Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ bằng Enzyme Protease vi sinh vật

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA


TRẦN VĂN KHIÊM

NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THỦY PHÂN
TỪ THỊT ĐỎ CÁC NGỪ BẰNG ENZYME PROTEASE
VI SINH VẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60420201

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Đà Nẵng – Năm 2018


Công trình được hoàn thành tại
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoàng Minh

Phản biện 1: TS. Lê Lý Thùy Trâm
Phản biện 2: PGS. TS Trần Thị Xô

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp
thạc sĩ công nghệ sinh học họp tại Trường Đại học Bách khoa vào
ngày 13 tháng 10 năm 2018

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

 Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng tại Trường Đại học Bách
khoa
 Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa - ĐHĐN


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cá ngừ (tuna) là nguồn lợi hải sản có giá trị dinh dưỡng, giá trị
sinh học và giá trị kinh tế cao. Theo Báo cáo xuất khẩu thủy sản Việt
nam Quý II, năm 2011, Việt Nam xuất khẩu gần 31 nghìn tấn cá ngừ,
trị giá 148 triệu USD, tăng gần 16% về khối lượng và 36,5% về giá
trị so với cùng kỳ năm ngoái. Hiện nay, có 87 doanh nghiệp tham gia
xuất khẩu cá ngừ sang 73 thị trường thế giới. Trong công nghiệp chế
biến cá ngừ, thành phần khối lượng của thịt cá ngừ chiếm khoảng
60%, phần còn lại là phế phẩm như đầu, xương, vây, thịt vụn… Phần
thịt thu nhận được sau quá trình chế biến bao gồm phần thịt trắng
được dùng để chế biến thành các mặt hàng như fillet, đồ hộp và xông
khói, còn phần thịt đỏ được loại bỏ do có chứa thành phần gây dị
ứng. Tùy theo loài, khối lượng phần thịt đỏ bị loại bỏ có thể lên tới
6,4% [13]. Ước tính lượng thịt đỏ cá ngừ này ở Việt Nam khoảng
1.000 tấn/năm. Quan trọng hơn nữa, phần thịt đỏ này có chứa hàm
lượng protein tương đối cao (14%). Nếu lượng thịt đỏ này không
được xử lý hết trước khi thải ra môi trường ngoài thì sẽ gây ảnh
hưởng nghiêm trọng tới môi trường [41]. Do đó, để giải quyết vấn đề
nêu trên, hiện nay rất nhiều nhà nghiên cứu đang quan tâm đến giải
pháp sử dụng enzyme protease để biến đổi nguồn protein trong thịt
đỏ cá ngừ thành các axit amin. Đây là giải pháp không chỉ giải quyết
vấn đề ô nhiễm môi trường nêu trên, mà còn góp phần tạo ra sản
phẩm dinh dưỡng giá trị cao.

Hiện nay, trên thế giới và tại Việt Nam đã có những công trình
nghiên cứu về thịt đỏ cá ngừ, đặc biệt là việc tìm cách sử dụng nguồn


2
phế phẩm này để phục vụ cho cuộc sống con người. Các nghiên cứu
này phát triển theo hướng sử dụng chính enzyme protease nội tại
trong con cá ngừ hoặc enzyme thương mại để thủy phân thịt đỏ cá
ngừ nhằm thu hồi protein [10, 13, 20, 38, 43]. Tuy nhiên, khi sử dụng
enzyme nội tại thì khả năng thủy phân không cao, còn với enzyme
thương mại thì không hiệu quả về mặt kinh tế.
Chính vì vậy, đề tài này đặt ra mục tiêu nghiên cứu khả năng
thủy phân protein trong thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ
hợp nhằm tiết kiệm chi phí sản xuất cũng như nâng cao khả năng
thủy phân thịt đỏ cá ngừ.
2. Mục đích nghiên cứu
- Biểu hiện gen nprC10 mã hóa protease từ Bacillus subtilis C10
trong chủng E. coli M15 nhờ hệ thống vector pQE30 nhằm thu nhận
enzyme protease tái tổ hợp.
- Xác định hoạt độ enzyme protease tái tổ hợp từ vi khuẩn
Bacillus subtilis C10 trên cơ chất thịt đỏ cá ngừ.
- Thu nhận dịch đạm thủy phân từ thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme
protease tái tổ hợp
3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
- Sản xuất chế phẩm enzyme protease npr C10 từ Bacillus
subtilis C10 bằng vi khuẩn E. coli M15 tái tổ hợp.
- Khảo sát các thông số thực hiện phản ứng thủy phân thịt đỏ cá
ngừ thu mua trên địa bàn Đà Nẵng bằng enzyme protease tái tổ hợp.
- Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Phương pháp vi sinh
- Nuôi cấy tế bào E. coli M15.


