Tách chiết, phân lập Cephalotaxine và Homoharringtonine từ cây Cephalotaxus

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trịnh Thái Hà

TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP
CEPHALOTAXINE VÀ HOMOHARRINGTONINE
TỪ CÂY CEPHALOTAXUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trịnh Thái Hà

TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP
CEPHALOTAXINE VÀ HOMOHARRINGTONINE
TỪ CÂY CEPHALOTAXUS

Chuyên ngành:Hóa hữu cơ
Mã số: 60440114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn: GS.TSKH. LƢU VĂN BÔI

Hà Nội–2013


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành chƣơng trình cao học và viết luận văn này, tôi đã nhận đƣợc
sự hƣớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô trƣờng Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và trƣờng Đại học Phủ Osaka (Nhật Bản).
Trƣớc hết, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô đã tận tình dạy bảo cho tôi
suốt thời gian học tập tại trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà
Nội. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến GS. TSKH. Lƣu Văn Bôi đã dành rất nhiều
thời gian và tâm huyết hƣớng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt
nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn GS. Maeda Yasuaki, GS. Imamura Kiyoshi và
GS. Yoshiaki Kitaya, trƣờng Đại học Phủ Osaka (Nhật Bản), đã giúp thu thập mẫu
nguyên liệu thực vật, hỗ trợ phƣơng tiện nghiên cứu và hƣớng dẫn các kỹ năng
thực nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và bạn bè trong Phòng
thí nghiệm Tổng hợp Hữu cơ 3, Khoa Hóa học đã giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm và
tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành phần thực nghiệm của đề tài nghiên cứu với
hiệu quả và chất lƣợng tốt.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình vì đã luôn thông cảm,
động viên và tạo động lực để tôi hoàn thành tốt chƣơng trình cao học và tiếp tục
nghiên cứu chuyên sâu hơn nữa.


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
Chƣơng 1 – TỔNG QUAN ............................................................................................. 3
1.1. Khái quát về chi Cephalotaxus ......................................................................................... 3
1.2. Khái quát về loài Cephalotaxus harringtonia ................................................................... 7

1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của các hợp chất alkaloid chiết xuất từ
Cephalotaxus (Cephalotaxacaea) ............................................................................................. 9
1.3.1. Chất ức chế tổng hợp protein ................................................................................ 9
1.3.2. Điều trị bệnh bạch cầu........................................................................................... 10
1.3.3 Phƣơng pháp điều trị khác ..................................................................................... 10
1.3.4. Các este của cephalotaxine không tự nhiên và hoạt tính kháng u ........................ 10
1.4.Tách chiết, phân lập alkaloid từ cây C. harringtonia ....................................................... 13
CHƢƠNG II .................................................................................................................... 16
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM ............................................... 16
2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................................... 16
2.1.1. Phƣơng pháp xử lý mẫu ........................................................................................ 16
2.1.2. Phƣơng pháp chiết alkaloid từ bột C. harringtonia bằng dung môi ..................... 16
2.1.3. Các phƣơng pháp sắc ký phân tích, tách, và phân lập alkaloid ............................ 16
2.2. Phần thực nghiệm .............................................................................................................. 17
2.2.1. Thiết bị và hoá chất ............................................................................................... 17
2.2.2. Thu hoạch và xử lý nguyên liệu thực vật .............................................................. 19
2.2.3. Chiết cephalotaxine và homoharringtonine từ cây C. harringtonia ..................... 19
2.2.4. Khảo sát sơ bộ thành phần alkaloid thô bằng sắc ký lớp m ng (TLC) ................. 20
2.2.5. Phân lập các alkaloid bằng sắc ký cột ................................................................... 22
2.2.6. Xác định hàm lƣợng alkaloid bằng sắc ký HPLC ................................................. 28


CHƢƠNG III .................................................................................................................. 33
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................................ 33
3.1. Thu hoạch và xử lý mẫu thực vật C. harringtonia.......................................................... 33
3.2. Chiết alkaloid từ C. harringtonia bằng dung môi methanol ........................................... 34
3.3. Tách và phân lập alkaloid bằng phƣơng pháp chiết axit-bazơ ........................................ 35
3.3.1. Loại b thành phần không phải alkaloid bằng dung dịch axit tartric.................... 35
3.3.2. Thu hồi alkaloid từ pha nƣớc bằng dung dịch amoniac ........................................ 36
3.4. Thuốc thử Dragendorff hiển thị sắc ký bản m ng ........................................................... 36

3.5. Khảo sát sơ bộ thành phần alkaloid thô bằng sắc ký lớp m ng (TLC) ........................... 37
3.6. Phân lập các alkaloid bằng sắc ký cột .............................................................................. 38
3.6.1. Quy trình A ( xem sơ đồ 4) ................................................................................... 38
3.6.2. Quy trình B ............................................................................................................ 39
3.6.3. Quy trình C (xem sơ đồ 6) .................................................................................... 40
3.6.4. Quy trình D (xem sơ đồ 7) .................................................................................... 40
3.7. Phân tích thành phần alkaloid bằng phƣơng pháp HPLC .............................................. 42
3.7.1. Lựa chọn nhiệt độ .................................................................................................. 42
3.7.2. Thể tích mẫu bơm ................................................................................................. 44
3.7.3. Lựa chọn dung môi ............................................................................................... 44
3.7.4. Tốc độ dòng và chƣơng trình gradient hỗn hợp dung môi.................................... 44
3.8. Xác định cấu trúc của cephalotaxine và homoharringtonine thu đƣợc ........................... 45
KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 49
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 53


