Thiết kế vector chuyển gene kháng virus phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi 14

MỞ ĐẦU
 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá
trị kinh tế cao và đem lại nguồn thu ngân sách đáng kể cho nhiều quốc gia
trên thế giới. Việc trồng và sản xuất thuốc lá góp phần tạo công ăn việc làm
và thu nhập cho nhiều đối tƣợng lao động. Ngoài ra, cây thuốc lá còn đƣợc sử
dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotine, axit hữu cơ, dùng làm thuốc trừ sâu
hay chiết xuất dầu thực vật từ hạt. Hơn nữa, với khả năng dễ tái sinh và chấp
nhận gene ngoại lai tốt, thuốc lá còn đƣợc xem là cây mô hình trong nhiều
nghiên cứu sinh học cơ bản nhƣ: nghiên cứu quá trình trao đổi chất ở thực vật;
nghiên cứu vai trò, chức năng của gene và protein cũng nhƣ làm đối tƣợng để
tiếp nhận gene ngoại lai.
Thuốc lá là cây trồng mẫn cảm với nhiều loại bệnh hại, đặc biệt là các
bệnh do virus gây nên. Cho tới nay, hơn 2000 loại virus gây hại trên thực vật
đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, trong đó có nhiều loài gây ảnh hƣởng
nghiêm trọng tới năng suất và chất lƣợng cây trồng nhƣ: bệnh khảm lá chủ
yếu là do Tobaco mosaic virus (TMV) và Cucumber mosaic virus (CMV) gây
nên; bệnh xoăn đọt vàng lá, héo ngọn do virus héo đốm cà chua Tomato
spotted wilt (TSWV) và Tomato yellow leaf curved virus (TYLCV) gây nên.
Các virus này gây thiệt hại nghiêm trọng tới năng suất cây trồng có thể lên tới
95% thậm chí là 100%, làm ảnh hƣởng lớn tới nền kinh tế của nhiều quốc gia
và trong đó có Việt Nam [3].
Bệnh do virus gây ra không có biện pháp diệt trừ mà chỉ có thể phòng
bệnh. Các biện pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng để phòng ngừa, hạn chế sự lây
lan của virus nhƣ: loại bỏ những cây bị bệnh ngay khi mới phát hiện, trồng luân canh
giữa các cây trồng, vệ sinh đồng ruộng... đều không mang lại hiệu quả cao mà còn
đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng. Việc tìm ra các
biện pháp để ngăn chặn sự phát triển và lây lan của virus thực vật đang là một vấn
cấp bách.
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, đã có rất nhiều ứng
dụng sinh học phân tử trong chọn tạo giống cây trồng kháng virus, trong đó,

công nghệ RNA interference (RNAi) là một giải pháp hữu hiệu nhất thông
1


qua việc sử dụng các vật liệu di truyền từ virus gây bệnh nhƣ gene mã hóa
protein vỏ (coat protein, CP), protein di chuyển (movement protein, MP) để
chuyển vào cây trồng tạo cây trồng chuyển gene kháng lại chính virus đó. Đã
có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc sử dụng công nghệ RNAi để
tạo ra giống cây trồng chuyển gene kháng virus gây bệnh nhƣ kiểm soát virus
Y ở khoai tây [47], chuyển gene kháng RYMV (Rice yellow mottle virus) vào
cây lúa [34]; kháng virus khảm dƣa chuột (CMV) [11][26], virus khảm thuốc
lá (TMV) [12]. Tuy nhiên, hầu hết các công trình đã công bố chỉ là chuyển
đơn gene hoặc gene kép để tạo cây trồng kháng một hoặc hai loài virus nhất
định, cây trồng vẫn có thể bị nhiễm các loài virus khác. Trên cơ sở đó, chúng
tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế vector chuyển gene kháng virus
phổ rộng trên cây thuốc lá bằng công nghệ RNAi”.


MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Thiết kế đƣợc cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus gây bệnh hại
trên cây thuốc lá hiện nay.
- Thiết kế vector RNAi chuyển gene mang các cấu trúc gene đa đoạn.
- Tạo cây thuốc lá mang cấu trúc gene chuyển.


NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn của nhiều loài virus
- Sử dụng các trình tự gene CP của các virus để thiết kế mồi đặc hiệu.
- Ghép nối các đoạn gene.

- Xác định trình tự gene
2. Thiết kế vector RNAi
- Tạo vector pDONOR mang cấu trúc gene CP của 4 loại virus.

- Chuyển cấu trúc gene CP vào vector chuyển gene pK7GWIWG(II)
bằng kỹ thuật Gateway.
- Chuyển vector chuyển gene vào vi khuẩn A. tumefaciens
3. Chuyển gene vào cây thuốc lá nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
- Chuyển gene
- Phân tích cây chuyển gene

2


Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ

1.1.1. Lịch sử phát triển của cây thuốc lá
Thuốc lá (Nicotiana tabacum và Nicotiana rustica) có nguồn gốc từ
châu Mỹ, là cây nhiệt đới và á nhiệt đới, có hƣơng vị đặc trƣng và đƣợc ngƣời
bản địa sử dụng trong các nghi lễ tôn giáo và dùng làm thuốc chữa bệnh [6].
Khi Christopher Columbus đặt chân lên Tây Ấn Độ Dƣơng, ông đã phát hiện
ngƣời bản xứ vừa nhảy múa, vừa hút một loại lá cuộn tròn gọi là Tabaccos. Các
thông tin về sự phân bố rất sớm của thuốc lá ở các vùng khác nhau đã đƣợc một
số tác giả đƣa ra [13].
Thuốc lá bắt đầu đƣợc trồng ở châu Âu vào khoảng những năm 1496 1498 do nhà truyền đạo ngƣời Tây Ban Nha mang từ châu Mỹ về. Andre Teve
mang hạt từ Braxin về trồng ở Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha năm 1556 [9].
Thuốc lá đƣợc du nhập vào trồng tại Trung Quốc và Nhật Bản từ giữa thế kỷ

thứ XVI, ở Ấn Độ vào khoảng năm 1605. Từ đó, các nƣớc này đã trở thành
các nhà sản xuất thuốc lá lớn, phục vụ cho tiêu dùng nội địa và thị trƣờng
thuốc lá thế giới.
Ở Việt Nam, thuốc lá đã đƣợc du nhập vào từ năm 1660 thời vua Lê
Thánh Tông, nhƣng phải đến năm 1876, nghề trồng thuốc lá mới chính thức
đƣợc phát triển tại Gia Định (1899), Tuyên Quang (1940) và ở một số tỉnh
miền bắc với giống ban đầu là Virginia Bland Cash [10].
1.1.2. Phân loa ̣i và nguồn gốc
Thuố c lá có tên khoa ho ̣c là : Nicotiana sp.,thuộc ngành thực vật hạt kín
Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Cúc Asteridae, bộ hoa mõm
sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana [35]. Chi Nicotiana có
khoảng 50-70 loài, đa số là cây da ̣i , căn cứ vào hiǹ h thái , màu sắc của hoa
ngƣời ta phân chia thành 4 loại chính:
Loài Nicotiana tabacum L. Có hoa màu hồng , đỏ tƣơi hoă ̣c đỏ thẫm là
loài phổ biến nhất chiếm 90% diê ̣n tić h thuố c lá trên thế giới , hầ u hế t các
3


giố ng thuố c lá sơ ̣i vàng thuô ̣c loa ̣i này.
Loài Nicotiana rustica L. Có hoa màu vàng , chiế m 10% diê ̣n tích, hầ u
hế t các giố ng thuố c lá sơ ̣i nâu và sơ ̣i đen thuô ̣c loa ̣i này , thƣờng dùng để nhai,
ngƣ̉i, làm thuốc xì gà.
Loài Nicotiana petunioide L. Có hoa màu trắng
, phớt hồ ng hay tím
, thƣờng có
trong vƣờn thƣ̣c vâ ̣t ho ̣c phu ̣c vu ̣ nguồ n dƣ̣ trƣ̃ gene cho lai
, íttacọ́o trong sản xuất
.
Loài Nicotiana polidieide L. Có hoa màu trắng, trong thƣ̣c tế cũng có ít
trong sản sản xuấ t, chỉ có trong vƣờn thực vật học của một số nƣớc.

