Bước đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể trên tế bào máu thỏ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM
NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ



Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2003 - 2007
Sinh viên thực hiện: MAI MINH MẪN




Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM
NHIỄM SẮC THỂ TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ




Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
THS. HỒ THỊ NGA MAI MINH MẪN
BSTY. NGUYỄN KIÊN CƢỜNG




Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2007

iii
LỜI CẢM TẠ

Con xin gửi đến Ba Má lòng thành kính ghi ơn. Con kính chúc Ba Má sức
khỏe, con sẽ luôn phấn đấu để trở thành ngƣời có ích cho xã hội để không phụ công
dƣỡng dục của Ba Má.
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

* Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ
Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả các quý thầy cô đã tận tụy
truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại
trƣờng.
* ThS. Hồ Thị Nga, BSTY. Nguyễn Kiên Cƣờng, đã trực tiếp hƣớng dẫn và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
* PGS.TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã giúp đỡ cũng nhƣ động viên
lúc tôi gặp khó khăn.
* TS. Dƣơng Nguyên Khang cùng các thầy cô Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo
mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt đề tài.
* Thầy Đinh Xuân Phát, Cô Quách Tuyết Anh đã dành thời gian quý báu để
cung cấp cho tôi những tài liệu, kinh nghiệm quý báu.
* Cùng toàn thể lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt
thời gian học tập tại trƣờng.

Sinh viên thực hiện
MAI MINH MẪN





iv
TÓM TẮT

MAI MINH MẪN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007.
“BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHUỘM NHIỄM SẮC THỂ
TRÊN TẾ BÀO MÁU THỎ”
Giáo viên hƣớng dẫn:
ThS. Hồ Thị Nga

BSTY. Nguyễn Kiên Cƣờng
Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh lý Khoa Chăn Nuôi Thú Y,
Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh trên đối tƣợng thỏ.
Nhiễm sắc thể là yếu tố ảnh hƣởng đến sự di truyền của một giống loài. Xây
dựng đƣợc kiểu nhân của một loài là bƣớc đầu cho việc nghiên cứu sâu hơn về cơ
chế di truyền của loài đó. Phƣơng pháp hiệu quả nhất trong nghiên cứu kiểu nhân là
nuôi cấy tế bào bạch cầu của máu và nhuộm.
Máu thỏ nuôi cấy với hai liều lƣợng là 0,4 ml và 1 ml trong môi trƣờng
RPMI 1640 có bổ sung một số chất giúp cho sự sinh trƣởng và phát triển tế bào nhƣ
huyết thanh phôi bò (FBS), Pokeweed (lectin), kháng sinh antimycotic – antibiotic.
Mẫu máu đƣợc nuôi cấy chủ yếu bằng chai Rough trong 72 giờ ở 37
0
C trong tủ ấm
CO
2
.

Sau 72 giờ, cho thêm 40 µl colcemid vào môi trƣờng và ủ theo ba mức thời
gian 20 phút, 40 phút và 60 phút trƣớc khi xử lý để nhuộm. Bên cạnh đó ống
nghiệm 15 ml cũng đƣợc sử dụng để nuôi cấy thử nghiệm.
Kết quả cho thấy khi nuôi cấy 1ml máu thỏ với môi trƣờng RPMI 1640
trong 72 giờ ở 37
0
C và ủ với colcemid trong thời gian 60 phút thì thu đƣợc tế bào ở
giai đoạn trung kỳ nhiều nhất. Ngoài ra, khi nuôi cấy máu thỏ với ống nghiệm 15 ml
vẫn thu đƣợc các tế bào ở giai đoạn trung kỳ. Mặc dù vậy, chúng tôi vẫn chƣa xây
dựng đƣợc kiểu nhân (karyotype) của bộ nhiễm sắc thể thỏ do nhiễm sắc thể chƣa
trãi đều khi nhuộm.