3
Phương pháp hóa sinh
- Xác định hoạt độ của enzyme theo phương pháp Anson cải tiến
[12]
- Xác định nồng độ protein sử dụng phương pháp Bradford
(1976) [29]
- Xác định hàm lượng nitơ tổng số và protein thô theo phương
pháp Kjeldahl [57].
Phương pháp th ng

v

s

i u

- Phương pháp xử lý số liệu: Tất cả số liệu được xử lý bằng
excel.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa hoa học
Cung cấp quy trình sản xuất dịch đạm thủy phân thịt đỏ cá ngừ
bằng enzyme protease tái tổ hợp dựa trên các thông số ảnh hưởng đến
quá trình thủy phân được khảo sát trong nghiên cứu (tỉ lệ enzyme/cơ
chất, nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng).
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Việc thực hiện công trình nghiên cứu khoa học này có một số ý

nghĩa thực tiễn như sau:
- Chủ động được nguồn enzyme protease trong điều kiện phòng
thí nghiệm cho việc thủy phân các nguồn cơ chất giàu protein khác
nhau.
- Tận dụng nguồn nguyên liệu phế phụ phẩm là thịt đỏ cá ngừ
giàu protein từ các nhà máy chế biến thủy sản trên địa bàn thành phố
Đà Nẵng để sản xuất dịch đạm thủy phân và từ đó nghiên cứu phát
triển mặt hàng mới như bột dinh dưỡng, bột gia vị làm tăng giá trị
cho nguyên liệu.


4
- Thịt đỏ cá ngừ giàu protein nếu thải ra môi trường là điều kiện
thích hợp cho vi sinh vật có hại phát triển. Việc nghiên cứu chế biến
thịt đỏ cá ngừ nếu thành công có thể góp phần ngăn ngừa nguy cơ
gây ô nhiễm môi trường.
6. Cấu trúc của luận văn
Luận văn gồm có những chương mục sau:
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


5
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về protease

1.1.1. Giới thi u chung
Nhóm enzyme protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên
kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và polypeptide đến sản
phẩm cuối cùng là axit amin. Ngoài ra nhiều protease có khả năng
liên kết este và vận chuyển acid amin.
1.1.2. Phân oại enzyme protease
Theo Barett và Donald (1956), protease được chia ra thành hai
nhóm lớn là nhóm endopeptidase và nhóm exopeptidase.
- Nhóm 1: Endopeptidase là các enzyme protease phân cắt các
liên kết peptide nằm trong mạch polypeptide. Dựa vào động học của
cơ chế xúc tác endopeptidase được chia thành bốn phân nhóm:
- Nhóm 2: Exopeptidase là nhóm enzyme protease có khả năng
thủy phân liên kết peptide ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc
đầu amine hoặc đầu carboxyl, tuần tự tách từng acid amin ra khỏi
chuỗi polypeptide.
1.1.3. Nguồn thu nhận protease
Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất
tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh
vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng chủ
yếu vẫn là ba nguồn chính: động vật (có nhiều ở gan, dạ dày bê...),
thực vật (đu đủ, dứa...) và vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus).
1.1.4. Thu nhận enzyme
Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội
bào (intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật


