầm bệnh
ảnh hưởng đến đối tượng chủ lực ở giai đoạn đó là tôm sú. Các đơn vị đầu tiên nhập
tôm thẻ vào nuôi thử nghiệm ở Việt Nam là 3 công ty: Công ty Duyên Hải (Bạc Liêu),
Công ty Việt Mỹ (Quảng Ninh) và Công ty Asia Hawai (Phú Yên). Đến nay, tôm thẻ
chân trắng đã phát triển nuôi khắp cả nước trong đó chủ yếu là vùng Đồng bằng sông
Cửu Long hướng tới mục tiêu đạt diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng là 150.000 ha, sản
lượng đạt trên 750.000 tấn và tổng giá trị kim ngạch xuất khẩu tôm nước lợ là 12 tỷ
USD ở năm 2030.
Tuy nhiên, sự phát triển nuôi trồng tôm thẻ chân trắng một cách mạnh mẽ như
vậy gây ra áp lực lớn đối với môi trường, cung ứng con giống, dịch bệnh, … Thêm vào
đó, khi nuôi trồng tôm thẻ chân trắng hướng chới xuất khẩu đến các thị trường khó tính

7

Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
như Châu Âu, Châu Mỹ, đòi hỏi sản lượng và chất lượng tôm rất cao. Do vậy, đã có
nhiều nghiên cứu, sách báo của các nhà khoa học trong nước về việc phát triển kỹ thuật
- công nghệ nuôi tôm thương phẩm, nghiên cứu nâng cao chất lượng tôm giống, sản
xuất tôm thẻ chân trắng bố mẹ sạch bệnh,… [3, 5].
Do vậy, việc sử dụng chế phẩm sinh học (probiotic) trong nuôi tôm là điều thiết
yếu, hướng tới giải pháp nuôi trồng tôm thẻ chân trắng theo hướng hạn chế sử dụng
kháng sinh, an toàn cho môi trường và con người, đồng thời vẫn đảm bảo tốc độ tăng
trưởng, khả năng chống chịu bệnh tật, sản lượng và chất lượng tôm.
1.2.

Probiotic và vai trò của chúng trong nuôi trồng thủy sản

1.2.1. Giới thiệu chung về probiotic
Nghiên cứu về probiotic từ lâu đã và đang nhận được rất nhiều sự quan tâm từ
các nhà khoa học trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, với mục đích ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực như: tăng cường sức khỏe, hỗ trợ quá trình hấp thụ dinh
dưỡng ở con người và chăn nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thủy sản... Probiotic là
lựa chọn thay thế cho thuốc kháng sinh để hạn chế tối đa các tác dụng phụ và đem lại
nhiều tác dụng có lợi cho vật chủ. Ngày nay, probiotic không chỉ dừng lại ở phạm vi
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm mà còn được thương mại hóa và phát triển mạnh
mẽ dưới nhiều hình thức khác nhau, trong đó, các sản phẩm được phát triển nhiều nhất
là thực phẩm chức năng cho người và thức ăn chăn nuôi cho gia súc, gia cầm và thủy
sản.
Probiotic là các chủng vi khuẩn sống mang lại tác dụng có lợi cho vật chủ bởi
khả năng cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh
vật có lợi phát triển và ức chế các chủng vi sinh vật có hại cho vật chủ [26]. Probiotic
là các chủng vi khuẩn sống, điển hình bởi những tác dụng sau đây :

-

Ngăn ngừa nhiễm trùng đường tiêu hóa, ngăn ngừa sự xâm lấn và gây hại của
các chủng vi sinh vật gây bệnh [74, 79].

8


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
-

Tăng cường miễn dịch cho vật chủ [33].

