Nghiên cứu tạo sinh khối spirulina platensis 10

41

CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP


42

2.1 Phương pháp thuần chủng Spirulina
Nguồn giống
Giống Spirulina được cung cấp từ Phịng Cơng nghệ biến đổi sinh học - Viện
Sinh học nhiệt đới – Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam. Giống được phân lập
và giữ trên môi trường Zarrouk chứa 1,5% agar. Dịch sinh khối được chuẩn bị trong
môi trường Zarrouk dạng dịch và nuôi ở điều kiện ánh sáng, nhiệt độ phịng thí
nghiệm cho tới khi đạt được nồng độ sinh khối khoảng 0,6 g/l. Việc nuôi Spirulina
trong môi trường dịch thể được thực hiện trong hệ ống thủy tinh.
Spirulina được thuần chủng (tinh sạch giống) bằng tia cực tím (UV) và ni
rửa bằng mơi trường Zarrouk vơ trùng.
2.1.1 Tia UV [30]
Sử dụng bóng UV cơng suất 15 W, công suất đầu ra của tia UV là 4,9 W.
Cách làm: sau 15 ngày nuôi, dịch nuôi Spirulina được chiếu UV với thời gian 0, 5,
10, 15, 30, 60 phút. Khoảng cách đến bóng đèn UV là 50 cm, có khuấy dịch ni
bằng máy khuấy từ trong khi chiếu UV với tốc độ 155-175 vòng/phút. Độ sâu của
dịch nuôi là 1-2 cm. Sau khi chiếu UV, Spirulina được giữ 22-24 giờ ở điều kiện
phịng thí nghiệm. Tiếp theo, mẫu được nhuộm fucshine và quan sát dưới kính hiển
vi. Dịch nuôi được cấy lên môi trường thạch-cá-peptone để phát hiện khuẩn lạc của
vi khuẩn nhiễm tạp. Dịch nuôi được đánh giá sạch và Spirulina được cho là thuần
chủng khi khơng có sự xuất hiện của vi khuẩn tạp sau hai ngày nuôi.
2.1.2 Môi trường Zarrouk vô trùng
Cách làm: sau 15 ngày nuôi, Spirulina được ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút

trong 7-10 phút, thu phần sinh khối lắng xuống và đưa lại vào môi trường Zarrouk
đã vô trùng (1210C, 15 phút). Khuấy nhẹ và tiếp tục ly tâm, thu sinh khối lắng
xuống, ly tâm lặp lại ba lần. Ở lần sau cùng, thu lấy sinh khối cấy lên môi trường
Zarrouk thạch vô trùng. Khi xuất hiện những sợi Spirulina đầu tiên phát triển ra thì
thu lấy phần đầu của những sợi đó và cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn môi trường
Zarrouk vô trùng, để yên ở nhiệt độ phịng. Sau khoảng 12-14 giờ ni, sinh khối
trong ống nghiệm được rửa qua 5-7 ống nghiệm khác cũng chứa môi trường


43

Zarrouk vô trùng. Spirulina đã rửa được cấy lên môi trường Zarrouk thạch vô trùng,
lại tiếp tục thu lấy sợi Spirulina đầu tiên phát triển ra, đưa vào ống nghiệm chứa
môi trường Zarrrouk vô trùng, để nuôi trong 12-14 giờ ở điều kiện phịng thí
nghiệm, lặp lại q trình trên cho đến khi thu được sinh khối thuần. Kiểm tra mức
độ thuần khiết của Spirulina bằng nhuộm fucshine và quan sát dưới kính hiển vi,
dịch ni được cấy lên mơi trường thạch - cá - peptone để phát hiện khuẩn lạc của
vi khuẩn nhiễm tạp. Dịch nuôi được đánh giá là sạch và Spirulina được cho là thuần
chủng nếu sau hai lần kiểm tra mà không xuất hiện vi khuẩn tạp nhiễm.
Môi trường Zarrouk [5]
Bảng 2.1 Thành phần của môi trường Zarrouk
Hóa chất

Khối lượng
(g/l)