6
tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular
enzyme). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào.
Để kết tủa protein cho mục đích tinh sạch, người ta thường dùng

dung môi hữu cơ như ethanol hay aceton hoặc muối trung tính
1.1.5. Thủy phân protein bằng enzyme protease
Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị
dương (dispositive bonds) trong hợp chất hữu cơ thành các thành
phần đơn giản dưới tác dụng của các chất xúc tác và có sự tham gia
của các yếu tố nước trong phản ứng [22]. Dưới sự xúc tác của
enzyme protease, quá trình thủy phân protein diễn ra như sau:
Protein → polypeptide → peptone → peptide → acid amin
a) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng
enzyme
Quá trình thủy phân chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: nhiệt độ,
pH, nồng độ cơ chất và enzyme, sự có mặt hay không có mặt của
chất hoạt hóa và chất kìm hãm, lượng nước thêm vào.
1.1.6. Ứng dụng của protease
1.1.6.1. Trong công nghiệp thực phẩm
1.1.6.2. Trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa
1.1.6.3. Trong công nghiệp thuộc da
1.1.6.4. Trong y học
1.1.6.5. Trong xử lý ô nhiễm môi trường
1.1.6.6. Trong công nghiệp dệt
1.2. Tổng quan về cá ngừ
1.2.1. Giới thi u về cá ngừ
Cá ngừ thuộc họ cá thu ngừ (Scombridae) có giá trị kinh tế quan
trọng nhất ở biển Việt Nam. Cá ngừ phân bố ở khắp các vùng biển


7
Việt Nam, kích thước cá tương đối lớn (6 loài có kích thước từ 20 70 cm, khối lượng từ 0,5 - 4 kg [17].
1.2.2. Th nh phần hóa học của cá ngừ
Năm 2006, dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản do

Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam chủ trì đã công bố
thành phần hóa học của một số loài cá ngừ đại dương như mô tả
trong bảng 1.2 [4].
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số cá ngừ đại dương
Nƣớc (%) Protein (%) Lipid (%) Tro (%)

Loài
Cá ngừ vây vàng

74,4

23,6

1,4

2,3

Cá ngừ mắt to

77,5

21

0,3

1,2

Cá ngừ vây

Thịt đỏ

68,7

28,3

1,4

0,1

xanh

Thịt trắng

52,6

24,3

21,4

1,3

Cá ngừ vây

Thịt đỏ

56

23,6

9,3

1,4

63,9

23,1

11,6

0,3

xanh
Phương Nam Thịt trắng

Trong thịt đỏ cá ngừ có một lượng lớn protein, nước và chất béo.
Hàm lượng các chất có trong thịt đỏ cá ngừ được thể hiện ở bảng 1.3.


8
Bảng 1.3. Hàm lượng các chất và năng lượng trong 100 g thịt đỏ cá
ngừ [50]
Thành phần

Hàm lƣợng

Calorie (kcal/100g)

120.0

Độ ẩm (g/100g)

69.37

Protein (g/100g)

18.28

Chất béo (g/100g)

4.631

Carbohydrate (g/100g)

0.750

1.3. Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp
1.3.1. Công ngh DNA tái tổ hợp
Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử
để định vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA.
Sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép chủ động về
nguyên liệu cung cấp enzyme ban đầu; nâng cao hiệu suất sản xuất,
chất lượng của enzyme; dễ dàng công nghệ hóa quá trình sản xuất và
nhờ đó làm giảm giá thành sản phẩm. Để sản xuất enzyme tái tổ hợp,
các nhà nghiên cứu phải tạo dòng được gen mã hóa cho enzyme quan
tâm, thiết lập hệ thống biểu hiện và tiếp theo là cải tiến hệ thống biểu
hiện để enzyme được sản xuất nhiều hơn theo một cơ chế điều hòa
đơn giản [15]. Hơn 60% các loại enzyme được sử dụng trong các
ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, thực phẩm và tinh bột là các
sản phẩm tái tổ hợp [32].