-

Tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng, tăng trọng lượng, tăng khả năng sống sót
của vật chủ [52].
Đặc điểm nổi bật khi sử dụng probiotic là thân thiện với môi trường và an toàn

cho người sử dụng. Do đó, probiotic ngày càng được các nhà khoa học quan tâm, với
mục đích nghiên cứu sâu hơn về vai trò, công dụng và cơ chế tương tác của chúng với
vật chủ. Dựa vào đó để đưa ra những kết luận mang tính khoa học, làm cơ sở cho các
doanh nghiệp phát triển và thương mại hóa các sản phẩm thức ăn chăn nuôi chứa
probiotic.
1.2.2. Các nghiên cứu về vai trò và ứng dụng của Bacillus probiotic trong nuôi
tôm
Probiotic dùng trong lĩnh vực thuỷ sản thường được biết đến hầu hết là các
chủng thuộc chi Lactobacillus và Bacillus [18, 31] (ngoại trừ B. cereus và B. anthracis
là một số loài Bacillus gây bệnh [9, 22]). Một trong những lý do khiến Bacillus sp gần
đây được ứng dụng phổ biến làm probiotic là vì chúng có khả năng hình thành nội bào

tử, nhờ đó probiotic chứa Bacillus sp. tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất
(sấy khô ở nhiệt độ cao), có thể bảo quản và sử dụng trong thời gian dài mà không ảnh
hưởng đến chất lượng và mật độ vi sinh vật trong sản phẩm, đồng thời chúng có khả
năng tồn tại trong điều kiện môi trường khắc nghiệt. Khi được cung cấp đủ chất dinh
dưỡng và môi trường sống thuận lợi, chúng có thể nảy mầm và trở thành dạng tế bào
sinh dưỡng [49]. Bên cạnh đó, Bacillus sp. còn đáp ứng được các tiêu chí của probiotic
như: có khả năng tồn tại và nảy mầm trong ruột, hình thành màng sinh học và khả năng
kháng vi sinh vật gây bệnh [32], Bacillus sp. có khả năng sản sinh một số enzyme tiêu
hóa, kích thích tiêu hóa thức ăn trong ruột dẫn đến kích thích tăng trọng lượng của vật
chủ, ví dụ cụ thể đối với đối tượng là tôm thẻ chân trắng [28, 79], ...

9


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
Nghiên cứu về vai trò probiotic trong nuôi tôm thẻ chân trắng có thể kể đến một
số lĩnh vực, bao gồm: (1) Thức ăn chứa probiotic giúp tăng cường miễn dịch, tăng sức
khỏe, khả năng tiêu hóa, hấp thụ chất dinh dưỡng,... ở tôm thẻ chân trắng, giúp tăng
năng suất và sản lượng nuôi tôm; (2) Thức ăn nuôi tôm chứa probiotic giúp tôm chống
chịu một số tác nhân gây bệnh, nghiêm trọng như vi rút đốm trắng. (3) Một hướng
nghiên cứu mới là thức ăn chứa probiotic là các chủng có khả năng sinh carotenoid,
giúp làm tăng hàm lượng astaxanthin ở tôm thẻ chân trắng, qua đó cải thiện chất lượng
tôm nuôi. Đã có nhiều công bố về vai trò probiotic của một số chủng Bacillus sp., cụ
thể: B. amyloliquefaciens [2, 4] B. subtilis và B. indicus [32, 52], B. licheniformis, B.
megaterium [19, 33, 35]. Cụ thể như nghiên cứu phân lập các chủng có hoạt tính
probiotic của tác giả Khuất Hữu Thanh và cộng sự (2009) [3], nghiên cứu về chủng B.
amyloliquefaciens không chỉ làm thức ăn mà có tác dụng tích cực trong việc cải thiện
chất lượng nước hồ nuôi tôm của các tác giả thuộc trường Đại học Cần Thơ [2, 4]
nghiên cứu về các chủng B. subtilis, B. megaterium liên quan đến sự tăng khả năng sản
sinh enzyme tiêu hóa cho tôm [54], nghiên cứu về B. licheniformis có tác dụng tăng

