Phân lập một số hợp chất taxoid từ lá thông đỏ lá dài (taxus wallichiana zucc ) trồng ở lâm đồng, định hướng thiết lập chất đối chiếu tt

B GIÁO D C VÀ ÀO T O
IH CYD

C THÀNH PH

B YT
H

CHệ MINH

------------------------H A HOÀNG OANH

PHÂN L P M T S H P CH T TAXOID T LÁ
THỌNG
LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA
ZUCC.) TR NG LÂM
NG,
NH H
NG THI T L P CH T
I CHI U

Ngành: Ki m nghi m thu c
Mã s : 62720410

TịM T T LU N ÁN TI N S D

TP. H Chí Minh, n m 2020

CH C

Công trình đ
ih cYD
Ng

ih

c hoàn thành t i:
c Thành ph H Chí Minh

ng d n khoa h c: PGS. TS. Nguy n Ph

ng Dung

Ph n bi n 1: ………………………………………………
Ph n bi n 2 ………………………………………………
Ph n bi n 3: ………………………………………………

Lu n án s đ c b o v tr c H i đ ng ch m lu n án c p
tr ng h p t i i h c Y D c Thành ph H Chí Minh
vào h i

gi

ngày

tháng

n m

Có th tìm hi u Lu n án t i th vi n:

- Th vi n Qu c gia Vi t Nam
- Th vi n Khoa h c T ng h p TP. HCM
- Th vi n

ih cYD

c TP. HCM


1

GI I THI U LU N ÁN
1.

tv nđ
Theo các nhà khoa h c, các loài Thông đ (Taxus sp.) có

ch a taxoid là nhóm h p ch t chính y u g m c paclitaxel, 10deacetyl baccatin III (10-DAB, ti n ch t t ng h p paclitaxel) đ s n
xu t Taxol® và các d n xu t taxoid khác (docetaxel) làm thu c ch a
tr ung th nh : Ung th bu ng tr ng, ung th vú, ung th ph i, v.v...
Do có giá tr kinh t cao nên Thông đ b l m d ng khai thác, đ c
bi t là

vùng Himalaya và Trung Qu c, ngu n d

c li u thiên nhiên

này tr nên khan hi m và b đe d a tuy t ch ng.
Vi t Nam, Trung tâm tr ng và ch bi n cây thu c à L t
tr ng Thông đ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) nh m cung c p

nguyên li u ph c v cho chi t tách taxol và các h p ch t taxoid trong
s n xu t thu c đi u tr ung th . Vì th , đ tài: “Phân l p m t s h p
ch t taxoid t lá Thông đ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) tr ng
Lâm

ng, đ nh h

ng thi t l p ch t đ i chi u” đ

c th c hi n v i

các m c tiêu sau:
1. Chi t xu t, phân l p và xác đ nh c u trúc m t s h p ch t taxoid t
lá Thông đ lá dài tr ng

Lâm

ng.

2. Thi t l p m t s ch t đ i chi u đ

c phân l p t lá Thông đ .

3. Xây d ng và th m đ nh quy trình đ nh l
m t s taxoid phân l p đ

ng đ ng th i taxol và

c t lá Thông đ .

2. Tính c p thi t c a đ tƠi
Theo yêu c u GMP c a WHO trong s n xu t, vi c đánh giá ch t
l

ng các cây thu c và các ch ph m ph i d a vào hàm l

ng ho t

ch t (ho c ch t đánh d u sinh h c). Ngoài ra, các l nh v c khác nh
tr ng tr t, nghiên c u cây thông đ c ng c n theo dõi, đánh giá ch t
l

ng các m u nghiên c u.

đánh giá đ

c ch t l

ng thông đ


2

tr ng

Lâm

ng và các ch ph m c n ph i có ch t chu n bao g m

các taxoid ch y u: Taxol, 10-deacetyl baccatin III (10-DAB), v.v. và

m t s t p ch t chu n đ c tr ng cho thông đ

Vi t Nam. Hi n nay,

các nhà khoa h c Vi t Nam đã thành công trong vi c chi t xu t, phân
l pđ

c m t s h p ch t taxoid. Vì v y, vi c chi t xu t, phân l p,

đi u ch các h p ch t taxoid chu n đ ki m đ nh và nghiên c u
thông đ

Vi t Nam là h t s c c p thi t, có ý ngh a khoa h c, th c

t và kinh t . Các h p ch t taxoid chu n đ c tr ng cho thông đ
Vi t Nam còn có th

ng d ng đ ki m đ nh ch t l

thông đ khác trên th tr

ng trong và ngoài n

ch t chu n dùng cho ki m nghi m taxol d

ng c a các lo i
c. Trong khi các

c d ng theo D

c đi n

M có giá thành r t cao.
3. Nh ng đóng góp m i c a lu n án
V m t hóa h c: L n đ u tiên công b vi c phân l p đ

c 2 h p ch t

taxoid trong lá Taxus wallichiana Zucc. g m có:
- Taxuspin D
- Taxchinin B
V m t thi t l p ch t đ i chi u: L n đ u tiên công b nghiên c u
thi t l p 4 ch t đ i chi u: Taxinin B; 10-.deacetyl taxinin B; taxuspin
D, taxuspin F.
V m t ki m nghi m thu c: L n đ u tiên công b các ph

ng pháp

RP-HPLC-PDA xác đ nh đ ng th i paclitaxel và 4 h p ch t taxoid:
Taxinin B; 10-.deacetyl taxinin B; taxuspin D, taxuspin F.
4. B c c c a lu n án
Lu n án g m: 131 trang, đ t v n đ 2 trang, t ng quan 29 trang, đ i
t

ng và ph

ng pháp nghiên c u 13 trang, k t qu 60 trang, bàn

lu n 20 trang, k t lu n 2 trang và ki n ngh 1 trang. Lu n án có 37

3

b ng, 72 hình, 4 s đ , 120 tài li u tham kh o (14 ti ng Vi t, 106
ti ng Anh), và 4 ph l c.
N I DUNG LU N ÁN
Ch

ng 1: T NG QUAN

Trình bày nh ng v n đ sau:
1.1. Gi i thi u t ng quan v cây Thông đ lá dài (T. wallichiana).
1.2. Thành ph n hóa h c trong Thông đ .
1.3. Tác d ng d

c lý c a Thông đ .

