Nghiên cứu đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên của một số tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp cấp trên bệnh nhân tại bệnh viện ở miền Bắc Việt Nam, 2013-2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------

TRẦN THỊ THANH LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN
VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ
TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP
TRÊN BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN Ở MIỀN BẮC
VIỆT NAM, 2013-2016

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------

TRẦN THỊ THANH LOAN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN
VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA MỘT SỐ
TÁC NHÂN VI RÚT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TRÊN
BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN Ở MIỀN BẮC
VIỆT NAM, 2013-2016
Chuyên ngành

Vi sinh vật học

Mã số

62420107

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai
PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - 2018


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tập thể mà tôi là
thành viên chính thức tham gia nghiên cứu. Tôi đã đƣợc trƣởng nhóm nghiên
cứu cho phép sử dụng kết quả nghiên cứu công bố trong luận án.
Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc công
bố trong bất kỳ công trình nào khác

NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Thanh Loan


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn:
 Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học và Khoa Sinh học, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

 Ban Giám đốc Bệnh viện Y học cổ truyền Trung ương đã cho phép, tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện và hoàn thành luận án.
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:
PGS.TS. Lê Thị Quỳnh Mai, Phó viện trưởng Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương, là người hướng dẫn khoa học luôn chỉ bảo tận tình và tạo mọi
điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà, Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, là giáo viên đồng hướng dẫn, đã truyền thụ cho
tôi những kiến thức chuyên ngành Vi sinh vật học và lòng nhiệt tình trong
suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thành luận án này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới:
PGS.TS. Nguyễn Lê Khánh Hằng, Phó trưởng Khoa Vi rút, Viện Vệ
sinh Dịch tễ Trung ương, là người thầy và cũng là người bạn luôn hướng dẫn
và chỉ bảo tận tình để tôi hoàn thành luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới :
 TS. Trần Văn Tuấn, Trưởng Bộ môn Vi sinh vật học cùng các thầy cô
giáo trong bộ môn đã truyền thụ cho tôi nhũng kiến thức quý báu trong thời
gian qua.
 TS. Hoàng Vũ Mai Phương, Trưởng Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương cùng toàn thể các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng Thí


nghiệm Cúm, Khoa Vi rút đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá
trình thực hiện luận án.
 Tập thể cán bộ Khoa Đông Y thực nghiệm đã luôn động viên và tạo
động lực cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Cuối cùng, tôi xin dành tất cả lòng biết ơn và tình cảm yêu quý tới Bố, Mẹ tôi,
Chồng và các con trai tôi cùng những người thân trong gia đình, các bạn
thân, các đồng nghiệp đã luôn động viên, hỗ trợ tôi, chia sẻ cùng tôi những

khó khăn vất vả và luôn hết lòng vì tôi trong cuộc sống và sự nghiệp!
Hà Nội, ngày….tháng…. năm 2018
Tác giả

Trần Thị Thanh Loan


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................4
DANH MỤC CÁC BẢNG ...............................................................................................6
CÁC CHỮ VIẾT TẮT .....................................................................................................8
MỞ ĐẦU..............................................................................................................................9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 13
1.1. BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP VÀ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA
CÁC TÁC NHÂN VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP THƢỜNG GẶP .................... 13
1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae .................................................................. 14
1.1.2. Vi rút Paramyxoviridae ........................................................................ 27
1.1.3. Vi rút họ Picornaviridae ....................................................................... 37
1.1.4. Vi rút họ Adenoviridae . ....................................................................... 41
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC CỦA CÁC CĂN NGUYÊN VI
RÚT GÂY BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP ................................................ 47
1.2.1. Trên thế giới .......................................................................................... 47
1.2.2. Tại Việt Nam ......................................................................................... 49
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÒNG THÍ NGHIỆM DÙNG TRONG CHẨN
ĐOÁN TÁC NHÂN VI RÖT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP .................... 51
1.3.1. Xét nghiệm chẩn đoán nhanh (Quicktest).......................................... 52
1.3.2. Phân lập vi rút ...................................................................................... 52
1.3.3. Phản ứng Realtime PCR/ RT-PCR ..................................................... 53
1.3.4. Kỹ thuật Luminex/xTAG RVP ........................................................... 55
1.3.5. Phƣơng pháp xác định trình tự gen Sanger sequencing ................... 56

1.3.6. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể ...................................................... 57
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 58
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 58
2.1.1. Định nghĩa bệnh viêm đƣờng hô hấp cấp .......................................... 58
2.1.2. Cỡ mẫu, thời gian và địa điểm ............................................................ 58
2.2. VẬT LIỆU ......................................................................................................... 58
2.2.1. Mẫu bệnh phẩm .................................................................................... 58
1