9
1.3.2. H th ng biểu hi n E. co i
1.3.2.1. Hệ thống vật chủ E. coli
Việc sản xuất các protein tái tổ hợp có thể được thực hiện bằng
nhiều hệ thống vật chủ biểu hiện khác nhau như vi khuẩn, nấm men,
nấm mốc và các tế bào động vật có vú, trong đó, hệ thống biểu hiện
sử dụng tế bào vi khuẩn E. coli được ưa chuộng nhất.
Hiện nay có rất nhiều chủng E.coli đã được tiêu chuẩn hóa cho
quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp và có sẵn trên thị trường như E.
coli BL21, E. coli K12, E. coli M15.
1.3.2.2. Họ vector pQE
Quá trình biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào E. coli M15
sử dụng hệ vector pQE được thực hiện dựa trên hoạt động điều hòa
của promoter T5.
Quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp sử dụng hệ vector pQE
được cảm ứng bởi IPTG. IPTG gắn lên protein ức chế và bất hoạt nó.
Một khi chất ức chế bị bất hoạt, enzyme RNA polymerase của vật
chủ biểu hiện có thể phiên mã trình tự đích. Các đoạn phiên mã được
tạo ra sẽ được dịch mã thành các protein tái tổ hợp [62].
1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu protease tái tổ hợp
1.4.1. Tình hình nghi n cứu tr n thế giới
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu sử dụng enzyme
protease để thủy phân protein từ các nguồn cơ chất khác nhau, nhằm
sản xuất ra các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng và dễ hấp thụ.
Quá trình thủy phân phụ phẩm cá tra bằng việc sử dụng enzyme
protease từ Bacillus subtilis, một loại vi khuẩn có khả năng thích nghi
cao, có thể tổng hợp được nhiều loại enzyme cần thiết (amylase,
hemicellulase, glucanase, xylanase, protease…) trong quá trình sống
để thích ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện môi trường (E.El

Mayday và cộng sự, 1989) đang được quan tâm nghiên cứu và có


10
nhiều triển vọng để ứng dụng trong sản xuất trên thực tế [46].
Ovissipour cùng các cộng sự đã tiến hành tối ưu hóa quá trình
thủy phân chất thải nội tạng của cá ngừ vây vàng (Thunnus
albacares) vào năm 2010. Tác giả đã chỉ ra rằng điều kiện tối ưu để
đạt đến mức thủy phân cao nhất là: nhiệt độ 60,40C, thời gian 90,25
phút và hoạt tính protease (Alcalase 2.4 L) là 70.22 AU/kg protein.
Protein nội tạng của cá ngừ đã sấy khô có hàm lượng protein tương
đối cao (72,34%) và hàm lượng lipid thấp (1,43%). Ngoài ra, tỷ lệ
hiệu suất protein của thủy phân nội tạng cá ngừ là 2,85-5,35 [58].
1.4.2. Tình hình nghi n cứu trong nước
Các nghiên cứu về khả năng thủy phân của enzyme protease đã
được tiến hành từ những năm đầu thế kỷ 21. Năm 2006, Trần Quốc
Hiền và Lê Văn Việt đã thu nhận được enzyme protease từ ruột cá ba
sa (Pangasius bocourti) với hoạt tính cao nhất là 15,79 UI/g CKNT
(chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1
(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 350C; thời gian chiết 10 phút [18].
Người tiên phong trong việc ứng dụng DNA tái tổ hợp liên quan
đến enzyme protease là Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự (2011). Tác
giả đã biểu hiện thành công gen nprC10 mã hóa cho enzyme protease
trung tính (NPRC10) từ Bacillus subtilis C10 trong hệ thống tế bào
biểu hiện E. coli BL21 (DE3) [52].
Nghiên cứu theo hướng sử dụng enzyme protease thương mại đã
được Nguyễn Thị Mỹ Hương thực hiện trên phụ phẩm đầu cá ngừ
vây vàng vào năm 2012. [10].
Enzyme Protamex, một enzyme thương mại phổ quát, đã được
tác giả Trần Thị Bích Thủy sử dụng để thủy phân cá trích (Sardinella

Gibbosa) trong một nghiên cứu tiến hành vào năm 2016 [20].