1.4. Các nghiên c u chi t xu t, phân l p h p ch t taxoid t Thông đ .
Ch

ng 2:

2.1.

it

IT

NG VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U

ng nghiên c u

Các h p ch t taxoid.
2.2. Nguyên v t li u
•

Lá cây Thông đ thu hái

Lâm

ng do Trung tâm tr ng và

ch bi n cây thu c à L t-Vimedimex cung c p.
2.3. Ph

ng pháp nghiên c u

2.3.1. Nguyên li u - Dung môi, hóa ch t - Trang thi t b
- Dung môi, hóa ch t s d ng lo i k thu t dùng cho chi t xu t, lo i
phân tích và s c ký (Merck và JT Baker) dùng cho các k thu t
SKLM, UV-Vis, IR, NMR, HPLC, ….
- Thi t b chi t xu t và phân tích t i Khoa D

c-

ih cYD

c

TP.HCM, Vi n Hàn lâm Khoa h c và Công ngh Vi t Nam, Vi n
Ki m nghi m thu c TP.HCM.
2.3.2. Ph

ng pháp nghiên c u

2.3.2.1. Chi t tách h p ch t taxoid t lá Thông đ lá dài
Kh o sát s b các thành ph n hóa h c trong lá Thông đ lá dài


4

Phân tích s b theo quy trình phân tích c a I. Ciuley đ
b i B môn D

c li u, Khoa D

c,

ih cYD

c c i ti n

c TP. HCM.

Chi t xu t taxoid (diterpen)
Ph ng pháp dùng dung môi h u c thay đ i đ phân c c
Chi t cao toàn ph n b ng ph

ng pháp ngâm l nh v i methanol.

Lo i t p và d u béo d a vào đ phân c c:
-

Chi t l ng - l ng d ch chi t MeOH/n

c v i dicloromethan.

-

S c ký c t diaion HP-20, r a gi i l n l

t v i các dung môi: N c,

MeOH 20%, MeOH 40%, MeOH 60%, MeOH 80%, MeOH 100%.
Phân l p taxoid
S d ng các ph

ng pháp:

- S c ký c t c đi n (v i silica gel 0,040-0,063 mm) đ tách các phân
đo n nh t p trung h p ch t taxoid, các h p ch t taxoid k t tinh thô.
- S c ký c t áp su t trung bình (MPLC) tách các h p ch t taxoid
trong phân đo n nh thu đ

c sau khi tri n khai s c ký c t c đi n.

Tinh ch
S

ph

d ng ph

ng pháp k t tinh l i trong dung môi thích h p và

ng pháp s c ký l ng đi u ch .

Xác đ nh c u trúc hóa h c
Xác đ nh c u trúc b ng các ph

ng pháp ph nghi m: UV-Vis, IR,

MS, NMR ( H-NMR, C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC), đ i chi u
1

13

v i các d li u ph c a taxoid đã công b .
2.3.2.2. Thi t l p ch t đ i chi u
Chi t xu t, phân l p, tinh ch
Ch t đ i chi u taxoid phân l p t lá Thông đ lá dài b ng các k
thu t s c ký c t c đi n, s c ký c t trung áp, k t tinh l i, s c ký l ng
đi u ch đ đ t đ tinh khi t cao nh t.


5

nh tính
i chi u các ph UV-Vis; IR; MS; NMR c a các ch t nghiên c u

v i các d li u ph t tài li u tham kh o.
ánh giá nguyên li u thi t l p ch t đ i chi u
i m ch y: Ph

ng pháp 1 theo D VN V.

ánh giá đ tinh khi t: Ph
đ nh ph

ng pháp: Theo h

ng pháp SKLM, HPLC-PDA. Th m
ng d n c a ICH.

ánh giá đ ng nh t lô trong quá trình đóng gói ch t đ i chi u
L y m u: S d ng cách l y m u ng u nhiên theo ph n m m Excel,
s l đ

c l y đ ki m tra là g = N +1 l , N là s l đóng đ

c.

ng pháp HPLC-PDA đã xây

Xác đ nh đ tinh khi t: Áp d ng ph
d ng và th m đ nh theo ICH.
ánh giá đ đ ng nh t gi a các l :

ánh giá b ng k thu t th ng kê

ANOVA m t y u t . Các l là đ ng nh t khi Ftn < Ftc (P = 0,05).
ánh giá ch t đ i chi u thông qua liên phòng thí nghi m
Ti n hành xác đ nh đ tinh khi t t i ba phòng thí nghi m đ c l p đ t
tiêu chu n GLP ho c ISO/IEC17025.

ánh giá k t qu

b ng k

thu t th ng kê ANOVA m t y u t , so sánh 2 giá tr Ftn và Ftc.
Xác đ nh giá tr

n đ nh và đ không đ m b o đo

Xác đ nh giá tr n đ nh và đ không đ m b o đo theo ISO 13528.
nh l

ng

Do không có ch t chu n nên hàm l
(theo h

ng % tính trên nguyên tr ng

ng d n c a WHO).

