phát hiện đột biến gen glucose 6 phosphat dehydrogenase trong hồng cầu người ở một số dân tộc phía bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGHIÊM THỊ THANH NGA

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN
GLUCOSE-6-PHOSPHAT DEHYDROGENASE
TRONG HỒNG CẦU NGƢỜI Ở MỘT SỐ DÂN
TỘC PHÍA BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGHIÊM THỊ THANH NGA

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN GEN
GLUCOSE-6-PHOSPHAT DEHYDROGENASE
TRONG HỒNG CẦU NGƢỜI Ở MỘT SỐ DÂN
TỘC PHÍA BẮC VIỆT NAM
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC
MÃ SỐ: 8.72.02.08
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Đỗ Thị Tuyên
TS. Đào Thị Mai Anh

HÀ NỘI - 2020


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đỗ Thị Tuyên – Trưởng
phòng công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam
và TS. Đào Thị Mai Anh - giảng viên Đại Học Dược Hà Nội. Hai cô là người
đã hướng dẫn tận tình, dìu dắt, dạy bảo tôi từ khi tôi bắt đầu làm đề tài và đã
hướng dẫn để tôi hoàn thành được luận văn này. Cô không chỉ trang bị cho tôi
những kiến thức và kinh nghiệm chuyên môn quý báu, mà còn luôn tạo điều
kiện để tôi có thể học hỏi không ngừng, phấn đấu hoàn thiện bản thân.
Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn tới TS.BS. Quách Xuân Hinh - Bệnh Viện
Quân Y Trung ương 108. Bác sĩ là người đã giúp đỡ tận tình cho tôi trong việc tổ
chức và tạo điều kiện cho việc lấy máu của một số dân tộc. Sự giúp đỡ quý báu
này đã hỗ trợ cho tôi hoàn thành nội dung nghiên cứu đề tài.
Tôi xin cảm ơn các cán bộ phòng công nghệ sinh học Enzym – Viện Công
Nghệ Sinh Học - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam, những
người đã tạo điều kiện và hỗ trợ tôi về trang thiết bị và kỹ thuật trong quá trinh
thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa sinh trường
Đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và
làm đề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, những

người luôn động viên tôi vượt qua khó khăn trong suốt chặng đường.
Hà Nôi, ngày tháng năm 2020
Học viên

Nghiêm Thị Thanh Nga


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Glucose-6-phosphat dehydrogenase ...................................................... 3
1.1.1. Danh pháp ........................................................................................ 3
1.1.2. Cấu trúc ............................................................................................ 3
1.1.3. Cơ chế hoạt động ............................................................................. 4
1.1.4. Vai trò của G6PD trong hồng cầu người ......................................... 5
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến G6PD ................................................... 6
1.2. Bệnh thiếu hụt G6PD ............................................................................ 7
1.2.1. Định nghĩa ....................................................................................... 7
1.2.2. Dịch tễ .............................................................................................. 8
1.2.3. Cơ sở di truyền học ........................................................................ 10
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh............................................................................ 12
1.2.5. Biểu hiện lâm sàng ....................................................................... 12
1.2.6. Phân loại ....................................................................................... 14
1.2.7. Điều trị và phòng bệnh .................................................................. 16
1.3 Các phương pháp xác định đột biến gen G6PD .................................... 16
1.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam .............................. 19

1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................ 19
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ................................................. 20
Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 21
2.1

Đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 21

2.1.1

Tiêu chuẩn lựa chọn .................................................................... 21


2.1.2

Tiêu chuẩn loại trừ ...................................................................... 21

2.1.3

Cỡ mẫu ........................................................................................ 21

2.1.4

Hóa chất ...................................................................................... 22

2.1.5

Thiết bị và dụng cụ ..................................................................... 24

2.2

Nội dung nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu .......................... 24

2.2.1 Nội dung nghiên cứu ...................................................................... 24
2.2.2. Các phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu đề tài .............. 26
2.3 Đạo đức nghiên cứu............................................................................... 33
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 35
3.1 Kết quả sàng lọc tình trạng thiếu hụt G6PD ở một số dân tộc phía Bắc
Việt Nam...................................................................................................... 35
3.1.1 Kết quả sàng lọc thiếu hụt G6PD bằng kĩ thuật tạo vòng Formazan
bán định lượng ......................................................................................... 35
3.1.2 Mức độ thiếu hụt enzym G6PD ở một số dân tộc xác định bằng
phương pháp đo hoạt độ enzym............................................................... 36
3.2 Phát hiện đột biến gen trong các trường hợp thiếu hụt G6PD bằng kĩ
thuật PCR- MPTP ........................................................................................ 37
3.2.1 PCR – MPTP tìm đột biến gen G6PD ............................................ 37
3.2.2. Kết quả đọc trình tự tìm đột biến gen G6PD ................................. 43
3.2.3. Phát hiện đột biến mới trên gen G6PD ở Việt Nam ...................... 46
Chƣơng 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 48
4.1. Về tình trạng thiếu hụt G6PD của một số dân tộc phía bắc Việt Nam 48
4.2. Về phát hiện đột biến gen trong các trường hợp thiếu hụt G6PD bằng kĩ
thuật PCR- MPTP ........................................................................................ 50
KẾT LUẬN .................................................................................................... 54
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ADN

deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

CI

Chlorfrom Isoamyl

Chlorfrom Isoamyl

dNTP

Deoxyribonucleotid triphosphate

Deoxyribonucleotid triphosphat

EDTA

Ethylen diamin tetraacetic acid

Axit etylenediaminetetraacetic

G6P

Glucose – 6 – phosphate

Glucose – 6 – phosphat

G6PD

Glucose - 6 - phosphate dehydrogenase Glucose–6–phosphat
dehydrogenase

GSH

Glutathion

Glutathion dạng khử

GSSG

Oxidized glutathione

Glutathion dạng oxi hóa

GPx

Glutathion peroxidase

Glutathion peroxidase

PCRMPTP

PCR using Multiplex Tandem forward PCR đa mồi xuôi song song

Primer

NADP+

Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate

NADP + dạng oxy hóa

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate dihydro

NADPH dạng khử

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại gen

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

mRNA

messenger RNA

ARN thông tin

WHO

World Health Orrganization

Tổ chức Y tế thế giới

EDTA

Ethylen diamin tetraacetic acid

Axit Ethylen diamin tetraacetic

TE

Tris EDTA

Tris EDTA

TBE

Tris borate EDTA

Tris borat EDTA

TAE

Tris acetate EDTA

Tris acetat EDTA


DANH MỤC BẢNG BIỂU
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1: Một số thuốc cần tránh cho bệnh nhân thiếu hụt G6PD

7

2

Bảng 1.2: Một số dạng đột biến phổ biến

11

3

Bảng 1.3: Phân loại thiếu hụt G6PD

15

4

Bảng 2.1: Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đề tài

22

5

Bảng 2.2: Bảng các dung dịch đệm trong nghiên cứu đề tài

23

6

Bảng 2.3: Các thiết bị và dụng cụ trong nghiên cứu

24

7

Bảng 2.4: Trình tự mồi của exon 2, 9 và exon 11-12 trên
gen G6PD

31

8

Bảng 2.5: Trình tự mồi của exon 2, 9 và exon 11-12 trên
gen G6PD d ng cho phản ứng PCR-MPTP

32

9

Bảng 3.1: Tỷ lệ thiếu hụt G6PD ở các dân tộc trong nghiên cứu

34

10

Bảng 3.2: Mức độ thiếu hụt G6PD ở các dân tộc trong nghiên
cứu

35

11

Bảng 3.3: Hoạt độ G6PD của các đối tượng có kết quả âm tính
và dương tính [++], [+++]

36

12

Bảng 3.4: Các dạng đột biến gen G6PD trên các exon 2, 9, 11,
12 trong nghiên cứu

41

13

Bảng 3.5: Các dạng đột biến gen G6PD trên một số dân tộc
trong nghiên cứu

41


DANH MỤC HÌNH VẼ
STT

Tên hình

Trang

1

Hình 1.1: Sự chuyển dạng cấu trúc của G6PD

3

2

Hình 1.2: Cấu trúc G6PD dạng dimer

4

3

Hình 1.3: Phản ứng Glucose-6-phosphate Dehydrogenase

5

4

Hình 1.4: Cơ chế phản ứng của G6PD

5

5

Hình 1.5: Vai trò của G6PD trong hồng cầu

6

6

Hình 1.6: Bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD trên thế giới

9

7

Hình 1.7: Vị trí nhiễm sắc thể X và phân bố đột biến tg trình tự
mã hóa gen G6PD

10

8

Hình 2.1: Nội dung nghiên cứu

25

9

Hình 2.2: Cơ chế phản ứng MTT tạo thành vòng Formazan

26

10

Hình 2.3: Nguyên tắc của phản ứng Formazan

26

11

Hình 2.4: Sản phẩm vòng Formazan trong khay 40 mẫu

28

12

Hình 3.1: Ảnh sản phẩm điện di ADN của PCR xác định exon 2
của 6 bệnh nhân thiếu hụt G6PD.

38

13

14
15

Hình 3.2: Kết quả sản phẩm điện di PCR- MPTP xác định đột
biến Gaohe của exon 2 ở các mẫu bệnh nhân thiếuhụt
G6PD
Hình 3.3: Sản phẩm điện di ADN của PCR trên exon 9 ở các
mẫu bệnh nhân thiếu hụt G6PD
Hình 3.4: Kết quả sản phẩm điện di PCR- MPTP xác định đột
biến Viangchan của exon 9 ở các mẫu bệnh nhân thiếu
hụt G6PD

38

39
39


16
17

18

Hình 3.5: Sản phẩm điện di ADN của PCR trên exon 11-12 của
những bệnh nhân thiếu hụt G6PD
Hình 3.6: Sản phẩm điện di PCR-MPTP xác định đột biến Silent
ở exon 12 (A) và exon 11 (B) ở các mẫu bệnh nhân
thiếu hụt G6PD
Hình 3.7: Kết quả đọc trình tự exon 2 ở người thiếu hụt G6PD

40
41

43

19

Hình 3.8 : Kết quả đọc trình tự exon 9 ở người thiếu hụt G6PD
không có đột biến

44

20

Hình 3.9: Kết quả đọc trình tự exon 9 ở người thiếu hụt G6PD
có đột biến Viangchan