NaHCO3

16,80

NaNO3

2,50

NaCl

1,00

K2HPO4

0,50

MgSO4

0,20

CaCl2

0,04

K2SO4

1,00

FeSO4

0,01

Na- EDTA

0,08

Dung dịch A5

1 ml/l

Dung dịch A6

1 ml/l

Độ pH

8 – 10

- Dung dịch A5:
+ H3BO3

2,86 g/l

+ MnCl2.4H2O

1,81 g/l


44

+ ZnSO4.7H2O

0,22 g/l

+ CuSO4.5H2O

0,08 g/l

+ MoO3

0,01 g/l

- Dung dịch A6:
+ NH4VO3

229 x 10-4 g/l

+ K2Cr2(SO4)3.24H2O

960 x 10-4 g/l

+ NiSO4.7H2O

478 x 10-4 g/l

+ Ti2(SO4)3

400 x 10-4 g/l

+ Co(NO3)2.6H2O

44 x 10-4 g/l

+ NaWO4

179 x 10-4 g/l

EDTA = Ethylene Diamine Tetra Acetat
2.2 Xác định nồng độ tế bào ban đầu để ni Spirulina
Thí nghiệm như sau: nuôi Spirulina với 4 nồng độ tế bào 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4
g/l trong môi trường Zarrouk. Bố trí như sau: 200 ml dịch ni chứa trong chai PET
thể tích 330 ml, có lắp, chất liệu polyethylen (PE), ni tĩnh, điều kiện phịng thí
nghiệm. Sự thay đổi nồng độ tế bào được theo dõi bằng trọng lượng khô theo ngày
nuôi vào khoảng 4-5 giờ chiều. Từ 4 giá trị trên, so sánh kết quả và kết luận giá trị
tối ưu.
2.3 Hệ thống nuôi Spirulina
2.3.1 Thiết kế hệ thống
Spirulina được nuôi trong hai hệ thống: hở (trong điều kiện tự nhiên) và kín
(trong điều kiện có điều khiển).
Khí sục vào hệ hở và hệ kín được lọc bằng bơng thủy tinh (BTT) và than hoạt
tính (THT) xếp xen kẽ nhau thành 5 lớp (BTT-THT-BTT-THT-BTT).
Hệ kín được rửa sạch bằng dung dịch có độ pH 9-10 trước khi đưa vào nuôi
S. platensis.
2.3.1.1 Hệ hở


45

Hệ hở được làm từ các chậu 30 lít, thể tích dịch ni 10-20 lít, chất liệu
polyvinylclorua (PVC).
2.3.1.2 Hệ kín
Hệ kín là các ống hình trụ làm từ thủy tinh hoặc PE trong suốt. Đường kính
trong 3,1 cm, đường kính ngoài 3,3 cm, chiều dài ống 120 cm, độ truyền suốt 95%,
các ống được nối với nhau nhờ bộ nối PVC có khả năng lắp vào và tháo ra dễ dàng.

2.3.2 Hoạt động hệ thống
2.3.2.1 Hoạt động của hệ hở
Đối với hệ này được thực hiện ở cùng một vị trí với hệ kín (để có cùng cường
độ ánh sáng), sử dụng môi trường Zarrouk để nuôi, thời gian theo dõi từ 10-30
ngày.
Chế độ đảo trộn: liên tục trong suốt q trình ni bằng máy sục khí.
Các chỉ tiêu tốc độ tăng trưởng, hàm lượng protein trong sinh khối thu được
khi kết thúc q trình ni được ghi nhận để từ đó so sánh với hệ kín.
2.3.2.2 Hoạt động của hệ kín
Thí nghiệm 1. Về cường độ ánh sáng và vận tốc dịng khí: Spirulina được
ni ở hai vị trí tương ứng với hai chế độ ánh sáng như bảng 2.2.
Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm về cường độ ánh sáng và vận tốc dịng khí
a) Dưới ánh nắng trực tiếp

b) Có mái che

Vận tốc dịng khí

Vận tốc dịng khí

(m/giây)

(m/giây)