2.3.2.3. Xây d ng và th m đ nh quy trình đ nh l
taxoid b ng ph
Kh o sát ch n ch

ng đ ng th i các

ng pháp HPLC
ng trình dung môi: Thay đ i t l pha đ ng, ch n

đi u ki n đ pic đ t đ phân gi i t i thi u 1,5.


6

Kh o sát ch n quy trình phân tích: Th

nghi m ch

ng trình

gradient và đ ng dòng.
Kh o sát b

c sóng phát hi n: G n v i c c đ i h p thu c a các ch t.

Kh o sát t c đ dòng: Tri n khai trên m u th v i t c đ dòng t ng
d n t 0,8 ml/phút; 1 ml/phút; 1,2 ml/phút đ l a ch n đ

ct cđ

dòng phù h p.
Th m đ nh quy trình
- Tính phù h p c a h th ng
Yêu c u: H s đ i x ng c a pic 0,8  As  1,5; %RSD di n tích pic

 2,0; s đ a lý thuy t ≥ 2000.
- Tính đ c hi u: S c ký đ pha đ ng và dung môi pha m u không
xu t hi n tín hi u trùng v i th i gian l u c a ch t c n phân tích trong
m u th và m u đ i chi u.

tinh khi t c a pic ch t c n phân tích

trong s c ký đ m u th : > 0,99.

phân gi i gi a pic ch t c n phân

và các pic li n k trong s c ký đ m u th : ≥ 1,5.
- Tính tuy n tính: r > 0,995.
chính xác:

+

l p l i: %RSD ≤ 3,0

+

chính xác trung gian: K t qu gi a các ki m nghi m viên

khác bi t không có ý ngh a th ng kê: F test (P = 0,05)
-

đúng: T l ph c h i 98% - 102%; %RSD ≤ 2,0.

- Gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh l
LOD

Ch

và

ng:
LOQ

ng 3: K T QU NGHIÊN C U

3.1. Chi t xu t, phơn l p taxoid trong lá thông đ lá dƠi
3.1.1. Kh o sát s b thành ph n hóa h c


7

B ng 3.1. K t qu đ nh tính thành ph n hóa h c trên các d ch chi t

3.1.1.2. Chi t taxoid thô b ng ph
dung môi

ng pháp thay đ i đ phân c c


8

3.1.2. Phân l p các h p ch t taxoid t lá Thông đ lá dài
3.1.2.1. Phân l p b ng ph

ng pháp s c ký c t c đi n (SKC) và s c

ký c t áp su t trung bình (MPLC)

S đ phân l p các h p ch t taxoid b ng SKC c đi n 1 và MPLC

S đ phân l p các h p ch t taxoid b ng SKC c đi n 2


9

3.1.2.2. Tinh ch các h p ch t taxoid sau khi phân l p
Các h p ch t sau phân l p đ

c tinh ch b ng ph

ng pháp k t tinh

l i trong dung môi và b ng s c ký l ng hi u n ng cao đi u ch đ đ t
đ tinh khi t cao trên HPLC.
3.1.2.3. Xác đ nh c u trúc các h p ch t taxoid đ

c phân l p

Các h ng s v t lý và d li u ph c a h p ch t (1), (2) tóm t t trong
b ng sau:
Mô t
i m ch y
UV (MeOH)
IR (KBr, cm-1)
EI-MS m/z
1

H-NMR
(H, ppm; J, Hz)

13

C-NMR
(C, ppm)

(1) ậ taxinin B

(2) ậ taxuspin F

B t vô đ nh hình, màu tr ng,
203 -205 oC
217 và 279 nm
1667, 1636, 1128 và 1041
664, 359, 274, 240
(CDCl3, 500 MHz): 1,15 (s); 1,77 (s);
2,38 (s); 1,03 (s); 6,45 (d; 16,0); 7,69
(d; 16,0); 7,47 (m); 7,78 (d; 7,0); 7,44
(m); 2,08 (s) x 4; 5,63 (dd; 1,5; 6,5);
5,39 (t, 3); 5,45 (dd; 6; 11); 5,94 (d;

K t tinh d ng b t, màu tr ng
242-244 oC
267 nm
3450, 1747 và 1679, 1199
534, 359, 274, 240
(CDCl3, 500 MHz): 1,74 (s); 1,11
(s); 2,33 (s); 0,98 (s); 2,02 (s); 2,05

(s) x 2; 2,08 (s); 5,60 (dd; 1,5: 6,0);
4,22 (d; 2,5); 5,50 (dd; 5,5; 11,5);
5,90 (d; 11,0); 6,26 (d; 11,0); 1,61

10,5); 6,25 (d; 10,5); 1,77 (m); 2,39
(d; 20); 2,85 (dd; 7; 20); 2,25 (d; 1,5;

(m); 1,94 (m); 2,33 (d; 19,5); 2,77
(dd; 7,0; 20,0); 2,20 (dd; 2,0; 6,0);

7); 3,33 (d; 6,5); 4,92 (s); 5,45 (s).
(CDCl3, 125 MHz): 199,3; 169,3;
169,7; 169,2; 150,5; 138,6; 68,6;
76,2; 69,6; 75,0; 72,8.