cường miễn dịch và cân bằng hệ vi sinh ruột tôm trước các tác nhân gây bệnh [16, 35,
40]. Có thể thấy rằng các nghiên cứu đánh giá tác dụng của probiotic dạng vi khuẩn
thuộc chi Bacillus rất phổ biến và đa dạng cả ở trong nước và trên phạm vi quốc tế.
Bên cạnh đó, tôm thẻ chân trắng là loài động vật có tốc độ tăng trưởng khá
nhanh trong điều kiện môi trường và dinh dưỡng thuận lợi. Song chúng lại rất nhạy
cảm với sự thay đổi các yếu tố môi trường như nhiệt độ và độ mặn của nước. Không
chỉ vậy, các tác nhân như vi rút như vi rút gây bệnh đốm trắng (WSSV – White Spot
Syndrome Virus) và các chủng vi sinh vật gây bệnh (Vibrio sp., ...) [3], đây luôn là
những mối lo ngại đáng kể đối với người nuôi tôm thẻ chân trắng vì những thiệt hại to
lớn mà chúng gây ra. Để khắc phục phần nào tình trạng vi rút hoặc vi khuẩn gây bệnh
cho tôm, sử dụng kháng sinh bằng cách cho tôm ăn hoặc bổ sung vào nước nuôi tôm là
biện pháp đã được sử dụng rất phổ biến. Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh để phòng ngừa

10


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
bệnh trong nuôi tôm để lại vấn đề tồn đọng chưa thể giải quyết đó là: vi khuẩn, vi rút
có khả năng tích lũy đột biến kháng thuốc, khiến thuốc kháng sinh không thể sử dụng
lâu dài [0, 74]. Hơn thế nữa, việc sử dụng kháng sinh còn dẫn đến ảnh hưởng xấu cho
sức khỏe con người khi sử dụng tôm và tác động tiêu cực đến môi trường do dư lượng
lớn kháng sinh tích lũy trong tôm và môi trường nước [71]. Những năm gần đây,
probiotic được cho là có tiềm năng và được sử dụng khá phổ biến nhằm mục đích khắc
phục những mặt hạn chế kể trên của việc sử dụng kháng sinh. Một số nghiên cứu của
các tác giả trong và ngoài nước đã chứng minh vai trò của các chủng Bacillus sp. trong
việc hỗ trợ tăng cường miễn dịch giúp tôm phòng ngừa các tác nhân gây bệnh như vi
rút đốm trắng [61].
1.3.

Nghiên cứu về carotenoid và vi khuẩn sinh carotenoid

1.3.1. Carotenoid
Carotenoid là các phân tử hữu cơ tự nhiên có trong một số thực vật và sinh vật
quang hợp như tảo, nấm và một số vi khuẩn, điển hình là Bacillus sp. [34]. Carotenoid
là tên chung của một nhóm các hợp chất có công thức phân tử và chức năng tương tự
nhau, mỗi loại carotenoid đặc trưng cho một loại sắc tố khác nhau như vàng, vàng cam,
đỏ, đỏ cam,... Một số carotenoid quen thuộc với con người như: β-carotene (tiền chất
của vitamin A), lycopene, lutein, zeaxanthin và astaxanthin. Carotenoid được biết đến
với tác dụng quan trọng nhất là khả năng chống oxy hóa, giúp tế bào chống lại sự phá
hủy bởi tia UV. Chúng hoạt động như các oxy phân tử độc lập hoặc tương tác hiệp
đồng với các chất chống oxy hóa khác để bảo vệ tế bào [70]. Đối với vi khuẩn,
carotenoid giúp bảo vệ vi khuẩn tồn tại trong môi trường nội bào [34]. Đối với sức
khỏe con người, carotenoid đã được chứng minh có khả năng phòng ngừa và ức chế tế
bào ung thư ở mô hình in-vivo [44]. Carotenoid còn được biết đến với vai trò là chất
dinh dưỡng quan trọng tác động đến khả năng sinh sản của tôm [41], đồng thời,
carotenoid phổ biến trong tôm là astaxanthin - là sắc tố tạo nên màu đỏ cam của tôm
khi luộc [76].
11