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1: Hiệu suất alkaloid phân lập từ 445kg C. harringtonia khô ........................... 13
Bảng 1.2: Hiệu suất chiết các alkaloid trong mẫu thân cây C. harringtonia bằng
phƣơng pháp chiết chất l ng siêu tới hạn ở 80°C và 34.0 MPa ...................................... 14
Bảng 2.1: Kết quả khảo sát các hệ dung môi trên bản m ng silicagel ........................... 21
Bảng 2.2: Kết quả khảo sát các hệ dung môi trên bản m ng nhôm oxit ........................ 22
Bảng 2.3: Chƣơng trình sắc ký gradient 1 ...................................................................... 29
Bảng 2.4: Chƣơng trình sắc ký gradient 2 ...................................................................... 29
Bảng 3.1: Tổng hợp hàm lƣợng cephalotaxine và homoharringtonine trong các mẫu chiết..... 43


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Cây Cephalotaxus hainanensis tại xã Nam Động, huyện Quan Hóa, tỉnh

Thanh Hóa ....................................................................................................................... 5
Hình 1.2: Cây Đỉnh tùng Cephalotaxus manniinon ở khu vực Pha Luông ................... 6
Hình 1.3: Cephalotaxus harringtonia ............................................................................ 7
Hình 1.4: Các loại alkaloid đƣợc tìm thấy trong cây C. harringtonia ........................... 8
H nh 2.1: Sắc ký đồ HPLC của cephalotaxine và homoharringtonine đối với chƣơng
trình gradient dung môi 1 ................................................................................................ 30
H nh 2.2: Sắc ký đồ HPLC của cephalotaxine và homoharringtonine đối với chƣơng
trình gradient dung môi 2 ................................................................................................ 30
Hình 2.3: Đƣờng chuẩn HPLC của homoharringtonine ................................................ 31
Hình 2.4: Đƣờng chuẩn HPLC của cephalotaxine ......................................................... 31
H nh 3.1: Phân tách alkaloid trên sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit ....................... 39
H nh 3.2. TLC của các mẫu dịch chiết alkaloid trên bản m ng nhôm oxit, dung môi
rửa giải CHCl3 : MeOH : acetonitrile = 97 :2 :1 ............................................................. 42
H nh 3.3: Hai chƣơng trình gradient dung môi cho HPLC để tách cephalotaxine và
homoharringtonine .......................................................................................................... 44
H nh 3.4: Phổ IR của cephalotaxine ............................................................................... 45
H nh 3.5: 1H-NMR của cephalotaxine .......................................................................... 46
Hình 3.6: Phổ IR của homoharringtonine thu đƣợc ....................................................... 47


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Tổng hợp (±)-cephalotaxine theo Weinreb ................................................... 11
Sơ đồ 1.2: Sơ đồ tổng hợp homoharringtonine .............................................................. 12
Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu nguyên liệu thực vật C. harringtonia ................. 19
Sơ đồ 2.2 : Quy trình A để tách cephalotaxine từ phần chiết alkaloid thô ..................... 23
Sơ đồ 2.3 : Sử dụng sắc ký bản m ng điều chế nhôm oxit để phân tách alkaloid thô ............24
Sơ đồ 2.4: Sử dụng sắc ký cột nhôm oxit để phân tách alkaloid thô .............................. 25
Sơ đồ 2.5: Quy trình B để tách cephalotaxine từ phần chiết alkaloid thô ...................... 26
Sơ đồ 2.6: Phân lập alkaloid bằng than hoạt tính và cột nhôm oxit ............................... 27

MỞ ĐẦU
Cephalotaxaceae là một họ các loài cây lá kim, với 3 chi và khoảng 20
loài. Cephalotaxaceae đƣợc phân bố nhiều ở các nƣớc Đông Á, Nhật Bản, Trung
Quốc, Việt Nam, Thái Lan , ... Theo Sách đ Việt Nam, loài Cephalotaxaceae
thƣờng đƣợc tìm thấy ở Việt Nam là các cây lâu năm, phân bố chủ yếu ở khu vực
miền núi của tỉnh Hà Tây (Ba Vì), Thanh Hóa (Lũng Văn), …. Các nghiên cứu
trên toàn thế giới đã chỉ ra một số alkaloid có hoạt tính chống ung thƣ đƣợc tìm
thấy trong các cây thuộc họ này, Cephalotaxus harringtonia, Cephalotaxus
hainanensis, Cephalotaxus wilsoniana ...
Cephalotaxine là chất đứng đầu của nhóm alkaloid chiết xuất từ
Cephalotaxus, đƣợc phân lập từ Cephalotaxus harringtonia. Nhóm này đƣợc
quan tâm nhờ có hoạt tính sinh học đa dạng chống lại bệnh bạch cầu, kháng u và
HIV. Các alkaloid tách từ cây Cephalotaxus, nhƣ là homoharringtonine và
isohomo-harringtonine, đã đƣợc chứng minh rằng có tính chất ức chế sự khởi đầu
của quá trình tổng hợp protein. Bên cạnh đó, homoharringtonine đã đƣợc nghiên
cứu trong điều trị bệnh sốt rét và trong nhãn khoa. Một số quy trình tổng hợp các
hợp chất này đã đƣợc đƣa ra, tuy nhiên, chúng có nhƣợc điểm là bao gồm nhiều
bƣớc và hiệu suất thấp. Do đó, việc tách chiết và phân lập các hoạt chất nói trên từ
nguyên liệu thực vật và bán tổng hợp có ý nghĩa khoa học và thực tiễn quan trọng.
Nghiên cứu này nhằm mục đích để tách chiết, phân lập cephalotaxine và
homoharingtonine từ cây Cephalotaxus harringtonia bằng cách sử dụng kết hợp
các phƣơng pháp sắc ký cột và phƣơng pháp phân tích hiện đại HPLC. Thứ nhất,
nghiên cứu để đƣa ra đƣợc quy trình tách chiết alkaloid thô và làm giàu các chất
có hoạt tính sinh học từ cây Cephalotaxus harringtonia. Thứ hai, nghiên cứu để
đƣa ra chƣơng trình HPLC để tách hiệu quả homoharringtonine và cephalotaxine
trong mẫu thực vật. Thứ ba, nghiên cứu để định lƣợng đƣợc hàm lƣợng của các
alkaloid nói trên trong thành phần của cây Cephalotaxus harringtonia.