3,53 (d; 6,0); 4,81 (s); 5,23 (s)
(CDCl3, 125 MHz): 199,4; 169,2;
169,3; 169,7; 169,8; 115,5; 139,2;
144,7; 149,8

Các h ng s v t lý và d li u ph c a (3) và (4) tóm t t trong b ng sau:
Mô t
i m ch y
UV (EtOH)
IR (KBr, cm-1)

(3) - 10-deacetyl taxinin B

(4) - taxuspin D

Tinh th hình kim, màu tr ng

B t m n, màu tr ng

o

239 - 241 C
274 nm
3450, 1665, 1639, 1128, 1041

230 – 232 oC
217, 278 nm
3450, 1653, 1636, 1131, 1038


10
EI-MS m/z
1
H-NMR
(H, ppm; J, Hz)

622, 526, 359, 288, 137
(CDCl3, 500 MHz): 1,23 (s); 1,80
(s); 2,24 (s); 1,02 (s); 2,08 (s) x 3;
5,60 (d; 6,0; 3,2); 5,35 (s); 5,38 (m);
5,83 (d; 10,0); 5,30 (t; 3,0); 1,76
(m); 2,08 (m); 2,38 (d; 20,0); 2,86
(dd; 20,0; 7,0); 2,23 (d; 1,5; 7,0);
3,32 (d; 6,0); 4,90 (s); 5,42 (s); 6,44
(d; 15,5); 7,69 (d; 15,5); 7,44 (m);

7,78 (d; 7,0); 7,42 (m); 2,08 (m)

724, 512, 374, 274, 159
(CDCl3, 500 MHz): 1,49 (s); 1,17
(s); 1,60 (s); 1,53 (s); 1,96 (s);
2,10 (s) x 2; 2,00 (s); 2,02 (s);
2,20 (s); 5,80 (d; 7,0); 5,34 (dd;
9,4; 6,2); 4,85 (m); 4,85 (d; 5,0);
5,60 (d; 5,0); 2,07 (m); 2,36 (d;
18,5); 2,57 (dd; 18,5; 7,5); 1,89
(dd; 1,5; 7,5); 3,70 (d; 7,0); 5,20
(s); 5,08 (s); 6,46 (d; 16,0); 7,70
(d; 16,0); 7,54 (m) x 2; 7,40 (m)

13

(CDCl3, 75 MHz): 199,3; 169,3;
169,7 (x 2); 150,5 138,6 (x 2);

(CDCl3, 125 MHz): 170,6; 170,2;
169,3; 170,4; 168,5; 124,3; 144,2;

134,5; 129,0 (x 2); 128,6 (x 2);
130,5; 118,8.

110,9; 50,4; 40,8; 142,6; 134,2;
128,1 (x 2); 128,9 (x 2); 68,4;
67,4; 70,4; 76,7; 78,5; 77,3.

C-NMR

(C, ppm)

Các h ng s v t lý và d li u ph c a h p ch t (5) tóm t t trong b ng sau:
(5) ậ taxchinin B
Mô t
i m ch y
UV (MeOH)
IR (KBr, cm-1)
EI-MS m/z
1
H-NMR

Tinh th vô đ nh hình, không màu
176 - 178 oC
219, 279 nm
3445, 1710, 1667, 1636, 1173, 1041
802, 512, 318, 274, 159
(CDCl3, 500 MHz): 1,19 (s); 1,23 (s); 2,01 (s) x 2; 1,72 (s); 4,39 (d; 8,0);

(H, ppm; J, Hz)

4,50 (d; 8,0); 2,10 (s); 1,76 (s); 6,17 (d; 8,0); 5,01 (d; 8,0); 5,62 (t; 8,3);
6,22 (d; 11,0); 6,61 (d; 11,0); 1,92 (dd; 9,0; 15,5); 2,60 (m); 1,72 (m);
2,45 (dd; 7,5; 14,8); 3,04 (d; 8,0); 6,50 (d; 16,0); 7,70 (d; 16,0); 7,80 (d;
8,0); 7,56 (m).
(CDCl3, 125 MHz): 67,9; 84,8; 70,6; 76,4; 68,7; 79,1; 134,1; 129,0 (x 2);
130,7; 128,8 (x 2); 129,1; 129,5; 128,2; 133,4; 135,9; 148,2; 170,3;
169,2; 169,8.

13

C-NMR
(C, ppm


11

3.2. Thi t l p ch t đ i chi u
Chi t xu t, phân l p và tinh ch đ thu đ
tinh khi t. Xây d ng tiêu chu n ch t l
tiêu, ph

ng pháp th theo h

ng, ch

ng c a taxinin B (C C)

Ch tiêu

M c ch t l

C m quan
nh tính
Ph UV-Vis
Ph IR
Ph kh i MS
Ph NMR

K t tinh d ng b t, màu tr ng.

ng

Ph i có các c c đ i h p thu 217 và 279 nm.
Ph i có các đ nh có s sóng: 1667, 1636, 1128 và 1041 cm-1.
Ph i có các pic có m/z 664 [M]+ (pic c n b n)
1
H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,15 (s); 1,77 (s); 2,38 (s); 1,03 (s); 6,45
(d); 7,69 (d); 7,47 (m); 7,78 (d); 7,44 (m); 2,08 (s) x 4; 5,63 (dd); 5,39
(t); 5,45 (dd); 5,94 (d); 6,25 (d); 1,77 (m); 2,39 (d); 2,85 (dd); 2,25 (d);
3,33 (d); 4,92 (s); 5,45 (s).
13
C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,3; 169,3; 169,7; 169,2; 150,5;
138,6; 68,6; 76,2; 69,6; 75,0 và 72,8.
203-205 oC.
Không ít h n 95,0%.

B ng 3.2. Tóm t t tiêu chu n ch t l

ng c a taxuspin F (C C)

Ch tiêu

M c ch t l

C m quan
nh tính

K t tinh d ng b t, màu tr ng.

Ph UV-Vis
Ph IR
Ph kh i l ng

ng v i m c ch t l

ng d n c a WHO và ASEAN.