v
SUMMARY
MAI MINH MAN, Nong Lam University, August 2007.
“THE INITIAL STEP OF SETTING UP STAINING RABBIT
PERIPHERAL BLOOD CHROMOSOME PROCESS”
Supervisors
HO THI NGA, MSc
NGUYEN KIEN CUONG, DMV
A study was carried out on rabbit chromosome at physiology laboratory of
Faculty of Animal Science and Veterinary Medicine, Nong Lam University Ho Chi
Minh City.
Chromosome is an element which affects the species genetics. Setting up
karyotype of species is the initial step of researching extendedly into species’
genetic mechanism. The most effective researching karyotype method is that
culturing and staining lymphocyte.
Rabbit peripheral blood (anticoagulated by heparin) was cultured with two
dosages, 0,4 ml and 1 ml. It was cultured in RPMI 1640 medium which
supplements some mitogenic agents: fetal bovine serum (FBS), pokeweed (lectin),
antimycotic – antibiotic.
Blood cell was cultured primarily in Rough vase for 72 hours at 37
0
C. In
addition, 15 ml falcon tubes were also used to culture. After 72 hours, we added
colcemid to medium and incubate in 20 min, 40 min and 60 min before the cell was
fixed.
The best result was that culturing 1 ml rabbit peripheral blood and
incubating with colcemid in 60 min. Besides, the cells also grew and divided when
they were cultured in 15 ml falcon tubes. So that, we could replace Rough vase with
15 ml falcon tubes in culturing blood leukocytes. However, we haven’t established
rabbit karyotype yet because chromosome didn’t spread on slides.

vi
MỤC LỤC

Trang
Lời cảm tạ ...................................................................................................... iii
Tóm tắt ............................................................................................................ iv
Summary .......................................................................................................... v
Mục lục ............................................................................................................ vi
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................. ix
Danh sách các bảng ......................................................................................... x
Danh sách các hình ........................................................................................ xi
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................... 2
1.2.1 Mục tiêu ................................................................................................. 2
1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................... 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3
2.1 Tổng quan về thỏ .......................................................................................... 3
2.1.1 Phân loài ................................................................................................. 3
2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý ......................................................................... 3
2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ ............................................................................ 3
2.2 Nhiễm sắc thể ............................................................................................... 4
2.2.1 Khái niệm ............................................................................................... 4
2.2.2 Hình thái và kích thƣớc .......................................................................... 4
2.2.3 Số lƣợng nhiễm sắc thể .......................................................................... 5
2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể ........................................................................... 6
2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể ......... ………………………….6

2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể ................................................... 8
2.3 Chu Kỳ sống của tế bào ............................................................................... 9
2.3.1 Gian kỳ ................................................................................................... 9

vii
2.3.1.1 Pha G1 ............................................................................................ 10
2.3.1.2 Pha S ............................................................................................... 10
2.3.1.3 Pha G2 ............................................................................................ 10
2.3.1.4 Phân bào ......................................................................................... 10
2.3.2 Nguyên phân ........................................................................................ 11
2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân ............................................................ 11
2.3.2.2 Các kỳ của phân bào ...................................................................... 12
2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể ........................................ 14
2.4.1 Kỹ thuật splash ..................................................................................... 14
2.4.2 Kỹ thuật squash .................................................................................... 16
2.5 Nghiên cứu về kiểu nhân nhiễm sắc thể thỏ .............................................. 16
Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................... 20
3.1 Thời gian và địa điểm................................................................................. 20
3.2 Đối tƣợng ................................................................................................... 20
3.3 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 20
3.4 Vật liệu và hóa chất .................................................................................... 20
3.4.1 Thiết bị ................................................................................................. 20
3.4.2 Dụng cụ ................................................................................................ 21
3.4.3 Hóa chất ............................................................................................... 21
3.5 Bố trí thí nghiệm ........................................................................................ 23
3.5.1 Thí nghiệm 1 ........................................................................................ 23
3.5.2 Thí nghiệm 2 ........................................................................................ 23
3.5.3 Thí nghiệm 3 ........................................................................................ 24
3.5.4 Chỉ tiêu quan sát ................................................................................... 24
3.6 Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 24