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
1.3.2. Vi khuẩn sinh carotenoid
Carotenoid có rất nhiều tác dụng hữu ích đối với các sinh vật sống. Tuy nhiên,
con người hay các động vật khác, bao gồm cả tôm đều không có khả năng tự tổng hợp
carotenoid mà chỉ có các loài vi khuẩn, một số thực vật và tảo [64] mới có khả năng
này. Trong nhiều năm gần đây, có nhiều công bố về sàng lọc các chủng vi khuẩn sản
sinh carotenoid từ đất, nước hay phân người, như: B. marisflavi, B. aquimaris sinh
carotenoid sắc tố đỏ-cam [77], B. firmus sinh carotenoid sắc tố hồng [55], B. indicus, B.
cibi, B. jeogadi sinh sắc tố vàng [34]. Tuy nhiên, cho đến nay mới chỉ có nghiên cứu
của Ngo và cộng sự năm 2016, tiến hành sàng lọc các chủng vi khuẩn sinh sắc tố trong

ruột tôm thẻ chân trắng [48]. Trong nghiên cứu này, Ngo và cộng sự đã phân lập được
một số chủng như B. aquimaris, B. marisflavi, B. firmus đều là các chủng vi khuẩn có
lợi, có khả năng sinh sắc tố carotenoid màu vàng cam, trong đó, B. aquimaris SH6 là
chủng được xác định có khả năng sinh sắc tố tốt nhất và khả năng tăng cường miễn
dịch của tôm thẻ chân trắng thông qua tăng cường hoạt tính enzyme PO ở tôm, cũng
như tiềm năng phát triển thành chế phẩm sinh học trong thức ăn nuôi tôm nói riêng và
nuôi trồng thủy sản nói chung.
1.3.3. Astaxanthin
Astaxanthin là một loại carotenoid có công thức hóa học là 3,3-dihydroxy-4,4diketo-β-carotene, là sắc tố chính được tìm thấy trong hầu hết các loại giáp xác như
tôm, cua,... và một số loài cá, chiếm tới 90% tổng số carotenoid trong các loài này.
Astaxanthin được biết đến là một loại chất chống oxy hóa tuyệt vời nhờ các gốc tự do
trong cấu trúc phân tử và tác dụng chống ung thư, tốt cho da, tốt cho tim mạch, bảo vệ
não bộ và giảm đau khớp,... Đối với tôm, astaxanthin là sắc tố quyết định màu sắc đỏ
cam của tôm khi luộc – là chỉ số cảm quan đánh giá giá trị dinh dưỡng và giá trị thương
phẩm của tôm, tăng cường đáp ứng miễn dịch và sức chịu đựng của tôm trong điều
kiện môi trường thiếu hụt oxy, đồng thời nồng độ astaxanthin cũng là chỉ số đánh giá
giá trị kinh tế của tôm. Từ năm 1990, Yamada và cộng sự đã chỉ ra rằng, tôm được cho
12


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
ăn với thức ăn bổ sung astaxanthin cho thấy tỷ lệ tử vong giảm đáng kể so với tôm
không được ăn với thức ăn bổ sung astaxanthin [76].
Với những công dụng quan trọng như thế, astaxanthin đang dần trở thành một
chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng và giá trị của tôm nuôi. Trên thị trường
hiện nay cũng có nhiều sản phẩm đã được thương mại hóa có tác dụng cung cấp
astaxanthin tổng hợp phục vụ nuôi trồng thủy sản, tiêu biểu là Carophyll Pink® 10%
CWS (hãng DSM, Thụy Sỹ) chứa 10% astaxanthin. Bên cạnh đó, cũng có nhiều loại
thực phẩm chức năng bổ sung astaxanthin cho người. Tuy nhiên, những sản phẩm như
Carophyll Pink® là những chất tổng hợp hoá học nên khả năng hấp thu và chuyển hoá ở

tôm sẽ không hiệu quả bằng những hợp chất carotenoid có nguồn gốc tự nhiên. Bên
cạnh đó, dư lượng khi sử dụng trong nuôi trồng thủy sản có thể để lại ảnh hưởng tiêu
cực cho người sử dụng và môi trường nuôi. Do đó, những nghiên cứu phát triển
probiotic dạng vi khuẩn sống có khả năng sinh tổng hợp carotenoid tự nhiên đem lại ý
nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn to lớn trong nuôi trồng tôm.
1.4.