2.2.2. Các dòng tế bào đƣợc sử dụng trong nghiên cứu .............................. 59
2.2.3. Sinh phẩm ............................................................................................. 60
2.2.4. Các chủng vi rút mẫu chứng ............................................................... 63
2.2.5. Trang thiết bị và dụng cụ..................................................................... 64
2.3. SƠ ĐỒ TÓM TẮT NGHIÊN CỨU .................................................................. 65
2.3.1. Sơ đồ tóm tắt mục tiêu 1 ...................................................................... 65
2.3.2. Sơ đồ tóm tắt mục tiêu 2 ...................................................................... 66
2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 67
2.4.1. Phƣơng pháp Realtime RT-PCR ........................................................ 67
2.4.2. Phân lập vi rút ...................................................................................... 70
2.4.3. Định typ vi rút bằng phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu (HI) ..... 71
2.4.4. Kỹ thuật giải trình tự gen .................................................................... 73
2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu.................................................................... 77
2.5. VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU ............................................... 77
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ................................... 78
3.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ....................................... 78
3.1.1. Kết quả thu thập mẫu theo thời gian trong giai đoạn nghiên cứu . 78
3.1.2. Đặc điểm của đối tƣợng nghiên cứu theo tuổi và giới ....................... 80
3.2. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN XÁC ĐỊNH VÀ PHÂN TYP CÁC TÁC NHÂN
VI RÖT GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP ....................................................... 81

3.2.1. Xác định các tác nhân vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp ................ 81
3.2.2. Sự phân bố các vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp theo thời gian ... 83
3.2.3. Sự phân bố các họ vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp tại miền Bắc
Việt Nam, 2013-2016 ...................................................................................... 84
3.3. ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN VÀ ĐẶC TÍNH KHÁNG NGUYÊN CỦA VI
RÚT CÚM................................................................................................................. 88
3.3.1. Kết quả phân lập và định typ vi rút cúm, 2013-2016 ........................ 89

2


3.3.2. Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA và NA của vi rút cúm
A/H1N1pdm09 phân lập từ bệnh nhân viêm đƣờng hô hấp cấp, 2013-2016
.......................................................................................................................... 90
3.3.3. Đặc điểm di truyền của phân đoạn gen HA, NA của vi rút cúm
A/H3N2 phân lập từ bệnh nhân VĐHHC, 2013-2016 ................................. 96
3.3.4. Đặc điểm di truyền của vi rút cúm B phân lập từ bệnh nhân viêm
đƣờng hô hấp cấp, 2013-2016 ...................................................................... 103
3.3.5. Đặc tính kháng nguyên vi rút cúm phân lập từ bệnh phẩm viêm
đƣờng hô hấp cấp tại miền Bắc, 2013-2016................................................ 110
3.4. ĐẶC ĐIỂM CÁC VI RÖT KHÁC GÂY VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP TẠI
MỘT SỐ BỆNH VIỆN KHU VỰC MIỀN BẮC, 2013-2016 .............................. 114
3.4.1. Phân bố các tác nhân vi rút đƣờng hô hấp khác theo thời gian
nghiên cứu ..................................................................................................... 116
3.4.2. Phân bố các tác nhân vi rút đƣờng hô hấp khác theo lứa tuổi ...... 117
3.4.3. Kết quả phân lập vi rút đƣờng hô hấp khác .................................... 120
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 126
KIẾN NGHỊ .................................................................................................................. 128
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 130

3


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm ......................................... 15
Hình 1. 2. Hệ gen của vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae .............................. 16
Hình 1. 3. Sự thay đổi nhỏ và lớn kháng nguyên của vi rút cúm ................... 17
Hình 1. 4. Chu trình nhân lên của vi rút cúm vào tế bào vật chủ .................. 18
Hình 1. 5. Giải phẫu bệnh tổ chức phổi nhiễm vi rút cúm A/H1N1pdm09 ... 21
Hình 1. 6. Nhóm thuốc ức chế neuraminidase (NAIs) ................................... 25
Hình 1. 7. Mô hình cấu trúc virion của vi rút họ Paramyxoviridae .............. 28
Hình 1. 8. Hệ gen của vi rút thuộc họ Paramyxoviridae ............................... 28
Hình 1. 9. Chu trình nhân lên của vi rút họ Paramyxoviridae ....................... 30
Hình 1. 10. Cấu trúc virion của Piconarviridae ............................................. 37
Hình 1. 11. Hệ gen của vi rút thuộc họ Piconarviridae ................................. 37
Hình 1. 12. Chu kỳ sống của vi rút Picona .................................................... 38
Hình 1. 13. Hình thái của Adenoviridae ......................................................... 41
Hình 1. 14. Cấu trúc hệ gen Adeno ............................................................... 42
Hình 1. 15. Quá trình nhân lên ở vi rút Adeno .............................................. 43
Hình 1. 16: Phân tích Real time RT-PCR ....................................................... 54
Hình 2. 1. Định typ vi rút bằng phản ứng ức chế ngƣng kết hồng cầu ........... 71
Hình 2. 2. Sơ đồ thực hiện phản ứng HI ......................................................... 72
Hình 3. 1. Kết quả thu thập mẫu theo tháng trong giai đoạn nghiên cứu 20132016 ................................................................................................................. 79
Hình 3. 2. Sự tƣơng quan giữa tác nhân vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp và
số mẫu thu thập theo thời gian ........................................................................ 83
Hình 3. 3. Tỷ lệ các vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp .................................. 86
Hình 3. 4. Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1778 nucleotide của vi rút cúm
A/H1N1pdm09, 2013-2016............................................................................. 91