0,1

0,2

0,3

0,1

0,2

0,3

Sục khí liên tục trong q trình ni
Chỉ tiêu theo dõi: thời gian tăng trưởng, năng suất sinh khối, hàm lượng protein và
sắc tố


46

Thí nghiệm 2. Về thời gian sục khí được thực hiện theo bảng 2.3
Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm về thời gian sục khí
Nguồn carbon, cường
Thời gian sục khí

độ ánh sáng, vận tốc

Chỉ tiêu theo dõi

dịng khí
1. Khơng sục
- Thời gian tăng

ngày (7-17 giờ)

Bicarbonate, cường độ

trưởng

ánh sáng và vận tốc

- Năng suất sinh

dịng khí tìm ra ở thí

khối

nghiệm 1

2. Sục khí 9-10 giờ/ngày vào ban

- Hàm lượng
protein và sắc tố

3. Sục khí liên tục trong thời gian
ni

Thí nghiệm 3. Về nguồn carbon cung cấp cho S. platensis như bảng 2.4
Bảng 2.4 Bố trí thí nghiệm về nguồn carbon cung cấp cho S. platensis
Nguồn carbon
1. Khơng khí và
bicarbonate
2. CO2 khơng khí

Mơi trường

Cường độ ánh sáng, vận

tốc dịng khí

Zarrouk
Cường độ ánh sáng và vận
Zar-

tốc dịng khí tìm ra ở thí
nghiệm 1

3. CO2 từ lên men cồn

Zar-

Chỉ tiêu theo dõi: thời gian tăng trưởng, năng suất sinh khối, hàm lượng protein và
sắc tố
Chú giải: mơi trường Zar- là mơi trường Zarrouk khơng có NaHCO3


47

Ngồi ra, hiệu suất sử dụng khí CO2 cũng được phân tích nhằm xem xét khả
năng dùng nguồn khí lên men cồn cho nuôi Spirulina ở quy mô lớn hơn hoặc đề
xuất một giải pháp mới để tận dụng nguồn CO2 khá tinh sạch này.
2.4 Phương pháp lên men cồn ethylic [6], [8]
Nguyên liệu
Giống nấm men .
Mật rỉ.
Bình lên men thể tích 25 lít.
Mơi trường Hansen (xem bảng 2.5).
Bảng 2.5 Thành phần của mơi trường Hansen

Hóa chất

Khối lượng
(g/l)

Peptone

10

Glucose

50

KH2PO4

3

MgSO4. 7H2O

3

Nước cất

Đủ 1000 ml


48

Quy trình lên men cồn ethylic tiến hành theo sơ đồ 2.1
Giống nấm men thuần

chủng tăng sinh trong

Mật rỉ pha lỗng đến
nồng độ đường 15-20 %

mơi trường Hansen

Tăng sinh trong mơi

Lên men trong

trường mật rỉ pha lỗng

bình 25 lít, 3-7
ngày

Thu khí CO2
- Xác định hàm lượng
- Sục vào hệ thống ni
Sơ đồ 2.1 Quy trình lên men cồn ethylic
2.5 Xác định nồng độ CO2
Nồng độ CO2 được xác định bằng máy TELAIRE 7001 (CO2/Temperature
Monitor, USA), đo từ 0-10000 ppm hoặc lớn hơn, độ chính xác ± 50 ppm.
Nguyên tắc hoạt động: máy TELAIRE 7001 dựa trên sự khác biệt nồng độ
CO2 bên trong và bên ngồi để tính lượng CO2 có trong mẫu phân tích.
2.6 Xác định cường độ ánh sáng và độ truyền suốt của vật liệu làm hệ thống
Cường độ ánh sáng
Cường độ ánh sáng xác định bằng máy LI-250A Light Meter với cảm biến
lượng tử LI-190SA.
Cường độ ánh sáng quang hợp là số lượng các lượng tử ánh sáng tới nằm

trong dải sóng 400-700 nm trong một đơn vị thời gian và trên một đơn vị diện tích.
1 µmol s-1m-2 = 1 µE s-1m-2 = 6.022 X 1017 photons s-1m-2