Các giống thuốc lá sợi vàng có chất lƣợng cao là

Virginia gold,

Virginia blond cash, Virginia bright… đƣợc trồ ng nhiề u ở Mỹ

, Italia,

Bungari, Trung Quố c, Ba Lan, Đức và một số nƣớc khác ở Nam Mỹ.
Ở Việt Nam, các giống thuốc lá sợi vàng đƣợc trồng lâu năm ở Ba Vì và
Cao Bằ ng, giố ng Trung Hoa Bài trồ ng ở các tỉnh phiá Bắ c , các giống C-83, K
51E, Coker 176, K326, C9-1, Burley và Flue-Cured virginia trồng phổ biế n ở
Nam và Trung bô. ̣ Hiện nay, giống thuốc lá N. tabacum L. K326 và C9-1 đƣợc
trồng phổ biến nhất [3].
1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị khoa học của cây thuốc lá
Thuốc lá là loại cây công nghiệp ngắn ngày có giái trị kinh tế cao, có tầm
quan trọng bậc nhất đối với nền kinh tế thế giới.Việc trồng thuốc lá không chỉ
trực tiếp tạo công ăn việc làm cho trên 33 triệu nông dân của hơn 120 quốc gia
trên thế giới mà còn đóng vai trò quan trọng cho toàn bộ nền công nghiệp thuốc
lá [13]. Các hãng sản xuất thuố c lá trên thế giới đề u phải thƣ̀a nhâ ̣n rằng thuố c
lá đem đến cho họ nguồn lợi nhuận khổng lồ

. Ở một số nƣớc nhƣ Brazil ,

Zimbabue, Mỹ, Cu Ba, Bungari… thuố c lá là mô ̣t mă ̣t hàng chiế n lƣơ ̣c, cho thu
nhâ ̣p lớn hơn các các loa ̣i cây trồ ng khác . Các số liệu thống kê đã ƣớc tiń h
khoảng ¼ sản lƣơ ̣ng thuố c lá trên thế giới đã đƣa vào kim nga ̣ch xuấ t khẩ u

.

Ngoài ra, cây thuố c còn giải quyế t nhiề u vấ n đề khác nhƣ luân canh , tăng vu ̣,
tâ ̣n du ̣ng đấ t đai, lao đô ̣ng và thu nhâ ̣p cao hơn mô ̣t số cây trồ ng khác.

4


Ở Việt Nam, cây thuốc lá đƣợc trồng phổ biến ở các tỉnh thuộc Bắc Bộ
và Nam Bộ. Đây là cây công nghiệp ngắn ngày, đem lại hiệu quả kinh tế cao
cho nông dân và thu nhập cho quốc gia. Theo thống kê của Tổng công ty
thuốc lá Việt Nam (Vinataba) [3] trong 3 năm (2006-2008) tổng doanh thu
của thuốc lá đạt 47,656 tỷ đồng, nộp ngân sách nhà nƣớc đƣợc 9,653 tỷ đồng,
kim ngạch xuất khẩu đạt 192,136 triệu USD, việc làm của ngƣời lao động
đƣợc bảo đảm, đời sống từng bƣớc đƣợc nâng cao.
Ngoài giá trị to lớn về kinh tế, cây thuốc lá còn có giá trị về mặt khoa học,
thuốc lá là một trong những cây mô hình quan trọng trong các nghiên cứu trên đối
tƣợng thực vật nhƣ: nuôi cấy mô tế bào thực vật, chuyển gene thực vật… vì nó dễ
tái sinh và chấp nhận gene ngoại lai, có sức sinh trƣởng và chống chịu tốt [40].
Trong y dƣợc học, thuốc lá là dƣợc liệu tốt để trị giun đũa, ký sinh trùng nhƣ chấy,
rận, ghẻ, lá khô giã đắp vào vết thƣơng để cầm máu [50].
1.2.

MỘT SỐ BỆNH VIRUS THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ

1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá
Hiện nay, năng suất và chất lƣợng thuốc lá giảm sút nghiêm trọng do
bệnh virus hoành hành. Trong đó, phổ biến và nghiêm trọng nhất là các bệnh
khảm lá do TMV (Tomato mosaic virus), CMV (Cucumber mosaic virus) gây
ra; bệnh xoăn vàng lá, héo đốm ngọn do các loài virus TYLCV (Tomato yellow
leaf curl virus) và TSWV (Tomato spotted wilt virus) gây hại (Bảng 1.1).
Năm 2008, theo thống kê của Nguyễn Văn Chín và Nguyễn Ngọc Bích

thuộc Tổng công ty thuốc lá Việt Nam, TMV và CMV là hai loài virus gây
hại chủ yếu trên cây thuốc lá ở Việt Nam. Bệnh khảm xuất hiện khá sớm với
tỷ lệ thấp (2,3-5,2%) và tăng dần hoặc tăng nhanh sau 20-50 ngày tùy theo
vùng, từ 18,5-26,5% thậm chí lên tới 100% nhƣ ở xã Lâu Thƣợng, tỉnh Thái
Nguyên, trong đó giống thuốc lá rất mẫn cảm với TMV chủ yếu là K326.
Thiệt hại do virus gây ra ở cây thuốc lá lên đến hàng chục tỷ đồng [3].
Đối với bệnh do virus nói chung và bệnh khảm nói riêng hiện vẫn chƣa
có loại thuốc hoá học nào có thể phòng trị đƣợc một cách hữu hiệu, do đó các
5


biện pháp phòng bệnh tốt nhất là sử dụng các hạt giống sạch bệnh để trồng,
không sử dụng các hạt giống từ các ruộng trƣớc đó đã bị các bệnh nói trên để
làm giống cho vụ sau. Thƣờng xuyên vệ sinh, kiểm tra đồng ruộng để phát
hiện sớm và phun thuốc diệt trừ các loại côn trùng chích hút mang mầm bệnh
nhƣ: bọ cánh tơ, bọ phấn trắng, rệp muội, bằng các loại thuốc trừ sâu để tránh
lây lan.
Bảng 1.1. Bệnh virus thường gặp trên cây thuốc lá [49]
Tên bệnh

Tên virus gây bệnh

Khảm linh lăng

Alfalfa mosaic virus (Virus khảm linh lăng)

Quăn ngọn cúc tần

Beet curly top virus (Virus gây bệnh quăn ngọn cây cúc tần)

Ngọn cây bụi

Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (Virus gây biến dạng
gân thuốc lá) và Tobacco bushy top virus (Virus ngọn cây bụi
thuốc lá)