3.6.1 Phƣơng pháp lấy máu thỏ..................................................................... 24
3.6.1.1 Phƣơng pháp lấy máu tim .............................................................. 24
3.6.1.2 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai ............................................. 24
3.6.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào máu .......................................................... 25

viii
3.6.3 Kỹ thuật nhuộm nhiễm sắc thể ................................................................ 26
3.6.3.1 Kỹ thuật trãi đều nhiễm sắc thể ...................................................... 26
3.6.3.1 Nhuộm nhiễm sắc thể với giemsa .................................................. 27
3.7 Xử lý số liệu ............................................................................................... 27
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 28
4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid ........................................... 28
4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy .................................................. 29
4.3 Kết quả nuôi cấy thử nghiệm trên ống ly tâm 15ml ................................... 31
4.4 Một số nguyên nhân ảnh hƣởng tới kết nuôi cấy và nhuộm ...................... 35
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 38
5.1 Kết luận ...................................................................................................... 38
5.2 Đề nghị ....................................................................................................... 38
CHƢƠNG 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................ 39

ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleotide
ARN Acid ribonucleotide
Ctv Cộng tác viên
IU International unit
FBS Fetal bovine serum
NST Nhiễm sắc thể
PHA Phytohemaglutinin
PBS Phosphate buffer saline

x
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Số lƣợng nhiễm sắc thể của một số loài ................................................ 5
Bảng 1.2 Đặc điểm các băng trên nhiễm sắc thể thể........................................... 17
Bảng 3.1 Môi trƣờng nuôi cấy 0,4 và 1 ml máu ................................................ 22
Bảng 4.1 Kết quả nhuộm theo thời gian ủ với colcemid..................................... 28
Bảng 4.2 Kết quả nhuộm theo lƣợng máu nuôi cấy ............................................ 30
Bảng 4.3 Kết quả nuôi cấy trên chai Rough và ống nghiệm 15 ml .................... 32

xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang
Hình 2.1 Nhiễm sắc thể ......................................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể ........................................................................... 6
Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể ................................................................... 7
Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể ........................................ 8
Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào .......................................................................... 9
Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm ...................................................... 13
Hình 2.7 Kiểu nhân tế bào thỏ đực ...................................................................... 19
Hình 3.1 Phƣơng pháp lấy máu động mạch tai .................................................... 25
Hình 3.2 Nuôi cấy tế bào bạch cầu ...................................................................... 26
Hình 4.1 Nhiễm sắc thể nhuộm với giemsa ......................................................... 33
Hình 4.2 Hình dạng nhiễm sắc thể thỏ ................................................................. 33
Hình 4.3 Chu kỳ phân chia của tế bào bạch cầu .................................................. 34
Hình 4.4 Nhân tế bào bạch cầu thỏ chƣa vỡ ........................................................ 36
Hình 4.5 Nhiễm sắc thể không trải đều trên phiến kính ...................................... 37
1

Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Tế bào là đơn vị tổ chức cơ bản của cơ thể sống. Trong tế bào có chứa các

bào quan và nhân. Nhân tế bào là cấu thành bắt buộc của tế bào eukaryote, vì trong
nhân có chứa nhiễm sắc thể (NST), là cấu trúc mang vật chất di truyền ADN (acid
deoxyribonucleotide) của tế bào và cơ thể. Nhiễm sắc thể đƣợc quan sát đầu tiên bởi
Nageli năm 1842, nhƣng đến năm 1888, NST mới đƣợc Waldeyer đặt tên là
“chromosome” (“chromo” có nghĩa bắt màu nhuộm và “some” nghĩa là một thể)
(Eldridge, 1985). Nhiễm sắc thể đóng vai trò rất quan trọng trong di truyền của các
loài, một yếu tố quyết định cho sự tiến hóa hay suy thoái của giống nòi.
Có thể nói hơn 100 năm qua, chƣa có một cấu trúc sinh học nào nhƣ NST
đã đƣợc nhiều phòng thí nghiệm, nhiều nhà nghiên cứu, nhiều phƣơng tiện kỹ thuật
và kinh phí để nghiên cứu. Mục đích cuối cùng là làm sáng tỏ cấu trúc phân tử, siêu
vi thể cũng nhƣ cơ chế hoạt động của chúng trong tế bào. Một trong những kỹ thuật
nghiên cứu NST rất cổ điển nhƣng rất hiệu quả đó là phƣơng pháp nhuộm.
Với phƣơng pháp nhuộm, chúng ta có thể nghiên cứu đƣợc kiểu nhân
(karyotype) của một loài nào đó. Mà việc sử dụng bảng đồ kiểu nhân có tầm quan
trọng trong nghiên cứu di truyền tế bào, trong y học lâm sàng chẩn đoán bệnh di
truyền, bệnh ung thƣ, trong phân loại học cũng nhƣ trong công tác chọn giống cây
trồng và vật nuôi. Do đó tìm ra một quy trình nhuộm NST tối ƣu để nghiên cứu kiểu
nhân trong tế bào là điều rất cần thiết.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ
Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm cùng với sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi
Thú Y, chúng tôi thực hiện đề tài “Bƣớc đầu xây dựng quy trình nhuộm nhiễm
sắc thể trên tế bào máu thỏ”, để tạo cơ sở cho việc xây dựng kiểu nhân hoàn chỉnh
của thỏ, góp phần ứng dụng cho những nghiên cứu sau này.
2