49

Độ truyền suốt
% độ truyền suốt =

AS2
×100
AS1

Trong đó: AS1 là cường độ ánh sáng trên bề mặt ống, µmol s-1m-2,
AS2 là cường độ ánh sáng dưới bề mặt ống, µmol s-1m-2,
và 100 là số chuyển sang phần trăm.
2.7 Xác định độ oxy hòa tan
Độ oxy hòa tan được xác định bằng máy SIGMA 950 với đầu dò oxy.
Nguyên tắc: dựa theo một cực phổ oxy của máy. Để đo lượng oxy hịa tan thì
máy bao gồm: điện cực làm việc là một kim loại quý (bằng Pt) điện cực đối là Ag.
Dung dịch điện phân là KCl, màng làm bằng teflon.
Một hiệu điện thế được tạo ra giữa hai điện cực làm oxy được tạo ra bị khử và
đi qua màng. Lượng bị khử bằng với lượng oxy hòa tan tạo ra, do đó xác định được
lượng oxy hịa tan ban đầu.
2.8 Phương pháp thu hoạch sinh khối [19], [20]
Sinh khối Spirulina được thu hoạch theo hai cách: lọc chân không bằng máy
AUTOSCIENCE và lọc trọng lực bằng vải polyeste.
Hiệu suất lọc được tính bằng độ chênh lệch sinh khối trước và sau lọc theo
cách sau: cùng một thể tích V ml của dịch nuôi chưa lọc, dịch thu được sau khi lọc
chân không và lọc vải được đem sấy ở 100-1050C đến trọng lượng khơng đổi.

Hiệu suất tính theo cơng thức sau:
HSlck =

m2
× 100
m1

HSlv =

m3
×100
m1

Trong đó: HSlck là hiệu suất lọc chân không, %,
HSlv là hiệu suất lọc vải, %,
m1 là khối lượng sau sấy của dịch chưa lọc, g,
m2 là khối lượng sau sấy của dịch lọc chân không, g.


50

và m3 là khối lượng sau sấy của dịch lọc vải.
2.9 Phương pháp xác định trọng lượng khô của sinh khối [38]
Nguyên tắc
Dựa vào sự bay hơi nước do nhiệt để tính độ chênh lệch khối lượng trước và
sau khi sấy.
Dụng cụ.
Tủ sấy điều chỉnh nhiệt độ.
Bình hút ẩm.
Cân phân tích, độ chính xác 0,0001 g.

Hóa chất
Dung dịch HCl (pha loãng 1:1 với nước cất). Khi dùng, lấy 0,5 ml dung dịch
này pha thành 100 ml bằng nước cất để sử dụng.
Cách tiến hành.
Sấy giấy lọc ở nhiệt độ 70oC qua đêm, để nguội và đem cân, ghi lại trọng
lượng G1.
Lấy 10 ml dịch nuôi, lọc qua giấy lọc.
Rửa phần trên giấy lọc bằng HCl để loại khoáng lẫn trong sinh khối.
Giấy lọc cùng với sinh khối trên giấy lọc được sấy ở 700C qua đêm.
Làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân, ghi lại trọng lượng G2.
Kết quả
Trọng lượng khô (DW) được xác định theo công thức
DW =

G2 − G1
x1000
10

(g/l)

Trong đó:
10 là thể tích dịch ni, ml,
1000 là số chuyển đổi từ ml sang l,
G2 là trọng luợng giấy lọc và sinh khối đã sấy, g,
G1 là trọng luợng giấy lọc đã sấy, g.