11
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Chủng vi sinh vật
- Chủng E.coli M15 có chứa vector pQE 30 đã được gắn gen npr
C10 mã hóa cho protease phân lập từ Bacillus subtilis C10
- Bacillus subtilis C10.
- Chủng E. coli hoang dại.
2.1.2. Nguy n i u v hóa chất
* Thịt đỏ cá ngừ: được thu mua tại khu vực Đà Nẵng.
- Môi trường LB
- Môi trường LB cải tiến
- Hóa chất sử dụng cho quá trình giữ giống và phân tích hóa
sinh.
2.1.3. Thiết bị s dụng
Quá trình nghiên cứu sử dụng các thiết bị có trong phòng thí
nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại Học Bách Khoa
– Đại học Đà Nẵng.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp bảo quản gi ng
2.2.2. Các phương pháp nuôi cấy E.co i M15
2.2.2.1. Phương pháp hoạt hóa giống
2.2.2.2. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh
2.2.2.3. Phương pháp nuôi cấy thu nhận dịch enzyme protease thô từ
vi khuẩn E.coli M15 tái tổ hợp
2.2.3. Phương pháp ây dựng đường cong tăng trưởng của E.co i
M15

12
2.2.4. Phương pháp định tính protease
2.2.5. Khảo sát sự biểu hi n của vi huẩn E. co i M15 tái tổ hợp
2.2.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
2.2.5.2. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng
2.2.5.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng
2.2.6. Đánh giá hoạt độ enzyme protease thu được từ quá trình
nuôi cấy E.co i M15
2.2.6.1. Xác định hoạt độ chung của protease
Hoạt độ chung protease của enzyme NPRC10 được xác định
theo phương pháp Anson cải tiến [12].
Một đơn vị hoạt độ protease (IU) được định nghĩa là lượng
enzyme mà trong một phút cần để giải phóng 1 µg tyrosine ở điều
kiện thí nghiệm.
2.2.6.2. Xác định hoạt độ riêng của protease
Protein tổng số của dịch chiết được xác định theo phương pháp
Bradford (1976) [29].
Hoạt độ riêng (unit/mg) protease của enzyme NPRC10 bằng hoạt
độ chung của nó chia cho hàm lượng protein tổng số.
2.2.7. Phương pháp ết tủa enzyme protease
2.2.7.1. Kết tủa enzyme bằng muối amoni sunfat (NH4)2SO4
2.2.7.2. Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ
2.2.8. Xác định các thông s phản ứng enzyme để thủy phân thịt đỏ
cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp
2.2.8.1. Xác định tỷ lệ enzyme/thịt đỏ
2.2.8.2. Xác định thời gian phản ứng
2.2.8.3. Xác định nhiệt độ phản ứng enzyme phù hợp

13
2.2.9. X

th ng

Số liệu thí nghiệm là kết quả trung bình cộng của ít nhất 3 lần
lặp lại. Kết quả thí nghiệm được xử lý để thu giá trị trung bình và
phân tích trên phần mềm Excel.


14
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát khả năng sinh trƣởng và sinh enzyme protease của
chủng vi khuẩn E.coli M15
3.1.1. Đường cong sinh trưởng của vi huẩn E.co i M15
Để khảo sát tốc độ sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn
E.coli M15 tái tổ hợp, đường cong sinh trưởng của chủng đã được
xây dựng dựa trên giá trị mật độ mật độ tế bào (giá trị OD600) sau mỗi
giờ nuôi cấy (hình 3.1).
6

50

5

40

4

30

3
20

2

10

1
0

0
1

3

5

7

9

11 13 15 17 19 21 23 25 27 29

Thời gian nuôi cấy (giờ)
CFU/ml

OD600

Hình 3.1. Đường cong sinh trưởng của E.coli M15
Kết luận: Quá trình sinh tổng hợp protease tái tổ hợp phụ thuộc
vào thời điểm bổ sungchất cảm ứng vào canh trường nuôi cấy.Thời
điểm đó thường nằm trong pha logarit vì trong pha này số lượng tế
bào vi khuẩn lớn, tế bào vi khuẩn đang phát triển ở trạng thái tốt
nhất. Do đó, chúng tôi quyết định chọn thời gian cảm ứng để sinh
enzyme là 5 giờ sau nuôi cấy (OD đạt giá trị 2-3).