4

Hình 3. 5. Cây gia hệ phân đoạn gen NA 1413 nucleotide của vi rút cúm
A/H1N1pdm09, 2013-2016............................................................................. 92
Hình 3. 6. Phân tích gia hệ nhóm 6 vi rút cúm A/H1N1pdm09 lƣu hành tại
miền Bắc, 2013-2016 ...................................................................................... 94
Hình 3. 7. Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1184 nucleotide của vi rút cúm
A/H3N2, 2013-2016 ........................................................................................ 97
Hình 3. 8. Cây gia hệ phân đoạn gen NA 1455 nucleotide của vi rút cúm
A/H3N2, 2013-2016 ........................................................................................ 98
Hình 3. 9. Cây gia hệ vi rút cúm A/H3N2 theo từng năm, 2013-2016 ........... 99
Hình 3. 10. Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1115 nucleotide của vi rút cúm
B/Victoria, 2013-2016................................................................................... 104
Hình 3. 11. Cây gia hệ phân đoạn gen HA 1115 của vi rút cúm B/ Yamagata,
2013-2016...................................................................................................... 105
Hình 3. 12. Cây gia hệ vi rút cúm B dòng Vitoria lƣu hành tại miền Bắc Việt
Nam, 2013 và 2016 ....................................................................................... 107
Hình 3. 13. Cây gia hệ cúm B dòng Yamagata lƣu hành tại miền Bắc Việt
Nam, 2013-2016 ............................................................................................ 109
Hình 3. 14. Phân bố tác nhân vi rút đƣờng hô hấp khác theo thời gian nghiên
cứu ................................................................................................................. 116
Hình 3. 15. Phân bố các tác nhân vi rút viêm đƣờng hô hấp cấp theo lứa tuổi
....................................................................................................................... 117
Hình 3. 16. Hình ảnh CPE của vi rút RSV trên dòng tế bào cảm nhiễm Hep2
(độ phóng đại x200) ...................................................................................... 122
Hình 3. 17. Hình ảnh CPE của vi rút Adeno trên dòng tế bào cảm nhiễm A549
(độ phóng đại x200) ...................................................................................... 123

5

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Các dòng tế bào thƣờng trực dùng trong phân lập vi rút cúm và các
vi rút hô hấp khác ........................................................................................... 59
Bảng 2. 2. Hệ thống mồi và probe sử dụng phát hiện vi rút cúm bằng phƣơng
pháp Realtime RT-PCR................................................................................... 60
Bảng 2. 3. Hệ thống mồi và probe sử dụng phát hiện vi rút hô hấp khác bằng
phƣơng pháp Realtime RT-PCR .................................................................... 61
Bảng 2. 4. Hệ thống mồi cho giải trình tự phân đoạn gen HA, NA ............... 62
Bảng 2. 5. Hệ thống mẫu chứng sử dụng trong nghiên cứu ........................... 63
Bảng 2. 6. Chủng chuẩn vi rút cúm trong nghiên cứu di truyền và đặc tính
kháng nguyên .................................................................................................. 64
Bảng 3. 1. Kết quả thu thập mẫu trong giai đoạn nghiên cứu 2013-2016 ...... 78
Bảng 3. 2. Phân bố bệnh nhân viêm đƣờng hô hấp cấp theo tuổi và giới....... 80
Bảng 3. 3. Tỷ lệ phát hiện tác nhân vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp, 20132016 ................................................................................................................. 82
Bảng 3. 4. Sự phân bố các họ vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp tại miền Bắc,
2013-2016........................................................................................................ 84
Bảng 3. 5. Các vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp tại miền Bắc, 2013-2016 . 86
Bảng 3. 6. Kết quả phân lập vi rút cúm năm 2013-2016 ................................ 89
Bảng 3. 7. Sự thay đổi các axit amin trong nhóm 6 của các vi rút
A/H1N1pdm09 lƣu hành tại miền Bắc, 2013-2016 ........................................ 95
Bảng 3. 8. Nhóm/ phân nhóm trên cây gia hệ của vi rút cúm A/H3N2 lƣu
hành tại miền Bắc, 2013-2016 ...................................................................... 100
Bảng 3. 9. Sự thay đổi axit amin của các vi rút H3N2 theo thời gian và
nhóm/phân nhóm ........................................................................................... 102
Bảng 3. 10. Sự thay đổi trên protein HA của vi rút cúm B dòng Yamagata lƣu
hành tại Việt Nam, 2013-2016 ...................................................................... 110

6

Bảng 3. 11. Kết quả xác định đặc tính kháng nguyên vi rút cúm phân lập từ
bệnh phẩm viêm đƣờng hô hấp cấp, 2013-2016 ........................................... 111
Bảng 3. 12. Phân bố các vi rút khác gây viêm đƣờng hô hấp cấp ................ 114
Bảng 3. 13. Phân bố các tác nhân vi rút theo nhóm tuổi .............................. 118
Bảng 3. 14. Kết quả phân lập các vi rút khác gây viêm đƣờng hô hấp cấp .. 121