45

21

Hình 3.10: Kết quả đọc trình tự exon 11-12 ở người thiếu hụt
G6PD có đột biến Silent

46

22

Hình 3.11: Kết quả đọc trình tự exon 11-12 ở mẫu người thiếu
hụt G6PD có đột biến Namoru

47


ĐẶT VẤN ĐỀ
Glucose - 6 - phosphat dehydrogenase là một enzym oxy hóa khử, đóng
vai trò then chốt trong quá trình chuyển hóa glucose theo con đường
hexose monophosphat trong hồng cầu. Con đường này tuy chỉ tạo ra năng
lượng không đáng kể nhưng lại đảm bảo hai chức năng quan trọng là cung
cấp ribose cho quá trình sinh tổng hợp acid nucleic và tạo ra NADPH, một
chất khử vô cùng quan trọng. Trong hồng cầu người, chất này tham gia
vào quá trình chống lại các tác nhân oxy hóa, loại bỏ H2O2, giúp bảo vệ
màng hồng cầu được bền vững, bảo vệ cấu trúc hemoglobin, cấu trúc các
enzym có trong hồng cầu để duy trì sự sống cho tế bào hồng cầu. Chính vì
vậy, khi cơ thể thiếu hụt enzym này, hồng cầu sẽ bị phá hủy khi gặp tác
nhân oxy hóa.
Thiếu hụt G6PD là bệnh lý enzym hồng cầu hay gặp nhất ở người đặc
biệt hay gặp ở những nhóm dân tộc sống trong vùng sốt rét lưu hành
[1,6,8]. Trên thế giới có hơn 400 triệu người mắc bệnh thiếu hụt G6PD
[65], chiếm 1/10 dân số thế giới [31]. Cơ sở di truyền học của bệnh thiếu
hụt G6PD là do đột biến xảy ra trên gen mã hóa G6PD. Gen này nằm trên
nhánh dài, v ng 2, băng 8 của nhiễm sắc thể giới tính X (Xq28), không có
alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y nên gặp nhiều ở nam hơn ở nữ. Với sự
phát triển của công nghệ sinh học, trình tự các exon hay toàn bộ trình tự
của gen G6PD đã được xác định, đồng thời bằng các phương pháp như
PCR, MPTP – PCR, giải trình tự…các đột biến mới của gen G6PD cũng
liên tục được tìm ra. Năm 2016 trên thế giới có 217 đột biến trong gen
G6PD được xác nhận trong đó có 31 đột biến là đột biến mới [28].
Trong số 54 nhóm dân tộc của Việt nam, tình trạng thiếu G6PD là
tương đối phổ biến ở các dân tộc đã được điều tra [1,6,7]. Nghiên cứu

G6PD ở mức độ phân tử tuy đã được bắt đầu nhưng còn chưa nhiều và
chưa hoàn chỉnh [34,46]. Việc bổ sung các dữ liệu về tần suất thiếu hụt
1


enzym G6PD và phát hiện đột biến mới, do đó là hết sức cần thiết. Chính
vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện đột biến gen gây thiếu hụt
glucose-6-phosphat dehydrogenase trong hồng cầu ngƣời ở một số dân
tộc phía Bắc Việt Nam” với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát tình trạng thiếu hụt G6PD trong hồng cầu người thuộc một
số dân tộc ở phía Bắc Việt Nam.
2. Phát hiện các đột biến gen trên exon 2, 9, 11, 12 ở các cá thể người
thiếu hụt G6PD.

2


Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1. Glucose-6-phosphat dehydrogenase
1.1.1. Danh pháp
Glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PD) là một enzym oxy hóa khử
nằm trong hệ thống enzym oxy hóa, có kí hiệu quốc tế là EC 1.1.1.49. Enzym
này còn có các tên gọi khác như: 6-phosphoglucose dehydrogenase, beta-Dglucose-6-phosphate; NADP oxidoreductase, Entner-Doudoroff enzym,
NADP-dependent glucose 6-phophate dehydrogenase… [65].
1.1.2. Cấu trúc
G6PD là một enzym có tính không đồng nhất và đa dạng phân tử. Bằng
phương pháp phân tích hóa sinh người ta đã mô tả có 442 dạng phân tử khác
nhau của enzym này. Tính không đồng nhất của G6PD thể hiện ở sự chuyển
dạng cấu trúc tùy thuộc vào điều kiện môi trường [30,40].
Dạng monomer của G6PD được cấu tạo từ chuỗi polypeptid gồm 515

acid amin, có khối lượng phân tử 59256 Daltons. Kết quả giải mã trình tự acid
amin của cả chuỗi cho thấy, tính đồng nhất của trình tự acid amin thay đổi
theo tùy từng v ng. V ng có tính đồng nhất cao được cho là vùng có chức
năng quan trọng. Ở người vùng này thuộc acid amin 188-291 [30].
Trong sự có mặt của NADP+ và nhóm –SH, hai phân tử monomer của
G6PD có thể trùng hợp với nhau để tạo thành dạng dimer. Đồng thời 2 phân
tử dimer cũng lại có thể tiếp tục trùng hợp với nhau để tạo thành dạng
tetramer. Sự chuyển dạng tetramer phụ thuộc vào pH môi trường và nồng độ
các cation hóa trị 2 (Hình 1.1). Kết quả trên vi ảnh điện tử chỉ ra rằng, dạng
tetramer chiếm ưu thế ở pH< 6, còn dạng dimer thì chiếm ưu thế ở pH > 8
[12,62].