Khảm cà chua

Cucumber mosaic virus (Virus gây bệnh khảm dƣa chuột)

Vàng chết hoại rau diếp

Lettuce necrotic yellows virus (virus dây bệnh vàng chết hoại
rau diếp) trên Nicotiana glutinosa

Còi cọc cây lạc

Peanut stunt virus

Bệnh hình hoa hồng

Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus bây biế n da ̣ng
gân lá thuốc lá) và Tobacco mottle virus (virus gây bệnh đốm
thuốc lá)

Kỵ axit thuốc lá

Tobacco etch virus (Virus gây bệnh ky ̣ axit thuốc lá)

Xoăn vàng lá ở cà chua

Tomato yellow leaf curl virus(Virus gây xoăn vàng lá ở cây cà
chua)

Khảm thuốc lá

Tobacco mosaic virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá) và
Satellite Tobacco mosaic Virus (Virus gây bệnh khảm thuốc lá
vệ tinh)

Hoại tƣ̉ thuốc lá

Tobacco necrosis virus (Virus gây hoại tƣ̉ thuốc lá)

Bung hạt thuốc lá

Tobacco rattle virus (Virus gây bung hạt thuốc lá)

Đốm vòng thuốc lá

Tobacco ring spot virus (Virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá)

Sọc thuốc lá

Tobacco streak virus (Virus gây bệnh sọc thuốc lá)

Còi cọc thuốc lá

Tobacco stunt virus (Virus gây bệnh còi cọc thuốc lá)

Vằn gân lá thuốc lá

Tobacco vein mottling virus (Virus gây bệnh vằn gân lá thuốc
lá)

Héo đốm cà chua

Tomato spotted wilt virus (Virus gây bệnh héo đốm cà chua)

Viền gân lá

Potato virus Y (Virus Y khoai tây)

U vết thƣơng

Wound tumor virus (Virus gây bệnh khối u vết thƣơng)

6


1.2.2. Sơ lƣợc về TMV, CMV, TYLCV, TSVV gây bệnh trên cây thuốc lá
1.2.2.1. Virus khảm thuốc lá (Tobacco mosaic virus - TMV)
Virus khảm thuốc láTMV là virus gây bệnh khảm phổ biến trên thực
vật thuộc loài Tobamovirus và đƣợc mô tả sớm nhất bởi Mayer (1886) [30],
Iwanowski (1892) [25], Allard (1914) [14] và Stanley (1935) [43]. Virus
khảm thuốc lá có phổ ký chủ rộng, gây bệnh trên hơn 120 loại thực vật khác
nhau, nhƣng nhiều nhất là trên cây thuốc lá. TMV lây truyền theo cách thức
tiếp xúc cơ giới thâm nhập vào trong các tế bào qua vết thƣơng, khí khổng lá
hoặc qua rễ [7]. Biểu hiện của bệnh khảm lá đầu tiên là các lá non chuyển
sang màu vàng nhạt, lá nhỏ lại, trên bề mặt xuất hiện các vết khảm loang lổ,

màu sắc chỗ đậm chỗ nhạt. Bên cạnh đó, còn có các biểu hiện khác nhƣ phiến
lá hơi nhăn, mặt lá không đƣợc phẳng mà chuyển sang lồi lõm do các gân lá
bị kìm hãm sinh trƣởng, trong khi thịt lá vẫn phát triển bình thƣờng.
Dạng tiềm ẩn của bệnh ở các mức độ khác nhau, bao gồm [5]:
- Dạng tiềm ẩn toàn phần: cây hoàn toàn không có biểu hiện của triệu
trứng bệnh.
- Dạng tiềm ẩn cục bộ: triệu trứng bệnh xuất hiện ở phần lá non, lá
ngọn nhƣng không đƣợc rõ ràng.
- Dạng tiềm ẩn tạm thời: chỉ xuất hiện ở một giai đoạn của bệnh,
thƣờng là giai đoạn sau.
- Tiềm ẩn vĩnh viễn: bệnh không biểu hiện triệu chứng trong suốt thời
gian phát triển của cây.
Giải thích cho hiện tƣợng tiềm ẩn của bệnh là do thời gian ủ bệnh của
virus TMV tƣơng đối dài, nếu cây bị nhiễm bệnh trong giai đoạn trƣởng
thành, TMV không kịp biểu hiện triệu trứng của. Tuy nhiên, năng suất và chất
lƣợng sản phẩm sau thu hoạch vẫn bị ảnh hƣởng nghiêm trọng. Ngoài ra,
trong điều kiện nhiệt độ cao (> 30 oC) cũng làm mất triệu chứng của bệnh.

7


Hình 1.1. Bệnh khảm thuốc lá do virus TMV gây ra (Nguồn: internet)

Nghiên cứu
ở cấp
phân
tử, vật
liệu
của gây
TMV

Hình
1.1.độ
Bệnh
khảm
thuốc
ládi
dotruyền
virus TMV
ra là 1 sợi đơn
Nghiên
cứu có
ở cấp
độ phân
tử, vật liệu
truyền
của TMV
là 1 sợi
đơn
RNA đơn
dƣơng,
chiều
dài khoảng
6,4diKb
và chứa
4 khung
đọc
mở
RNA đơn dƣơng, có chiều dài khoảng 6,4 Kb và chứa 4 khung đọc mở
(ORF). Đầu 5’ của RNA có gắn với 7-methyl guanosine. Những khung đọc
(ORF). Đầu 5’ của RNA có gắn với 7-methyl guanosine. Những khung đọc

mở (ORF) gần đầu 5’ mã hóa 2 protein có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt là 126
mở (ORF) gần đầu 5’ mã hóa 2 protein có trọng lƣợng phân tử lần lƣợt là
kDa
và 183
kDa (Hình
126kDa
và 183kDa
[18].1.2) [20].
6,395 nt

RdRp

CP

Helicase

MP

Hình
Hình 1.2.
1.2.Sơ
Sơđồ
đồcấu
cấutrúc
trúcgenome
genomecủa
củaTMV
TMV

RdRp -- replicase;

replicase;CP
CP- protein
- protein
helicase
- enzyme
tới trình
quá trình
vỏ;vỏ;
helicase
- enzyme
liênliên
quanquan
tới quá
duỗi xoắn;
dịch
mãmã
xoắn; MP
MP -- protein
proteinvận
vậnchuyển.
chuyển.Chiều
Chiềumũi
mũitên
tênthể
thểhiện
hiệnchiều
chiều
dịch

1.2.2.2. Virus

khảm
trên
Virus
khảm
trêncây
câydưa
dưaleo
leo(Cucumber
(Cucumbermosaic
mosaicvirus,
virus, CMV)
CMV)
môđƣợc
tả lầnmô
đầutảtiên
là
Bệnh khảm
khảm trên
trêncây
câydƣa
dƣaleo
leođƣợc
CMV
lầnvào
đầunăm
tiên1916,
vào năm
một trong
những
bệnh

virusbệnh
gây nên
đƣợc
nhất.
1916,
là một
trong
những
virustrên
gâythực
nênvật
trên
thựcphát
vậthiện
đƣợcsớm
phát
hiện
Hiệnnhất.
nay, có
nhiều
CMV
đã đƣợc
tả vớimô
dữtảliệu
sớm
Hiện
nay,dòng
có nhiều
dòng
CMVmô

đã đƣợc
với di
dữ truyền
liệu di chứa
truyền
khoảng
60 protein
khác nhau
15 trình
genome
virus hoàn
chứa
khoảng
60 protein
khácvà
nhau
và 15tựtrình
tự genome
viruschỉnh.
hoàn chỉnh.
Virus khảm
thuộc
loài Cucumovirrus,
họ Bromovirus
Virus
khảm dƣa
dƣa leo
leo (CMV)
thuộc loài
Cucumovirrus,

họ Bromovirus
và đƣợc
và đƣợc biết đến là virus có phổ gây bệnh rộng nhất với trên 1000 loài thực
biết đến là virus có phổ gây bệnh rộng nhất với trên 1000 loài thực vật [33].
Phƣơng thức lan truyền của CMV thông qua vật trung gian là các loài rệp,
!
9!
trong
đó 2 loài chủ yếu là Myzus persicae
và Aphis gossypii [27].