7


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CDC
CPE
HA
HI
ILI
RT-LAMP

Realtime
RT-PCR
VĐHHC
Sequencing
MDCK
HEp-2
A549
LLC-MK2
SPF
WHO
Pdm
GISRS

KT
mARN
cADN

Centers
for
Disease
Control and Prevention
Cytopathic effect
Hemagglutinin Assay
Hemagglutinin Inhibition
Assay
Influenza Like Illness
Reverse
transcriptaseLoop-mediated isothermal
amplification
Real
time
Reverse
Transcriptase-Polymerase
Chain Reaction
Sever Acure Respiratory
Infection
Mardin – Darby canine
kidney cells
Human epithelial type 2
cells
Alveolar
Type

II
pulmonary epithelium
Rhesus Monkey Kidney
Epithelial Cells
Specific Pathogen Free
World
Health
Organization
Pandemic
Global
Influemza
Surveilance and Response
System
Anti body
messenger RNA
complementary DNA
8

Trung tâm Phòng ngừa và
Kiểm soát bệnh – Mỹ
Hủy hoại tế bào
Phản ứng ngƣng kết hồng cầu
Phản ứng ức chế ngƣng kết
hồng cầu
Hội chứng Cúm
Phƣơng pháp khuếch đại đẳng
nhiệt qua trung gian vòng phiên
mã ngƣợc
Phƣơng pháp sao chép ngƣợc
chuỗi polymerase theo thời

gian thực
Viêm đƣờng hô hấp cấp tính
Phƣơng pháp giải trình tự gen
Tế bào thận chó
Tế bào ung thƣ biểu mô thanh
quản
Tế bào ung thƣ biểu mô phổi
Tế bào biểu mô thận khỉ
Không có tác nhân gây bệnh
Tổ chức Y tế thế giới
Đại dịch
Hệ thống phản ứng và giám sát
cúm toàn cầu
Kháng Thể
ARN thông tin
ADN bổ sung


MỞ ĐẦU
Viêm đƣờng hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên vi rút là một trong
những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu tại các nƣớc đang phát triển. Theo
báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khoảng 4,5 triệu trẻ em dƣới 5
tuổi tử vong hàng năm do VĐHHC và do căn nguyên vi rút chiếm 40% trong
tổng số đó [69]. Các tác nhân vi rút thƣờng gặp nhƣ vi rút cúm mùa
(Influenzavirus), vi rút hợp bào đƣờng hô hấp (RSV), vi rút á cúm
(Parainfluenzavirus) đã đƣợc ghi nhận. Bên cạnh đó sự xuất hiện của các tác
nhân vi rút mới nhƣ vi rút cúm A/H5N1 (1997), metapneumovirus (hMPV)
(2001), SARS-CoV (2003), cúm A/H1N1 đại dịch (2009), vi rút MERS-CoV
(tháng 9/2012) và gần đây nhất là vi rút cúm A/H7N9 lây từ gia cầm sang
ngƣời tại Trung Quốc (4/2013)…[31, 142] đã làm tăng mối quan ngại cho sức

khỏe cộng đồng, đặc biệt đối với trẻ em và ngƣời già (>65 tuổi). Trong khi
đó, thuốc kháng vi rút dùng trong điều trị đặc hiệu là hạn chế, vắc xin dự
phòng của nhiều tác nhân vẫn còn trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển.
Vi rút gây VĐHHC thƣờng mang tính chất mùa tại các nƣớc có khí hậu
ôn đới, trong khi Việt Nam là nƣớc nhiệt đới, có sự khác biệt rõ rệt của khí
hậu tại 2 khu vực miền Bắc và miền Nam. Do phần lớn các tác nhân vi rút
gây bệnh VĐHHC có sự đa dạng di truyền và đặc tính kháng nguyên nên việc
nghiên cứu để lựa chọn vi rút phát triển vắc xin phòng bệnh có tính ổn định
cao và đại diện cho quần thể vi rút lƣu hành là cần thiết. Các nghiên cứu trƣớc
đây về vi rút VĐHHC đã có tại Việt Nam sử dụng phƣơng pháp phân lập vi
rút trên tế bào cảm thụ hoặc phƣơng pháp PCR thông thƣờng nên chƣa mang
tính đồng bộ, chƣa phản ánh đƣợc đầy đủ tỷ lệ lƣu hành và đặc điểm của các
loại vi rút gây VĐHHC.
Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực Y-Sinh học
tại Việt Nam những năm gần đây, kỹ thuật Realtime RT-PCR đã đƣợc triển