1

Luận văn đƣợc hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hóa học hữu cơ III, Khoa
Hóa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và khoa
Công nghệ hóa học, Trƣờng Đại học Osaka Prefecture Nhật Bản).
Công trình đƣợc sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thƣ Việt – Pháp, mã
số 42/2011/HĐ-NĐT của Bộ KH&CN.

2


Chƣơng 1 – TỔNG QUAN
1.1.Khái quát về chi Cephalotaxus
Cephalotaxus, còn gọi là đỉnh tùng, là loại thực vật lá kim thƣờng mọc đơn
lẻ hoặc mọc thành bụi, thuộc họ Cephalotaxaceae (đỉnh tùng). Trƣớc đây họ cây
này đƣợc liệt vào họ Thanh tùng, hay còn gọi là họ Thông đ (Taxaceae). Chi
Cephalotaxus thƣờng đƣợc coi là đại diện duy nhất của họ thực vật
Cephalotaxaceae, đƣợc cấu thành từ 6-12 loài [26]. Một trong số đó, Cephalotaxus
harringtonia (trƣớc đây đƣợc gọi là C. Drupacea (tiếng Nhật là Inukaya), đƣợc thu
lƣợm ở Nhật Bản và giới thiệu tại châu Âu vào năm 1829 bởi nhà tự nhiên học Von
Siebold, tác giả của Flora Japonica [25]. Chi Cephalotaxus đƣợc phân bố ở vùng
Đông Á hoặc Nam Á: Trung Quốc, bao gồm cả Đài Loan và đảo Hải Nam, Ấn Độ,
Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Myanmar, Thái Lan và Việt Nam. Một số loài đã đƣợc
coi là có nguy cơ tuyệt chủng, đặc biệt là ở Trung Quốc, do tác động quá mức của
con ngƣời và thời gian trƣởng thành của hạt giống dài, hoặc tỷ lệ tái sinh thấp trong
tự nhiên [25].
Cephalotaxus thƣờng đƣợc tìm thấy trên các vùng đất giàu mùn ở các khu
rừng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới ấm ƣớt. Chúng chủ yếu phân bố ở các vùng núi
thấp, hoặc trung bình, nhƣng có một vài loại biến thể đƣợc tìm thấy ở vùng núi cao
và trên những vách đá vôi. Toàn bộ các loài thuộc chi Cephalotaxus phân bố rải rác

kéo dài từ vùng nhiệt đới tới vùng khí hậu ôn đới, và sức chịu lạnh của từng loài
tƣơng ứng với xuất xứ của chúng.
Các loài Cephalotaxus thƣờng có đặc điểm hình thái chung dễ nhận thấy.
Chúng là các loại cây bụi hay cây thân gỗ nh có nhiều cành. Lá của chúng thƣờng
sắp xếp theo vòng xoắn, thƣờng vặn xoắn lại tại gân để xuất hiện theo kiểu hai
hàng lá. Lá có hình dáng từ thẳng tới mũi mác, có màu xanh lục nhạt, có phấn trắng
ở mặt dƣới. Các loài trong họ hoặc là đơn tính cùng gốc hoặc là đơn tính cận khác
gốc hay đơn tính khác gốc. Các nón đực dài khoảng 4–25 mm và phát tán phấn vào
đầu mùa xuân. Các nón cái bị thoái hóa, với 1 hoặc một số lá noãn, và một hạt trên
một lá noãn. Khi hạt phát triển đầy đủ thì lá noãn cũng phát triển thành một dạng

3


v hạt nhiều xơ, bao phủ toàn bộ hạt. V hạt phát triển đầy đủ thuộc loại m ng thịt
có màu lục, tía hay đ , mềm và có chứa nhựa. Mỗi lá noãn nằm rời rạc, vì thế nón
cái phát triển thành một cọng ngắn với một hay vài hạt trông tựa nhƣ một loại quả
mọng. Chúng có thể bị chim hay một số loài động vật khác ăn để sau đó phát tán
phần hạt cứng không bị phân hủy, nhƣng cơ chế phát tán hạt hiện nay vẫn chƣa đƣợc
nghiên cứu kỹ lƣỡng [26].
Các cá thể Cephalotaxus ngày càng khan hiếm và đang bị đe dọa tuyệt
chủng trong khu vực phân bố của chúng [14].Thời gian trƣởng thành hạt giống dài,
kết hợp với hình thức sinh sản đơn tính khác gốc và sự phân bố tự nhiên thƣa thớt
trong một vùng địa lý, dẫn tới tần số tái sinh thực tế thấp của chi này trong tự
nhiên. Ngoài ra sự thoái hóa của các loài Cephalotaxus còn do các hoạt động của
con ngƣời gây ra. Các cây thuộc họ này đƣợc khai thác lấy gỗ, củi hoặc sử dụng
nhƣ các phƣơng thuốc truyền thống. Đôi khi các nón cái đƣợc khai thác để lấy dầu.
Phân bố của các loài Cephalotaxus ở Việt Nam
Ở Việt Nam loài Cephalotaxus đƣợc biết chắc chắn có ở Hà Tây (Ba Vì),
Thanh Hóa (Lũng văn), Quảng Trị (giữa Hòn Rao và A Dua), Thừa Thiên Huế,