Hình 1.1: Sự chuyển dạng cấu trúc của G6PD
3


Ở tế bào hồng cầu, dạng dimer và tetramer là 2 dạng hoạt động của
enzym, trong đó, dạng dimer chiếm ưu thế nhiều hơn [40].
Mỗi dimer có hai vị trí gắn NADP+, bao gồm NADP+ xúc tác và NADP+
cấu trúc. NADP+ xúc tác đóng vai trò là coenzym, tham gia vào hoạt động xúc
tác của enzym còn NADP+ cấu trúc có vai trò ổn định G6PD bằng việc ngăn
cản sự chuyển enzym ở dạng dimer thành dạng monomer không hoạt động
[30]. Tùy vào từng vị trí mà việc gắn NADP+ sẽ khác nhau: vị trí NADP+ cấu
trúc sẽ gắn chặt chẽ hơn so với NADP+ xúc tác (Hình 1.2). Có bốn acid amin
liên quan đến vị trí gắn NADP+ cấu trúc là: Cys 385, Lys 386, Arg 387, Arg
393. Acid amin liên quan đến vị trí gắn NADP+ xúc tác là Lys 47. Ngoài ra,
còn hai vị trí cũng liên quan đến việc gắn NADP+ nữa là acid amin 242-248
và 38 - 44.
Vị trí liên kết G6P là lysin 205. Acid amin này có vai trò quan trọng
trong việc chuyển điện tử khi phản ứng xảy ra [14].

Hình 1.2 Cấu trúc G6PD dạng dimer [28]
1.1.3. Cơ chế hoạt động
G6PD xúc tác cho phản ứng oxy hóa glucose-6-phosphat thành 6phosphogluconolacton (Hình 1.3).

4


Hình 1.3 Phản ứng Glucose-6-phosphate Dehydrogenase [66]
Cơ chế của phản ứng này được nghiên cứu kỹ nhất trên vi khuẩn
Leuconostoc mesenteroides. G6PD của vi khuẩn này sử dụng cặp electron tự
do của nguyên tử nitơ ở vòng imidazol của Histidin chuỗi bên như một tác
nhân ái nhân để tấn công carbon bán acetal số 1 của phân tử G6P. Nguyên tử
này từ dạng aldehyd sẽ bị oxi hóa thành este vòng là lacton. Điều này cho
phép chuyển 1 proton H+ từ vị trí C1 của G6P sang vị trí C4 của khung
nicotinamid của NADP+ và biến chất này thành NADPH (Hình 1.4) [66].

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng của G6PD [66]
Vì phân tử Histidin chuỗi bên này được bảo tồn trong trình tự G6PD ở
nhiều loài khác nhau nên cơ chế xúc tác mô tả ở trên có thể là cơ chế chung
cho tất cả các G6PD.
1.1.4. Vai trò của G6PD trong hồng cầu người
G6PD là enzym then chốt mở đầu và điều khiển tốc độ cho con đường
pentose phosphat (pentose phosphate pathway- PPP). Đây là con đường quan
5


trọng nhất cung cấp NADPH, nhân tố, đóng vai trò chính trong việc bảo vệ
hồng cầu chống lại tác nhân gây oxy hóa. Cụ thể là, NADPH hoạt động thông
qua phản ứng chuyển GSSG thành GSH với sự tham gia của enzym

glutathion reductase. GSH được tạo thành sẽ ngăn cản quá trình peroxid trong
hồng cầu, trực tiếp bảo vệ hồng cầu trước sự tấn công của các tác nhân oxy
hóa. Khi NADPH bị oxy hóa, GSSG bị khử thành GSH, NADPH sẽ chuyển
thành NADP + và G6PD tiếp tục hoạt động và khử NADP+ thành NADPH. Do
glutathione peroxidase (GPX) và catalase (Cat) loại bỏ peroxid khỏi các tế
bào hồng cầu bằng cách sử dụng GSH làm cơ chất, trong khi NADPH có vai
trò làm giảm GSSG bị oxy hóa (Hình 1.5) nên chuỗi phản ứng này tạo liên hệ
mật thiết với nhau để bảo vệ hồng cầu. Sự tương quan giữa hoạt độ G6PD với
độ bền vững của hồng cầu có quan hệ mật thiết với nhau [35].
Thiếu enzym G6PD có ảnh hưởng đến việc sản xuất NADPH mà biểu
hiện lâm sàng là hồng cầu dễ vỡ, nhất là khi dùng các thuốc oxy hóa.

