tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 1 methyl 1h indazol 6 amin

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG HUY HIỆU

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT
SỐ DẪN CHẤT
1-METHYL-1H-INDAZOL-6-AMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2019


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG HUY HIỆU
Mã sinh viên: 1401226

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ
DẪN CHẤT
1-METHYL-1H-INDAZOL-6-AMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. ThS. Ngô Xuân Hoàng
2. TS. Trần Phương Thảo
Nơi thực hiện:

1. Bộ môn Hóa Hữu cơ
2. Bộ môn Hóa dược

HÀ NỘI - 2019


Lời cảm ơn
Với tất cả lòng biết ơn và sự kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất
tới ThS. Ngô Xuân Hoàng – Bộ môn Hóa Hữu cơ và TS. Trần Phương Thảo – Bộ
môn Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội. Đây là những người thầy đã luôn tận
tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp tôi xây những viên gạch đầu tiên trên con đường nghiên
cứu khoa học. Bằng tâm huyết của mình, thầy cô đã tiếp lửa và truyền cảm hứng để tôi
có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Văn Thị Mỹ Huệ, ThS. Hoàng Thu Trang,
CN. Dương Văn Diễn cùng các thầy cô giảng viên và kỹ thuật viên thuộc Bộ môn Hóa
Hữu cơ và Bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Dược Hà Nội. Các thầy cô đã giúp đỡ và
tạo điều kiện tốt nhất cả về cơ sở vật chất và tinh thần để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Trường Đại học Dược Hà Nội vì luôn
tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới DS. Dương Tiến Anh và em Nguyễn Đình
Trung Dũng vì những gợi ý quý báu cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.
Lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn dành cho gia đình, bạn bè và các em trong nhóm
nghiên cứu tại bộ môn Hóa Hữu cơ, đặc biệt là các bạn Nguyễn Việt Hà, Nguyễn Công
Hòa Cường, Phạm Kim Tuyến, các em Nguyễn Minh Hường, Nguyễn Khánh Linh,
Cao Quỳnh Anh và Lê Việt Anh. Gia đình và bạn bè là hậu phương vững chắc nhất để
tôi có thể toàn tâm thực hiện đề tài này.
Mọi ngôn từ đều không thể diễn tả hết lòng biết ơn của tôi tới những người đã
giúp đỡ tôi trong cả quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này!
Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2019
Sinh viên

Phùng Huy Hiệu


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................1
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của dẫn chất indazol ........................................... 3
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của dẫn chất indazol trên các đích khác nhau
.................................................................................................................................. 3
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol trên các
đích khác nhau .......................................................................................................... 7
Một số phản ứng liên quan đến tổng hợp dẫn chất indazol .................................. 9
Các phản ứng hóa học cơ bản ......................................................................... 9
Các phương pháp tổng hợp dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol...................... 12

Nguyên vật liệu, thiết bị ...................................................................................... 15
Nguyên liệu nghiên cứu ................................................................................ 15
Thiết bị nghiên cứu ....................................................................................... 16
Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 17
Tổng hợp hóa học ......................................................................................... 17
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro ................................................. 17
Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 17
Tổng hợp hóa học ......................................................................................... 17
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro ................................................. 18
Hóa học ............................................................................................................... 20

Tổng hợp hóa học ......................................................................................... 20
Kiểm tra độ tinh khiết ................................................................................... 27
Khẳng định cấu trúc ...................................................................................... 29
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro ....................................................... 33


Về tổng hợp hóa học ........................................................................................... 35
Phản ứng tổng hợp chất II ............................................................................ 35
Phản ứng tổng hợp chất III........................................................................... 36
Phản ứng tổng hợp các dẫn chất Va-f........................................................... 37
Về khẳng định cấu trúc ....................................................................................... 37
Phổ hồng ngoại (IR)...................................................................................... 37
Phổ khối lượng (MS) .................................................................................... 38
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) ........................................... 39
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) ............................................... 41
Về thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro ................................................... 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon
(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

1

H-NMR

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
(Proton nuclear magnetic resonance)

A549

: Dòng tế bào ung thư phổi

AcOH

: Acid acetic

AKSci

: Công ty AK Scientific

Ar

: Aryl

CTPT

: Công thức phân tử

δ (ppm)

: Độ chuyển dịch hóa học (phần triệu)

d

: Doublet

DCM

: Dicloromethan

DMA

: Dimethylacetamid

DMEM

: Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMF

: N,N-dimethylformamid

DMSO

: Dimethylsulfoxid

EC50

: Nồng độ có tác dụng với 50% cá thể (50% Effective concentration)

EGFR

: Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì

EtOAc

: Ethyl acetat

EtOH

: Ethanol

FBS

: Huyết thanh bò chửa

FDA

: Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

GI50

: Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư

HCT116

: Dòng tế bào ung thư đại trực tràng

HDAC

: Histon deacetylase

IC50

: Nồng độ ức chế 50% (Half maximal inhibitory concentration)