Kontum (Đắc Glây, Đắc Tô: Ngọc Pan, Sa Thầy), Gia Lai, Lâm Đồng (Di Linh: núi
Braian)… Các cá thể đƣợc tìm thấy là cây gỗ mọc đứng, tƣơng đối chịu bóng râm
với thân thẳng và tán hẹp, cao tới 20 ‐30 m và đƣờng kính (ngang ngực) 50‐110
cm. Cây mọc rải rác thành từng đám nh ở vùng núi đất, đất phong hoá từ silicát và
trên cả núi đá vôi, ở độ cao 500‐2000 m so với mực nƣớc biển, trong các rừng
nguyên sinh rậm, thƣờng có nhiều cây lá rộng. Khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ
trung bình năm 13‐210C, lƣợng mƣa trên 1500 mm/năm).
Họ Cephalotaxus thƣờng mọc cùng với Kim giao núi đất (Nageia
wallichiana), Thông đỏ nam (Taxus wallichiana), Thông tre lá dài (Podocarpus
neriifolius) và Thông nàng núi đá silicát (Dacrycarpus imbricatus), chủ yếu ở miền
Trung và Nam Việt Nam. Cephlotaxus mọc với Thiết sam giả (Pseudotsuga
sinensis), Thông Pà Cò (Pinus kwangtungensis), Kim giao núi đá (Nageia fleuryi),
Thông tre lá ngắn (Podocarpus pilgeri), Pơ mu (Fokienia hodginsii), Thông đỏ bắc

4


(Taxus chinensis) và các loài Dẻ tùng (Amentotaxus spp) trên núi đá vôi ở miền
Bắc Việt Nam [2].

Hình 1.1: Cây Cephalotaxus hainanensis tại xã Nam Động,
huyện Quan Hóa, tỉnh Thanh Hóa [1]
Họ Cephalotaxus đƣợc ghi nhận với các quần thể nh ở một loạt các Vƣờn
Quốc Gia (VQG) và khu Bảo tồn thiên nhiên (BTTN) nhƣ VQG Ba Vì, VQG Bạch
Mã, khu BTTN Pù Luông, khu BTTN Pù Huống, VQG Chƣ Mom Ray và phần lớn
các khu bảo tồn quanh núi Bì Đúp ở Lâm Đồng. Thông tin từ VQG Tam Đảo cần
đƣợc kiểm tra. Các quần thể lớn nhất ở Lâm Đồng (khoảng 100 cây) gặp trên các
sƣờn của Núi Voi ‐ huyện Đức Trọng, là khu vực đƣợc xếp vào rừng phòng hộ đầu
nguồn. Năm 1999, tại Cao nguyên đá Đồng Văn, TS. Lê Trần Chấn đã tìm thấy duy
nhất một cá thể cây Họ Cephalotaxus tại xã Thài Phìn Tủng, huyện Đồng Văn, tỉnh

Hà Giang [5] .

5


Hình 1.2: Cây Đỉnh tùng Cephalotaxus manniinon ở khu vực Pha Luông [7]
Cuối tháng 11 năm 2011, hạt Kiểm lâm huyện Quan Hóa (tỉnh Thanh Hóa)
mới phát hiện 4 loài cây hạt trần quý hiếm gồm Thông Pà cò, Cephalotaxus, thông
Tre lá ngắn và Dẻ tùng sọc trắng. Các loài cây hạt trần này phân bố tập trung trên
diện tích gần 500 ha ở địa bàn xã Nam Động (huyện Quan Hóa, tỉnh Thanh Hóa),
trong đó họ Cephalotaxus hainanensis có 260 cây [3].
Giữa tháng 12/2012, nhóm các nhà nghiên cứu thuộc Trung tâm Con ngƣời
và Thiên nhiên (Pan Nature) phát hiện một khu vực rừng dƣới chân đỉnh núi Pha
Luông thuộc địa phận Khu Bảo tồn Thiên nhiên Xuân Nha (Sơn La) có các loài cây
lá kim quí hiếm, trong đó gồm Cephalotaxus [6]. Quần thể Cephalotaxus (mannii
Hook.f.) tại Pha Luông ƣớc tính có khoảng 10 cá thể trƣởng thành, một số cây cao

6


tới 25m, đƣờng kính ngang ngực tới 80 cm. Một số cây mọc trên vách đá thì kém
phát triển hơn, thân chính bị gãy, mọc lên nhiều nhánh nh . Ngoài các cây trƣởng
thành, nhóm nghiên cứu cũng bắt gặp nhiều cây Đỉnh tùng tái sinh tốt ở những nơi
ẩm ƣớt, chúng mọc trên lớp mùn đƣợc tạo bởi xác thực vật của rừng. Thân cây
Đỉnh tùng có v màu nâu đ , bong rời thành các lớp m ng. Lá có mặt trên màu
xanh đậm, mặt dƣới có các dải lỗ khí khổng màu trắng xanh [6].
Qua phân tích ở trên cho thấy, Đỉnh tùng là loài cây lá kim quý hiếm, hiện
đƣợc đánh giá ở mức Sẽ nguy cấp (VU) trong Sách Đ Việt Nam (2007) cũng nhƣ
trong Danh lục đ của IUCN. Loài này cũng đƣợc liệt kê trong danh mục IIA của
Nghị định 32 của Chính phủ về các loài Thực vật rừng, động vật rừng hạn chế khai

thác, sử dụng vì mục đích thƣơng mại.
1.2. Khái quát về loài Cephalotaxus harringtonia

Hình 1.3: Cephalotaxus harringtonia
Cephalotaxus harringtonia (C. harringtonia), hay còn đƣợc gọi là Inugaya
trong tiếng Nhật, là một loài thực vật điển hình thuộc chi Cephalotaxus. Đây là loài
Đỉnh tùng đầu tiên đƣợc thu thập và đƣợc trồng lâu nhất ở các nƣớc phƣơng Tây.
Loài này phổ biến ở Nhật Bản từ vùng bắc Kyushu tới Hokkaido và cũng đƣợc tìm
thấy trong các khu vực đông bắc Trung Quốc và Hàn Quốc. Ở những nơi ấm áp,

7


chúng thƣờng đƣợc tìm thấy ở dạng các cây nh , trong khi đó tại khu vực lạnh hơn
chúng thƣờng là loại cây bụi tròn, dáng thấp đến trung bình. Cũng vì đặc điểm phát
triển phụ thuộc vào khí hậu đó mà chúng thƣờng đƣợc trồng ở châu Âu và Bắc Mỹ.
O
N
O
H
OR
1

