Thu nhận hợp chất Alkaloid từ nuôi cấy in vitro tế bào cây dừa cạn

MỤC LỤC
Mở đầu: .............................................................................................2
I. Tổng quan về HCTC và ALKALOID: ...........................................4
A. Hợp chất thứ cấp: ..........................................................................4
1. Định nghĩa: ....................................................................................4
2. Vài nét về tình hình nghiên cứu các HCTC ở Việt Nam: ...............4
B. Alkaloid: .......................................................................................5
1. Lịch sử phát triển: ..........................................................................5
2. Khái niệm về Alkaloid: ..................................................................6
II. Thu nhận các hợp chất Alkaloid từ loài Catharanthus roseus (L.)
G.Don bằng phương pháp nuôi cấy tế bào: ........................................9
III. Thu nhận Alkaloid từ nuôi cấy in vitro tế bào cây dừa cạn: .......16
1. Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào: ..................................................18
2. Nuôi cấy mô sẹo: .........................................................................19
3. Hột nhân tạo: ...............................................................................20
4. Nuôi cấy mô phân sinh: ...............................................................21
5. Nuôi cấy rễ tơ: .............................................................................22
6. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng: ..................................22
Tài liệu tham khảo: ..........................................................................28
MỞ ĐẦU
1
Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệ sinh
học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung. Thế kỷ 21
được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học.Việt Nam là nước nhiệt đới có khí
hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của thực vật và đây được coi là một kho
tàng vô giá về nguồn hợp chất tự nhiên và nguồn nguyên liệu để phát triển ngành
công nghệ sinh học nước nhà.
Trong những năm gần đây, công nghệ tách chiết các hợp chất từ thực vật đã
không ngừng phát triển và và bước đầu đạt được những thành quả đáng kể. Trên thế
giới từ rất lâu người ta đã ứng dụng những công nghệ này để sản xuất các chất có
hoạt tính sinh học, phục vụ cho nghiên cứu, sản xuất và phục vụ lợi ích của con

người. Những nghiên cứu về hợp chất có hoạt tính sinh học ở thực vật phát triển từ
những năm 1950. Có khoảng hơn 30.000 hợp chất được chiết xuất từ thực vật có hoạt
tính và rất có giá trị đối với cuộc sống. Những hợp chất này như các alkaloid,
terpenoid, phenolic… được biết đến như là các hợp chất thứ cấp. Các hợp chất này
thường chỉ được tạo ra ở một số loại tế bào nhất định như các tế bào rễ tơ, biểu mô,
hoa, lá…
Mặc dù, hóa học tổng hợp hữu cơ đạt nhiều thành tựu quan trọng nhưng nhiều
hợp chất có hoạt tính sinh học (thường gọi là các chất thứ cấp) vẫn còn khó tổng hợp
hoặc có thể tổng hợp được nhưng chi phí rất đắt. Chẳng hạn, một số hỗn hợp phức
tạp như tinh dầu hoa hồng là không thể tổng hợp hóa học được.
Ngày nay, những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây
cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc
sức khoẻ con người. Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ
thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v... Mặc
dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt
dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong
rất nhiều song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ
đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp,
2
gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm
những dược phẩm mới cho việc điều trị các bệnh thông thường cũng như các bệnh
nan y.
Tuy nhiên nguồn thực vật ngoài thiên nhiên cũng đang ngày một hạn hẹp,hơn nựa
khi chiết xuất hợp chất từ thiên nhiên thường hiệu suất không cao.Ứng dụng nuôi cấy
tế bào đơn để thu nhận hợp chất tự nhiên đang là một hướng mới cho ngành công
nghệ sinh học hiện nay.Một trong nhữ hợp chất được thu nhận thành công từ nuôi cấy
tế bào đơn là các hợp chất alkaloid.
I.TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT THỨ CẤP VÀ ALKALOID.
A.HỢP CHẤT THỨ CẤP
1.Định nghĩa:

3
Sản phẩm trao đổi chất bậc hai hay hợp chất thứ cấp là những sản phẩm được tạo
ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào,sau đó chúng thoát
ra khỏi tế bào và đi ra môi trường ngoài.
Phần lớn các sản phẩm bậc hai thường không có ý nghĩa sinh lý đối với bản thân tế
bào.Quá trình tạo ra các sản phẩm bậc hai chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất
tự nhiên của tế bào,cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn
đến hiện tượng sinh tổng hợp thừa.
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực
phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp,
thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất
chưa được biết đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của
thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật.
Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ
cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002). Các chất trao đổi thứ cấp có thể
xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
2.Vài nét về tình hình nghiên cứu hợp chất thứ cấp ở Việt Nam.
Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứu cấp chủ yếu gắn liền với
công nghệ nuôi cấy tế bào và chúng phát triển vào những năm 1970. Từ đó đến nay
đã đạt được nhiều thành công, đáng kể nhất chính là quy trình sản xuất sâm Ngọc
Linh do Học viện Quân y khai thác. Phương pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ sâm
Ngọc Linh được cấp bằng độc quyền sáng chế số 7523 vào ngày 11/02/2009 tại Việt
Nam.
Việt Nam cũng đang triển khai các dự án nuôi cấy và chiết xuất taxol từ cây
thông đỏ ở Lâm Đồng. Ngoài ra còn có “Nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng kỹ
thuật nuôi cấy tế bào từ cây thanh hao hoa vàng” của Viện Sinh học Nhiệt đới
trong nghị định thư hợp tác với Malaysia (2007-2010) hay đại học Huế “Nghiên
4
cứu khả năng tích lũy glycoalkaloid ở callus cây cà gai leo Solanum hainanense”.
Tuy nhiên, những dự án nói trên vẫn còn ở quy mô phòng thí nghiệm.

B. Alkaloid.
1 Lịch sử phát hiện.
Năm 1804- 1805, pháp và Đức đã phân lập được morphin và điều chế được
dạng muối của nó. Đồng thời đã chứng minh được morphin là hoạt chất chính của
cây thuốc phiện có tác dụng sinh lý rõ rệt.
Năm 1980, từ vỏ cây canhkina, đã chiết và kết tinh được một chất đặt tên là
“cinchonino” sau đó hai nhà hóa học pháp đã xác định cinchonino là hỗn hợp của hai
alcaloid là quinin và cinchonin.
Năm 1918, phát hiện ra alcaloid của hạt mã tiền là strycnin và bruxin.
Năm 1918 phát hiện ra được cafein trong chè, cà phê rồi sau đó là nicotin trong
thuốc lá, atropin trong cà độc dược, theobromin trong cacao, codein trong thuốc
phiện, cocain trong lá coca.
Giữa năm 1973, người ta đã xác định được 4959 Alcaloid khác nhau trong đó có
3293 chất đã xác định được công thức hóa học. Hiện nay đã phát hiện ra được rất
nhiều số lượng Alcaloid và cũng đã đưa vào ứng dụng trong y học ngày một tăng .
2 Khái quát về Alkaloid
2.1 Khái niệm.
Alkaloid có nguồn gốc từ chữ: alcali tiếng Ả rập là kiềm. Alkaloid là:
- Những hợp chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, có tính bazơ thường gặp ở trong
nhiều loài thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật.
- Có phản ứng kiềm cho các muối với acid và các muối này dễ kết tinh.
5
- Có hoạt tính sinh học rất quan trọng.
- Có một số phản ứng chung là tạo “tủa“ cần thiết cho sự xác định chúng.
Chúng là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng về nhiều mặt. Đặc biệt trong lĩnh
vực y học, chúng cung cấp nhiều loại thuốc có giá trị chữa bệnh cao và độc đáo.
2.2 Cấu tạo hóa học.
Về mặt hóa học, sự phong phú và đa dạng của alkaloid đã trở thành một chuyên
nghành, chiếm một vị trí quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và trong tạp chí thông
tin về hóa học. Đối với việc nghiên cứu alkaloid còn quan trọng hơn bởi vì chúng có