B ng 3.1. Tóm t t tiêu chu n ch t l

i m ch y
nh l ng

c ch t đ i chi u (C C)

ng

Ph i có các c c đ i h p thu 267 nm.
Ph i có các đ nh có s sóng: 3450, 1747 và 1679, 1199 cm-1.
Ph i có các pic có m/z 534 [M]+.


12
Ph NMR

i m ch y
nh l ng

1

H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,74 (s); 1,11 (s); 2,33 (s); 0,98 (s); 2,02
(s); 2,05 (s) x 2; 2,08 (s); 5,60 (dd); 4,22 (d); 5,50 (dd); 5,90 (d); 6,26
(d); 1,61 (m); 1,94 (m); 2,33 (d); 2,77 (dd); 2,20 (d); 3,53 (d); 4,81 (s)
và 5,23 (s).
13
C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,4; 169,2; 169,3; 169,7; 169,8;
115,5; 139,2; 144,7 và 149,8.
242-244 oC.
Không ít h n 95,0%.

B ng 3.3. Tóm t t tiêu chu n ch t l ng c a 10-deacetyl taxinin B (C C)
Ch tiêu

M c ch t l

ng

C m quan
nh tính

Tinh th hình kim, màu tr ng.

Ph UV-Vis
Ph IR
Ph kh i l ng

Ph i có các c c đ i h p thu 274 nm.
Ph i có các đ nh có s sóng: 3450, 1665, 1639, 1128 và 1041 cm-1.
Ph i có các pic có m/z 622 [M]+.

Ph NMR

1

H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,23 (s); 1,80 (s); 2,24 (s); 1,02 (s); 2,08

(s) x 3; 5,60 (d); 5,35 (s); 5,38 (m); 5,83 (d); 5,30 (d); 1,76 (m); 2,08
(m); 2,38 (d); 2,86 (dd); 2,23 (d); 3,32 (d); 4,90 (s); 5,42 (s); 6,44 (d);
7,69 (d); 7,44 (m); 7,78 (d); 7,42 (m); 2,08 (m).
13
C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 199,3; 169,3; 169,7 (x 2); 150,5 138,6
i m ch y
nh l ng

(x 2); 134,5; 129,0 (x 2); 128,6 (x 2); 130,5 và 118,8.
239-241 oC.
Không ít h n 95,0%.


13

B ng 3.4. Tóm t t tiêu chu n ch t l
Ch tiêu

M c ch t l

C m quan
nh tính
Ph UV-Vis
Ph IR

B t m n, màu tr ng.

Ph kh i l
Ph NMR

i m ch y
nh l ng

ng c a taxuspin D (C C)

ng

Ph i có các c c đ i h p thu 217 và 278 nm.
Ph i có các đ nh có s sóng: 3450, 1653, 1636, 1131 và 1038 cm-1.
ng

Ph i có các pic có m/z 724 [M]+.
1

H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 1,49 (s); 1,17 (s); 1,60 (s); 1,53 (s); 1,96
(s); 2,10 (s) x 2; 2,00 (s); 2,02 (s); 2,20 (s); 5,80 (d); 5,34 (dd); 4,85
(m); 4,85 (d); 5,60 (d); 2,07 (m); 2,36 (d); 2,57 (m); 1,89 (d); 3,70 (d);
5,20 (s); 5,08 (s); 6,46 (d); 7,70 (d); 7,54 (m) và 7,40 (m).
13
C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 170,6; 170,2; 169,3; 170,4; 168,5; 124,3;
144,2; 110,9; 50,4; 40,8; 142,6; 134,2; 128,1 (x 2); 128,9 (x 2); 68,4;
67,4; 70,4; 76,7; 78,5; và 77,3.
230-232 oC.
Không ít h n 95,0%.

(1) ậ Taxinin B

(2) ậ Taxuspin F


14

(3) ậ 10-Deacetyl taxinin B

(4) ậ Taxuspin D

(5) ậ Taxchinin B
Hình 3.1. C u trúc hóa h c c a các h p ch t taxoid đ

c phân l p


15

3.3. Xây d ng quy trình đ nh l
ph

ng đ ng th i các taxoid b ng

ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao

3.3.1. Xây d ng quy trình đ nh l

ng đ ng th i paclitaxel và các

taxoid
3.3.1.1. Kh o sát b

c sóng phát hi n:

D a vào các đ nh h p thu c c đ i c a paclitaxel và các
taxoid đ ch n b

c sóng phát hi n cho quy trình đ nh l

ng: C t

Phenomenex C18, 5 µm, 250 x 4,6 mm, 110 Å. T c đ dòng: 1
ml/phút. Th tích tiêm m u: 10 l. Nhi t đ c t: 25 oC. Pha đ ng:
ACN – H2O (60 : 40).
3.3.1.2. Kh o sát pha đ ng:
M u th đ

c tri n khai trên cùng đi u ki n s c ký v i các

pha đ ng ACN - H2O có t l l n l

t là: 70 : 30; 60 : 40 v i cùng

t c đ dòng 1 ml/phút.
3.3.1.3. Kh o sát ch

ng trình tri n khai gradient

Các đi u ki n: c t Phenomenex C18, 5 µm, 250 x 4,6 mm,
110 Å. T c đ dòng: 1 ml/phút. Th tích tiêm m u: 10 l. Nhi t đ
c t: 25 oC. Pha đ ng: ACN – H2O v i ch
gradient:
Th i gian
(phút)
0-35
35-60
60-70
70-80

H2O (%)

ACN (%)

35

65

35→80
80→35
35

65→20
20→65
65

ng trình tri n khai
Ch

ng trình tri n
khai
ng dòng
Gradient
Gradient
ng dòng

3.3.1.4. Kh o sát t c đ dòng
Kh o sát theo chi u t ng c a t c đ dòng: 0,8; 1; 1,2 ml/phút
v i cùng t l pha đ ng ACN – H2O (60:40).