R=H

H

OCH 3

Cephalotaxine (MW: 315)

R1

R2

2

OH

OH

Cephalezomine C (MW: 547)

4

OH

H

Harringtonine (MW:531)

6

H

OH

Isoharringtonine (MW: 531)

8

H

H

Deoxyharringtonine (MW: 515)

O
H
R2

H3CO

R=

OH

R1

O
O

3

OH

OH

Cephalezomine E (MW: 561)

5

OH

H

Homoharringtonine (MW: 545)

9

H

H

Homodeoxyharringtonine (MW: 529)

H

R=

R2

H3CO

R1
OH
O

O

7

Axit Deoxyharringtonic (MW:501)

R=

HO

OH
O

Hình 1.4: Các loại alkaloid đƣợc tìm thấy trong cây C. harringtonia
Xét về đặc điểm hình thái học, loài C. harringtonia thƣờng mọc thành các
cây con hoặc các bụi cây nh . Chồi non của C. harringtonia có màu xanh lá cây,
dạng hình cầu và chỉ dài khoảng 1 mm. Có một hàng lá xuất hiện ở hai bên của
chồi, và những lá nh này lớn dần lên, hơi cong vào bên trong, tạo dáng hình chữ V
hẹp. Hàng lá thƣờng mọc theo chiều thẳng đứng, nhƣng cũng có thể là nằm theo
chiều ngang ở trong bóng râm. Lá có dạng phẳng, dài khoảng 5 cm và rộng khoảng
0,3 cm. Lá nhọn ở phần chóp, bề mặt trên của lá có màu xanh sáng bóng. Mặt dƣới
của lá có hai dải lỗ khí khổng rộng và màu hơi trắng nhạt [6].

8


Kết quả nghiên cứu trong nhiều năm qua đã cho thấy, alkaloid chiết xuất từ cây
Cephalotaxus có hoạt tính kháng u tƣơng đối rõ rệt. Thành phần alkaloid đƣợc phân lập
và xác định chủ yếu gồm cephalotaxine và các ester của cephalotaxine (xem hình 1.4).
1.3. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của các hợp chất alkaloid chiết xuất từ
Cephalotaxus (Cephalotaxacaea)
Các nghiên cứu về hoạt tính và cơ chế tác động của các alkaloid phân lập từ

cây Cephalotaxus đã đƣợc tiến hành trong hơn 20 năm qua, chủ yếu ở Hoa Kỳ và
Trung Quốc. Hầu hết các nghiên cứu ở Mỹ tập trung vào homoharringtonine tinh
khiết, trong khi Trung Quốc nghiên cứu trên cơ sở homoharringtonine ít tinh khiết
hơn. Cephalotaxine không có hoạt tính sinh học, nhƣng đƣợc dùng làm chất đầu để
điều chế các dẫn xuất este có hoạt tính sinh học cao. Các este của cephalotaxine
đƣợc dùng để điều trị các bệnh liên quan tới suy giảm hệ miễn dịch.
Homoharringtonine là dẫn xuất este quan trọng nhất của cephalotaxine, có hiệu quả
cao trong điều trị nhiều loại bệnh ung thƣ, đặc biệt là ung thƣ bạch cầu.
1.3.1. Chất ức chế tổng hợp protein
Gần đây, các nghiên cứu về tác động của harringtonnine và
homoharringtonine với bệnh bạch cầu L-1210 bằng phƣơng pháp thử in-vitro và in
vivo cho thấy khả năng gây độc của chúng tỷ lệ thuận với sự ức chế tổng hợp
protein [15, 32]. Các nhà nghiên cứu Nga đã chỉ ra rằng homoharringtonine ức chế
sự kéo dài chuỗi polypeptide ở bƣớc hình thành liên kết peptide. Họ đã quan sát
thấy sự ức chế tổng hợp glycoprotein trong quá trình nghiên cứu sử dụng
homoharringtonine.
Các nghiên cứu liên quan đến các hoạt tính sinh học của homoharringtonine
đã đƣợc tiến hành đồng thời với nghiên cứu cấu trúc. Nghiên cứu thử nghiệm gây
độc tế bào của homoharringtonine cho thấy độc tính của homoharringtonine phụ
thuộc vào chu kỳ tế bào đặc thù, nó ảnh hƣởng đến hầu hết các tế bào trong giai
đoạn G1 và G2. Mặc dù điều này cho thấy vai trò của HHT chống lại những khối u

9


phát triển chậm, các nghiên cứu thử nghiệm cũng đã chứng minh hoạt tính cao hơn
đối với những khối u phát triển nhanh [15].
1.3.2. Điều trị bệnh bạch cầu
Kết quả thử lâm sàng của harringtonine và homoharringtonine trong điều trị
bệnh bạch cầu đƣợc công bố trong rất nhiều tài liệu [17]. Giai đoạn I nghiên cứu đã