15
3.1.2. Xác định hả năng sinh enzyme protease của vi huẩn E.co i
M15
Để khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng E.coli
M15 tái tổ hợp, phương pháp đục lỗ thạch đã được sử dụng.
Kết quả ở hình 3.2 cho thấy vòng thủy phân xuất hiện xung
quanh các lỗ thạch chứa dịch enzyme protease thô thu được từ canh
trường nuôi cấy chủng E. coli M15 tái tổ hợp và chủng B. subtilis
hoang dại (đối chứng dương). Trong trường hợp đối chứng âm (-) là
dịch chiết từ chủng E. coli hoang dại, vòng thủy phân không được
quan sát. Điều này chứng tỏ enzyme protease NprC10 đã được tiết ra
ngoài tế bào E. coli M15 tái tổ hợp và có khả năng phân giải casein.

Hình 3.2. Hình ảnh vòng tròn thủy phân casein
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả
năng sinh tổng hợp enzyme protease NprC10 của vi khuẩn E.coli
M15 tái tổ hợp


16
3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ

n hả năng sinh tổng hợp

enzyme protease NprC10 của E. co i M15 tái tổ hợp
Nguồn nitơ (như pepton, tryptone) đóng vai trò quan trọng cho
sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Để đánh giá ảnh hưởng
của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp protease NprC10 tái tổ
hợp, chúng tôi tiến hành nuôi cấy E.coli M15 tái tổ hợp mang gen
nprC10 trong môi trường LB (chứa trypton) và môi trường LB cải
tiến (chứa pepton) có bố sung kháng sinh phù hợp. Dịch enzyme thô
được thu sau 19 giờ cảm ứng với 1 mM IPTG. Kết quả ở hình 3.3
cho thấy hoạt độ protease khi nuôi trên môi trường LB cải tiến (6,768
U/ml) tăng gấp 2 lần so với môi trường LB thông thường (2,83
U/ml).
8.000

[CELLREF]

Hoạt độ enzyme (U/ml)

7.000
6.000
5.000

4.000
3.000

[CELLREF]

2.000

1.000
0.000
LB

Môi trường nuôi cấy LB cải tiến

Hình 3.3. Ảnh hưởng của môi trường lên hoạt độ protease
Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn môi
trường LB cải tiến cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian

n

hả năng sinh tổng hợp

enzyme protease NprC10 của E. co i M15 sau hi cảm ứng
Với mục tiêu lựa chọn thời điểm thích hợp để thu nhận dịch


17
enzyme thô, sau khi cảm ứng, chúng tôi tiến hành thu dich enzyme

Hoạt độ enzyme (U/ml)

thô tại các mốc thời gian 2, 4, 6, 17, 19 và 21 giờ.
8.000

[CELLREF]

7.000

6.000

[CELLREF]

[CELLREF]

5.000
4.000
3.000
2.000
1.000

[CELLREF]

[CELLREF] [CELLREF]

0.000
2

4

6

17

19

21

Thời gian (giờ)

Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng lên hoạt độ protease
Kết quả ở hình 3.4 chỉ ra rằng sau khi bổ sung chất cảm ứng hoạt
tính protease tăng dần và đạt giá trị cao nhất (6,768 U/mL) ở thời
điểm 19 giờ.
Kết luận cho phần thí nghiệm này, chúng tôi lựa chọn thời điểm
19 giờ sau cảm ứng để thu nhận dịch enzyme thô.
3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng

n hả năng sinh

tổng hợp enzyme protease NprC10 của E. co i M15
Kết quả trình bày ở hình 3.5 cho thấy, khi nồng độ IPTG tăng từ
0.25 đến 1 mM, hoạt độ của enzyme cũng tăng theo và đạt giá trị cao
nhất (6,694 U/ml) tại giá trị 1mM IPTG. Hoạt độ protease đã giảm
4,3 lần khi nồng độ IPTG cuối là 1,5 và mất dần hoạt tính ở nồng độ
2 mM IPTG. Điều này cho thấy nồng độ cao của IPTG đã gây độc
cho tế bào E.coli.