8


Hình 1.3. Cây thuốc lá bị bệnh khảm do virus CMV gây ra(Nguồn: internet)

Các chủng CMV đƣợc chia thành hai nhóm I và II dựa trên các phân
tích huyết thanh [24, 46], lai acid nucleic và giải trình tự gene [32]. Giữa
nhóm I và II có mối quan hệ khá xa nhau, hệ gene của chúng chỉ có 75%
nucleotide tƣơng đồng. Trong nhóm I lại đƣợc chia thành 2 phân nhóm IA và
IB với độ tƣơng đồng của chúng lên tới 92 – 95% [33, 37]. Các chủng CMV
phân nhóm IA và nhóm II xuất hiện gần nhƣ trên toàn thế giới, trong khi các
chủng thuộc phân nhóm IB lại chủ yếu xuất hiện ở Châu Á [12].
Khi xem xét ở cấp độ tế bào và phân tử, CMV có dạng hình cầu,
đƣờng kính khoảng 28 – 30 nm và trọng lƣợng phân tử từ 5,0 – 6,7.106 Da.
Vật liệu di truyền của CMV gồm 3 sợi RNA thông tin (RNA1, RNA2, RNA3)
và có 5 khung đọc mở (ORF). RNA1 gồm có 3357 nucleotide mã hoá cho
protein 1a (khoảng 111 kDa), RNA2 chứa 3050 nucleotide mã hoá trực tiếp
protein 2a (97 kDa), RNA3 mã hoá trực tiếp protein di chuyển (30kDa).
Ngoài 3 sợi RNA trên, còn có RNA4A gồm 691 nucleotide có nguồn gốc từ

RNA2 mã hoá cho protein 2b (15 kDa) và RNA4 (1034 nucleotide) có nguồn
gốc từ RNA3 mã hoá protein vỏ (24,5 kDa). Hai protein 1a, 2a kết hợp với
những protein của kí chủ tạo thành enzyme “replicase” của CMV [37].
Trong ba loại RNA của CMV, RNA3 thƣờng xuyên xảy ra quá trình
tái tổ hợp hơn so với RNA1 và RNA2 [37]. Do đó, đã có nhiều nghiên cứu
dựa trên RNA3 để đánh giá về đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinh
của chủng CMV.
9


Hình
1.4. Sơ đồ cấu trúc hệ gene của virus CMV
Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome CMV

1.2.2.3. Virus héo đốm cà chua (Tomato spotted wilt virus, TSWV) gây bệnh
Các chủng CMV đã đƣợc phân chia thành hai nhóm I và II dựa vào huyết

xoăn đọt héo ngọn trên cây thuốc lá

thanh học [42] [22], lai acid nucleic [50], trình tự gen [27]. Phân nhóm I và II

virus
héo đốm
câychỉ
cà chua
đƣợc
mô tả
có mối TSWV
quan hệlàkhá
xa gây

nhaubệnh
và genmon
củatrên
chúng
có 75%
nucleotid

lần đầu

tƣơng
nhómvàI lại
đƣợc
thành IA và
IB, bệnh
độ tƣơng
tiên
vàođồng.
nămTrong
1930 đó
bởiphân
Samuel
cộng
sự chia
tại Australia
[39],
héo đốm cà
đồng của chúng lên tới 92%-95% [29] [31]. Các chủng CMV phân nhóm IA
chua
gây thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế nông nghiệp. TSWV đƣợc đánh giá
và II xuất hiện hầu nhƣ khắp thế giới trong khi các chủng CMV phân nhóm

là virus gây hại phổ rộng với hơn 370 loại cây trồng trong 50 họ thực vật khác
IB chủ yếu có mặt ở Châu Á [21] [9].

nhau tại các vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới [18].
Trong ba RNA của CMV, RNA3 xảy ra sự tái tổ hợp thƣờng xuyên hơn

Tại Việt Nam, virus héo đốm cà chua đƣợc phát hiện trên cây cà chua

RNA1 và RNA2 [31]. Vì vậy có rất nhiều nghiên cứu dựa trên RNA3 để đánh

tại
Môn
[7]divà
trên và
cây
thuốc
giáHooc
bảng đa
dạng
truyền
xây
dựnglá.
cây phát sinhc ủa chủng CMV
TMV thuộc loại Tobamovirus, phổ ký chủ virus TMV có tới 230 loài thuộc
32 họ và là một trong virus gây hại trên thực vật đƣợc mô tả sớm nhất ở nƣớc
ta. Đây là một trong những virus gây bệnh thực vật đƣợc mô tả sớm nhất bởi
12

Hình 1.5: Ảnh cây thuốc lá bị bệnh héo đốm do virus TSWV gây ra(Nguồn:

internet)

10


Virus héo đốm cà chua thuộc loại Tospovirus, họ Bunyaviridae, có cấu
tạo dạng thiên thể kích thƣớc 70 - 90nm. TSWV đƣợc lan truyền thông qua
tác nhân trung gian là côn trùng, chủ yếu là bọ trĩ Thrips tabaci, Thrips
17 gồm ba sợi
setosus, Thrips parmi,… theo kiểu [7]. Hệ gene của loại virus này

RNA
đơn
âm hoặc
lƣỡngof tính,
cácwilt
sợivirus.
L (8,9
kb),of sợi
M (4,9
Figure
1. Genome
organization
Tomatolà
spotted
Functions
each gene
are kb) và sợi S
(2,9noted
kb)on(hình

1.6). Sợi L mã hóa cho các replicase liên quan tới quá trình
the right side.
phiên mã của virus trong khi sợi M mã hóa cho protein vận chuyển (NSm) và
protein vỏ (GN và GC) còn sợi S mã hóa cho nucleprotein (N) và protein ức
chế quá trình bất hoạt gene (NSs) [28].