16

D a vào k t qu kh o sát các đi u ki n nh trên, quy trình
đ nh l ng đ ng th i đ c đ ngh nh sau:
B ng 3.5. Các đi u ki n tri n khai quy trình đ nh l
i u ki n s c ký

ng đ ng th i

HPLC

Pha t nh

C t Phenomenex C18, 5 µm, 250 x 4,6 mm, 110 Å

Pha đ ng

ACN – H2O (60 : 40)

Nhi t đ c t

25 ºC

B

227 nm và 280 nm

c sóng phát hi n

T c đ dòng

1 ml/phút

Th tích tiêm m u

10 µl

3.3.2. Th m đ nh quy trình
Th m đ nh quy trình theo các ch tiêu:
- Tính phù h p c a h th ng
K t qu kh o sát tính phù h p c a h th ng cho th y sau 6 l n s c ký
các thông s đ u n m trong gi i h n cho phép, RSD < 2%, As < 1,5;
N > 2000.
- Tính đ c hi u: Quy trình có tính đ c hi u.
- Tính tuy n tính: K t qu kh o sát tính tuy n tính cho th y có s
t

ng quan tuy n tính gi a n ng đ các ch t đ i chi u và paclitaxel

chu n c ng nh các ch t th trong m u và di n tích pic t
v ih s t
-

ng ng

ng quan r > 0,995.

chính xác và đ đúng

K t qu th ng kê cho th y các quy trình có t l h i ph c n m trong
gi i h n cho phép c a t l h i ph c lý thuy t 90% - 107%; RSD <


17

2% và RSD < 2% đ i v i đ l p l i; RSD < 3% đ i v i đ chính xác
trung gian.
B ng 3.6. K t qu kh o sát tính tuy n tính, gi i h n phát hi n và gi i
h n đ nh l

ng
Kho ng tuy n

R2

tính (µg/ml)

LOD

LOQ

(µg/ml)

(µg/ml)

Taxuspin F

25 – 75

1

0,30

1,00

Paclitaxel

25 – 75

0,9997

0,075

0,25

10-deacetyl

25 – 75

0,9996

0,06

0,20

Taxuspin D

25 – 75

0,9994

0,075

0,25

Taxinin B

25 – 75

1

0,06

0,20

taxinin B

ng d ng

Áp d ng quy trình đ nh l

ng đ ng th i đã xây d ng và

th m đ nh đ phân tích m u th TW đ
tr ng

Lâm

c chi t t thông đ lá dài

ng.

Ti n hành đ nh l

ng m u th thông đ . M i m u th ti n

hành 3 l n l y giá tr trung bình.
B ng 3.7. Hàm l
STT

Tên ch t

ng taxoid trong m u th TW
Di n tích pic

HƠm
(mg/g)

1

Taxuspin F

82021

404,49

2

Paclitaxel

651359

268,88

3

10-deacetyl taxinin B

308751

373,90

4

Taxuspin D

282929

459,40

5

Taxinin B

394229

431,98

l

ng


18

CH

NG 4. BÀN LU N

4.1. Chi t xu t, phơn l p, xác đ nh c u trúc vƠ đ nh tính,

đ nh l

ng taxoid trong lá Thông đ lá dƠi
Lu n án đã dùng ph

ng pháp chi t xu t t lá Thông đ lá

dài b ng các dung môi h u c có đ phân c c thay đ i nh MeOH,

CH2Cl2 đ phân l p đ

c các h p ch t taxoid. Do trong lá Thông đ

có nhi u t p nh di p l c t , d u béo nên c n x lý t p b ng thay đ i
dung môi, tri n khai qua c t daion HP-20, l c v i ether d u h a.
tài đã phân l p và xác đ nh đ

c c u trúc c a 5 h p ch t taxoid trong

lá Thông đ lá dài: Taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D,
taxuspin F, taxchinin B. ây đ u là các taxoid có tác d ng d
có tri n v ng làm thu c.
taxchinin B ch a đ

c lý và

c bi t, hai h p ch t taxuspin D và

c công b tìm th y trong lá Thông đ lá dài

(Taxus wallichiana Zucc.).
đ nh tính các taxoid trong lá Thông đ lá dài tr ng
ng, lu n án đã áp d ng h u h t các ph
c y cao. Nh ng ph

Lâm

ng pháp ph bi n và đ tin

ng pháp phân tích đ nh tính đã đ

c s d ng

nh : SKLM, HPLC-PDA, ph nghi m (UV, IR, MS, NMR), đi m
ch y c a t ng h p ch t so sánh v i d li u trong tài li u tham kh o.
nh l

ng các taxoid trong nguyên li u d

g p nh ng khó kh n: (1) là hàm l
Taxus; (2) là chi t xu t t d

c li u th

ng

ng taxol r t th p trong các cây

c li u ch a nhi u h p ch t n i sinh

khác nhau, và (3), c u trúc c a m i taxoid khác nhau r t ít. Vì v y,
đ nh l

ng các taxoid b ng HPLC th

ng các đ nh phân tách kém và

đòi h i th i gian phân tích dài. Do đó, các k thu t khác bao g m
SKLM c i ti n, s c ký đi n di MEKC, đi n di mao qu n, …. c ng

đ

c nghiên c u.