IDO1

: Indoleamin 2,3-dioxygenase 1

IR

: Hồng ngoại (Infrared)

J

: Hằng số tương tác spin-spin

Krn

: Các chất chuyển hóa của Trp qua con đường kynurenin


m

: Multiplet

MDA-MB-231

: Dòng tế bào ung thư vú

Me

: Methyl (-CH3)

MeOH

: Methanol

MS

: Phổ khối lượng (Mass spectrometry)

Rf

: Hệ số lưu giữ trong sắc kí lớp mỏng

RPMI

: Môi trường nuôi cấy tế bào RPMI 1640

s

: Singlet

SK-HEP-1

: Dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan

SNU-638

: Dòng tế bào ung thư dạ dày

SRB

: Phương pháp Sulforhodamin B

t

: Triplet

Tonc

: Nhiệt độ nóng chảy

THF

: Tetrahydrofuran

TLC

: Sắc kí lớp mỏng (Thin layer chromatography)

TMS

: Tetramethylsilan

Treg

: Tế bào T ức chế

Trp

: Tryptophan

TT

: Thứ tự

UV

: Tử ngoại (Ultraviolet)

VEGFR

: Thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu

WHO

: Tổ chức Y tế Thế giới


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu .......................................................15
Bảng 3.1. Các nguyên liệu IVa-f ..................................................................................20
Bảng 3.2. Thông số cảm quan và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất Va-f ......................27
Bảng 3.3. Thông số nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf của các dẫn chất Va-f ................28
Bảng 3.4. Số liệu phổ hồng ngoại của các dẫn chất Va-f .............................................29
Bảng 3.5. Số liệu phổ khối lượng của các dẫn chất Va-f..............................................30
Bảng 3.6. Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của các dẫn chất Va-f
.......................................................................................................................................31

Bảng 3.7. Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của các dẫn chất Va-f ........32
Bảng 3.8. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các dẫn chất Va-f .33


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1. Các đồng phân của vòng indazol ....................................................................2
Hình 1.2. Các hợp chất indazol trong tự nhiên ............................................................... 2
Hình 1.3. Một số thuốc mang cấu trúc indazol ............................................................... 3
Hình 1.4. Dẫn chất indazol ức chế EGFR.......................................................................4
Hình 1.5. Dẫn chất indazol ức chế nhiều tyrosin kinases khác nhau.............................. 4
Hình 1.6. Các dẫn chất indazol ức chế ERK1/2 ............................................................. 5
Hình 1.7. Cơ chế lẩn tránh miễn dịch của tế bào ung thư thông qua IDO1 ...................6
Hình 1.8. Các dẫn chất indazol ức chế IDO1 .................................................................6
Hình 1.9. Cấu trúc của pazopanib ...................................................................................7
Hình 1.10. Dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế đồng thời VEGFR và HDAC ......8
Hình 1.11. Dẫn chất indazol với nhóm thế amin ở vị trí số 6 ức chế EGFR ..................8
Hình 1.12. Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế PLK4 .....................................9
Hình 1.13. Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế IDO1 .....................................9
Hình 4.1. Phổ hồng ngoại của hợp chất Vf ...................................................................38
Hình 4.2. Phổ khối lượng của hợp chất Vf ...................................................................39
Hình 4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) của hợp chất Vf .................41
Hình 4.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) của hợp chất Vf .....................42


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1. Sơ đồ phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffmann ...............................................10
Sơ đồ 1.2. Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm bằng sắt trong môi trường acid ..........10
Sơ đồ 1.3. Phản ứng amin hóa khử ...............................................................................11

Sơ đồ 1.4. Giai đoạn tạo hợp chất trung gian imin .......................................................12
Sơ đồ 1.5. Giai đoạn khử hóa tạo sản phẩm amin .........................................................12
Sơ đồ 1.6. Tổng hợp 1-methyl-1H-indazol-6-amin bằng tác nhân khử hóa hóa học ...13
Sơ đồ 1.7. Tổng hợp 1-methyl-1H-indazol-6-amin bằng khí H2 với xúc tác Pd/C ......13
Sơ đồ 1.8. Tổng hợp dẫn chất indazol có nhóm amin bậc 2 ở vị trí số 6 ......................13
Sơ đồ 1.9. Tổng hợp dẫn chất indazol có nhóm sulfonamid ở vị trí số 6 .....................14
Sơ đồ 3.1. Quy trình tổng hợp chung ............................................................................20
Sơ đồ 3.2. Quy trình tổng hợp chất II ...........................................................................20
Sơ đồ 3.3. Quy trình tổng hợp chất III .........................................................................21
Sơ đồ 3.4. Quy trình tổng hợp chất Va .........................................................................22
Sơ đồ 3.5. Quy trình tổng hợp chất Vb .........................................................................23
Sơ đồ 3.6. Quy trình tổng hợp chất Vc .........................................................................24
Sơ đồ 3.7. Quy trình tổng hợp chất Vd .........................................................................25
Sơ đồ 3.8. Quy trình tổng hợp chất Ve .........................................................................25
Sơ đồ 3.9. Quy trình tổng hợp chất Vf ..........................................................................26
Sơ đồ 4.1. Cơ chế phản ứng tổng hợp chất II ............................................................... 35
Sơ đồ 4.2. Cơ chế phản ứng tổng hợp chất Va-f........................................................... 37