Hình 1.6. Sơ đồ cấu trúc genome của TSWV
RdRp: replicase; Nsm: protein vận chuyển; GN/GC: protein vỏ;
NSs: nhân tố ức chế quá trình bất hoạt gen; N: nulceoprotein
Chiều mũi tên thể hiện chiều dịch mã

1.2.2.4. Virus gây bệnh xoăn vàng lá ở cà chua (Tomato yellow leaf curl
virus, TYLCV)
Bệnh xoăn vàng lá cà chua đƣợc phát hiện vào năm 1929 tại Israel và
các nƣớc Trung Đông do một loài virus có tên Tomato yellow leaf curl virus
(TYLCV) gây ra, sau đó đƣợc phân lập vào năm 1988 [21] và tới năm 1991
thì đƣợc giải trình tự hệ gene [31].
TYLCV không lây truyền qua hạt, đất, hay va chạm cơ học, mà đƣợc
lây nhiễm từ cây này sang cây khác nhờ loài bọ cánh trắng Bemisia tabaci.
Đây là loài côn trùng nhỏ hút nhựa cây đƣợc phát hiện lần đầu tiên tại Israel
từ năm 1931 [15].
11


Hình 1.7. Cây thuốc lá bị nhiễm bệnh xoăn vàng lá trên cây thuốc lá
(Nguồn: internet)

Hệ gene của TYLCV gồm 6 gene chức năng là: gene CP (V1), PreCP
(V2), C1, C2, C3, C4. Các gene này có thể nằm trên cùng một vòng DNA-A
hay hai vòng DNA-A và DNA-B riêng biệt và đƣợc ngăn cách với nhau bởi

một vùng gene (IR-intergenic region) có độ dài khoảng 200 nucleotide [29].

Hình 1.8. Tổ chức bộ gene của TYLCV. Khung mở đọc được chỉ định V (định
hướng của virus) hoặc C (định hướng ý nghĩa bổ sung)

- Những nghiên cứu về thiệt hại do bệnh virus gây ra trên cây thuốc
lá tại Việt Nam:
Tại một số vùng trồng thuốc lá lớn nhƣ Tây Ninh, Ninh Thuận, bệnh
xoăn ngọn do Virus héo đốm cà chua TSWVgây thiệt hại nặng cho sản xuất
khi xuất hiện ở giai đoạn sớm và không cho thu hoạch. Theo báo cáo của
phòng Đầu tƣ - Phát triển thuộc Công ty cổ phần Hoà Việt và Phân viện Kinh
tế Kỹ thuật Thuốc lá, thiệt hại về kinh tế chỉ riêng vùng Tây Ninh trong 3 niên
vụ từ 2001-2004 ƣớc tính ở mức 40 - 50 tỷ đồng. Tại các vùng trồng phía
12


Bắc, các bệnh khảm lá do virus khảm thuốc lá TMV và virus khảm dƣa leo
CMV gây ra có tỷ lệ nhiễm trung bình từ 15-20%, có khi lên tới 100% nhƣ tại
xã Lâu Thƣợng – Thái Nguyên và gây thiệt hại cho nông dân khoảng 10– 15
tỷ đồng/ năm[3].
1.2.3. Biện pháp phòng chống bệnh virus
Hiện nay, vẫn chƣa có biện pháp nào có thể xử lý trị bệnh do virus gây
ra trên cây trồng. Khác với những bệnh hại do nấm, vi khuẩn hay sâu bọ gây
ra, bệnh do virus rất khó điều trị. Các biện pháp đƣa ra chỉ nhằm mục đích
phòng bệnh là chính. Một số biện pháp đang đƣợc sử dụng trong công tác
phòng bệnh trên cây trồng nhƣ: Sử dụng giống sạch bệnh, giống kháng bệnh,
các biện pháp canh tác,...[8]
1.2.3.1. Sử dụng giống sạch bệnh
Giống sạch bệnh đƣợc thu từ các cây trồng khoẻ mạnh, không bị nhiễm
bệnh từ vụ trƣớc. Các cây trồng khoẻ mạnh sẽ đƣợc đem lai với giống cây dại

do cây dại có tính kháng bệnh cao, sau đó hạt giống thu đƣợc sẽ đƣợc xử lý,
bảo quản để sử dụng cho vụ sau. Sử dụng giống sạch bệnh đƣợc xem là một
trong những biện pháp quan trọng để hạn chế các bệnh do virus ở nhiều loại
cây trồng. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là cây trồng có thể bị
nhiễm bệnh trong quá trình canh tác trên đồng ruộng.
1.2.3.2. Sử dụng giống kháng bệnh bằng phương pháp lai tạo
Sử dụng các loại giống đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng kháng lại
nhƣng virus gây bệnh đƣợc xem hữu hiệu trong sản xuất nông nghiệp hiện
nay. Phƣơng pháp này vừa mang lại hiệu quả cao, mà không gây ô nhiễm môi
trƣờng sinh thái và tạo đƣợc cây sạch bệnh. Tuy nhiên, nhƣợc điểm của
phƣơng pháp này là số lƣợng biện pháp gặp nhiều hạn chế về nguồn vật liệu
di truyền kháng virus phục vụ cho công tác lai tạo, cũng nhƣ chi phí cao.

13


1.2.3.3. Các biện pháp canh tác
- Luân canh: thƣờng là luân canh giữa cây trồng nƣớc với cây trồng cạn
(ví dụ: thuốc lá – lúa – thuốc lá), khi thay đổi cơ cấu cây trồng và thay đổi
điều kiện môi trƣờng đất (từ đất cạn – đất ngập nƣớc) sẽ làm hạn chế sự phát
triển của mầm bệnh hoặc mầm bệnh có thể bị tiêu diệt. Tránh độc canh hoặc
luân canh cây trồng cạn với cây trồng cạn.
- Sử dụng biện pháp kiểm soát côn trùng gây bệnh: do hầu hết virus lây
truyền bệnh thông qua vật trung gian (côn trùng gây bệnh) nên khi trồng
những cây có tính kháng lại, xua đuổi côn trùng xen với cây trồng chính cũng
có tác dụng ngăn ngừa dịch bệnh (ví dụ trồng ổi không hạt cạnh cây bƣởi sẽ
xua đổi bọ cánh trắng gây hại trên cây bƣởi), các biện pháp bắt côn trùng (bẫy
đèn, ong mắt đỏ)
- Vệ sinh đồng ruộng: làm sạch cỏ dại, xử lý đất sau khi thu hoạch và
trƣớc gieo trồng vụ mới, phát hiện sớm và tiêu huỷ cây bệnh.

- Phòng trị bệnh cho cây con ở vƣờn ƣơm: đây là biện pháp cho hiệu
quả cao. Sử dụng đất sạch mầm bệnh để làm vƣờn ƣơm, cách ly vƣờn ƣơm
với ruộng sản xuất, chọn những cây con khoẻ mạnh đem trồng.
Các biện pháp trên chỉ có khả năng phòng bệnh cho cây trồng, cây
trồng có thể bị nhiễm bệnh trong quá trình canh tác.
1.2.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học
Ứng dụng công nghệ sinh học vào trong sản xuất nông nghiệp đƣợc coi
là phƣơng pháp tối ƣu nhất hiện nay trong việc phòng chống bệnh hại do virus
gây ra. Thành công đầu tiên trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo
giống cây trồng đƣợc đánh dấu bằng công bố công trình nghiên cứu của
Beachy và cộng sự (1986) [36] trên cây thuốc lá chuyển gene mã hoá protein
vỏ của virus gây bệnh khảm (TMV). Sau đó nhóm tác giả đã phát triển những
thí nghiệm của mình thành phƣơng pháp chuyển gene CP tạo cây trồng kháng
virus. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng thành công trên thực vật hai lá mầm
14