18

Hoạt độ enzyme (U/ml)

8.000
[CELLREF]
[CELLREF]

7.000
6.000

[CELLREF][CELLREF]

5.000
4.000
3.000

[CELLREF]

2.000
1.000 [CELLREF]

[CELLREF]

0.000
0,00

0,25

0,5

0,75

1,00

1,5

2,00

Nồng độ IPTG (mM)
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ cảm ứng lên hoạt độ protease

3.3. Kết quả nghiên cứu quá trình kết tủa protease E.coli M15

Hoạt độ enzyme (U/ml)

Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.6.
35.000
30.000
25.000
20.000
15.000
10.000
5.000
0.000

[CELLREF]

[CELLREF]
[CELLREF]

Đối chứng

[CELLREF]

(NH4)2SO4 Acetone (80%) Ethanol (80%)
(70% độ bão
hòa)

Tác nhân tủa
Hình 3.6. Ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme
protease

Từ những kết quả nghiên cứu thu được ở trên chúng tôi nhận
thấy rằng:


19
+ Hoạt tính protease thu được khác nhau khi sử dụng các nồng
độ khác nhau của các tác nhân tủa. Trong 3 tác nhân tủa, muối amoni
sulfate cho hiệu quả tủa cao nhất với hoạt tính protease, đạt 31,725
U/ml, (cao hơn 15 lần so với trường hợp sử dụng ethanol, và 2 lần so
với trường hợp sử dụng aceton).
Do đó, chúng tôi chọn muối (NH4)2SO4 với nồng độ đạt 70% độ
bão hòa là tác nhân tủa thích hợp cho việc thu nhận chế phẩm
protease từ E.coli M15.
3.4. Xác định các thông số của phản ứng ảnh hƣởng đến hiệu quả
thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái tổ hợp
3.4.1. Kết quả ảnh hưởng của tỷ

enzyme/cơ chất đến hi u quả

thủy phân bằng enzyme protease NPRC10

Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng nitơ tổng
số trong dịch đạm và hiệu suất thu hồi nitơ từ thịt đỏ cá ngừ
Hình 3.7 cho thấy khi tăng tỉ lệ enzyme/nguyên liệu từ 0,4% lên
6,4% thì hàm lượng nitơ tổng số trong dịch đạm thay đổi tương ứng


20
với hiệu suất thu hồi nitơ. Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy
với tỉ lệ enzyme/nguyên liệu là 1,6% thì hàm lượng nitơ tổng số trong

dịch thủy phân (3,1%) và, hiệu suất thu hồi nitơ (68,81%) là cao nhất.
Đây là tỉ lệ phù hợp để enzyme protease kết hợp với nguyên liệu thực
hiện quá trình thủy phân.
Từ kết quả phân tích trên cho thấy ở tỷ lệ enzyme so với cơ chất
là 1,6% có hiệu suất thu hồi cao nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn tỷ lệ
enzyme là 1,6% cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.2. Xác định ảnh hưởng của thời gian đến hi u quả thủy phân
bằng enzyme protease NPRC10

Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi nitơ

Kết quả nghiên cứu (hình 3.8) cho thấy hiệu suất thu hồi nitơ
trong sản phẩm thủy phân tăng theo thời gian thủy phân. Cụ thể, thời
gian thủy phân tăng từ 2 giờ đến 5 giờ thì hiệu suất thu hồi nitơ tăng
đáng kể từ 61,77% lên 77,11%.
Từ những kết quả phân tích ở trên, chúng tôi chọn thời gian tối


21
ưu cho quá trình thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease tái
tổ hợp là 5,0 giờ.
3.4.3. Xác định nhi t độ phản ứng enzyme phù hợp
85.55

90.00

78.66

Hiệu suất thu hồi Nitơ (%)

80.00

70.00
60.00
47.10

50.00
40.00

33.99

30.00
20.00
10.00
0.00
30.00

40.00

50.00

Nhiệt độ thủy phân

60.00

(0C)

Hình 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hiệu suất thu hồi
nitơ (%) khi thủy phân thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme protease NPRC10
Kết quả thể hiện trên hình 3.9 cho thấy nhiệt độ thủy phân có