51

2.10 Tính số Renolds [28]

Số Renolds (Re) trong đường ống tính theo cơng thức sau:
Re =

VxD
Kv

Trong đó:
Kv là độ nhớt động học của nước ở 300C và bằng 1,141 x 10-6 m/s2,
D là đường kính ống, m,
và V là vận tốc chất lỏng, m/s.
2.11 Tính năng suất sinh khối (P) [34]
Xt − X0
(g/l/ngày)
t − t0

P=

Trong đó : X0 là nồng độ sinh khối ở thời gian t0 (ngày thứ 1), g/l,
và Xt là nồng độ sinh khối tại thời gian t (ngày có nồng độ sinh
khối cao nhất) sau t0 (ngày), g/l.
2.12 Định lượng chlorophyll [14], [28]
Nguyên tắc: dựa vào bước sóng hấp phụ cao nhất của chlorophyll để thu
lấy giá trị A khi đo mầu.
Dụng cụ
Máy đồng hóa tốc độ cao.
Hóa chất
Methanol tuyệt đối.
Cách tiến hành
Lấy 10 ml mẫu đem lọc, thu phần trên giấy lọc cho vào ống 20 ml có vạch
chia thể tích và thêm 5-15 ml methanol.

Đồng hóa mẫu với tốc độ 5000-15000 vịng/phút, trong 5-10 phút. Sau khi
đồng hóa để ở nhiệt độ phịng trong 10-20 phút.
Tiếp theo, đem dịch chiết ly tâm ở tốc độ 8000-10000 vòng/phút, trong 5-7
phút.


52

Thu phần dịch nổi, mầu trong, đem đo ở bước sóng 665 nm với dung dịch
methanol làm mẫu chứng. Ghi nhận hai giá trị tương ứng là A665.
Tính kết quả
Chlorophyll tổng (mg/g) =

13,9 xA665 x10
a

Trong đó: A665 là độ hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm,
13,9 là hệ số hấp thu của chlorophyll ở bước sóng 665 nm,
và a là khối lượng mẫu có trong 10 ml dịch phân tích, g.
2.13 Định lượng phycocyanin [14]
Ngun tắc
Phycocyanin có độ hấp phụ cực đại ở bước sóng 618 nm, dựa vào giá trị A
đo được để tính hàm lượng phycocyanin có trong mẫu phân tích.
Dụng cụ
Máy đo cường độ mầu.
Máy đồng hóa ULTRA-TURRAX T8 (IKA-WERKE, 5000–25000
vịng/phút, 100w, Germany).
Máy ly tâm lạnh.
Hóa chất
Dung dịch đệm phosphate 100mM (10,64g K2HPO4 và 5,29g

KH2PO4 pha trong 1 lít nước cất, pH 7).
Cách tiến hành
Lấy 10 ml mẫu, lọc, thu phần trên giấy lọc, cân a g từ sinh khối lọc được
cho vào ống ly tâm, sau đó cho 10 – 15 ml dung dịch đệm phosphate vào ống ly
tâm, lắc kỹ.
Đồng hóa mẫu trong khoảng thời gian 5-10 phút, ở tốc độ 10000-15000
vòng/phút bằng máy ULTRA-TURRAX T8.
Để ở 370C trong 24 giờ đồng hồ.
Khi đủ thời gian, đem ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/phút trong thời gian 10
phút.


53

Sau khi ly tâm, thu phần dịch nổi và đo cường độ mầu tại bước sóng 618
nm, sử dụng đệm phosphate làm mẫu chứng.
Tính kết quả
Phycocyanin (mg/g) =

A618 x10
3,39 xa

Trong đó:
a là trọng lượng sinh khối thí nghiệm, g,
A618 là giá trị hấp thu đo được của mẫu,
và 3,39 là hệ số hấp thu của phycocyanin tại bước sóng 618 nm.
2.14 Định lượng carotenoid [16]
Nguyên tắc: dựa vào tính tan trong dung môi hữu cơ để tách chiết
carotenoid ra khỏi nguyên liệu. Dựa vào giá trị A thu được khi đo mầu để tính hàm
lượng carotenoid có trong ngun liệu.

Dụng cụ
Giấy lọc.
Phễu tách.
Máy quang phổ so mầu.
Bể ổn nhiệt.
Hóa chất
Diethyl ether.
Ethanol 960.
Dung dịch KOH 60%.
Dung dịch NaCl 9%.
Na2SO4 khan.
Cách làm
1. Cân a g mẫu khô (hoặc V ml mẫu dạng lỏng, lọc qua giấy lọc, lấy
phần trên giấy lọc làm thí nghiệm) cho vào cốc 100 ml.
2. Thêm 10-20 ml KOH 60%, lắc kỹ, đồng hóa mẫu bằng máy để
trong bể ổn nhiệt ở 500C trong 5-10 phút.