Hình 1.5 Vai trò của G6PD trong hồng cầu [28]
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến G6PD
Hoạt độ enzym bị ảnh hưởng bởi các yếu tố liên quan đến môi trường
nhiệt độ, nồng độ cơ chất, đồng yếu tố, các sản phẩm, những hydrogen, các
cation kim loại...[5]:
6


Nhiệt độ: enzym bắt đầu biến tính nhẹ từ 40oC, đến 60oC thì hoạt tính
của enzym còn lại không đáng kể.
Độ pH: pH kiềm nhẹ sẽ làm cho nồng độ dạng dimer nhiều và enzym sẽ
hoạt động tốt nhất, bởi vậy có mặt một lượng nhỏ NaHCO3 sẽ giúp enzym
phản ứng tốt hơn. pH tối ưu của G6PD là 8,0.
Nồng độ của của các chất nội bào như cơ chất, các chất đồng yếu tố, chất
tạo thành cũng tuân theo quy luật của các phản ứng hoá học khác. Ion Mg2+ là
ion đặc hiệu cho hồng cầu người, với nồng độ 0,01 mol/l thì hoạt độ enzym là
100%, ion kim loại này đóng vai trò tạo phức hợp giữa enzym và cơ chất.
Khi ở ngoài cơ thể thì để đảm bảo cho enzym hoạt động được tốt thì vấn

đề bảo quản là hết sức quan trọng vì G6PD là một enzym rất nhạy cảm, không
bền vững, nhưng nếu hồng cầu được rửa và bảo quản nguyên vẹn trong dung
dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ lạnh (4oC) ngay sau 24h thì hoạt độ enzym chưa bị
thay đổi. Trái lại chỉ bảo quản theo tiêu chuẩn trữ máu ở 20o C thì sau 24h sẽ
giảm 17% hoạt tính [5].
1.2. Bệnh thiếu hụt G6PD
1.2.1. Định nghĩa
Thiếu hụt G6PD là một bệnh lý di truyền làm suy giảm hoạt động của
enzym G6PD trong hồng cầu. Sự suy giảm enzym quan trọng này khiến cho
hồng cầu dễ bị phá hủy có thể dẫn tới tình trạng thiếu máu tan huyết đặc biệt
là sau khi bệnh nhân ăn một số loại thực phẩm và thuốc.
Danh sách các thuốc thông thường có thể gây thiếu máu tan huyết ở
bệnh nhân thiếu hụt G6PD được trình bày trong bảng 1.1 [67]
Bảng 1.1: Một số thuốc cần tránh với bệnh nhân thiếu hụt G6PD
Thuốc giảm đau, hạ sốt, chốngviêm
 Acetanilid

 Phenothiazine derivatives

 Acetaphenetidin

 Senemid

 Aminopyrine

 Fenamic acid

7

 Aspirin

 Antazoline
Thuốc tim mạch

 Procainamide

 Quinidin
Thuốc kháng khuẩn

 Streptomycin

 Sulfapyridin

 Sulfacetamid,

 Sulfacytin

 Sulfanilamid,



 Sulfisoxazol,

 Ulfaguanidin

 Trimethoprim



Sulfadiazin

Sulfamethoxazol

Thuốc chống sôt rét
 Prinaquin

 Qamaquin

 Pentaquin

 Quinidin

 Chloroquin

 Quinin

1.2.2. Dịch tễ
1.2.2.1. Trên thế giới
Trên thế giới, các nghiên cứu được lựa chọn từ năm 1960 trở lại đây đã
thống kê tỷ lệ thiếu hụt G6PD khoảng 10%, tương ứng với 88 quốc gia. Tần
suất thiếu hụt G6PD khác nhau rất nhiều theo từng v ng dân cư và lãnh thổ.
Tỷ lệ cao nhất đươc thống kê là ở Châu Phi, Châu Á, Địa Trung Hải và Trung
Đông [26,52] (Hình 1.6).

8


Hình 1.6: Bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD trên thế giới [28]
Các đột biến G6PD thường được phân loại theo mức độ nghiêm trọng

của sự thiếu hụt G6PD đi kèm với hoạt động của enzym và thông số huyết
học của bệnh nhân, từ các biểu hiện nghiêm trọng nhất với hoạt động G6PD
còn lại dưới 5% (lớp I) đến dạng nhẹ nhất (lớp V) [28]. Độ thiếu hụt này phân
bố không đồng đều giữa các quốc gia, với tần suất từ 2% đến 20% ở Hy Lạp,
Thổ Nhĩ Kỳ và Ý; nhưng tăng tới 70% trong các nhóm người Do Thái người
Kurd [26]. Ở châu Mỹ Latinh (LA), tỷ lệ thiếu hụt G6PD thấp hơn so với các
khu vực khác như châu Phi cận Sahara hoặc châu Á [35,44]. Sự thiếu hụt
G6PD ở LA thay đổi đáng kể từ vùng này sang vùng khác ngay cả trong cùng
một quốc gia. Sự khác biệt này có thể là do sự không đồng nhất di truyền giữa
các quần thể cũng như các phương pháp chẩn đoán được sử dụng trong mỗi
nghiên cứu. Các nghiên cứu cũng cho thấy sự thiếu hụt G6PD thường gặp ở
nam nhiều hơn nữ [37,45,58]. Tại Hoa Kỳ, sự thiếu hụt này chủ yếu ảnh
hưởng đến nam giới có nguồn gốc dân tộc châu Phi và Địa Trung Hải, với tỷ
lệ mắc khoảng 10% [26].
Khu vực Châu Á cũng là nơi có tỷ lệ thiếu hụt được dự đoán khá cao. Khu
vực miền trung Châu Á và Đông Nam Á có tỉ lệ mắc lớn hơn 20% : chủ yếu là
ở các khu vực phía đông Ấn Độ, dọc biên giới phía bắc Lào- Thái Lan và phần
9