Hệ thống miễn dịch của tôm thẻ chân trắng
Tôm là loài động vật giáp xác không có khả năng sản sinh immunoglobulins mà

cơ chế bảo vệ phụ thuộc chính vào hệ miễn dịch tự nhiên hay còn gọi là hệ miễn dịch
không đặc hiệu [23]. Hệ thống miễn dịch này bao gồm các phản ứng trực tiếp của tế
bào máu với tác nhân gây bệnh như cơ chế thực bào, các yếu tố hoạt hóa huyết tương
từ hệ thống prophenoloxidase (proPO), hoạt độ enzyme superoxidase (SOD), chúng
cũng tạo ra các yếu tố kết dính, hệ thống đông máu (hemolymph coagulation system),
melanin hóa, peptide kháng khuẩn - AMP (Anti-Microbial Peptide) [27, 42, 75].
Hệ thống miễn dịch của tôm khởi động bằng việc nhận diện tác nhân xâm nhập
thông qua sự gắn kết protein bề mặt, các lipopolysaccharide trên thành tế bào vi khuẩn
hoặc các β-1,3-glucan trên thành tế bào nấm, kích hoạt các yếu tố zymogen, dẫn đến
các quá trình bao gói, thực bào, melanin hóa, encapsunin hóa nhằm tấn công và tiêu

13


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
diệt tác nhân xâm nhập [38, 65]. Đối với hệ miễn dịch ở tôm, liên quan đến quá trình
tiêu thụ các gốc tự do gây độc, các tế bào hyaline tiếp nhận tín hiệu và kích hoạt cơ chế
tự vệ tế bào sản sinh ra lượng lớn các gốc oxy tự do. Các gốc oxy tự do này nếu tồn tại
với số lượng lớn sẽ gây độc cho tế bào. Khi đó, cơ chế miễn dịch không đặc hiệu của
tôm sẽ cho phép tế bào sản sinh SOD - là một enzyme có khả năng xúc tác các phản

ứng nội bào, chuyển hóa các gốc oxy tự do thành oxy phân tử và H2O2. Nhờ có enzyme
SOD, mà các oxy tự do hoặc các gốc oxy hóa trong tế bào được kiểm soát ở mức tối
thiểu, không xảy ra hiện tượng gây độc hay gây chết tế bào [11, 25]. Bên cạnh cơ chế
hoạt động của enzyme SOD, hoạt tính proPO/PO cũng đóng một vai trò thiết yếu trong
hệ miễn dịch không đặc hiệu của tôm thẻ chân trắng, cụ thể. Cơ chế hoạt hóa enzyme
PO được kiểm soát bằng tế bào máu granular và semi-granular dẫn đến hiện tượng
encapsunin và melanin hóa. Khi các tế bào granular và semi-granular tiếp nhận các tín
hiệu từ thụ thể màng tế bào về các tác nhân xâm nhập, chúng được hoạt hóa và xảy ra
hiện tượng degranulation, sau đó kích hoạt hệ thống enzyme ProPO, hình thành phân
tử enzyme có hoạt tính - PO nhờ sự xúc tác của enzyme nội bào trypsine proteinase.
PO hay còn gọi là trysinase, enzyme xúc tác cho các phản ứng: (1) hydroxyl hóa hợp
chất monophenol thành o-diphenol và (2) oxi hóa o-diphenol thành o-quinone. Oquinone chính là các nội độc tố tham gia quá trình melanin hóa, encapsunin hóa nội
bào và tiêu diệt các tác nhân xâm nhập vào tế bào [65].
Bên cạnh đó, một số nghiên cứu khác về hệ miễn dịch và quá trình thực bào của
tôm, các nhà khoa học đã phát hiện ra sự tham gia của các protein họ GTPase, trong
đó, điển hình là protein Rho (Ras like GTPase) tham gia vào cơ chế opsonin hóa, nội
tiết và quá trình hình thành superoxide trong cơ chế thực bào của tôm [36]; protein Ran
(ras-related nuclear protein) là nhân tổ chủ đạo tham gia các quá trình vận chuyển các
chất qua nhân [17, 28]. Những công bố này đã đưa ra bằng chứng về việc khi có các
tác nhân xâm nhập như vi khuẩn, vi rút (WSSV) thì mức độ biểu hiện các gen Rho và
Ran này tăng lên một cách đáng kể. Điều này là minh chứng cho sự gia tăng mức độ