và sau đó là thực vật một lá mầm [23]. Tuy nhiên, hạn chế của phƣơng pháp
này là chỉ tạo đƣợc cây trồng chuyển gene kháng đƣợc duy nhất một chủng
virus mang gene mã hoá vỏ protein mà nó chuyển vào. Điều này gây trở ngại
trong việc phát triển các giống cây trồng dựa trên phƣơng pháp chuyển gene
CP do các virus gây bệnh thƣờng có độ đa dạng khá cao [41].
Đến cuối thế kỷ 20, kỹ thuật RNA gây nhiễu (RNA interference, RNAi)
hay còn gọi là cấu trúc dạng kẹp tóc (intron-hairpin RNA, ihpRNA) ra đời.
Đây đƣợc xem là kỹ thuật hiện đại và hữu hiện nhất trong việc tạo giống cây
trồng chuyển gene kháng lại virus gây bệnh. Năm 2004, Baulcombe và cộng
sự đã công bố cơ chế hoạt động của đoạn RNA gây nhiễu nhỏ (small
interfering RNA, siRNA) và xem đó là cơ chế quan trọng trong việc kháng lại
virus ở thực vật [16]. Các bƣớc chính trong kỹ thuật RNAi gồm: (1) Thiết kế
vector chuyển gene mang cấu trúc RNAi; (2) Biến nạp vector chuyển gene

mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterum tumefaciens
để làm bất hoạt các RNA thông tin (mRNA) của virus gây bệnh; (3) Sàng lọc
các cây chuyển gene mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của
các cây chuyển gene [44]. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi là tạo cho cây
chuyển gene mã hoá protein của virus (gene mã hoá vỏ CP, enzyme phiên mã
RdRp,...) có khả năng kháng lại chính virus đó. Năm 2007, Zrachya và cộng
sự đã công bố về việc đƣa siRNA nhắm vào các bản sao CP của TYLCV dẫn
đến việc bất hoạt sự biểu hiện và kháng lại virus này [48].
Các cấ u trúc gene có nguồ n gố c tƣ̀ virus gây bệnh đƣợc sƣ̉ du ̣ng chuyể n
vào cây trồ ng để ta ̣o tính kháng có thể là các loa ̣i khác nhau nhƣ : các cấ u trúc
của virus theo chiều xuôi (sense) hay chiề u ngƣợc (antisense), các cấ u trúc
dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) và các miRNA nhân ta ̣o có đích là các
trình tƣ̣ gene của virus gây bệnh , hay kỹ thuật RNAi đang đƣợc quan tâm
nhiề u và ƣ́ng du ̣ng rộng rãi.

15


1.3.

KỸ THUẬT RNA INTERFERENCE – CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA

ĐỀ TÀI
1.3.1. Khái niệm về RNA interference
RNA interference (RNAi) là cơ chế tự nhiên của tế bào sống có thể làm
bất hoạt một gene nào đó. Hiện tƣợng này đƣợc quan sát lần đầu tiên trên
những cây thuốc lá kháng bệnh do virus đốm vòng thuốc lá (Tobacco ring
spot virus, TRSV) gây ra sau lây nhiễm lần hai, trên các cây chuyển gene có
biểu hiện ức chế phiên mã nhờ RNA ''chiều đối mã'' (antisense RNA) [16] và
nhiều kết quả từ những thí nghiệm gây bất ngờ do các nhà nghiên cứu thực

vật ở Mỹ và Hà Lan thực hiện vào những năm đầu thập niên 90 trên đối tƣợng
cây dã yên thảo (petunia).
Các kỹ thuật cơ bản của RNAi đƣợc sử dụng để làm rõ chức năng của
gene. Theo đó, để tích luỹ thông tin trình tự hệ gene trong các loài thực vật
khác nhau, việc phân tích các gene chức năng không xác định tăng đáng kể.
Những nỗ lực này giúp cho việc xác định các gene có đặc điểm quý. Sự bất
hoạt các gene không mong muốn cũng đƣợc ứng dụng trong sản xuất giống cây
trồng với việc tăng giá trị dinh dƣỡng và quá trình xử lý thực phẩm. Ví dụ, kỹ
thuật RNAi đƣợc ứng dụng để tạo giống bông vải với hàm lƣợng stearic acid
và oleic acid cao cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất dầu đậu lành
với tăng sự ổn định ở nhiệt độ cao. Chất lƣợng hoa cũng là mục tiêu của kỹ
thuật RNAi trong việc nhân giống, tăng số lƣợng hoa hạt cải dầu, tạo giống hoa
hồng với cánh hoa màu xanh bằng cách sử dụng Công nghệ RNAi.
1.3.2. Cơ chế hoạt động của RNAi
RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA.
Ở thực vật có ba con đƣờng ức chế RNA. Con đƣờng đầu tiên là sự ức chế
gene sau phiên mã PTGS (Post-Transcriptional Gene Silencing) qua trung
gian là các RNA gây nhiễu nhỏ có vai trò ức chế (short interfering RNA,
siRNA); Con đƣờng thứ hai gồm có các tiểu RNA (micro-RNA, miRNA).
Con đƣờng thứ ba là sự bất hoạt gene phiên mã TGS (transcriptional gene
16


silencing) bằng cách liên kết với quá trình biến đổi nhiễm sắc thể trực tiếp qua
siRNA bao gồm sự methyl hóa histone và DNA. Ba con đƣờng này có vai trò
nhất định trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của thực vật nhƣ kháng
virus hoặc sự xâm nhập của các DNA/RNA lạ, điều khiển biểu hiện gene hay
ngƣng tụ chất nhiễm sắc thành thể dị nhiễm sắc [16]. Các phần tử quan trọng
tham gia vào cơ chế RNAi này là hai enzyme Dicer và Argonaute trong phức
hệ RISC (RNA-induced silencing complex) kích hoạt quá trình ức chế RNA,

các siRNA và miRNA [16].
Trong ba con đƣờng ức chế RNA, sự ức chế gene sau phiên mã (PTGS)
qua trung gian là các siRNA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu tạo
cây trồng chuyển gene kháng virus. Quá trình này xảy ra ở tế bào chất và là
con đƣờng quan trọng trong tế bào thực vật bị nhiễm virus, nơi mà các sợi
RNA mạch kép hoặc cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thể sao chép
gián tiếp. Cấu trúc này sẽ tạo ra RNA CPi dạng kẹp tóc bổ sung chính nó có
intron (intron-hairpin RNA, ihpRNA) sau khi đƣợc chuyển vào cây trồng.
Khả năng cấu trúc ihpRNA bổ sung chính nó có hiệu quả làm bất hoạt gene ở
thực vật đã đƣợc Smith và cộng sự chứng minh vào năm 2000 [42]. Trong
trƣờng hợp là DNA virus , các đoạn dsRNA (double strain RNA) có thể đƣợc
tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung liên tiếp [16]. Cơ chế này cũng xảy ra
tƣơng tƣ̣ nhƣ ở động vật . Khi có sƣ̣ xâm nhập của dsRNA , các Dicer có bản
chấ t là RNaseIII đặc hiệu cho dsRNA sẽ cắ t nhƣ̃ng chuỗi kép RNA này ra
nhƣ̃ng đoa ̣n ngắ n hơn , khoảng 21-25 nucleotide, gọi là siRNA . Sau đó, các
siRNA mạch kép hình thành đƣợc tách ra làm hai chuỗi đoạn và chỉ một chuỗi
đơn RNA với đầ u 5' có lƣ̣c bắ t c ặp base (base-pairing) nhỏ nhất đƣợc giữ lại
để tiế p tu ̣c liên kế t với Argonaute trong phƣ́c hệ RISC. Tiế p đó, phƣ́c hệ RISC
đã gắ n đoa ̣n siRNA nhận biế t các mRNA của tế bào có trình tƣ̣ tƣơng đồ ng
với trình tƣ̣ của đoa ̣n chuỗi đơn siRNA này . Sau khi nhận da ̣ng mRNA qua
việc bắ t cặp các base tƣơng đồ ng với trình tƣ̣ của chuỗi đơn siRNA
, các
mRNA bi ̣cắ t đƣ́t ở khoảng giƣ̃a của chuỗi kép siRNA -mRNA thành nhƣ̃ng
đoa ̣n nhỏ khoảng 12 nucleotide tƣ̀ đầ u 3’. Sau khi bi ̣cắ t đƣ́t , mRNA nhanh
chóng bi ̣tiêu huỷ bởi các RNA nuclease [17] (Hình 1.9).
17