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là một nhóm các bệnh lý đặc trưng bởi sự phân chia mất kiểm soát của
tế bào, dẫn tới xâm lấn các tổ chức xung quanh hay di trú đến nhiều cơ quan khác nhau.
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong
thứ hai trên toàn thế giới, cướp đi sinh mạng của 9,6 triệu người chỉ trong năm 2018
[45]. Tại Việt Nam, số ca mắc mới ung thư tăng rất nhanh, từ 68.000 ca năm 2000 lên
125.000 năm 2012 [44]. Năm 2018, số ca mắc mới tăng lên gần 165.000 ca/96,5 triệu
dân, trong đó gần 70% trường hợp tử vong, tương đương 115.000 ca [43].
Hiện nay đã có nhiều thuốc điều trị ung thư có mặt trên thị trường, cũng như một
số hợp chất đang trong thử nghiệm lâm sàng. Tuy nhiên, với tốc độ phát triển ngày càng
nhanh của bệnh ung thư thì việc tìm kiếm các thuốc kháng ung thư mới vẫn là một thách

thức không nhỏ đối với các nhà khoa học. Do đó, một trong những bước đi cấp thiết để
giảm thiểu những gánh nặng do ung thư gây ra là tìm ra các liệu pháp điều trị và các
thuốc chống ung thư mới có hiệu quả.
Indazol là một nhóm các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học phong phú như
kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống trầm cảm, chống buồn nôn và nôn, kháng
tế bào ung thư [31], [36], [38]. Dẫn chất indazol có khả năng tương tác với nhiều phân
tử đích khác nhau liên quan tới sự phát sinh ung thư [33]. Đặc biệt, các dẫn chất ở vị trí
số 6 của indazol đã cho thấy hoạt tính chống ung thư rất tốt với các cơ chế đa dạng, tác
động lên nhiều đích phân tử của nhiều bệnh ung thư khác nhau [16], [17], [34], [37],
[41]. Điều này đã đưa các dẫn chất này trở thành những chất dẫn đường đầy tiềm năng
để tổng hợp các hợp chất mới có hiệu quả trong điều trị ung thư.
Trên cơ sở đó, nhằm mục đích tìm kiếm và phát triển thêm các hợp chất có hoạt
tính kháng ung thư mạnh, đồng thời góp phần làm phong phú thêm thư viện hợp chất
indazol trên thế giới, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử tác dụng
kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 1-methyl-1H-indazol-6-amin” với hai
mục tiêu:
1. Tổng hợp một số dẫn chất 1-methyl-1H-indazol-6-amin
2. Thử độc tính tế bào của các chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung
thư.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Indazol là một hệ dị vòng ngưng tụ giữa vòng pyrazol và vòng benzen. Đây là
một trong những dị vòng chứa nitơ được khai thác nhiều nhất trong thiết kế phân tử
thuốc nhờ các ứng dụng phong phú của chúng trong lĩnh vực hóa học và dược phẩm
[42]. Nhân indazol có thể tồn tại ở 2 đồng phân là 1H-indazol và 2H-indazol do sự
chuyển vị của proton giữa hai nguyên tử nitơ ở vị trí số 1 và 2 (Hình 1.1). Trong đó,
dạng 1H-indazol là dạng chiếm ưu thế do bền hơn về mặt nhiệt động học [3].

Hình 1.1. Các đồng phân của vòng indazol
Dẫn chất của indazol rất hiếm gặp trong tự nhiên. Chỉ một số ít alkaloid từ thực
vật có sự hiện diện của dị vòng này. Một số ví dụ về dẫn chất indazol trong tự nhiên như
Nigellicin và Nigellidin được phân lập từ Nigella sativa, Nigeglanin phân lập từ Nigella
glandulifera (Hình 1.2) [13].

Hình 1.2. Các hợp chất indazol trong tự nhiên
Các hợp chất mang khung indazol có nhiều hoạt tính sinh học đa dạng như kháng
khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống loạn nhịp, kháng HIV, kháng tế bào ung thư [42].
Vì vậy, các hợp chất indazol thường xuyên được sử dụng làm nguyên liệu cho các phản
ứng tổng hợp và có mặt trong cấu trúc của nhiều phân tử thuốc (Hình 1.3). Ví dụ,
niraparib đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư buồng trứng, ưng thư ống dẫn
trứng, ung thư phúc mạc nguyên phát, ung thư vú và tuyến tiền liệt [29]. Granisetron là
chất đối kháng thụ thể serotonin 5-HT3 và được sử dụng để điều trị các triệu chứng buồn

2


nôn và nôn do hóa trị liệu ung thư [38]. Bendazac và benzydamin là các thuốc chống
viêm thuộc nhóm NSAID dùng trong điều trị đục thủy tinh thể [31].