lớn ở quần đảo Solomon. Tỉ lệ nhiễm ở các khu vực trong cùng một quốc gia
cũng không đồng nhất : đối với Lào tỉ lệ 1%-23%, Indonesia từ 0-15% [28]
1.2.2.2. Ở Việt Nam
Theo bản đồ phân bố bệnh thiếu hụt G6PD của WHO, Việt Nam nằm
trong vùng có tỉ lệ này dao động 0,5 - 30% [6,36]. Theo nghiên cứu của tác
giả Đoàn Hạnh Nhân và cộng sự: thiếu G6PD có tỉ lệ cao tại một số vùng sốt
rét lưu hành như Kim Bôi (34,1%); Mai Châu (20,4%); Như Xuân (19,7%);
Mường La (17,8%) và thấp tại một số vùng không có sốt rét lưu hành như
Mèo Vạc (5,3%) và Nga Sơn (0,5%) [6]. Theo nghiên cứu của Trần Thị
Chính, Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự tỷ lệ thiếu hụt là 1,75% ở người

Kinh Hà Nội và quanh Hà Nội [1]; ở các tỉnh phía Nam theo nghiên cứu của
Nguyễn Thị Ngọc Phượng tỉ lệ này là 5,5% [8].
1.2.3. Cơ sở di truyền học
1.2.3.1. Gen mã hóa
Ở người, gen mã hóa cho G6PD nằm ở nhánh dài của nhiễm sắc thể X
vị trí v ng 2 băng 8 (dải Xq28) [11,41,55]. Vùng này gắn với rất nhiều nhóm
gen khác nhau như: gen mã hóa hội chứng nhiễm sắc thể X, hemophillia A,
nhìn màu....( Hình 1.7).

Hình 1.7 Vị trí trên nhiễm sắc thể X và phân bố đột biến trong trình tự
mã hóa gen G6PD [28]
10


Gen này có kích thước 18,5 Kb, bao gồm 13 exon và 12 intron. Exon
13 dài khoảng 800 nucleotid và chứa một bộ ba mã kết thúc [14]. Vùng mã
hóa protein được chia thành 12 phân đoạn, có kích thước từ 12 đến 236 bp
[58]. Exon đầu tiên không chứa chuỗi mã hóa. Intron 2 giữa exon 2 và 3 có
kích thước dài nhất tới 9,857 bp. mARN của G6PD gồm 2269 nucleotid
tương ứng 2,4kb. Cũng như những gen khác, 600 bp đầu tiên của vị trí đầu 5’
tương ứng với exon 1 và một phần của exon 2 không làm nhiệm vụ mã hóa do
đó bộ ba mã hóa khởi đầu ATG nằm ở vị trí 127 bp của exon 2. Đây là một
vùng giàu guanin và cytosin (CpG) với mức độ cao (80%). Vùng CpG này
được bảo tồn ở người và chuột [11,59].
1.2.3.2. Các loại đột biến G6PD
Có 450 đột biến G6PD đã được xác định dựa vào động học enzym, đặc
điểm hóa lý và các thông số khác [11,24,41]. Gần 300 đột biến trong số này
đã được Tổ chức Y tế Thế giới xác nhận. Hầu hết các biến thể này là biến thể
điểm có ảnh hưởng đến các khiếm khuyết trong cấu trúc enzym làm thay đổi
hoạt động, mất ổn định của enzym hoặc giảm ái lực của enzym đối với cơ

chất của nó [42]. Một số dạng đột biến phổ biến được tóm tắt trong bảng 1.2
Bảng 1.2. Một số dạng đột biến phổ biến
Đột biến

Thay thế

Vị trí

Axit amin

nucleotide

mã

thay thế

cDNA

hóa

Exon

Nguồn

TLTK

gốc

Đột biến đơn
Việt Nam 1

7G> A

3

Glu → Lys

2

Việt Nam

[34]

Bahia

197T> A

66

Phe → Thr

4

Brazil

[52]

Việt Nam 2

197T> G

66

Phe → Cys

4

Việt Nam

[34]

Tunis

920A> C

307

Glu → Pro

9

Tunisia

[23]

11


Nefza

968T> C

323

Leu → Pro

9

Tunisia

Karachi

973G> A

325

Asp → Asn

9

Pakistan

[51]

Tennessee

1465C> G

422

Leu → Val

10

Hoa Kỳ

[50]

9, 11

Thailand

[53]

7

Italy

[57]

[23]