1.2 Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1 Mục tiêu
Xây dựng quy trình nhuộm nhiễm sắc thể tế bào bạch cầu trong máu thỏ.
1.2.2 Yêu cầu
- Thu nhận và nuôi cấy tế bào bạch cầu thỏ đạt giai đoạn trung kỳ.

- Thử nghiệm quy trình nhuộm ở các mức thời gian ủ khác nhau.
- Thử nghiệm quy trình nhuộm với lƣợng máu nuôi cấy khác nhau.
- Thử nghiệm nuôi cấy tế bào máu thỏ trên ống nghiệm 15 ml.
















3

Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về thỏ
Thỏ có nguồn gốc từ thỏ rừng, đã đƣợc con ngƣời thuần hoá hơn 1000 năm
trƣớc công nguyên và trở thành thỏ nhà với tên khoa học là Oryctolagus Cesnoaclus
Domesticies.
2.1.1 Phân loài
־ Bộ gặm nhấm: Rodentia
־ Lớp: Lagomorpha

־ Loài: Orgctolagus
־ Họ thỏ: Leporides
2.1.2 Một số đặc điểm sinh lý
־ Thân nhiệt: 39,5
0
C (biến động từ 30 – 41
0
C)
־ Nhịp tim: 120 - 160 lần/phút
־ Tần số hô hấp: 60 - 90 lần/phút
־ Nhiệt độ môi trƣờng thích hợp khoảng: 20 – 25
0
C
2.1.3 Đặc điểm của máu thỏ
Lƣợng máu của thỏ chiếm khoảng 5,5% so với trọng lƣợng cơ thể. Thành
phần máu gồm huyết tƣơng và tế bào máu. Huyết tƣơng chiếm 60% thể tích, gồm
huyết thanh và chất sinh sợi huyết. Huyết tƣơng có vai trò vận chuyển chất hữu cơ
và vô cơ trong cơ thể (Dƣơng Nguyên Khang, 2006).
Máu có ba loại tế bào là hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu. Số lƣợng hồng cầu
khoảng từ 6 – 6,5 triệu trong 1 mm
3
máu, chiếm hơn 90% tế bào máu. Hồng cầu có
vai trò vận chuyển O
2
và CO
2
, điều hòa pH.
Số lƣợng tiểu cầu khoảng 300.000 trong 1 mm
3
máu. Tiểu cầu khi vỡ sẽ

sinh ra enzyme thrombokinase có tác dụng làm đông máu. Khi nuôi cấy tế bào máu,
ngƣời ta dùng heparin để kháng lại cơ chế đông máu. Heparin có trong đại thực bào
của gan, phổi và bạch cầu ƣa base, chúng không gây độc đối với tế bào.
4