Hình 1.3. Một số thuốc mang cấu trúc indazol
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của dẫn chất indazol
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của dẫn chất indazol trên các đích khác nhau
Các dẫn chất indazol ức chế các enzym tyrosin kinases
Tyrosin kinases là một họ enzym tham gia vào quá trình vận chuyển gốc phosphat
từ phân tử ATP đến acid amin tyrosin của các protein đích. Chúng tham gia điều hòa
quá trình sinh trưởng, chuyển hóa, phân chia và tồn tại của tế bào. Đột biến di truyền ở
các enzym này làm chúng gia tăng quá mức về số lượng và có khả năng tự kích hoạt

trong tế bào, dẫn đến sự tăng trưởng và phân chia mất kiểm soát của các tế bào liên quan
[24]. Đây là tiền đề của việc hình thành các tế bào ung thư. Do đó, tyrosin kinases đã
trở thành một trong những đích phân tử chính trong điều trị ung thư [11]. Trong nhóm
này, thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) và thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô
mạch máu (VEGFR) được coi là những đích phân tử quan trọng để tìm ra các hoạt chất
chống ung thư hiện nay [20].
Bằng việc sàng lọc từ 1500 hợp chất với 80 dòng tế bào ung thư phổi tế bào
không nhỏ, Engel và cộng sự đã tìm thấy các chất có khả năng ức chế các dạng đột biến
đôi L858R/T790M của EGFR. Trong số này, chất 1 mang khung 1H-indazol có hoạt
tính ức chế mạnh nhất với giá trị IC50 là 0,07 µM (Hình 1.4) [11].
3


Hình 1.4. Dẫn chất indazol ức chế EGFR
Năm 2017, nhóm nghiên cứu của Sun và cộng sự đã tổng hợp một nhóm dẫn chất
của 1H-indazol-3-amin hướng ức chế đồng thời nhiều tyrosin kinases. Kết quả đánh giá
tác dụng sinh học chỉ ra rằng, các dẫn chất này có khả năng ức chế quá trình tăng sinh
mạch máu nội mô và ức chế tế bào ung thư tốt. Đặc biệt, chất 2 là chất ức chế enzym
mạnh nhất với giá trị IC50 ứng với từng phân tử đích là 3,45 nM (VEGFR-2); 2,13 nM
(Tie-2) và 4,71 nM (EphB4) (Hình 1.5). Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành thử độc
tính của chất này trên một số dòng tế bào ung thư gan, dạ dày, tụy, ung thư biểu mô biểu
bì và ung thư tuyến giáp. Kết quả cho thấy chất 2 ức chế sự phát triển của cả 9 dòng tế
bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 1,80 mM đến 13,26 mM. Hơn thế nữa, độc
tính tế bào của chất 2 tốt hơn cả chứng dương là sorafenib trên 8 dòng tế bào [30].

Hình 1.5. Dẫn chất indazol ức chế nhiều tyrosin kinases khác nhau
Các dẫn chất indazol ức chế các enzym serin/threonin kinases
Serin/threonin kinases là một nhóm lớn các enzym tham gia vào quá trình
phosphoryl hóa các acid amin serin và threonin. Sự hoạt hóa bất thường các enzym này
đã được chứng minh là có liên quan đến sự phát triển của tế bào ung thư [6]. Vì vậy, tìm

kiếm các chất ức chế các serin/threonin kinases như PLK-4, ERK1/2 là một cách tiếp
cận trong điều trị ung thư.
Từ chất dẫn đường 3, một dãy các dẫn chất amid của 1H-indazol đã được nhóm
nghiên cứu của Cao tổng hợp và thử tác dụng ức chế hoạt động của ERK1/2. Trong số
4


đó, các chất 4, 5 và 6 có khả năng ức chế enzym rất tốt với giá trị IC50 từ 9,3 đến 25,8
nM (Hình 1.6). Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư đại trực tràng HT29 của ba chất này
cũng cho kết quả khả quan với giá trị IC50 từ 0,9 đến 6,1 μM [18].