Đột biến nhiều điểm
Viangchan +

871G > A

291

Val → Met

Union

1360C > T

454

Arg → Cys

Palemo

769> A

257

Arg Met

770G>T
1.2.4. Cơ chế bệnh sinh
Thiếu hụt G6PD là bệnh di truyền gen lặn liên kết với giới tính, nằm
trên nhiễm sắc thể X, không có alen tương ứng trên nhiễm sắc thể Y. Nữ là
người mang gen bệnh và truyền cho con trai. Người nữ dị hợp tử mang gen
đột biến sẽ có kiểu bình thường hoặc thiếu hụt G6PD từ nhẹ đến trung bình,
hiếm khi thiếu hụt enzym nặng. Nguyên nhân là do sự bất hoạt nhiễm sắc thể
X trong tế bào nữ từ giai đoạn sớm của quá trình phát triển của phôi. Sau đó,
theo sự phân bào nó được nhân lên tạo thành dạng khảm giữa tế bào có nhiễm
sắc thể lành và mang bệnh với các tỷ lệ khác nhau. Vì vậy, những người này
có hai quần thể hồng cầu: một nhóm hồng cầu bình thường và một nhóm thiếu
G6PD. Người nữ đồng hợp tử gen đột biến hiếm gặp. Người nam chỉ cần
mang một gen đột biến là đã thể hiện sự thiếu hụt G6PD. Do đó, tỉ lệ trẻ nam

được phát hiện bệnh cao hơn trẻ nữ.
1.2.5. Biểu hiện lâm sàng
1.2.5.1. Biểu hiện lâm sàng
Khác với các nguyên nhân gây thiếu máu tan máu khác, những người bị
thiếu hụt G6PD thường không biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Chỉ khi tiếp
xúc với tác nhân oxy hoá, triệu chứng lâm sàng thường thể hiện chủ yếu là

12


những cơn tan máu. Tuỳ thuộc vào loại đột biến mà hoạt độ G6PD của người
bệnh khác nhau, cùng với tính chất của từng tác nhân oxi hóa và các bệnh di
truyền đồng thời khác mà các triệu chứng lâm sàng khác nhau.
- Do dùng thuốc: Ở một số người thiếu máu tan máu có thể liên quan
từ việc sử dụng thuốc, mặc dù không phải là tình trạng tan máu vĩnh viễn. Tán
huyết do thuốc là tác dụng gây bệnh đầu tiên và được biết đến nhiều nhất khi
thiếu G6PD. Triệu chứng tan máu dẫn đến tan máu thường xảy ra vào ngày
thứ 2, 3 sau khi dùng thuốc. Trong tan huyết nặng, bệnh nhân có thể gặp phải
các triệu chứng về đau lưng và dạ dày và nước tiểu chuyển sang màu tối...[18]
- Tan máu trong bệnh đái tháo đường: giai đoạn bắt đầu nhiễm toan đái
tháo đường có thể dẫn đến tan máu ở những người thiếu G6PD [18].
- Do nhiễm trùng: Nhiễm trùng có lẽ là nguyên nhân phổ biến nhất của
tan huyết ở những người bị thiếu G6PD. Có rất nhiều báo cáo về tầm quan
trọng của nhiễm trùng trong việc gây thiếu máu tan huyết. Một số lượng lớn
các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, virus và rickettsia đã được báo cáo là yếu
tố ảnh hưởng. Viêm gan truyền nhiễm (viêm gan A), viêm phổi và sốt thương
hàn được biết là gây ra tan máu. Liên quan đến đường hô hấp trên và hệ tiêu
hóa, nhiễm virus đã được báo cáo là nguyên nhân gây tan máu nặng hơn [43]
- Vàng da sơ sinh: Một trong những hậu quả đe dọa nhất của thiếu
G6PD là vàng da sơ sinh [18]. Vàng da ở trẻ bị thiếu men G6PD có thể nhẹ

hoặc nặng đến mức gây ra bệnh Kernicterus, một loại bại não co cứng và
thậm chí có thể gây tử vong [43]. Vàng da sơ sinh có hai loại là sinh lý và
bệnh lý. Vàng da sinh lý thường diễn ra trong ba ngày đầu và kết thúc tối đa
là 10 ngày, mức độ vàng da nhẹ. Vàng da bệnh lý xuất hiện khi nồng độ
bilirubin trong máu cao hơn 20mg/dl.
- Hội chứng Favism (Luzzatto, 2001) [18,43]: là bệnh lý thiếu máu đã
được biết đến từ thời kì Pythagoras, khi đó người ta nhận thấy rằng việc ăn
đậu fava sau khoảng 24 giờ thì xuất hiện tình trạng tan máu, có khi rất dữ dội.
Sau đó thì cũng có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng tình trạng này có liên quan
13


đến thiếu hụt G6PD. Trong đậu Fava thành phần liên quan trực tiếp gây ra
hiện tượng tan máu là glucosidevicin và dividin. Aglycon của chúng được
thay thế bởi prymidin đến tổn thương oxi hóa cho xu hướng oxi hóa tự phát ở
những bệnh nhân này thường thấy Hemoglobin niệu trong vài ngày. Bệnh
nhân có thiếu máu cấp: da xanh, niêm mạc nhợt, nhịp tim nhanh, gan, lách có thể
to. Trường hợp nặng có thể suy tim, suy thận. Ngoài ra hiện tượng tan máu còn
được biết đến sau khi bệnh nhân sử dụng một số loại thức ăn có tính oxi hóa cao
như long não, rượu vang đỏ, các sản phẩm từ đậu tương, đậu nành.
1.2.5.2. Cận lâm sàng
Lúc khởi phát cơn tan máu cấp: hemboglobin giảm nhanh
Nếu tan máu nặng: Hb được giải phóng ồ ạt, không chuyển hóa kịp,
Hemoglobin tự do có thể xuất hiện trong huyết tương và trong nước tiểu,
hồng cầu giảm hồng cầu lưới tăng.
Khi soi hồng cầu không nhuộm thì phát hiện được thể Heinz
Hoạt độ enzym G6PD giảm.
Tuy nhiên sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn luôn rõ ràng.
1.2.5.3. Chẩn đoán
Thiếu G6PD cần được xem xét thông qua dịch tễ và tiền sử: vùng có tỉ lệ