14


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
biểu hiện các gen này tương ứng với sự tăng cường miễn dịch bảo vệ tế bào khỏi các
tác nhân xâm nhập đối với tôm. Do đó, bên cạnh mức độ hoạt động của các enzyme
SOD hay PO như được mô tả ở trên thì mức độ biểu hiện các gen Rho, Ran này cũng
được xem là các chỉ thị sinh học phân tử phục vụ nghiên cứu đánh giá mức độ tăng

cường hệ miễn dịch ở tôm nói chung và tôm thẻ chân trắng nói riêng.
1.5.

Bào tử B. aquimaris SH6 và tác dụng probiotic của chúng đối với tôm thẻ
chân trắng

1.5.1. Thực trạng nghiên cứu vai trò probiotic của bào từ B. aquimaris
Cũng giống như như nhiều loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus, B. aquimaris có khả
năng hình thành bào tử bền nhiệt và tồn tại lâu dài trong điều kiện môi trường khác
nhau. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng nảy mầm và thể hiện vai trò probiotic của
mình. Do đó, B. aquimaris được đánh giá là có tiềm năng phát triển thành chế phẩm
sinh học với ưu điểm độ sống được đảm bảo trong quá trình bảo quản và sử dụng. B.
aquimaris là chủng vi sinh vật được tìm thấy phổ biến trong trầm tích biển, sinh trưởng
tốt trong điều kiện pH 7.5-9.5, tế bào hình que, có khả năng hình thành nội bào tử, ưa
mặn [77]. Đã có một số nghiên cứu chứng minh rằng B. aquimaris phân lập từ phân
của người có khả năng sinh tổng hợp các loại glycolycopens (một dạng carotenoid) và
nghiên cứu đánh giá khả năng hấp thu carotenoid của B. aquimaris ở mô hình chuột
[34, 77]. Năm 2016, với mục đích sàng lọc các chủng vi khuẩn Bacillus trực tiếp từ
tôm để phát triển probiotic thân thiện với hệ vi sinh vật của tôm, nhóm nghiên cứu của
tác giả Ngo và cộng sự đã tiến hành sàng lọc các vi khuẩn tạo bào tử và có sắc tố từ hệ
vi sinh vật trong ruột tôm thẻ chân trắng. Từ các chủng phân lập được, nhóm nghiên
cứu đã thực hiện các thử nghiệm sâu hơn để xác định các chủng Bacillus sp. có khả
năng sản sinh carotenoid ở mức độ cao nhất, có hoạt tính chống oxy hoá tốt nhất, và
bào tử bền nhiệt. Qua đó, Ngo và cộng sự đã chứng minh được rằng bào tử B.
aquimaris SH6 là chủng ưu việt nhất có khả năng sản sinh tổng hợp hơn 10 loại
glycolycopen khác nhau. Chủng vi khuẩn này đã được chọn làm giống để sản xuất
15