54

3. Ly tâm mẫu với tốc độ 8000-10000 vòng/phút, trong 5 phút.
4. Chuyển phần dịch nổi vào phễu tách và thêm 15-25 ml diethyl
ether và 20-30 ml NaCl 9%.
5. Trộn kỹ và để cho đến khi dịch nổi phân làm hai lớp: mầu xanh lá
cây ở dưới, mầu vàng ở trên.
6. Cẩn thận, thu lấy phần mầu xanh lá cây.
7. Thêm NaCl 9% và lặp lại bước 6 cho tới khi dịch tách thành hai
lớp mầu vàng và mầu trắng trong suốt.
8. Tách và thu lấy phần dịch mầu vàng, cho thêm một lượng nhỏ
Na2SO4 vào để hấp thu nước.

9. Thêm diethyl ether vào dịch mầu vàng tới 25 ml và trộn đều.
10. Đo mầu ở bước sóng 450 nm với dung dịch diethyl ether làm
mẫu chứng.
Tính kết quả:
Carotenoid (mg/g) =

A450 x 25
260 xa

Trong đó:
A450 là độ hấp phụ đo được ở bước sóng 450 nm,
a là trọng lượng mẫu thí nghiệm, g,
và 260 là hệ số hấp thu của carotenoid ở bước sóng 450 nm.
2.15 Định lượng carbohydrate [3]
Nguyên tắc: sự định lượng này căn bản dựa trên phản ứng mầu đặc trưng cho
bởi đường với sự hiện diện của H2SO4.
Sự chính xác của kết quả tùy thuộc vào:
Độ sạch của dụng cụ.
Độ tinh khiết của thuốc thử và H2SO4.
Nhiệt độ cố định trong suốt thời gian đun.
Hoá chất
Cồn 80o, cồn 90o.


55

Phenol 5% trong cồn.
H2SO4 đậm đặc.
Dung dịch đường saccharose 0,1%: 500 mg saccharose, sấy khơ
ở 60oC hồ tan trong 500 ml nước cất.

Cách tiến hành
Bước 1. Ly trích đường
Nghiền nguyên liệu cần định lượng đường, sau đó cân chính xác 1 – 2 g
nguyên liệu đã nghiền nhuyễn chứa khoảng 5 – 50 mg đường cho vào cốc thủy tinh
50 ml, cho thêm 10 ml cồn 90o vào. Đun cốc trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần (mỗi
lần sôi lấy cốc ra cho nguội bớt rồi đặt trở lại). Khuấy đều bằng que thủy tinh, để
nguội, lọc qua giấy lọc (giữ cặn, khơng đổ cặn lên giấy lọc).
Sau đó thêm 10 ml cồn 80o vào cốc chứa cặn, khuấy đều, đun sôi 2 lần trên
nồi cách thủy. Để nguội, lọc. Tiếp tục làm như vậy khoảng 2 lần. Sau đó đưa cặn
lên giấy lọc và tráng cốc 2 – 3 lần bằng cồn 80o nóng (nước tráng cũng cho cả lên
giấy lọc). Dịch lọc cho bay hơi ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy để
cồn bay hơi hết.
Pha loãng cặn thu được với nước cất thành 50 ml. Để lắng, dung dịch này
đem đi hiện mầu để xác định hàm lượng đường, có thể pha lỗng dung dịch đường
tùy theo nồng độ đường có trong dung dịch nhiều hay ít.
Bước 2. Thực hiện phản ứng mầu
Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi thêm vào
1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó cho chính xác 5 ml H2SO4 đậm đặc vào ống
nghiệm (không để giây acid vào thành ống). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên nồi cách
thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30oC để hiện mầu.
Bước 3. Xây dựng đường chuẩn.
Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi bổ sung như bảng 2.6


56

Bảng 2.6 Thí nghiệm xây dựng đường chuẩn saccharose
Bình

Saccharose 0,1% (ml)