9


khai nhằm phát hiện toàn bộ các tác nhân vi rút gây VĐHHC với độ chính xác
cao trong thời gian ngắn giúp cho các bác sĩ lâm sàng có định hƣớng điều trị
hiệu quả. Tuy nhiên, thông tin về vai trò, đặc điểm vi rút học của các tác nhân
vi rút gây VĐHHC tại Việt Nam còn hạn chế. Xuất phát từ lý do trên, chúng
tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm di truyền và đặc tính kháng
nguyên của một số tác nhân vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp trên bệnh
nhân tại bệnh viện ở miền Bắc Việt Nam, 2013-2016‖ với mục tiêu:
1. Xác định các tác nhân vi rút gây viêm đƣờng hô hấp cấp bằng phƣơng
pháp Realtime RT-PCR.
2. Phân tích đặc điểm di truyền, tính kháng nguyên một số tác nhân vi rút
chủ yếu gây viêm đƣờng hô hấp cấp trong giai đoạn nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu
Gồm 2 nội dung chính:
Nội dung 1: Xác định các tác nhân vi rút gây VĐHHC bằng phương pháp
Realtime RT-PCR
- Mẫu bệnh phẩm (dịch họng, dịch nội khí quản) của bệnh nhân
VĐHHC điều trị chủ yếu ở các Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Nhi Trung
ƣơng, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ƣơng, Bệnh viện Lao phổi Trung
ƣơng, Bệnh viện Saint-Paul… thuộc khu vực miền Bắc Việt Nam.
- Xác định 12 tác nhân vi rút bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR tại Trung
tâm Cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng.
Nội dung 2: Phân tích đặc điểm di truyền, tính kháng nguyên một số tác nhân
vi rút chủ yếu gây viêm đường hô hấp cấp trong giai đoạn nghiên cứu.
- Phân lập các mẫu bệnh phẩm đƣợc xác định dƣơng tính với các tác
nhân vi rút cúm, RSV, hMPV...trên tế bào cảm thụ (MDCK, Vero, LLC/MK,
Hep 2…)
- Xác định hình thái tế bào bị huỷ hoại bởi các tác nhân vi rút hô hấp

10


RSV, hMPV, Adeno…
- Khuếch đại chủng vi rút, giải trình tự nucleotide một số mẫu đại diện
theo thời gian của vi rút cúm.
- So sánh phân đoạn gen HA và NA với các vi rút cúm lƣu hành tại một
số nƣớc khác trong khu vực và trên thế giới; xây dựng cây gia hệ.
- Nghiên cứu giám sát hiệu quả cho việc phát hiện các chủng vi rút
nguy hiểm mới từ các hiện tƣợng đột biến hoặc trao đổi tích hợp gen và có thể
là về nguy cơ xuất hiện dịch cũng nhƣ mức độ lan rộng của dịch.
Tính mới, ý nghĩa khoa học và sự cần thiết của vấn đề cần nghiên cứu.
- Là công trình nghiên cứu giám sát một cách toàn diện 12 tác nhân vi rút

hô hấp phổ biến gây VĐHHC tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2013-2016
bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR, đã cung cấp các thông tin cập nhật về
sự lƣu hành các vi rút gây VĐHHC tại miền Bắc Việt Nam, bổ sung vào các
thông tin chung tại khu vực và trên hệ thống giám sát toàn cầu.
- Là công trình công bố các kết quả nghiên cứu về đặc tính vi rút học của
chủng vi rút A/H1N1pdm09, A/H3N2 và B trong giai đoạn nghiên cứu (20132016) một cách đầy đủ.
- Đây là thông báo đầu tiên về nhiễm hMPV trong mẫu bệnh phẩm thu
thập tại đối tƣợng ngƣời lớn (19-59 tuổi) tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu
này sẽ cung cấp thêm thông tin vào các nghiên cứu trên thế giới về gánh nặng
bệnh tật của nhiễm hMPV, góp phần thúc đẩy phát triển vắc xin phòng chống
hMPV trong tƣơng lai.
Nghiên cứu là một trong những hoạt động không những cung cấp các
kết quả khoa học, mà còn góp phần trong công tác đảm bảo sức khoẻ cộng
đồng cho nhân dân Việt Nam. Điều lệ Y tế quốc tế (IHR-2005) đã đƣợc 194
quốc gia và vùng lãnh thổ cam kết thực hiện, Việt Nam cũng là một thành
viên thành viên đã và đang triển khai thực hiện chƣơng trình An ninh Y tế

11


toàn cầu (GHS) với sự hỗ trợ của TCYTTG (WHO) và Trung tâm Kiểm soát
bệnh tật Mỹ (CDC).

12


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP VÀ ĐẶC ĐIỂM VI RÖT HỌC
CỦA CÁC TÁC NHÂN VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP CẤP THƢỜNG GẶP
Viêm đƣờng hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên vi rút là nguyên