ảnh hưởng lớn đến hiệu suất thu hồi nitơ (%) dước xúc tác của
enzyme protease. Khi tăng nhiệt độ thủy phân từ 300C lên 500C thì
hiệu suất thu hồi nitơ (%) tăng đáng kể từ 33,99% lên 85,55%. Sau
đó, giá trị này giảm đáng kể khi nhiệt độ tăng lên 600C với hiệu suất
thu hồi nitơ (%) 78,66%. Kết quả này cũng tương ứng với kết quả
thủy phân protein cá hồi Atlantic và và cá trích [44], [20]. Điều này
có thể giải thích khi tăng nhiệt độ thủy phân thì tốc độ phản ứng cũng
tăng lên do các phân tử enzyme có động năng lớn hơn, tăng cường
khả năng tiếp xúc với cơ chất, do đó quá trình thủy phân sẽ được tăng


22
cường và đạt cực đại tại nhiệt độ tối thích.
Tuy nhiên khi tăng nhiệt độ thủy phân vượt quá 500C, hoạt tính
của enzyme protease đã bị giảm. Điều này có thể do enzyme bắt đầu
bị biến tính tại nhiệt độ này. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất thu
hồi nitơ (%) đối với enzyme protease trong nghiên cứu này tương
đồng với kết quả nghiên cứu sử dụng enzyme Protamex thủy phân
nguyên liệu giàu protein từ cá trích và cá ngừ của Trần Thị Bích
Thủy và cộng sự (2016) và Nguyễn Thị Mỹ Hương (2012) [20], [10].
Dựa vào kết quả phân tích ở trên ta có thể thấy ở 500C enzyme
hoạt động tốt nhất. Do đó chọn nhiệt độ tối ưu cho enzyme là 500C.
3.4.4. Kết uận hảo sát đơn biến
Nghiên cứu đã tìm ra điều kiện thích hợp để thực hiện phản ứng
thủy phân thu dịch đạm từ protein thịt đỏ cá ngừ bằng enzyme
protease tái tổ hợp NPRC10: thời gian phản ứng 5,0 giờ, tỷ lệ
enzyme/cơ chất là 1,6% và nhiệt độ phản ứng là 500C. Hiệu suất thu
hồi nitơ (%) đạt được là 85,55%.

23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
A. Kết luận
Qua kết quả quá trình nghiên cứu tôi đưa ra kết luận sau:
- Đã xác định được khả năng sinh protease ngoại bào của vi
khuẩn E.coli M15 mang vector pQE30 có gắn gen npr C10 từ
Bacillus subtilis C10 với điều kiện:
+ Môi trường nuôi cấy: môi trường LB cải tiến (mỗi lít chứa:
10g peptone, 5g chiết xuất nấm men, 10g NaCL, pH 7,4).
+ Điều kiện biểu hiện protease: Tăng sinh tế bào đến khi mật độ
tế bào (OD600) đạt [2-3] (tương đương 5 giờ nuôi cấy), sau đó cảm
ứng bằng 1 mM IPTG trong 19 giờ với nhiệt độ 370C và tốc độ lắc
250 vòng/phút.
- Đã xác định được điều kiện tủa enzyme: tủa bằng muối
(NH4)2SO4 với nồng độ đạt 70% độ bão hòa.
- Đã xác định được điều kiện thủy phân protein thịt đỏ cá ngừ
bằng enzyme protease bằng phương pháp khảo sát đơn biến với các
thông số phản ứng như sau: thời gian phản ứng là 5 giờ; tỷ lệ
enzyme/cơ chất = 1,6/100 (v/w); nhiệt độ phản ứng là 500C. Khi đó
hiệu suất thu hồi nitơ (%) đạt cực đại (85,55%).
B. Kiến nghị
- Tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng
hợp protease tái tổ hợp của E.coli M15 (mật độ tế bào trước khi cảm
ứng, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ tinh bột hòa tan, nồng độ ion Ca2+)
- Tinh sạch protease tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực
- Nghiên cứu sử dụng enzyme protease NPRC10 để thủy phân
các nguồn phế phẩm giàu protein khác.