Nước cất (ml)

1

1

99

2

2

98

3

3

97

4

4

96

5

5

95

6

6

94

7

7

93

Chuẩn bị 8 ống nghiệm, lần lượt cho vào các ống như bảng 2.7
Bảng 2.7 Thí nghiệm phản ứng mầu của đường saccharose
Ống

Dung dịch
saccharose

Phenol 5% (ml)

H2SO4

Nồng độ saccharse

(ml)

(μg)

1

1 ml bình số 1

1

5

10

2

1 ml bình số 2

1

5

20

3

1 ml bình số 3

1

5

30

4

1 ml bình số 4

1

5

40

5

1 ml bình số 5

1

5

50

6

1 ml bình số 6

1

5

60

7

1 ml bình số 7

1

5

70

8

1 ml nước cất

1

5

0


57

Mầu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ mầu bằng máy quang phổ so
mầu ở bước sóng 490 nm.
Tính kết quả
Vẽ đường cong chuẩn: trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừ đi trị
số mật độ quang của ống thử khơng. Từ đó, ta xây dựng một đường cong chuẩn.

Mặt khác, trị số mật độ quang của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừ đi
trị số mật độ quang của ống thử không, rồi dựa vào đường chuẩn để suy ra nồng độ
x μg, từ đó tính ra lượng đường trong mẫu.
2.16 Định lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl [3]
Nguyên tắc
Chất đạm được vơ cơ hố bằng H2SO4 đậm đặc thành amonsulphat
(NH4)2SO4.
Muối này đem cho tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3:
H2SO4đđ
Chất đạm
→
(NH4)2SO4
Xúc tác
(NH4)2SO4 + NaOH

→

2NH3 + H2O + Na2SO4

Sau đó, lượng NH3 được hơi nước lơi cuốn sang một bình tam giác có chứa
một lượng thừa H3BO3 mà ở đó H3BO3 tự phân ly:
H3BO3 → HBO2 + H2O
Khi cất đạm, NH3 bay sang sẽ phản ứng với HBO2
NH4OH + HBO2 → NH4 + BO-2 + H2O
BO2- Là một bazơ mạnh, bởi vậy dung dịch của bình hứng chuyển từ mầu tím
đỏ sang mầu xanh lá mạ. Lượng BO2- được tạo thành tương đương với NH3 đẩy ra
trong quá trình cất đạm. Xác định BO2- bằng cách chuẩn độ ngược với HCl 0,25N.
Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ mầu xanh lá mạ sang mầu tím
đỏ.
BO2- + H+ → HBO2

58

Dụng cụ
Máy Kjeldahl.
Burret 25 ml.
Bếp đun.
Bình chưng cất.
Hố chất
Dung dịch H2SO4 đậm đặc.
Dung dịch NaOH 32%.
Dung dịch HCl 0,25N.
Chất xúc tác: là hỗn hợp của 60g selenium + 75g CuSO4 + 865g
K2SO4.
Hỗn hợp chị thị mầu:
Hoà tan 0,624g methyl đỏ trong 250 ml cồn tuyệt đối.
Hoà tan 1,28g Bromocresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối.
Trộn đều 2 dung dịch trên, bổ sung 96 ml HCl 0,25N. Bổ
sung đến 1 lít bằng cồn tuyệt đối.
Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị mầu: làm tan 80g acid boric
trong 1800 ml nước cất, đun nóng một chút. Để nguội và bổ sung 25 ml hỗn hợp
chất chỉ thị mầu. Bổ sung đến 2 lít bằng nước cất.
Cách tiến hành
Bước 1. Vơ cơ hố mẫu
Tùy theo hàm lượng đạm có trong mẫu mà khối lượng mẫu vơ cơ hóa nhiều
hay ít, Cân a g mẫu đã nghiền kỹ cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1 g chất xúc tác và
5 ml H2SO4 đậm đặc đặt lên bếp tiến hành phá mẫu trong tủ hút, đun đến khi dung
dịch có mầu xanh rồi trong suốt, tiếp tục đun thêm 30 phút nữa. Để nguội ở nhiệt độ
phòng. Khi phá mẫu xong, để nguội và bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và để

nguội, lắp vào máy chưng cất.