nhân chính của tỷ lệ mắc, nhập viện, tử vong trong các bệnh lý đƣờng hô hấp
trên phạm vi toàn cầu, đặc biệt tại các nƣớc đang phát triển. VĐHHC thƣờng
gây bệnh nặng cho trẻ em (<5 tuổi) và ngƣời già (>65 tuổi), tuỳ thuộc vị trí
địa lý, điều kiện khí hậu, căn nguyên vi rút gây viêm đƣờng hô hấp khác nhau
trong từng quốc gia. Tuy nhiên, các vi rút thƣờng gặp tại các bệnh nhân nằm
viện đƣợc ghi nhận từ 5 họ: Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae,
Picornaviridae, Coronaviridae và Adenoviridae. Mỗi loại vi rút có thể chịu
trách nhiệm cho các hội chứng/ triệu chứng lâm sàng khác nhau phụ thuộc
vào lứa tuổi, hệ miễn dịch của từng cá thể. Ngƣợc lại, mỗi triệu chứng/ hội
chứng viêm đƣờng hô hấp cấp có thể gây nên bởi nhiều tác nhân vi rút khác
nhau [64]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nghiên cứu các vi rút thuộc 4 họ:
Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae và Adenoviridae.
VĐHHC thƣờng biểu hiện tại đƣờng hô hấp trên hoặc đƣờng hô hấp
dƣới, mặc dù VĐHHC đƣợc phân loại theo tác nhân gây bệnh, nhƣng thông
thƣờng đƣợc gọi theo hội chứng: cảm lạnh, viêm phế quản, viêm thanh quản,
viêm phổi…và tƣơng ứng với các hội chứng đó là các tác nhân liên quan (VD:
viêm tiểu phế quản thường gặp do vi rút hợp bào đường hô hấp - RSV).
VĐHHC do căn nguyên vi rút đƣợc lây truyền từ ngƣời bệnh sang ngƣời lành
trong quá trình tiếp xúc: nói chuyện, ho, hắt hơi, các giọt khí mang tác nhân
gây bệnh sẽ lƣu hành trong không khí, và có thể nhiễm vào đƣờng thở ngƣời
bên cạnh. Ngoài ra, vi rút cũng có thể lây truyền khi tiếp xúc trực tiếp hoặc
gián tiếp với ngƣời bệnh: bắt tay, khăn giấy, chất thải (vi rút đƣờng ruột).

13


Một số vi rút gây bệnh mang tính theo mùa và đƣợc biểu hiện rõ tại các
nƣớc có khí hậu ôn đới nhƣ vi rút cúm và RSV thƣờng gây dịch vào mùa
đông. Những hiểu biết về xu hƣớng và mùa của VĐHHC trong cộng đồng có
thể cung cấp các thông tin cần thiết để cảnh báo về sự bùng phát dịch cũng

nhƣ xây dựng các chiến lƣợc phòng bệnh, giảm thiểu sự lây truyền trong cộng
đồng [3, 64].
1.1.1 Vi rút họ Orthomyxoviridae
Vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae bao gồm 7 loài: vi rút cúm A, vi rút
cúm B, vi rút cúm C, vi rút cúm D, Isavirus, Thogotovirus và Quaranjavirus,
trong đó 3 loài vi rút cúm A, B và C (vi rút cúm mùa) đƣợc ghi nhận là tác
nhân chính gây VĐHHC [135]. Trong đó vi rút cúm A lƣu hành phổ biến trên
gia cầm, ngƣời và các động vật khác nhƣ lợn, ngựa… là căn nguyên gây nên
các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B thƣờng gây bệnh nhẹ nhƣng cũng
có thể bộc phát thành dịch vào mùa đông, đặc biệt là ở trẻ em. Vi rút cúm C
chƣa thấy biểu hiện gây bệnh nguy hiểm cho ngƣời. Vi rút cúm A có tổng số
256 phân typ khác nhau dựa vào kháng nguyên (KN) bề mặt HA và NA.
Trong số đó, chỉ có các phân typ A/H1N1; A/H3N2; A/H2N2 và gần đây là
A/H1N1pdm09 đƣợc ghi nhận gây bệnh cho ngƣời. Nguồn gốc các vụ đại
dịch cúm thế kỷ XX, XXI với căn nguyên là vi rút cúm A nhƣ sau:
- H1N1 (1918): Có nguồn gốc từ vi rút cúm gia cầm, do đột biến tại các điểm
quan trọng liên quan đến khả năng thích nghi trên vật chủ là ngƣời (gen HA)
[115].
- H2N2 (1957): Do trao đổi tích hợp giữa vi rút cúm ngƣời và vi rút cúm gia
cầm: vi rút cúm mới có gen HA, NA và PB1 của gia cầm [96].
- H3N2 (1968): Do trao đổi tích hợp giữa vi rút cúm ngƣời và vi rút cúm gia
cầm: vi rút cúm mới có gen HA và gen PB1 của gia cầm [122].
- H1N1 (1977): Vi rút cúm mới tái tạo lại từ vi rút cúm A/H1N1 đã lƣu hành
vào đầu năm có thể là do sơ xuất trong phòng thí nghiệm [122].
- H1N1pdm (2009): Do trao đổi tích hợp giữa vi rút cúm lợn (H1N1, H3N2),
14


vi rút cúm gia cầm (H5N1) và vi rút cúm ngƣời (H3N2) [107].
1.1.1.1. Đặc điểm vi rút họ Orthomyxoviridae

a.

Hình thái và cấu trúc phân tử

Hình 1. 1. Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm [145]
Orthomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, thƣờng có hình
cầu với cấu trúc xoắn, đƣờng kính 80-120nm, đôi khi cũng thấy dạng sợi dài
đến vài µm. Bề mặt vi rút có đính các gai bản chất là glycoprotein, đó là
kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Protein HA gây
ngƣng kết hồng cầu và có vai trò gắn vi rút vào tế bào vật chủ, protein NA có
vai trò phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào để giải phóng vi rút (Hình 1.1).
Vật liệu di truyền của vi rút cúm A, B có hệ gene ARN đƣợc cấu trúc
từ 8 phân đoạn riêng biệt và không có gene mã hóa enzym sửa chữa ARN, tạo
điều kiện thuận lợi cho sự xuất hiện các đột biến điểm trong các phân đoạn
genqua quá trình sao chép nhân lên của vi rút, hoặc trao đổi các phân đoạn
gen giữa các chủng vi rút cúm đồng nhiễm trên cùng một tế bào, rất có thể
dẫn đến thay đổi đặc tính kháng nguyên tạo nên các chủng vi rút cúm A, B
mới. Cấu trúc vi rút có 8 phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb. Mỗi
phân đoạn mã hoá cho 1 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: 7 protein cấu

15


trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc: NS1,
NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NP đối với vi rút cúm B (Hình 1.2).