hệ thực vật nhiệt đới phong phú là nguồn cung cấp alkaloid chủ yếu.
Về mặt cấu trúc hóa học, chúng có ít nhất 1 nguyên tử N trong phân tử, chủ yếu
nằm trong vòng. Có ý kiến xếp các hợp chất có N ngoài vòng như Colchicin,
Hordenin, là các protoalkaloid. Sự có mặt của nguyên tử của N trong cấu trúc quyết
định tính bazơ của alkaloid và là chỗ dựa rất quan trọng cho các nhà hóa học trong
nghiên cứu alkaloid.
2.3 Phân loại.
Đã biết có đến trên 250 dạng cấu trúc khác nhau với hơn 5.500 hợp chất alkaloid
trong tự nhiên. Vì vậy cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản trước đây
(khoảng 20 nhóm cấu trúc) xét ra chưa đáp ứng nên ngày càng có xu hướng chia
chúng thành những nhóm nhỏ: nhóm alkaloid Ecgotamia, Harmin, Yohimbin,
Strychnin, Echitamin. Nhóm alkaloid có nhân isoquinolin được chia thành các nhóm:
Benzyliaoquinolin, Apocphin, Protobecberin, Benzophenanthridin.
Bảng 1:Một số dạng cấu trúc nhóm Alkaloid
Tên cấu trúc Công thức Hợp chất thí dụ
6
Apocphin Stephanin, Apomocphin
Erythrinan Erythratin
Pyrolidin Nicotin, Stachydrin,
Hygrin
Indol Reserpin, Strychnin,
Echitamin
Mocphinan Mocphin, Codein
Purin Cafein, Theophylin
Pyridin Rixinin
Pyroligidin Heliotridin
Quinolin Dictamnin
Steroit Solasodin, Tomatidin
7
Tropan Hyosxinamin,Cocain

II.THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT ALKALOID TỪ LOÀI Catharanthus
roseus (L.) G. Don BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TẾ BÀO.
1. Catharanthus roseus
2. Tên khác: Bông dừa, Hải đăng, Hải đằng.
3. Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G. Don
4. Tên đồng nghĩa: Vinca rosea L.
5. Họ: Trúc đào (Apocynaceae)
6. Tên nước ngoài: Madagasca Periwinkle, Pervenche mangache.
Thân cỏ nhỏ, mọc đứng, phân nhiều cành, cao 40-60 cm. Thân hình trụ có 4 khía
dọc, có lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím.
8
Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, dầu hơi nhọn, dài 4-7 cm, rộng
2-3 cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông. Cuống lá ngắn, dài 3-5 mm. Gân lá
hình lông chim lồi mặt dưới, 12-14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên
trên.
Cụm hoa : Hai hoa ở kẽ lá. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5; cuống hoa dài 4-5 mm. Lá
đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở
mặt ngoài, dài 3-4 mm. Cánh hoa 5, dính.
9
Ống tràng màu xanh, cao 2-4 cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi;
5 thùy có màu đỏ hay hồng tím , trắng , …ở mặt trên, mặt dưới màu trắng, dài
1,5-1,7 cm, miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ
nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím)Tiền khai

hoa vặn cùng
chiều kim đồng hồ.
Nhị : rời, đính ở phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa,chỉ nhị ngắn.
Bao phấn hình mũi tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu
nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc.
Lá noãn : rời ở bầu nhưng dính ở vòi và đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá

noãn mang nhiều noãn, đính noãn mép, bầu trên.
Vòi nhụy: dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng. Đầu nhụy hình trụ, màu xanh, đỉnh
có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng. 2 đĩa mật màu vàng, hình tam
giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn. 2 quả

đại dài 3-5 cm, mỗi quả chứa 12-20 hạt, xếp
thành 2 hàng. Hạt nhỏ, hình trứng.
10
Đặc điểm giải phẫu:
Vi phẫu rễ:
Lớp bần gồm 4-5 lớp tế bào hình chữ nhật. Mô mềm vỏ khoảng 5-6 lớp tế bào có
vách bằng cellulose, hình dạng thay đổi, xếp không đều đặn. Trụ bì vách bằng
cellulose. Libe 1 bị libe 2 đẩy ra sát trụ bì, các tế bào bị ép dẹp lại. Libe 2 là những tế
bào hình chữ nhật, xếp thành dãy xuyên tâm. Gỗ 2 chiếm tâm. Mạch gỗ 2 xếp thành
dãy, kích thước không đều. Tia tủy hẹp 1-2 dãy tế bào. Gỗ 1 phân bố đều. Libe trong
11