Hình 1.6. Các dẫn chất indazol ức chế ERK1/2
Các dẫn chất indazol ức chế indoleamin 2,3-dioxygenase 1
Indoleamin 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) là một enzym nội bào chứa nhân hem xúc
tác cho quá trình chuyển hóa acid amin thiết yếu tryptophan (Trp) thông qua con đường
kynurenin [9]. Đây cũng là con đường chuyển hóa chính của Trp trong cơ thể, phụ trách
95% tổng lượng Trp [22].
Sự chuyển hóa của Trp thông qua con đường kynurenin đã được chứng minh là
đóng vai trò quan trọng trong quá trình ức chế miễn dịch liên quan tới ung thư. Nhiều
nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự thiếu hụt Trp sẽ dẫn tới ức chế hoạt động của các tế bào
lympho T [10]. Trong khi đó, các chất chuyển hóa của Trp qua con đường kynurenin lại
gây hoạt hóa tế bào T ức chế (Treg) cũng như gây độc tính lên một số tế bào của hệ miễn
dịch trong cơ thể như tế bào diệt tự nhiên NK [12], [35]. Tất cả những điều này dẫn tới
sự ức chế đáp ứng của hệ miễn dịch, gây ra sự dung nạp miễn dịch của cơ thể đối với
khối u, giúp nó tồn tại và kháng lại các liệu pháp điều trị (Hình 1.7) [9].
Sự hoạt động quá mức của IDO1 đã được báo cáo trong một số bệnh ung thư như
ung thư đại trực tràng, ung thư biểu mô tế bào gan, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung
thư phổi tế bào không nhỏ [7], [23], [32], [40]. Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra rằng,
5

sự biểu hiện quá mức của IDO1 trên các bệnh nhân là một trong những nguyên nhân
gây kém đáp ứng với hóa trị và xạ trị. Trong khi đó, các bệnh nhân có nồng độ IDO1
thấp đáp ứng tốt hơn với các liệu pháp điều trị trên [7], [19]. Trên các nghiên cứu thử
nghiệm lâm sàng, các chất ức chế IDO1 cho những kết quả khả quan, đưa IDO1 trở
thành một trong những mục tiêu phân tử đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư.

Hình 1.7. Cơ chế lẩn tránh miễn dịch của tế bào ung thư thông qua IDO1
Gần đây, một số dẫn chất indazol được công bố có khả năng ức chế hoạt động
của IDO1 ở ngưỡng μM (7, IC50 = 0,72 μM; 8, IC50 = 0,77 μM, Hình 1.8). Trong cấu
trúc của các chất này, nhân 1H-indazol đóng vai trò là cấu trúc lõi tương tác với nhân
hem của enzym [25], [26]. Do khả năng ức chế IDO1 của dẫn chất indazol chỉ mới được
phát hiện vào năm 2016, nên số lượng nghiên cứu về các dẫn chất này với tư cách là
chất ức chế IDO1 vẫn còn hạn chế. Vì vậy, việc tiến hành các nghiên cứu sâu hơn nhằm
tối ưu hóa khả năng ức chế IDO1 của các dẫn chất này là hướng đi cần thiết.

Hình 1.8. Các dẫn chất indazol ức chế IDO1

6


Hoạt tính kháng tế bào ung thư của dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol trên các
đích khác nhau
Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế tyrosin kinases
Nhiều dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol có hoạt tính chống ung thư rất tốt, nổi bật
trong số đó là pazopanib. Pazopanib là một trong những thuốc ức chế VEGFR đầu tiên
được FDA phê duyệt với chỉ định điều trị ung thư biểu mô tế bào thận (Hình 1.9). Trong
thử nghiệm lâm sàng pha III, pazopanib đã cho thấy hiệu quả tuyệt vời khi cải thiện
đáng kể tỷ lệ đáp ứng và kéo dài khoảng thời gian không tiến triển của bệnh ở cả những
bệnh nhân chưa điều trị và những bệnh nhân đã điều trị bằng cytokin trước đó [17].

Hình 1.9. Cấu trúc của pazopanib
Dựa trên cấu trúc của pazopanib, một số hợp chất đã được tổng hợp hướng điều
trị ung thư. Năm 2018, Zang và các đồng nghiệp đã công bố một dãy các hợp chất có
cấu trúc tương tự pazopanib hướng ức chế đồng thời cả VEGFR và histon deacetylase
(HDAC). Kết quả sinh học cho thấy hai chất 9 và 10 đều có khả năng ức chế cả HDAC
và VEGFR (Hình 1.10). Đặc biệt, khả năng ức chế HDAC của chất 10 mạnh gấp 40 lần
SAHA- chất ức chế HDAC đã được cấp phép sử dụng trong lâm sàng (10, IC50 = 0,0033
μM; SAHA, IC50 = 0,13 μM). Trong khi đó, chất 9 cho thấy khả năng ức chế VEGFR
tương đương pazopanib (pazopanib, VEGFR IC50 = 34 nM; 9, VEGFR IC50 = 37 nM).
Chất này cũng ức chế HDAC với giá trị IC50 = 4,6 μM. Đặc biệt, độc tính trên tế bào
ung thư đại trực tràng HT29 của chất 9 tốt hơn cả SAHA (9, HT29 IC50 = 1,07 μM;
SAHA, HT29 IC50 = 1,51 μM). Thử nghiệm trên chuột cũng cho thấy chất này có sinh
khả dụng đường uống lên tới 72% [41].