đƣợc hoàn thành, và thử nghiệm lâm sàng giai đoạn II/III đang đƣợc tiến hành.
Những thử nghiệm này cho thấy homoharringtonine là một loại thuốc chống ung
thƣ bạch cầu an toàn và hiệu quả cao với liều lƣợng rất thấp. Thử nghiệm ở Mỹ
sử dụng truyền dịch HHT ngắn (3-4 mg/m2 trong 5 ngày) đã dẫn đến tỷ lệ cao
các biến chứng tim mạch. Liều dùng đã đƣợc giảm bằng cách sử dụng lịch trình
truyền liên tục 3-7 mg/m2 mỗi ngày trong 5-7 ngày đầu, và sau đó sử dụng liều
thấp hơn 2,5 mg/m2 mỗi ngày trong 7-14 ngày [17,19].
1.3.3 Phƣơng pháp điều trị khác
Các ứng dụng của homoharringtonine trong nhãn khoa và bệnh sốt rét cũng
đã đƣợc nghiên cứu.
Homoharringtonine, 2-3,4 nM, có hiệu quả trong việc gây ra ức chế 50% sự
tăng trƣởng của hai chủng sốt rét Plasmodium falciparum kháng chloroquine đối
với thử nghiệm in vitro. Các thử nghiệm in vivo ở chuột bị nhiễm P. yoelii cho thấy
chất này cũng có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển ký sinh trùng. Các tế bào
phơi nhiễm thuốc giảm mức độ putrescine và spermidine và tăng nồng độ
spermine. Các kết quả này đã chứng minh tiềm năng của homoharringtonine trong
điều trị sốt rét kháng chloroquine [28].
1.3.4. Các este của cephalotaxine không tự nhiên và hoạt tính kháng u
Trong những năm 1970, một hỗn hợp của homoharringtonine và
harringtonine lần đầu tiên đƣợc sử dụng để điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy cấp tính
(AML) và bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính (CML) ở Trung Quốc [11].
Homoharringtonine ức chế quá trình tổng hợp protein G1 và G2 gây ra sự phân ly

10


tế bào và thúc đẩy sự tự hủy diệt của tế bào [21]. Homoharringtonine có hoạt động
hiệp lực với imatinib trong các dòng tế bào kháng imatinib và tế bào sơ cấp từ các
bệnh nhân mắc bệnh CML. Nghiên cứu Giai đoạn I và II ở Hoa Kỳ đã khẳng định
hiệu quả lâm sàng của homoharringtonine trong CML nhƣng cũng đồng thời cho

thấy tỷ lệ cao các biến chứng tim mạch khi áp dụng tiêm tĩnh mạch [20].
Wang và cộng sự đã tổng hợp các este của cephalotaxine không phải nguồn
gốc tự nhiên có các hoạt tính gây độc đối với tế bào bạch cầu P-388 [27]. Đáng chú
ý là, hoạt tính chống ung thƣ bạch cầu của các hợp chất này có thể so sánh với
homoharringtonine.
Các nhà nghiên cứu ở Bắc Kinh đã điều chế các este của cephalotaxine và
axit amin với cấu trúc khác nhau [33]. Thử hoạt tính chống tế bào ung thƣ bạch cầu
HL-60 của chúng cho thấy rằng, hợp chất có hoạt tính mạnh nhất trong số đó vẫn
chƣa bằng harringtonine [33].
Quy tr nh mẫu tổng hợp (±)-cephalotaxine
Do hoạt tính đa dạng, các dẫn xuất este của cephalotaxine đã đƣợc nhiều nhà
khoa học trên thế giới nghiên cứu tổng hợp. Sự khác nhau giữa các phƣơng pháp đã
đƣợc công bố chủ yếu là sử dụng các nguyên liệu đầu. Một trong những quy trình
tiêu biểu tổng hợp toàn phần (±)-cephalotaxine đã đƣợc Weinreb thực hiện [8].
O
O

O

O

CO2H 1- SOCl2

N

O
2- Prolinol, 82%
3- DCC, DMSO, 70%

1

O

pyruvic acid
ethyl chloroformate
NaHCO3, 73%

N
O

1- BF3.OEt2
CHO 2- LiAlH4
85%

3

Mg(OMe)2

O

MeOH, 58%

O

(CH3)2C(OMe)2
TsOH

N
O
4

O
N

O
5

O

N
O

O
Mg O
MeO
5'

O

O

O
N

O

N

+
O

15%
7' MeO

45%
7

H
O

O

HO
6

NaBH4

O

85%

O

N
H
HO

OMe

8 OMe

Cephalotaxine

Sơ đồ 1.1: Tổng hợp (±)-cephalotaxine theo Weinreb

11

O


Quá trình tổng hợp đƣợc mô tả trên sơ đồ 1.1. Nguyên liệu đầu đƣợc
Weinreb sử dụng là axit 3,4-methylene-dioxyphenylaxetic (1) đƣợc chuyển hóa
thành dẫn xuất cloanhidrit axit tƣơng ứng bằng cách khuấy với thionyl clorua. Dẫn
xuất

clorua

axit

tác

dung

với

prolinol

tạo

thành

N-(3,4-

methylenedioxyphenylacetyl)prolinol. Oxy hóa prolinol bằng carbodiimide thu
đƣợc N-(3,4-Methylenedioxyphenylacetyl)-prolinal (3). Hợp chất 3 đƣợc đóng
vòng bằng axit lewis BF3.Et2O tạo thành 5,8,9,10-Tetra-hydro-6H-1,3-dioxolo[4,5b]pyrrol[2,1-b][3]benzazepin-6-on (4), hay còn đƣợc gọi là enamin Weinreb. Phản
ứng của enamin Weinreb với axit pyruvic tạo thành hợp chất 2-oxo-1-(5,8,9,10)tetrahydro-6H-1,3

dioxolo[4,5-h]pyrrolo[2,1-b]

benzazepin-11-yl)-1-Propanone

(5). Hợp chất 5 tác dụng với magie dimetoxyt, tạo phức trung gian 5’, sau đó
chuyển

hóa

thành

thành

(RS)-5,6,8,9-Tetrahydro-1-hydroxy-4H-

cyclopenta[a][1,3-]dioxolo(4,5-h]pyrrolo[2,1-b]

[3]benzazepin-2(3H)-on

(6).

Metyl hóa rồi khử hợp chất 6 qua hợp chất trung gian 7 sẽ thu đƣợc sản phẩm cuối
cùng là cephalotaxine (8). Bằng quy trình này, Weinreb đã tổng hợp (±)cephalotaxine qua 17 bƣớc và hiệu suất toàn phần là 21%.