Hình 1. 2. Hệ gen của vi rút thuộc họ Orthomyxoviridae [145]
Trong đó PB1, PB2: là enzym phiên mã, tìm thấy trong quá trình tổng
hợp mARN, tham gia vào quá trình sinh tổng hợp vi rút thế hệ mới vào trong
tế bào chủ [81], thích ứng với nhiệt độ trên ngƣời và trên cúm gia cầm [111],

có hiện tƣợng tế bào chết theo chƣơng trình (appoptosis) [120]. PA là một
tiểu đơn vị của polymerase, kéo dài phiên mã trong quá trình tổng hợp ARN
của vi rút [72]. HA (hemaglutinin): có cấu trúc trimer, thuỷ phân thành HA1
và HA2, là cơ sở cho khả năng nhiễm trùng. Cầu nối HA1 và HA2 gồm một
số aminoacid đƣợc mã hoá bởi một chuỗi oligonucleotid, là điểm cắt của
enzym protease là vùng quyết định độc lực của vi rút [20]. NP
(nucleoprotein): là protein đƣợc glucosyl hoá, chứa một trong các kháng
nguyên đặc hiệu typ, phân biệt 3 typ cúm A, B, C [81]; NA (neuraminidase):
phân cắt phân tử axit sialic của phân tử HA từ các virion mới tổng hợp, làm lộ
HA ra ngoài, tăng khả năng nhiễm trùng. Trên các nghiên cứu phân tử cho
thấy phần đầu 5’ của gen này có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng
vi rút cúm A liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của cúm trên
nhiều đối tƣợng vật chủ khác nhau [19]. M1 tham gia vào quá trình lắp ráp vi
rút và nảy chồi, là kháng nguyên đặc hiệu typ, ổn định cấu trúc vi rút [72];

16


M2 là kênh ion, cần thiết cho khả năng lây nhiễm của vi rút. NS1-NS2: là
protein phi cấu trúc, kết thúc quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, chỉ có
trong tế bào nhiễm vi rút.
b. Tính đa dạng về vật liệu di truyền và sự tiến hóa của vi rút cúm A
Vi rút cúm A (không xảy ra đối với vi rút cúm B hoặc C) có đối tƣợng
gây nhiễm phong phú: gia cầm (gà, vịt, ngan. . . ), thủy cầm, chim di cƣ, động
vật có vú và ngƣời nên vật liệu di truyền ARN của vi rút luôn chịu tác động
của vật chủ trong quá trình xâm nhiễm, phiên mã, nhân lên, tích hợp, nảy chồi
và giải phóng thế hệ mới ra khỏi tế bào chủ. Kết quả của quá trình này là các
biến đổi trong vật liệu di truyền hoặc có sự pha trộn các phân đoạn gen của vi
rút cúm A khác nhau khi cùng đồng nhiễm trên một tế bào (trao đổi và tích
hợp). Hệ quả của nó là sự thay đổi kháng nguyên: thay đổi nhỏ kháng nguyên

(antigenic drift) hoặc thay đổi lớn kháng nguyên (antigenic shift) (Hình 1.3).
Đó chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch lẻ tẻ hoặc đại dịch cúm. Những
thay đổi trong vật liệu di truyền của vi rút cúm A là động lực cho sự tiến hóa
của nó [12].

a. Sự thay đổi nhỏ kháng nguyên

b. Sự thay đổi lớn kháng nguyên

(Antigenic drift)

(Antigenic shift)

Hình 1. 3. Sự thay đổi nhỏ và lớn kháng nguyên của vi rút cúm

17


Vật liệu di truyền của vi rút cúm A với các phân đoạn rời kết hợp với
đặc tính không ổn định, kém bền vững đã làm cho vi rút cúm trở thành tác
nhân sinh học nguy hiểm với sức khỏe cộng đồng. Đại dịch cúm xảy ra khi
xuất hiện một vi rút cúm A phân typ hoàn toàn mới, thoát khỏi sự bảo vệ của
hệ thống miễn dịch đã có trong quần thể ngƣời. Vi rút cúm A phân typ mới
xuất hiện khi [116]:
+ Có sự trao đổi, tích hợp vật liệu di truyền của các vi rút cúm A đã biết
+ Có sự lây truyền chéo vi rút giữa các loài.
Những giả thuyết trên đã đƣợc chứng minh khi nghiên cứu về các vi rút
cúm A gây đại dịch trong thế kỷ XX, XXI.
c. Cơ chế nhân lên của vi rút cúm vào tế bào vật chủ