7


Hình 1.10. Dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế đồng thời VEGFR và HDAC
Năm 2017, Wang và đồng nghiệp đã công bố một dãy các hợp chất mới dựa trên
khung indazol và thử hoạt tính ức chế EGFR đột biến L858R/T790M kháng thuốc. Kết
quả sinh học chỉ ra chất 11 là một dẫn chất có nhóm thế amin ở vị trí số 6 có khả năng
ức chế EGFR ở ngưỡng dưới nM (IC50 < 1 nM). Chất này cũng ức chế hai dòng tế bào
ung thư phổi là H1975 và HCC827 với giá trị EC50 lần lượt là 191 và 22 nM (Hình 1.11)
[34].

Hình 1.11. Dẫn chất indazol với nhóm thế amin ở vị trí số 6 ức chế EGFR
Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế serin/threonin kinases
Năm 2014, nhóm nghiên cứu của Sampson đã công bố một dãy các dẫn chất
mang khung indazol hướng ức chế PLK4. Trong đó, các chất 12, 13, 14 cho thấy khả

năng ức chế enzym ở ngưỡng nM (12, IC50 = 1,3 nM; 13, IC50 = 7,4 nM; 14, IC50 = 2,8
nM). Đặc biệt, chất 14 thể hiện hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung
thư đại trực tràng HCT116 ở chuột (GI50 = 0,004 μM) và đã được đưa vào thử nghiệm
lâm sàng (Hình 1.12) [16], [28]. Quá trình sàng lọc cho thấy vòng indazol là vùng tương
tác với enzym quan trọng nhất [39].

8


Hình 1.12. Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế PLK4
Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế indoleamin 2,3-dioxygenase 1
Hai dẫn chất mang nhóm thế bromo ở vị trí số 6 của indazol do 2 nhóm nghiên
cứu độc lập của Qian và Yang tổng hợp có khả năng ức chế IDO1 ở ngưỡng μM (15,
IC50 = 5,3 μM; 16, IC50 = 0,74 μM, Hình 1.13) [26], [37]. Nhóm nghiên cứu của Qian
cho rằng việc hình thành liên kết kỵ nước giữa nhóm thế halogen ở vị trí số 6 với các
acid amin thân dầu của IDO1 làm tăng khả năng liên kết và ức chế enzym của các dẫn
chất này. Dựa vào phân tích cấu trúc-tác dụng của phức hợp chất ức chế-IDO1, nhóm
tác giả kết luận nhóm thế halogen ở vị trí số 6 đóng vai trò tối quan trọng đối với hoạt
tính ức chế IDO1 của dẫn chất indazol [26].

Hình 1.13. Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế IDO1
Một số phản ứng liên quan đến tổng hợp dẫn chất indazol
Các phản ứng hóa học cơ bản
Phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffmann
Đây là phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2) giữa tác nhân ái nhân là amoniac
hoặc amin và các alkyl halid [1].
Sơ đồ phản ứng như sau:

9

Sơ đồ 1.1. Sơ đồ phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffmann
Các amin có tính ái nhân yếu cần sử dụng xúc tác là các base để chuyển từ dạng
phân tử về dạng anion nhằm làm tăng hoạt tính ái nhân.
Tỷ lệ mol của tác nhân N-alkyl hóa ảnh hưởng tới mức độ alkyl hóa sản phẩm.
Việc lựa chọn tỷ lệ mol ban đầu có ý nghĩa quyết định đến tỷ lệ tạo thành các bậc amin
trong sản phẩm [2]. Trong thực tế, sản phẩm thu được thường ở dạng hỗn hợp bao gồm
các amin có bậc khác nhau và muối amoni bậc 4.
Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm
Khử hóa là quá trình làm giảm độ oxy hóa của chất đem khử. Với hóa học hữu
cơ, các phản ứng khử hóa thường là quá trình các chất hữu cơ lấy thêm nguyên tử hydro
hoặc loại các dị tố (thường là oxy). Trong công nghiệp hóa dược, quan trọng nhất là quá
trình khử nitro thành amin [2].
Tác nhân của phản ứng khử hóa rất đa dạng. Có thể chia thành 3 nhóm chính sau:
tác nhân khử hóa hóa học (gồm các kim loại trong môi trường acid hoặc kiềm, hỗn hống
kim loại, các muối của lưu huỳnh…), hydro phân tử với xúc tác và tác nhân khử hóa
điện hóa. Trong đó các tác nhân khử hóa thường dùng để tổng hợp amin từ nitro là kim
loại trong môi trường acid (Fe, Sn/HCl) hoặc hydro phân tử có xúc tác.
a. Kim loại trong môi trường acid
- Sắt trong môi trường acid (Phản ứng Bechamp)
Đây là tác nhân khử có ý nghĩa thực tế lớn nhất và là phương pháp quan trọng để
điều chế các amin thơm trong công nghiệp. Phương trình phản ứng như sau:

Sơ đồ 1.2. Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm bằng sắt trong môi trường acid
Phản ứng đạt hiệu quả tốt nhất khi sử dụng tác nhân là bột gang xám. Bột gang
này không đồng nhất nên tạo nhiều cặp pin điện hóa tham gia vào quá trình khử.
- Thiếc trong môi trường acid
10