19

Nghiên c u này đã xây d ng ph
taxoid b ng ph

ng pháp đ nh l

ng các

ng pháp HPLC v i c t C18, đ u dò PDA. Do c u

trúc và tính ch t lý hóa c a các taxoid c n phân tích là nh ng h p
ch t mang tính base h u c do có s hi n di n c a nhóm alkanoyl
trong c u trúc và đ phân c c t trung bình đ n phân c c do có các
nhóm -OH. Do đó, nghiên c u đ nh tính, đ nh l
lu n án đã s

d ng k

ng các taxoid c a

thu t HPLC/PDA pha đ o v i c t

Phenomenex Gemini RP-C18 (250 x 4,6 mm, 5
đ ng: ACN – H2O. M u đ

c ch y theo ch

m) và h pha

ng trình đ ng dòng

v i th i gian phân tích 40 phút/ m u, th tích tiêm m u 10 l, b

c

sóng phát hi n: 280 nm.
4.2. Thi t l p ch t chu n đ i chi u
Các h p ch t taxoid đ

c phân l p trong lu n án: Taxinin B, 10-

deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F có hàm l
150g) và đ tinh khi t trên 95% đ

ng cao (h n

c ch n đ làm nguyên li u thi t

l p ch t đ i chi u. Hi n nay, các h p ch t này c ng ch a th y có nhà
s n xu t hay phân ph i ch t chu n đ i chi u nh ChromaDex, Sigma
Aldrich, USP, Cerilliant ho c hai Vi n ki m nghi m thu c trung
ng và TP.HCM cung c p.
Lu n án đã xây d ng đ

c quy trình chi t xu t, phân l p

ch t đ i chi u các taxoid trong lá Thông đ có tính n đ nh, hi u
qu . Các ch t đ
b ng ph

c phân l p có đ tinh khi t cao, đ

ng pháp ph nghi m và phân tích HPLC có các giá tr tin

c y cao. Quy trình đ nh l
ph

c xác đ nh

ng pháp HPLC đ

ng các taxoid đ

c xây d ng b ng

c th m đ nh đô đ c hi u, tính phù h p h

th ng, đ l p l i, kho ng tuy n tính.


20

4.3. Xây d ng quy trình đ nh l
Ph

ng đ ng th i

ng pháp HPLC-PDA
D

c đi n M (t USP 30 tr đi) là có chuyên lu n paclitaxel,

đ c p đ n đ nh l

ng taxol và các t p ch t liên quan. Theo USP (hi n

đang l u hành là USP 42), đ i v i nguyên li u đ

c dán nhãn là đ

c

phân l p t ngu n t nhiên, vi c ki m tra đ tinh khi t và xác đ nh t p
ch t liên quan c a paclitaxel đ

c ti n hành b ng ph

ng pháp HPLC

v i đi u ki n s c ký: C t s c ký L43 (4,6 mm x 25 cm, 5 µm), nhi t đ
c t: 30 oC, b

c sóng phát hi n: 227 nm, t c đ dòng: 2,6 ml/phút, th

tích tiêm m u: 15 µl, h pha đ ng MeOH-ACN tri n khai theo ch

ng

trình gradient trong 80 phút/ m u.
Lu n án xây d ng quy trình đ nh l

ng đ ng th i b ng

HPLC d a trên chuyên lu n paclitaxel c a USP 41 và các tài li u
tham kh o. USP s

d ng c t L43 (c t Pentafluorophenyl) là c t

chuyên bi t cho taxoid, tuy nhiên giá thành còn cao so v i đi u ki n
trang b thi t b

các phòng thí nghi m c a n

c u này ti n hành xây d ng quy trình đ nh l
trình đ nh l

c ta. Vì vây, nghiên
ng trên c t C18, quy

ng đ t các ch tiêu th m đ nh v đ đ c hi u, tính tuy n

tính, đ chính xác, đ l p l i, đ đúng.
K thu t HPLC/PDA trong nghiên c u này gi ng v i các
nghiên c u đã công b . Tuy nhiên, nghiên c u này đã s d ng pha

t nh c t C18, pha đ ng ACN-H2O v i ch
gian phân tích d

ng trình đ ng dòng, th i

i 30 phút/ m u phù h p h n đ tách đ ng th i 05

taxoid (taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F và
paclitaxel) trong lá Thông đ .

ây là quy trình đ nh tính, đ nh l

ng

đ ng th i trên các taxoid có trong lá Thông đ lá dài b ng ph

ng

pháp HPLC/PDA mà ch a đ

c công b b i tài li u nào.

Qua kh o sát các y u t

nh h

ng lên kh n ng phân tách

gi a các pic thì h dung môi tri n khai đóng vai trò quan tr ng. Quy

21

trình đ nh l

ng c a lu n án tri n khai v i h pha đ ng ACN-H2O,

không s d ng các h đ m có mu i vô c hay acid đ đi u ch nh pH
giúp b o v c t phân tích, kéo dài tu i th c t và rút ng n th i gian v
sinh h th ng tr

c và sau khi phân tích, có hi u qu v m t kinh t .

Trong quy trình đ nh l
b

c sóng phát hi n

280 nm đ đ nh l

ng đ ng th i, lu n án s d ng 2

227 nm đ đ nh l

ng paclitaxel và b

ng các taxoid còn l i.