Hình 1.9. Mô tả con đường tạo thành RNAi. a: siRNA; b: miRNA
(Nguồn: Baulcombe và cs, 2004)

1.4. NGHIÊN CỨU TẠO CÂY TRỒNG CHUYỂN GENE KHÁNG
VIRUS TẠI VIỆT NAM
Virus là nguyên nhân gây hại tới nhiều loại cây trồng trên thế giới cũng
nhƣ ở Việt Nam. Hầu hết các bệnh thực vật do virus gây ra cho tới nay chƣa
có thuốc đặc trị, do vậy tạo giống cây trồng kháng bệnh virus là mục tiêu
nhiều nghiên cứu tại nƣớc ta. Từ năm 1999, Phòng Công nghệ tế bào thực vật,
Viện Công nghệ Sinh học phối hợp với 5 nƣớc trong khu vực ASEAN tham
gia vào chƣơng trình nghiên cứu phát triển cây đu đủ chuyển gene kháng bệnh
virus đốm vòng (Papaya ringspot virus - PRSV) do tổ chức ISAAA
(International Service for Acquisition of Agri-biotech Applications) tài trợ.
Trong khuôn khổ đề tài nhóm thực hiện đã phân lập đƣợc gene CP của một số
chủng virus tại miền Bắc và Nam Trung Bộ. Gene CP đã đƣợc sử dụng để
thiết kế các cấu trúc chuyển gene vào cây đu đủ nhằm tạo cây chuyển gene
kháng virus đốm vòng. Một số dòng cây đu đủ chuyển gene đã biểu hiện tính
18


kháng virus sau khi thử nhiễm bệnh nhân tạo [2]. Thời gian gần đây đã có một
số nghiên cứu theo hƣớng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng
chuyển gene kháng lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực
vật – Viện Công nghệ sinh học là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam
thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gene
kháng virus. Tiếp đó, đề tài cấp nhà nƣớc ”Nghiên cứu tạo giống cây ăn quả
kháng bệnh virus phổ rộng bằng chuyển gene đa đoạn” (KC.04.03/06-10) đã
thiế t kế thành công 2 đoạn gene nhân tạo mang đa đoa ̣n gene CP , Nib và HCpro của PRSV và 2 đoạn gene đa đoạn RdRp-CP và RdRp-CP-p20-p23 của
virus Citrus tristeza virus (CTV) cũng nhƣ đã thiết kế thành công những cấu
trúc RNAi mang các gene đa đoạn này [1]. Phân tích phân tử cho thấy sự có
mặt của các cấu trúc RNAi trong nhiều dòng cây chuyển gene
trong đề tài cấ p Viện HLKH &CN Việt Nam đƣợc tiế n hành

[4]. Đặc biệt,
trong hai năm

2007-2008: “Nghiên cƣ́u ƣ́ng dụng kỹ thuật RNAi trong taọ giố ng cây trồ ng
chuyển gene kháng bệnh virus” đã tạo đƣợc một số kết quả đặt tiền đề cho
nghiên cứu tạo giống thuốc lá kháng bệnh khảm lá và xoăn đọt. Các kết quả
đạt đƣợc cụ thể nhƣ sau:
- Phân lập đƣợc đoạn gene CP của một số dòng virus TMV và CMV tại
một số tỉnh phía Bắc
- Thiết kế đƣợc một số cấu trúc RNAi mang đoạn gene CP của virus
TMV và CMV đồng thời tạo đƣợc các dòng cây thuốc lá chuyển gene mang
cấu trúc này
- Khả năng kháng virus TMV hoặc CMV của 100 dòng cây chuyển
gene trên quy mô nhà lƣới đạt tỷ lệ khoảng 75-84% Phân tích ELISA những
dòng cây biểu hiện kháng hoàn toàn đều không phát hiện đƣợc sự có mặt của
virus TMV.
- Tạo đƣợc một số dòng cây kháng đồng thời cả hai virus TMV và
CMV bằng chuyển cấu trúc mang đoạn gene của cả hai virus.

19


Kinh nghiệm trong đánh giá tính đa dạng di truyền virus, thiết kế cấu
trúc RNAi chuyển gene, taọ và phân tích cây thuốc lá chuyển gene đồng thời
kiểm tra tính kháng bằng lây nhiễm nhân tạo đƣợc nhóm nghiên cứu học hỏi
và phát huy trong đề tài này . Những kết quả nghiên cứu trên là bằng chứng
quan trọng chƣ́ng tỏ tính hiệu quả của công nghệ RNAi trong tạo cây thuốc lá
chuyển gene kháng virus và khả năng làm chủ công nghệ của các nhà khoa
học Việt Nam. Tuy vậy, do thời gian thực hiện đề tài cấ p Viện HLKH &CN

Việt Nam hạn chế nên những dòng cây chuyển gene tạo đƣợc còn bộc lộ một
số nhƣợc điểm khó phát triển thành dòng sản xuất:
- Mới nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm lá trên nền giống
K326. Nghiên cứu tạo cây kháng bệnh xoăn ngọn còn bỏ ngỏ. Nghiên cứu tạo
cây thuốc lá kháng đồng thời hai bệnh khảm lá và xoăn ngọn cũng chƣa đƣợc
đề cập trong nghiên cứu trƣớc đây.
- Virus có tính đa dạng di truyền cao nên chỉ phân tích gene CP của
các dòng TMV phân lập tại một số địa phƣơng phía Bắc chƣa đại diện đƣợc
cho virus TMV và TSWV gây bệnh trên cây thuốc lá tại Việt Nam. Cần thiết
phải phân tích bổ sung thêm các gene chính khác của hai virus này nhằm xây
dựng bức tranh toàn cảnh về virus gây bệnh khảm lá và xoăn ngọn trên cây
thuốc lá ở Việt Nam, đồng thời làm cơ sở nghiên cứu tạo cây chuyển gene có
tính kháng rộng.
- Các dòng cây chuyển gene tạo ra vẫn còn chứa gene chọn lọc kháng
kháng sinh, do vậy khả năng phát triển thành giống sẽ ít thuận lợi hơn nếu
nghiên cứu tạo đƣợc những cây chuyển gene không mang gene kháng kháng
sinh này.