Tác nhân này có khả năng khử hóa nhiều hợp chất khác nhau, bao gồm hợp chất
nitro. Trong công nghiệp, tác nhân này ít phổ biến hơn sắt trong môi trường acid do giá
thành cao.
b. Tác nhân khử hóa là hydro phân tử với xúc tác
Ở điều kiện thường, hydro phân tử ít có khả năng phản ứng. Khi tiếp xúc với xúc
tác, hydro được hoạt hóa và có khả năng tham gia phản ứng. Do đó, phản ứng hydro hóa
bao giờ cũng cần xúc tác. Độ hoạt hóa của các chất xúc tác được thể hiện bằng lượng
hydro hấp phụ trên một đơn vị khối lượng. Xúc tác có thể sử dụng riêng hoặc được đưa
lên một chất mang để giảm giá thành với các xúc tác là kim loại quý.
Niken là xúc tác sử dụng phổ biến nhất, có thể sử dụng một mình hoặc đưa lên
chất mang. Ni-Raney thường được sử dụng do độ hoạt hóa tốt. Một gam xúc tác NiRaney có thể hấp phụ 25-150 cm3 khí H2. Ni-Raney có thể dùng để hydro hóa các alken,
ceton, nitril và các hợp chất thơm.
Bột đồng có thể sử dụng để khử các hợp chất nitro thơm do không làm ảnh hưởng
tới nhân thơm. Có thể sử dụng một mình hoặc cùng chất mang. Hỗn hợp Cu-cromit là
xúc tác có giá trị thực tế lớn, có thể hydro hóa các ester và amid. Phản ứng khử với xúc
tác này được tiến hành ở điều kiện áp suất, nhiệt độ trên 100oC.
Các kim loại quý như palladi, platin cũng có thể sử dụng để khử hóa nhiều nhóm
chức. Các tác nhân này có giá thành cao nên thường được trộn với chất mang như than
hoạt tính, trong đó hàm lượng kim loại thường từ 3-10%. Platin và Palladi có thể khử
hóa hầu hết nhóm chức trừ acid carboxylic, amid và ester. Hoạt tính của palladi yếu hơn
platin khi dùng để khử ceton mạch thẳng và nhân thơm. Ưu điểm của các kim loại quý
là có thể tiến hành phản ứng ở nhiệt độ thấp hơn nhiều so với Ni và Cu, do đó hạn chế
được phản ứng dehydro hóa không mong muốn [2].
Phản ứng amin hóa khử
Các hợp chất chứa nhóm carbonyl như aldehyd, ceton có thể phản ứng với
amoniac hoặc các amin bậc thấp để tạo thành các amin bậc cao hơn khi có mặt tác nhân
khử hóa (Sơ đồ 1.3).

Sơ đồ 1.3. Phản ứng amin hóa khử
11

Quá trình phản ứng trải qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Quá trình ngưng tụ giữa hợp chất carbonyl và amoniac hoặc amin
bậc thấp để tạo thành hợp chất imin, kèm loại một phân tử nước (Sơ đồ 1.4). Đây là
phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl. Có thể sử dụng acid làm xúc tác proton
hóa nguyên tử oxy của nhóm carbonyl, tạo điều kiện cho tác nhân ái nhân tấn công dễ
dàng hơn. Tuy nhiên, điều kiện môi trường phản ứng thích hợp tùy thuộc vào hoạt tính
của nhóm carbonyl và tính base của amin. Sử dụng quá thừa acid làm xúc tác có thể làm
giảm hoạt tính của các amin. Nhìn chung, phản ứng tạo imin được tối ưu hóa ở pH hơi
acid [5].

Sơ đồ 1.4. Giai đoạn tạo hợp chất trung gian imin
Giai đoạn 2: Hợp chất imin tạo thành không bền (đặc biệt là các imin mạch hở),
dễ bị khử hóa thành amin dưới sự có mặt của tác nhân khử là hydro phân tử với xúc tác
kim loại nặng (Ni, Pt, Pd…) hoặc tác nhân khử hóa học như natri cyanoborohydrid
(NaBH3CN) (Sơ đồ 1.5). NaBH3CN lần đầu tiên được công bố bởi Borch và cộng sự
vào năm 1971 và được sử dụng rộng rãi trong các phản ứng amin hóa khử. Ưu điểm của
NaBH3CN là khả năng khử chọn lọc liên kết đôi C=N, do đó làm hạn chế sự tạo thành
các alcol là sản phẩm phụ của quá trình khử hóa aldehyd và ceton nguyên liệu [5].

Sơ đồ 1.5. Giai đoạn khử hóa tạo sản phẩm amin
Các phương pháp tổng hợp dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol
Năm 1996, Morel và cộng sự đã sử dụng tác nhân khử hóa hóa học là SnCl2 trong
môi trường acid để khử nhóm nitro thơm của 1-methyl-6-nitro-1H-indazol thành nhóm
amin (Sơ đồ 1.6). Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ cao (100-110oC) trong khoảng 2 giờ. Sau
khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được kiềm hóa bằng KOH rồi chiết với dung môi diethyl
ether. Lớp dung môi hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4 rồi cất quay chân không loại
dung môi. Sản phẩm cuối được kết tinh lại bằng hệ dung môi EtOH:H2O = 90:10 với
hiệu suất phản ứng là 86%, nhiệt độ nóng chảy 130oC [21].