thiếu hụt G6PD, vùng có sốt rét lưu hành; tiền sử vàng da, thiếu máu cấp hoặc
mạn tính; các triệu chứng lâm sàng xuất hiện sau khi dùng các thuốc hoặc các
thực phẩm có tính oxi hóa mạnh.
Việc chẩn đoán xác định sẽ dựa vào việc đánh giá thiếu hụt G6PD bằng
phương pháp định tính, bán định lượng hay định lượng. Ngoài ra có thể sử
dụng kĩ thuật phân tích gen để phát hiện nguyên nhân, dạng đột biến gen từ
đó có thể hướng tới dự phòng và tiên lượng.
1.2.6. Phân loại
Dựa vào hoạt độ của enzym trong hồng cầu và những biểu hiện lâm
sàng của chúng, WHO đã chia các biến thể của thiếu hụt G6PD thành 5 lớp
(Bảng 1.3) [15]:

14


Bảng 1.3 : Phân loại thiếu hụt G6PD
Lớp
I

Hoạt độ enzym và một số biệu hiện lâm sàng
Hoạt độ enzym < 1% (Thiếu enzym nặng với biểu hiện thiếu máu
tan máu hồng cầu hình không tròn mạn tính.)

II

Hoạt độ enzym < 10% so với bình thường (thiếu G6PD nặng)

III

Hoạt độ enzym từ 10-60% so với bình thường (thiếu G6PD từ nhẹ

đến vừa)

IV

Hoạt độ enzym từ 60-90% so với bình thường (: thiếu rất nhẹ, không
có triệu chứng lâm sàng)

V

Hoạt độ tăng > 110% ( Không có triệu chứng lâm sàng)
Cụ thể là:
Lớp I bao gồm thiếu máu tan huyết không đặc hiệu mãn tính với thiếu

hụt enzym nghiêm trọng. Một số biến thể thuộc lớp I như: G6PD Minnesota,
G6PD Tokyo, G6PD Campinas.
Các đột biến lớp II bị thiếu hụt enzym nghiêm trọng, không bị thiếu
máu tan huyết không đặc hiệu mãn tính: G6PD Mediterrian, G6PD Canton,
G6PD Union, G6PD Kaiping.
Các đột biến loại III bao gồm thiếu hụt enzym trung bình hoặc nhẹ, với
hoạt động ở mức 10-60% G6PD B +: G6PD Aˉ.
Các đột biến lớp IV có sự thiếu hụt hoặc không, có enzym hoạt động là
60-90%: G6PD A +.
Các đột biến lớp V đã tăng hoạt động của enzym: G6PD Hektoen [20].
Tuy nhiên sự phân biệt giữa các lớp này không phải luôn rõ ràng. Một
vài đột biến được liệt kê trong lớp một do chúng gây ra những rối loạn chức
năng nghiêm trọng, nhưng nếu xét về mặt hoạt độ enzym in vitro thì thậm chí
lại cao hơn một số biến thể lớp III [15,47].

15

1.2.7. Điều trị và phòng bệnh
1.2.7.1. Điều trị
Chủ yếu là phòng bệnh để không xảy ra các triệu chứng. Với các bệnh
nhân đã biết trước thiếu hụt G6PD cần tránh những thực phẩm và thuốc có
tính oxy hóa. Với những bệnh nhân khi có chỉ định dùng những loại thuốc có
tính chất oxy hóa (primaquin, aspirin...) cần xét nghiệm enzym G6PD trước
khi dùng, cần theo dôi tình trạng tan máu, các triệu chứng như : nước tiểu sẫm
màu, vàng da, thiếu máu…
Khi tan máu xảy ra cần ngưng d ng thuốc, nếu tình trạng thiếu máu do
tan máu nặng cần được truyền máu, lưu ý không d ng những loại thiếu máu
G6PD.
1.2.7.2. Phòng bệnh
Tùy vào từng tình trạng mà việc phòng bệnh cũng khác nhau :
Trường hợp những bệnh nhân đang có biểu hiện tan máu cần theo dõi
chặt chẽ tránh các biến chứng có thể xảy ra : vàng da, suy thận....
Trường hợp những bệnh nhân khi có chỉ định dùng thuốc có tính oxy
hóa (aspirin, primaquinin...) cần thận trọng, nếu có dấu hiệu tan máu cần được
xét nghiệm G6PD.
Trường hợp những bệnh có tiền sử thiếu hụt G6PD thì cần tránh những
thực phẩm và thuốc có tính chất oxy hóa.
1.3 Các phƣơng pháp xác định đột biến gen G6PD
Hiện nay có rất nhiều phương pháp xác định biến thể ở gen G6PD.
Bao gồm: giải trình tự gen, phương pháp ARMS-PCR, phương pháp MPTPPCR…

16