20


Chƣơng 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguồn gene CP của virus
Plasmid pENTR/TCY mang vùng gene mã hoá cho CP (Coat protein)
của các loài virus TMV, CMV, cTYLCV. Plasmid pENTR/TSWV mang trình
tự gene mã hoá cho CP của virus TSWV do Phòng Công nghệ tế bào thực vật

- Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
Các loại vector: pK7GWIWG2(II), pNOV-gusplus, pENTRTM/D-TOPO®
do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học cung cấp.
2.1.2. Chủng vi khuẩn
E. coli DH5 và One Shot TOP 10 (Invitrogen), Agrobacterium
tumefaciensCV58do Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh
học cung cấp.
2.1.3. Nguồn thực vật
Giống thuốc lá Nicotiana tabacum L. K326 và C9-1 đang nuôi cấy trong
điều kiện in vitro (Phòng Công nghệ tế bào thực vật -Viện Công nghệ sinh học).
2.1.4. Hóa chất
Kit tinh sạch DNA (AccuPrep® Gel Purification Kit) và tách chiết
plasmidZ (Plasmid Extraction Kit, Bioneer, Hàn Quốc); bộ kit nhân dòng
pENTRTM Directional TOPO® Cloning Kit.
Bacto pepton, yeast extract, NaCl, mannose, sucrose, glucose, tryptone,
KCl, Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, glycerol, CaCl2, ethanol
70%, nƣớc khử ion. Các loại kháng sinh rifamycine, cefotacime,
streptomycine, spectinmycine, và các hóa chất thông dụng khác (agar,
agarose,...) của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham
Pharmacia Biotech…
2.1.5. Thiết bị
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di
Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, BioRad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy
Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A
21


(Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gene Plulser, cùng với các trang
thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng
điểm công nghệ gene, Viện Công nghệ sinh học.

2.2.

PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Thiết kế cấu trúc gene đa đoạn
Bảng 2.1 Danh sách các mồi
Tên mồi

Trình tự (5'-3')

TMV-CP-Fi-2

CACCGAAGTTGAAAATCAGG

cTYLCV-TSWV-Fi-1

TATCATCAACAGTTCTGCGAGTTTTGC

cTYLCV-TSWV-Ri-1

GCAAAACTCGCAGAACTGTTGATGATA

TSWV-CP-Ri-1

TTGCCATAATGCTAGGAGGT

Đoạn TMV-CP-Fi-2 đƣợc bổ sung thêm 4 nucleotide CACC để tƣơng
thích với đầu 3’ GTGG của vector nhân dòng pENTRTM/D-TOPO®
(Invitrogen) còn hai mồi cTYLCV-TSWV-Fi-1 và cTYLCV-TSWV-Ri-1 có
20 nucleotide gối lên nhau (10 nucleotit đầu 5’ của TMV và 10 nucleotide đầu

3’ của TSWV).
Việc thiết kế mồi đƣợc thực hiện tại các vùng bảo thủ nhất, vì vậy,
ngoài những trình tự gene CP đã có, một trình tự nhân tạo gene cTYLCV gồm
112 nucleotide của CP, 101 nucleotide C1/C2, 128 nucleotide C1/C4 và 56
nucleotidecủa βC1 đã đƣợc thiết kế thêm.
Ghép nối các đoạn gene theo các phƣơng pháp của Sambrook 1989 [38],
PCR khuếch đại và ghép nối tạo TCYS đƣợc thực hiện cụ thể theo 5 bƣớc sau:
Bƣớc 1: PCR khuếch đại đoạn gene đa đoạn TCY từ pENTR/TCY
bằng cặp mồi TMV-CP-Fi-2/cTYLCV-TSWV-Ri-1. Thành phần gồm 2,5 l
đệm PCR, 2 l dNTPs, 0,25 l Taq Pfu, 1 l mỗi loại mồi, 1-2 ng plasmid
pENTRY/TCY và bổ sung nƣớc tới tổng thể tích cuối cùng là 25 l. Chu kỳ
nhiệt: 94oC 3’; 25 chu kỳ (94oC 1’; 52oC 1’; 72oC 1’30’’); 72oC 10’; 4oC α.
Sản phẩm PCR có kích thƣớc khoảng 747 bp.
22


Bƣớc 2: PCR khuếch đại đoạn gene CP bảo thủ của TSWV bằng cặp
mồi cTYLCV-TSWV-Fi-1/TSWV-CP-Ri-1. Sản phẩm có kích thƣớc khoảng
280 bp.
Bƣớc 3: Điện di, chụp ảnh và thôi gel tinh sạch sản phẩm PCR ở bƣớc
1 và 2.
Bƣớc 4: Thực hiện PCR với thành phần gồm 5 l đệm PCR, 5 l dNTPs, 0,5
l Taq Pfu, 1-2 ng sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch từ bƣớc 1 và 2. Thực hiện chu kỳ

nhiệt: 94oC 3’; 5 chu kỳ (94oC 1’; 60oC 1’; 72oC 1’); 72oC 10’; 4oC α.
Bƣớc 5: Bổ sung 2 l mồi mỗi loại TMV-CP-Fi-2 và TSWV-CP-Ri-1
vào ống PCR, thực hiện tiếp phản ứng PCR với chu kỳ nhiệt nhƣ sau: 94 oC
3’; 25 chu kỳ (94oC 1’; 52oC 1’; 72oC 1’30’’); 72oC 10’; 4oC α. Sản phẩm
PCR cuối cùng có kích thƣớc khoảng 1000 bp.
Cấu trúc TCYS gồm CP của bốn loại virus đƣợc ghép nối vào vector

pENTRTM/D-TOPO® (Invitrogen), tạo thành pENTR/TCYS. Cấu trúc đã
đƣợc xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động. Sử dụng các phần mềm
DNAstar, BioEdit và MEGA 4 để sosánh các trình tự gene.
2.2.2. Thiết kế vector RNAi
2.2.2.1. Thiết kế vector RNAi tiếp nhận mang gene chọn lọc manA
Vector RNAi gốc chọn lọc bằng đƣờng mannose đƣợc tạo ra bằng cách
cắt và nối giữa vector chuyển gene pK7GWIWG2(II) với vector pNOVgusplus có chứa gene manA (Hình 2.1).

23


Hình 2.1: Mô hình thiết kế vector pK7M
Sử dụng các enzyme cắt giới hạn SphI, HindIIIvà enzyme tạo đầu bằng
T4 DNA polymerase để tạo trình tự RNAi từ vector pK7GWIWG2(II). Trình
tự gene manA thu đƣợc từ vector pNOV-gusplus nhờ phản ứng cắt bởi 2
enzyme PmeI và HindIII. Sản phẩm cắt của hai vector sau đó đƣợc ghép nối
với nhau nhờ enzyme T4 ligase để tạo ra vector RNAi mang cấu trúc gene
chọn lọc bằng đƣờng mannose (ký hiệu: pK7M). Sản phẩm sau đó đƣợc biến
nạp vào vi khuẩn E.coli chủng DH5α và đƣợc kiểm tra bằng phản ứng colonyPCR và phản ứng cắt bởi enzyme hạn chế XbaI, HindIII.

24


Bảng 2.2: Thành phần phản ứng cắt pK7GWIWG2(II) enzyme SphI
STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

pK7GWIWG2(II)

10

2

10X Buffer B

3

3

SphI (10u/ µl)

4

4

dH2O

13

Tổng

30

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng bởi T4 DNA Polymerase
STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

DNA (1 µg / µl)

35

2

Multi – CoreTM Buffer (10X)

5

3

dNTP (10 mM)

2

4

T4 DNA polymerase (100u/ µl)

1

4

dH2O

7

Tổng

50

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt bởi enzyme HindIII
STT

Thành phần

Thể tích (µl)

1

DNA (1 µg / µl)

30

2

Buffer R (10X)

4

3

Hind III (10 u/ µl)

2

4

dH2O

4

Tổng

40

25