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018

probiotic cho thử nghiệm tăng hàm lượng astaxanthin, cân nặng và hoạt tính enzyme
PO (phenoloxidase) ở tôm thẻ chân trắng so với các chủng đối chứng như B. subtilis
PY79 và B. indicus HU36 [48].
Tuy nhiên, báo cáo này chỉ giới hạn ở việc đánh giá một chỉ tiêu miễn dịch (hoạt
tính enxyme PO), cân nặng, nồng độ astaxanthin của tôm dưới tác dụng của B.
aquimaris SH6 mà chưa làm sáng tỏ số phận của bào tử khi đi vào ruột tôm, cũng như
ảnh hưởng của nó đối với hệ vi sinh vật trong ruột và một số chỉ tiêu miễn dịch khác ở
tôm như Rho, Ran và SOD (Superoxidase dimustase).
1.5.2. Khả năng nảy mầm của bào tử B. aquimaris
Nảy mầm là quá trình mà vi khuẩn gặp điều kiện môi trường và dinh dưỡng
thuận lợi sẽ tái tạo trạng thái tế bào sinh dưỡng thay vì trạng thái nội bào tử. Chất dinh
dưỡng liên kết với thụ thể màng trong của bào tử, kích hoạt sự giải phóng axit
dipicolinic, các cation và sự thủy phân lớp vỏ peptidoglycan của bào tử cho phép bào
tử chuyển thành trạng thái tế bào sinh dưỡng [60].
Liên quan đến vai trò probiotic của các chủng Bacillus sp., câu hỏi đặt ra là:
Nếu bào tử không nảy mầm, mà chỉ tồn tại ở trạng thái bào tử, đi ngang qua ruột và sau
đó bị thải ra ngoài qua phân của vật chủ, thì làm sao chúng có thể thực hiện chức năng
probiotic của mình? Đây cũng là nguyên nhân khiến nhiều nhà khoa học tập trung
nghiên cứu về số phận của bào tử trong hệ tiêu hóa của vật chủ bao gồm cả hai quá
trình nảy mầm và tái tạo bào tử trong ruột [12, 49, 60]. Tuy nhiên, các nghiên cứu này
chỉ mới thực hiện trên đối tượng là B. subtilis spp., nảy mầm trong ruột một số động
vật có xương sống. Cụ thể, nghiên cứu của Nguyen và cộng sự (2006) về vòng đời của
B. subtilis trong ruột chuột [53], nghiên cứu sự nảy mầm của chủng tái tổ hợp B.
subtilis SC2288 ở ruột chuột [12] hoặc sự nảy mầm của bào tử B. subtilis SC2362
trong ruột gà [68]. Sử dụng nhiều phương pháp và các chỉ thị sinh học khác nhau,
những nghiên cứu này đã chứng minh được rằng bào tử không chỉ được tiêu thụ và thải

16

Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
ra khỏi ruột vật chủ một cách đơn thuần, mà phần nào bám lại trong thành ruột và sau
đó nảy mầm. Qua đó, chúng thể hiện vai trò của mình trong việc kích thích hệ miễn
dịch của vật chủ sản sinh IgA và cytokin tiền viêm (TNF-α) [33], kích thích sự phát
triển của hệ thống mô bạch huyết đường ruột (gut-asociated lymphoid tissue – GALT)
[62], ... Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào đánh giá khả năng nảy mầm
của bào tử B. aquimaris trong ruột tôm.
Phương pháp truyền thống sử dụng các kỹ thuật vi sinh vật học được dùng để
đánh giá khả năng nảy mầm của bào tử vi khuẩn có thể kể đến là đếm khuẩn lạc hình
thành trên đĩa môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, phương pháp này có độ chính xác
không cao. Do đó, để đánh giá khả năng nảy mầm của vi khuẩn trong ruột động vật,
điển hình là bào tử B. subtilis spp., các nhà khoa học lựa chọn các một số các chỉ thị
sinh học phân tử đặc trưng cho sự nảy mầm của bào tử B. subtilis như một số gen:
gerA/B/K, Cwl,...[12, 53]. Tuy nhiên, trong trường hợp của B. aquimaris SH6, do
những nghiên cứu về khả năng nảy mầm của chủng vi khuẩn này hoàn toàn chưa có.
Nên nghiên cứu này lựa chọn gen BaqA-mã hóa cho enzyme α-amylase để làm chỉ thị
sinh học phân tử, giúp đánh giá khả năng và hiệu suất nảy mầm của bào tử B.
aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng. Enzyme α-amylase được biết đến là
enzyme thủy phân tích bột, giúp phân giải liên kết α1-4 của phân tử amylose thành
amylopectin. Quá trình nảy mầm của bào tử vi khuẩn liên quan mật thiết với nồng độ
Ca2+ và nồng độ DPA (Dipicolinic acid) và tăng tiết enzyme α-amylase [55]. Do đó,
đánh giá mức độ biểu hiện gen BaqA có thể giúp đánh giá khả năng và hiệu suất nảy
mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm.
1.6.