Trên cơ sở cephalotaxine, ngƣời ta đã tiến hành ngƣng tụ với dẫn xuất ester
của axit sucinic điều chế homoharringtonine. Một trong những phƣơng pháp đơn
giản nhất để tổng hợp homoharrringtonine đƣợc mô tả tóm tắt trên Sơ đồ 1.2.
O

O

1, 2

3, 4
COOH

10
O

9

CHO

O

O

OH

5
11

COOCP

COOCP

12
COOCH3

1 = Ag2O; 2 = O3/Me2S; 3 = (COCl)2; 4 = Cephalotaxine/Py/CH2Cl2;
V = Zn/BrCH2CO2Me/THF; 6 = MeMgI/-200C; Cp = Cephalotaxine

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ tổng hợp homoharringtonine

12

6

HHT


Có thể thấy, điều chế homoharingtonine phải qua rất nhiều giai đoạn, hiệu
suất thấp, do đó giá thành của hợp chất này rất cao (10mg/1500 USD). Vì vậy, các
nhà nghiên cứu đã tìm cách tách chiết và phân lập các hợp chất này từ thực vật.
1.4. Tách chiết, phân lập alkaloid từ cây C. harringtonia
Các alkaloid kháng u có nguồn gốc thiên nhiên đang đƣợc phân lập với quy
mô lớn ở các nhà máy sản xuất dƣợc phẩm để làm thuốc chữa bệnh vì việc tổng
hợp hóa học các hợp chất này vẫn chƣa đƣợc hoàn thiện [29].
Nhóm nghiên cứu của Giáo sƣ Richard G. Powell là một trong những phòng
thí nghiệm đầu tiên tiến hành phân lập alkaloid từ C. harringtonia và đã đạt đƣợc
nhiều kết quả đáng ghi nhận. Richard G. Powell và cộng sự đã xây dựng quy trình
thí nghiệm tách và phân lập các alkaloid kháng u (harringtonine, isoharringtonine,
và homoharringtonin) từ cây C. harringtonia. Các bƣớc xử lý quan trọng bao gồm:
chiết xuất nguyên liệu thực vật với etanol, tách thô các alkaloid bằng cách chiết với

clorofom, phân lập sơ bộ các alkaloid bằng phƣơng pháp sắc ký phân bố dòng
ngƣợc 10 ống (10-tube countercurrent distribution), làm giàu alkaloid hoạt động
bằng sắc ký cột, và ở giai đoạn cuối cùng, phân lập các alkaloid hoạt động tinh
khiết bằng phƣơng pháp phân bố dòng ngƣợc 200 ống (200-tube countercurrent
distribution) [13].
Bảng 1.1: Hiệu suất alkaloid phân lập từ 445kg C. harringtonia khô [13].
Alkaloid

Lƣợng, g

Thành phần trong
alkaloid thô, %

Thành phần trong nguyên
liệu thực vật, g

Alkaloid toàn phần

330.0

100.0

0.0720

Harringtonine

5.3

1.6

0.0012

Isoharringtonine

14.4

4.4

0.0032

Homoharringtonine

16.6

5.0

0.0037

13


Các alkaloid hoạt động, là các ester của cephalotaxin, gồm có harringtonine,
isoharringtonine, homoharringtonine, và deoxyharringtonine. Các alkaloid này tồn
tại ở trong tất tất cả các phần của cây, nhƣng tập trung chủ yếu ở hạt và ít hơn ở rễ,
thân và lá. Việc thu gom một lƣợng lớn hạt để chiết là rất khó khăn vì thời gian
sinh trƣởng của hạt C. harringtonia thƣờng rất lâu. Lá cây có hàm lƣợng chất béo
cao hoặc các chất tan trong methanol, dẫn tới việc tạo nhũ tƣơng, rất khó xử lý
trong quá trình tách chiết. Do đó, một số phƣơng pháp tách chiết và phân lập khác
cũng đã đƣợc nghiên cứu. Young Hae Choi và cộng sự [29] đã đề xuất phƣơng
pháp chiết bằng chất l ng siêu tới hạn. Hỗn hợp giữa methanol và các alkyl amin

đƣợc khảo sát ở các tỉ lệ khác nhau để tìm ra hỗn hợp dung môi thích hợp cho hiệu
suất chiết và độ chọn lọc cao nhất. Bằng cách thay đổi tỉ lệ dung môi, ngƣời ta thu
đƣợc hỗn hợp alkaloid với thành phần đƣợc làm giàu theo mong muốn.
Bảng 1.2: Hiệu suất chiết các alkaloid trong mẫu thân cây C. harringtonia bằng
phƣơng pháp chiết chất l ng siêu tới hạn ở 80°C và 34.0 MPa
Thành phần hợp chất (μg/g)

Dung môi

Cephalotaxine Harringtonin Homoharringtonine Isoharringtonine
e
Methanol

251.1

187.1

227.5

402.7

Methanol:dietylamin (9:1)

273.6

236.4

298.6

474.2

Methanol:trimetylamin(9:1)

253.0

129.2

183.5

362.8

Những kết quả nghiên cứu trên đã cho thấy C. harringtonia là một đối tƣợng
đƣợc các nhà hóa học về hợp chất tự nhiên rất quan tâm. Cấu trúc của các alkaloid
kháng u đã đƣợc xác định, và kết quả về hoạt tính chống ung thƣ của chúng cũng
đƣợc chứng minh. Điều thú vị là không chỉ alkaloid đƣợc phân lập, mà các hợp
chất khác nhƣ tropone norditerpene với những đặc tính gây độc tế bào cũng đƣợc
phát hiện. Sự đa dạng về hóa học của các chất trong C. harringtonia với những cấu
trúc đặc trƣng chỉ đƣợc tìm thấy trong loài thực vật này. Các alkaloid phân lập, đặc
biệt homoharringtonine đang đƣợc thƣơng mại hóa gần đây có ý nghĩa quan trọng
nhƣ một biệt dƣợc để điều trị bệnh bạch cầu.