59

Bước 2. Chưng cất mẫu
Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất, bổ sung 30ml NaOH 32%. Khởi động
quy trình chưng cất, dịch chưng cất chuyển sang bình tam giác có chứa sẵn 20 ml
dung dịch chỉ thị mầu.
Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra khơng cịn NH3 (thử bằng giấy quỳ).
Chuẩn độ bằng HCl 0,25N. Ngừng chuẩn độ khi xuất hiện mầu phớt đỏ.
Tính kết quả
Thơng qua lượng HCl 0,25N ta biết được acid boric kết hợp với NH3 và từ đó
biết được lượng NH3 giải phóng ra từ mẫu. 1 ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035
g nitơ.
% nitơ tổng (Ntổng) =

VHCl 0,25 x0, 0035
a

x100

Trong đó:
VHCl là thể tích HCl 0,25N dùng để chuẩn độ, ml,
và a là trọng lượng mẫu đem xác định, g.
Sau khi có kết quả Ntổng, có thể tính được hàm lượng protein trực tiếp trong
nguyên liệu dựa theo công thức sau:
% protein thô = % Ntổng x 6,25
2.17 Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet [3]
Ngun tắc

Dùng ete nóng để hịa tan tất cả chất béo tự do trong thực phẩm. Sau đó làm
bay hơi hết ete, cân chất béo cịn lại và tính hàm lượng lipid trong 100 g mẫu.
Dụng cụ và hóa chất
Máy Soxhlet.
Bếp đun.
Giấy lọc.
Ete dầu hoả.
Cách tiến hành
Sấy giấy lọc kích thước 8 x 9 cm đến trọng lượng không đổi.


60

Cân chính xác m g ngun liệu đã sấy khơ và nghiền nhỏ cho vào giấy lọc,
gói lại theo hình trụ, cân trọng lượng mẫu và giấy trước khi chiết rút lipid.
Đặt giấy lọc có chứa mẫu vào trụ chiết và bắt đầu chiết với ete dầu hỏa. Sau
khi chiết xong (khoảng 8 giờ đồng hồ), lấy mẫu ra, để trong tủ hút cho dung mơi
bay hơi hết, sau đó sấy ở 1050C đến trọng lượng khơng đổi.
Tính kết quả
Hàm lượng lipid có trong 100 g ngun liệu được tính theo cơng thức sau:
X=

P−P
1
x100
m

Trong đó:
X là hàm lượng lipid có trong nguyên liệu ở độ khô tuyệt đối, %,
P là khối lượng gói nguyên liệu trước khi chiết lipid, g,

P1 là khối lượng gói nguyên liệu sau khi chiết lipid và sấy, g,
và m là khối lượng mẫu đem phân tích, g.
2.18 Phương pháp xác định tổng nấm men, nấm mốc [7]
Nguyên tắc: nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật dị dưỡng, cần
nguồn carbon hữu cơ từ mơi trường bên ngồi. Dựa vào đặc điểm này để sử dụng
kỹ thuật pha loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên mơi trường Plate Count Agar (PCA).
Mơi trường và hóa chất
Môi trường tổng hợp PCA (casein, dịch chiết nấm men, dextrose, agar).
Quy trình phân tích như sơ đồ 2.2


61

Đồng nhất và
pha loãng mẫu
đến các độ pha
loãng 10-1, 10-2,
10-3 …

Trải 0,1 ml mẫu lên đĩa thạch
PCA, ủ nhiệt độ phịng 5-7 ngày

Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm
men, tính theo CFU/g hoặc
CFU/ml

Sơ đồ 2.2 Quy trình định lượng tổng nấm men, nấm mốc
2.19 Kiểm tra E. coli
Phương pháp ISO 16649-2 : 2001
2.20 Kiểm tra Salmonella

Phương pháp ISO 6579 : 2002
2.21 Phương pháp xử lý thống kê SPSS