12


Sơ đồ 1.6. Tổng hợp 1-methyl-1H-indazol-6-amin bằng tác nhân khử hóa hóa học
Cũng với phản ứng trên, vào năm 2015 một nhóm các nhà khoa học người Trung
Quốc đã sử dụng tác nhân khử hóa là hydro phân tử với xúc tác Pd/C trong dung môi
MeOH (Sơ đồ 1.7). Phản ứng được để qua đêm, sau đó khối phản ứng được lọc bỏ xúc
tác và cất quay chân không để thu sản phẩm là chất rắn màu nâu. So với tác nhân khử
hóa hóa học trong phương pháp của Morel thì hydro phân tử với xúc tác cho phản ứng
xảy ra ở điều kiện nhẹ nhàng hơn, quá trình tinh chế sản phẩm đơn giản hơn. Hiệu suất
của phương pháp này cũng cao hơn, lên đến 96% [8].

Sơ đồ 1.7. Tổng hợp 1-methyl-1H-indazol-6-amin bằng khí H2 với xúc tác Pd/C
Sau phản ứng khử hóa nhóm nitro ở vị trí số 6 thành nhóm amin, nhóm nghiên
cứu của Morel đã tiếp tục tiến hành phản ứng N-aryl hóa ở vị trí này để tổng hợp amin
bậc 2. Tác nhân N-aryl hóa được sử dụng là p-methoxyphenyl chì triacetat, được chuẩn
bị từ nguyên liệu chì tetraacetat (Sơ đồ 1.8). Phản ứng diễn ra ở nhiệt độ phòng và cần
cấp khí N2 khô. Kết thúc phản ứng, tinh chế qua sắc kí cột để thu sản phẩm với hiệu suất
56%, nhiệt độ nóng chảy 150oC. Phương pháp này tồn tại một số nhược điểm như
nguyên liệu đắt tiền, việc chuẩn bị tác nhân N-aryl hóa phải qua nhiều bước phức tạp,
tốn thời gian trong khi hiệu suất phản ứng không cao (60%) [21].

Sơ đồ 1.8. Tổng hợp dẫn chất indazol có nhóm amin bậc 2 ở vị trí số 6
Một số dẫn chất sulfonamid ở vị trí số 6 của indazol được nhóm nghiên cứu của
Rakib tổng hợp từ nguyên liệu ban đầu là 1H-indazol-6-amin và 4-methylbenzen
sulfonylclorid (Sơ đồ 1.9). Phản ứng tiến hành trong dung môi pyridin và kết thúc sau
24 giờ. Tinh chế bằng sắc kí cột thu được hai sản phẩm: một hợp chất chỉ mang nhóm
13

sulfonamid ở vị trí số 6 (38%) và một hợp chất mang nhóm sulfonamid ở cả vị số trí số
2 và 6 (44%) với nhiệt độ nóng chảy lần lượt là 218-220oC và 196-198oC [27].

Sơ đồ 1.9. Tổng hợp dẫn chất indazol có nhóm sulfonamid ở vị trí số 6

14


CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
Nguyên liệu nghiên cứu
Các dung môi, hóa chất dùng trong tổng hợp hóa học chủ yếu có nguồn gốc xuất
xứ từ hãng Merck (Đức), AKSci (Mỹ) và Trung Quốc. Các hóa chất này được sử dụng
trực tiếp không qua tinh chế và được trình bày trong Bảng 2.1 dưới đây:
Bảng 2.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
TT

Tên nguyên liệu

Nguồn gốc – Xuất xứ

1

6-Nitro-1H-indazol

Trung Quốc

2

Iodomethan (CH3I)

AKSci - Mỹ

3

Aceton

AKSci - Mỹ

4

Cyclopentanon

AKSci - Mỹ

5

Cyclohexanon

AKSci - Mỹ

6

Benzaldehyd

AKSci - Mỹ

7

4-florobenzaldehyd

AKSci - Mỹ

8

3-florobenzaldehyd

AKSci - Mỹ

9

Ethyl acetat (EtOAc)

Trung Quốc

10

n-hexan

Trung Quốc

11

Methanol (MeOH)

Trung Quốc

12

Acid acetic (AcOH)

Trung Quốc

13

N,N-dimethylformamid (DMF)

Trung Quốc

14

Dicloromethan (DCM)

Trung Quốc

15

Nước cất

Việt Nam

16

10% Pd/C

Merck - Đức

17

Celite

AKSci - Mỹ

18

K2CO3

Trung Quốc

19

NaBH3CN

Trung Quốc

20

Na2CO3

Trung Quốc

21

NaCl

Trung Quốc

15