14


Nhiều quy trình tổng hợp khung cephalotaxine và ester của nó đã đƣợc đƣa
vào ứng dụng thực tiễn. Tuy nhiên, cho đến nay các quy trình xây dựng đƣợc
thƣờng bao gồm nhiều bƣớc và có hiệu suất thấp.
Do đó, việc tách chiết và phân lập cephalotaxine và ester của nó từ nguyên
liệu tự nhiên giữ một vai trò quan trọng chƣa thể thay thế [29].
Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu tìm điều kiện thích hợp để tách chiết,

phân lập cephalotaxine và homoharingtonine từ cây Cephalotaxus harringtonia
bằng cách sử dụng kết hợp phƣơng pháp sắc ký cột điều chế và phƣơng pháp phân
tích hiện đại HPLC. Trong tƣơng lai, từ cephalotaxine phân lập đƣợc sẽ tiến hành
chuyển hóa thành các este có cấu trúc khác nhau để tìm kiếm các hợp chất có khả
năng chống ung thƣ cao mà các nhà khoa học quốc tế đang rất quan tâm.

15


CHƢƠNG II
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1 Phƣơng pháp xử lý mẫu
Mẫu thực vật là lá và cành nhánh của cây C. harringtonia sau khi thu hái tại
vƣờn thực vật của Đại học Tokyo đƣợc GS. Yoshiaki Kitaiya (Trƣờng Đại học Phủ
Osaka, Nhật Bản) thẩm định. Quá trình xử lý mẫu cây đƣợc tiến hành nhƣ sau: để
khô ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày, cắt nh và xay thành bột mịn. Bột nguyên liệu
tiếp tục đƣợc sấy khô trong chân không thời gian 48 giờ. Bột nguyên liệu khô đƣợc
bảo quản trong bình hút ẩm (desiccator) để sử dụng khi cần.
2.1.2 Phƣơng pháp chiết alkaloid từ bột C. harringtonia bằng dung môi
Dung môi lựa chọn cho phƣơng pháp phải đáp ứng các tiêu chí: hòa tan tốt
các alkaloid; không tham gia phản ứng với các alkaloid có trong mẫu chiết; ít tạo
nhũ trong quá trình chiết. Theo tài liệu [24] các dung môi tốt nhất cho quá trình
chiết cephalotaxine và homoharringtonine từ cây C. harringtonia là MeOH, CHCl3.
Tách alkaloid bằng phƣơng pháp chiết axit-bazơ
Nguyên lý cơ bản của phƣơng pháp này là dựa trên độ tan khác nhau của các
alcaloid trong nƣớc và trong các dung môi hữu cơ. Dung môi hữu cơ có thể là bất
cứ dẫn xuất hydrocacbon nào không tan trong nƣớc, nhƣng hòa tan đƣợc các
alkaloid. Các loại dung môi đƣợc sử dụng phổ biến là ete, ethyl axetat hoặc
diclorometan.

2.1.3 Các phƣơng pháp sắc ký phân tích, tách, và phân lập alkaloid
a) Sắc ký lớp m ng (TLC) đƣợc sử dụng để tách và phân tích định tính các
phần chiết. Sắc ký lớp m ng còn đƣợc sử dụng để khảo sát chọn hệ dung môi thích
hợp. Chất chỉ thị màu Dragendorff và đèn UV đƣợc sử dụng để hiển thị.

16


b) Sắc ký cột đƣợc sử dụng để phân lập các alkaloid. Chất hấp phụ đƣợc sử
dụng trong phƣơng pháp này là silicagel hoặc nhôm oxit. Hệ dung môi sử dụng để
chạy sắc ký cột đƣợc lựa chọn dựa trên kết quả khảo sát sắc ký m ng TLC.
c) Sắc ký l ng hiệu năng cao (HPLC) đƣợc dùng để xác định hàm lƣợng của
các alkaloid trong mẫu C harringtonia. Các điều kiện chạy sắc ký đƣợc chuẩn hóa
trên cơ sở khảo sát các chất chuẩn cephalotaxine và homoharringtonine.
2.2 Phần thực nghiệm
2.2.1 Thiết bị và hoá chất
a. Các thiết bị sắc ký
Bản mỏng dùng cho sắc ký lớp mỏng (TLC):
Bản m ng dùng trong sắc ký gồm gồm 3 loại:
-

Bản m ng silicagel tráng sẵn trên nền kính, TLC Silica gel 60 F254, kích
thƣớc 5*20cm, hãng sản xuất Merck (Đức).

-

Bản m ng silicagel tráng sẵn trên nền nhôm, TLC Silica gel 60 F254,
kích thƣớc 20*20cm, hãng sản xuất Merck (Đức).

-

Bản m ng nhôm oxit tráng sẵn trên nền kính TLC Aluminium oxide 60
F254, kích thƣớc 5*20cm, hãng sản xuất Merck (Đức).

Hiển thị bằng đèn UV ở bƣớc sóng λ = 254 nm hoặc bằng dung dịch thuốc
thử Dragendorff.
Sắc ký cột
Sắc ký cột đƣợc thực hiện trên cột thủy tinh kích thƣớc thích hợp với chất
hấp phụ là silicagel hoặc nhôm oxit. Chất hấp phụ silicagel dùng cho sắc ký cột ở
đây là Wakogel® C-200 cỡ hạt 75 ~ 150μm (Wako, Nhật Bản) và nhôm oxit
Aluminium oxide 60 cỡ hạt 63-200 μm (Merck, Đức).
Chất hấp phụ đƣợc cho vào cột thủy tinh bằng kỹ thuật nhồi cột ƣớt.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Thiết bị HPLC sử dụng cho nghiên cứu này đƣợc cung cấp bởi hãng
Shimadzu (Nhật Bản) với detector PDA SPD-M10Avp; cột Cadenza C18 250*46
mm, kích thƣớc hạt 3µm.

17