Hình 1. 4. Chu trình nhân lên của vi rút cúm vào tế bào vật chủ [72]
Bƣớc đầu, vi rút gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất của tế
bào chủ nhờ gai glycoprotein HA theo nguyên tắc khóa - chìa. Các thụ thể đặc
hiệu có bản chất là các axit sialic (N- acetyl neuraminic acid – NANA). Sau
đó vi rút xâm nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào. Các virion vi
rút ấn sâu vào màng tế bào tạo hốc rồi khép lại tạo túi nội bào hay bọng
(endosome) nằm bên trong tế bào chất. Bơm proton trong endosome vận
18


chuyển H+ vào làm cho pH trong endosome giảm xuống 5, pH thấp tạo điều
kiện cho protein F (fusion) chồi lên cắm vào màng endosome nhƣ chiếc neo,
kéo vỏ ngoài vi rút sát với endosome và tiến hành dung hợp với màng
endosome để giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất. Sự hợp nhất này chỉ
xảy ra khi phân tử HA tiền thân (HAo) phân tách thành HA1 và HA2 nhờ
protease phổ biến là furin. Phân tử HA2 có đầu – N đóng vai trò hoà tan trung
gian giữa vỏ vi rút và màng nội bào. Protein M2 ở vi rút cúm A hay còn gọi là
kênh ion (ion- channels) cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình thay đổi
pH và dung hợp này [109].
Trong nhân, sợi ARN (-) ban đầu đƣợc làm khuôn để tổng hợp nên sợi
ARN (+) theo cơ chế bổ sung [cARN (+)] nhờ enzym ARN - polymerase phụ
thuộc ARN của vi rút. Chính các cARN (+) này lại đƣợc dùng làm khuôn để
tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của vi rút. Các sợi
ARN (-) đƣợc tạo thành này là một sợi hoàn chỉnh về độ dài (có độ dài đủ full length ARN), không đƣợc mũ hoá ở đầu 5’ và không đƣợc adenyl hoá ở
đầu 3’. Các ARN (-) mới này một phần đƣợc phiên mã tạo ra các mRNA (+)
ngắn hơn. Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein với các chức năng khác
nhau xảy ra ở tế bào chất. Các protein này bao gồm 7 protein cấu trúc PB1,
PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc NS1, NS2 và M2
đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút cúm B. Các protein NS1, M1 và NP
đƣợc vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới tổng hợp để hình

thành nên nucleocapsid, sau đó đƣợc vận chuyển ra tế bào chất. Tại đây, các
protein HA, NA, M2 đƣợc chuyển qua lƣới nội chất tới bộ máy Golgi, tƣơng
tác với nhau, bao bọc nucleocapsid, khởi đầu cho việc nảy chồi của vi rút. Hạt
virion mới đƣợc tạo thành bằng cách nảy chồi từ màng sinh chất (Hình 1.4).
Phân tử NA phân cắt axit sialic giải phóng vi rút ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu
một chu trình lây nhiễm mới và tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác [84, 85].

19


Quá trình nhân lên của RNA vi rút cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào,
đây là đặc điểm khác biệt so với các vi rút khác. Sau khi hợp nhất màng,
nucleocapsid đƣợc vận chuyển vào trong nhân tế bào [132].
Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt vi rút mới
của vi rút cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ). Sự tạo thành các hạt vi
rút mới không phá tan tế bào nhiễm, nhƣng các tế bào này bị rối loạn hệ thống
tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chƣơng trình làm tổn
thƣơng mô của cơ thể vật chủ [114, 124].
d, Dịch tễ học
Tại các nƣớc ôn đới, dịch cúm thƣờng xảy ra vào mùa đông trong khi
tại các nƣớc nhiệt đới, vi rút cúm có thể lƣu hành quanh năm. Biểu hiện lâm
sàng từ nhẹ đến nặng, nguy hiểm và có thể tử vong. Bệnh nhân nhập viện
hoặc tử vong do cúm thƣờng gặp ở các nhóm nguy cơ cao (trẻ em, ngƣời già
trên 65 tuổi, có bệnh lý nền) [117], số ca nhiễm cúm có biểu hiện nặng từ 3-5
triệu/ năm trên toàn cầu và trong số đó 250.000 đến 500.000 tử vong. Hiện
tại, dịch cúm tại các nƣớc đang phát triển chƣa có những thống kê rõ ràng, tuy
nhiên ƣớc tính 99% trƣờng hợp tử vong ở trẻ nhỏ (< 5 tuổi) viêm phổi có liên
quan đến nhiễm vi rút cúm đã đƣơc ghi nhận tại một số nghiên cứu [82].
1.1.1.2.Bệnh cúm
Khi vi rút cúm thâm nhiễm vào đƣờng hô hấp thông qua các sol khí

(aerosol) hoặc tiếp xúc trực tiếp với nƣớc bọt, dịch tiết của bệnh nhân, vi rút
bám vào tế bảo biểu mô đƣờng hô hấp và bắt đầu nhân lên tại cả đƣờng hô
hấp trên và hô hấp dƣới trong nhiễm tự nhiên cũng nhƣ trong thực nghiệm.

20