ó là do

b

c sóng

c sóng 227

nm thì di n tích và chi u cao c a paclitaxel xu t hi n rõ nh ng các
pic còn l i có s khác nhau không rõ r t. Còn đ nh l

ng

b

c

sóng 280 nm thì các pic c a các taxoid còn l i xu t hi n rõ nh ng pic
c a paclitaxel l i th p. Vì v y, lu n án ch n đ u dò PDA v i 2 b
sóng phát hi n

227 nm và b

c sóng 280 nm đ đ nh l

c

ng đ ng

th i paclitaxel v i taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D và
taxuspin F.
Ph

ng pháp phân tích HPLC trong đ tài đã cho phép đ nh

tính và xác đ nh đ ng th i các taxoid trong lá T. walichiana. V i s
tr giúp c a d li u ph UV c a các taxoid có s n, ph
phép xác đ nh nhanh chóng các taxoid trong tr
ch t tham chi u t
tích th

ng pháp cho

ng h p thi u các

ng ng. Ph

ng pháp này c ng phù h p đ phân

ng quy taxoid trong d

c li u ho c d ch chi t mà không c n

l y m u ph c t p. Ph

ng pháp phân tích cung c p m t quy trình

nhanh chóng, thông th

ng và đáng tin c y đ đ nh tính và đ nh

l

th

ng đ ng th i m t nhóm các taxoid trong lá Taxus wallichiana có
ng d ng trong ki m nghi m ngu n nguyên li u và các ch ph m

liên quan đ n d

c li u này.

K t qu th m đ nh quy trình đ nh l

ng đ ng th i 04 taxoid

(taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D và taxuspin F) và
paclitaxel cho th y quy trình có tính đ c hi u cao, R2 > 0,9995 trong
kho ng n ng đ kh o sát và đ t yêu c u v đ chính xác và đ đúng.


22

K t qu th m đ nh này ch ng t r ng qui trình chu n b m u th là
n đ nh, các ch t phân tích h u nh không b m t đi nhi u trong quá
trình x lý m u.

i u này s giúp nh ng k t qu phân tích khi áp

d ng quy trình này là có đ chính xác, đ đúng cao và tin c y.
Tính m i c a đ tài
1. H p ch t taxuspin D và taxchinin B l n đ u đ
phân l p đ

c t lá Taxus wallichiana Zucc. Tuy nhiên, các taxoid

phân l p trong nghiên c u này đã đ
nghiên c u tr
d ng d

c công b

c lý đ

c đây. Các taxoid đ

c công b c u trúc trong các
c phân l p là nh ng ch t có tác

c quan tâm: Taxinin B, taxuspin D, taxuspin F và

taxchinin B. C th : H p ch t taxinin B có tác d ng ch ng k t t p
ti u c u, taxuspin D và taxchinin B có kh n ng ch ng l i s đ
kháng thu c kháng ung th , taxuspin F có tác d ng c ch các t bào
Hela. Ngoài ra, các h p ch t này còn có th làm nguyên li u t ng
h p paclitaxel và các d n xu t do t
2. L n đ u tiên thi t l p đ

ng đ ng c u trúc khung c b n.
c 4 h p ch t taxoid làm ch t đ i

chi u, đây là nguyên li u c n thi t trong ki m nghi m d
ph n ki m tra, đánh giá ch t l

ng c a d

c li u, góp

c li u và các ch ph m

liên quan.
3.

ã s d ng ph

ng pháp HPLC đ đ nh l

paclitaxel cùng 04 lo i taxoid đ

c phân l p t T. wallichiana.

không ch l n đ u tiên thi t l p ph
l

ng đ ng th i
tài

ng pháp xác đ nh đ ng th i hàm

ng taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F và

taxol, mà còn phát hi n ra r ng c t Phenomenex Gemini RP-C18 có
th tách riêng các h p ch t này v i đ phân gi i cao.

23

K T LU N
Sau th i gian th c hi n, đ tài: “Phân l p m t s h p ch t
taxoid t lá Thông đ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.) tr ng
ng, đ nh h
nghiên c u đ
1. Phân l p đ
tr ng

ng thi t l p ch t đ i chi u” đã đ t đ

Lâm

c các m c tiêu

c đ t ra:
c 5 h p ch t taxoid tinh khi t t lá Thông đ lá dài đ

Lâm

c

ng

V i các ph

ng pháp s c ký c t c đi n, s c ký c t trung áp,

s c ký l p m ng, HPLC, HPLC đi u ch và các ph

ng pháp ph

nghi m nh : UV, IR, MS, NMR, lu n án đã phân l p, tinh ch và xác
đ nh c u trúc c a m t s h p ch t taxoid trong lá Thông đ lá dài
tr ng
-

Lâm

ng:

T 75 g phân đo n cao MeOH 100% phân l p đ
(1) đ

c 425 mg h p ch t

c xác đ nh là taxinin B và 732 mg h p ch t (2) đ

c xác đ nh

là taxuspin F và 158 mg h p ch t (3) - 10-deacetyl taxinin B.
-

T 50 g phân đo n cao MeOH 100% phân l p đ

c 183 mg h p ch t

(4) là taxuspin D và 105 mg taxchinin B - h p ch t (5).
2. Thi t l p ch t đ i chi u
Trong 5 h p ch t đ

c phân l p thì 4 h p ch t đ t tiêu chu n

nguyên li u thi t l p ch t đ i chi u:
l

tinh khi t > 95% và có kh i

ng > 150 mg. Vì v y, đ tài đã thi t l p 4 h p ch t taxoid làm ch t

đ i chi u: taxinin B, 10-deacetyl taxinin B, taxuspin D, taxuspin F.
Quy trình thi t l p ch t đ i chi u theo h

ng d n c a ASEAN, m i

ch t đ i chi u có các thông tin: d li u ph , đi m ch y, đ tinh
khi t,…
3. Xây d ng quy trình đ nh l
taxoid b ng ph

ng đ ng th i paclitaxel và 4 h p ch t

ng pháp HPLC