Đặt vấn đề nghiên cứu và thiét kế thí nghiệm
Nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích đánh giá khả năng lưu trú và

nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6 trong ruột tôm thẻ chân trắng và các tác dụng
probiotic của chúng. Để đánh giá được khả năng lưu trú, nảy mầm của bào tử B.

aquimaris SH6 cũng như ảnh hưởng của bào tử lên các chỉ tiêu miễn dịch, tăng trưởng
17


Luận văn thạc sĩ khoa học 2018
trọng lượng và nồng độ astaxanthin, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên đối tượng tôm
thẻ chân trắng 25 ngày tuổi (Litopenaeus vannamei) với thiết kế thí nghiệm cho tôm ăn
bào tử B. aquimaris SH6 và dịch chiết carotenoid từ vi khuẩn B. aquimaris SH6 có so
sánh với các nhóm đối chứng liên tục trong 28 ngày, ở quy mô phòng thí nghiệm. Các
nhóm thí nghiệm bao gồm: nhóm đối chứng âm “ĐC”: tôm được nuôi với thức ăn
thông thường; nhóm “Carophyll”: tôm được cho ăn với thức ăn trộn Carophyll Pink®
10% CWS để đạt nồng độ astaxanthin cuối cùng trong thức ăn là 0,5 mg/g thức ăn;
nhóm “SH6 spore”: tôm được cho ăn với thức ăn trộn bào tử B. aquimaris SH6, nồng
độ 5 × 106 CFU/g thức ăn và nhóm “SH6 carotenoid”: tôm được cho ăn với thức ăn
trộn dịch chiết carotenoid từ tế bào sinh dưỡng SH6, nồng độ 5 µg/g thức ăn. Với mục
tiêu ban đầu là đánh giá khả năng lưu trú và nảy mầm của bào tử B. aquimaris SH6, và
ảnh hưởng của nó tới hệ vi sinh vật của tôm, chúng tôi thiết kế thí nghiệm đếm độ sống
của vi khuẩn từ mẫu ruột tôm ở các lô thí nghiệm và kết hợp với kỹ thuật giải trình tự
gen 16sRNA để xác định đa dạng vi sinh vật cũng như độ sống của các loài vi sinh vật
có lợi trong ruột tôm. Việc đánh giá sự nảy mầm của bào tử SH6 được thực hiện thông
qua mức độ biểu hiện của gen quy định khả năng nảy mầm của bào tử Bacillus
aquimaris – BaqA, gen mã hóa cho enzyme α-amylase được tế bào vi sinh vật tiết ra
khi chúng tồn tại ở tế bào sinh dưỡng. Với mục tiêu thứ hai đánh giá các chỉ số miễn
dịch và các hoạt tính probiotic khác trên tôm, chúng tôi thực hiện theo các phương
pháp tham khảo nghiên cứu của các nhóm tác giả Huang và cộng sự (2008), McCord
và cộng sự (1969), … [33, 46] và của chính nhóm nghiên cứu đã công bố trước đây –
Ngo và cộng sự (2016) [48].

18