Bạch cầu giữ nhiệm vụ bảo vệ cơ thể, số lƣợng bạch cầu ở thỏ khoảng
7.600 trong 1mm
3
máu (Trịnh Văn Thịnh, 1978). Bạch cầu gồm hai nhóm: bạch cầu
có hạt và bạch cầu không hạt. Bạch cầu có hạt gồm: trung tính, acid và base. Bạch
cầu không hạt gồm: đơn nhân lớn và lympho. Trong đó, bạch cầu lympho có khả
năng phân chia nhanh và nhiều nhất trong nuôi cấy in vitro (Eldridge, 1985).
2.2 Nhiễm sắc thể
2.2.1 Khái niệm
Nhiễm sắc thể (NST) là những cấu trúc hiển vi trong nhân tế bào, cấu tạo
chủ yếu từ DNA và protein histon, có khả năng tự nhân đôi và biến đổi hình thái
cấu trúc theo qui luật trong các quá trình phân bào.
Nhiễm sắc thể tồn tại trong nhân tế bào soma thành từng cặp đồng dạng,
trong đó một NST có nguồn gốc từ bố và một có nguồn gốc từ mẹ. Trong các tế bào
bình thƣờng mỗi NST gồm 2 nhiễm sắc tử (chromatid), còn trong các giao tử NST
đơn bội ở dạng một nhiễm sắc tử. Mỗi loài bình thƣờng có bộ NST lƣỡng bội (2n)
đặc trƣng về số lƣợng, hình thái, cấu trúc và ổn định tƣơng đối qua các thế hệ. Kiểu
nhân (karyotype) là thuật ngữ dùng chỉ số lƣợng và hình dạng của các NST chuyên
biệt cho mỗi loài.

Hình 2.1 Nhiễm sắc thể
(Nguồn
2.2.2 Hình thái và kích thƣớc
Nhiễm sắc thể quan sát ở trung kỳ thƣờng có hình dạng chấm hoặc hình
que, thƣờng có kích thƣớc đƣờng kính khoảng 0,2 µm đến 3 µm và chiều dài chiều

dài khoảng 0,2 µm đến 50 µm. Về kích thƣớc ở các tế bào khác nhau thì không
giống nhau, nhƣng chúng đặc trƣng cho các tế bào và cá thể của cùng một loài.
5

Tuy nhiên, các mô khác nhau của cùng một cơ thể có sự biến đổi hình dạng
và kích thƣớc NST để thích nghi với chức năng của một giai đoạn phát triển
(Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
2.2.3 Số lƣợng nhiễm sắc thể
Số lƣợng nhiễm sắc thể là một chỉ tiêu đặc trƣng cho loài. Theo quy luật
chung, mỗi một cá thể cùng một loài có số lƣợng NST đặc trƣng cho loài đó.
Không thể dựa vào số lƣợng NST để đánh giá mức độ tiến hóa của các loài.
Cũng giống nhƣ hàm lƣợng DNA, tuy có tính ổn định loài nhƣng chƣa thể hiện tính
logic của bậc thang tiến hóa. Vấn đề là cần phải xem xét mức độ tổ chức và hoạt
động của hệ gen trong DNA và trong NST.
Bảng 1.1 Số lƣợng nhiễm sắc thể của một số loài (Eldridge, 1985)
Ngƣời (Homo sapiens) 2n = 46
Thỏ (Oryctolagus cuniculus) 2n = 44
Cừu (Ovis aries) 2n = 54
Chó (Canis familiaris) 2n = 78
Mèo (Felis catus) 2n = 38
Ngựa (Equus asinus) 2n = 62
Vịt (Anas platyrhyncha) 2n = 80
Heo (Sus scrola) 2n = 38
Số lƣợng nhiễm sắc thể còn đặc trƣng cho bộ NST. Gồm các bộ:
Bộ nguyên bội (monoploid) đƣợc ký hiệu là x, từ đó khởi nguyên hình
thành các bộ đơn bội, lƣỡng bội, đa bội.
Bộ đơn bội (haploid) ký hiệu là n, đặc trƣng cho các tế bào, cơ thể đơn
bội và các tế bào sinh dục trƣởng thành ở loài sinh sản hữu tính.
Bộ lƣỡng bội (diploid) ký hiệu 2n, đặc trƣng cho các tế bào và cơ thể
lƣỡng bội. Bộ lƣỡng bội đƣợc hình thành do sự kết hợp hai bộ đơn bội.

Bộ đa bội (polyploid) đặc trƣng cho tế bào và cơ thể đa bội. Số NST
đƣợc tăng lên theo bội số của n khởi nguyên.
6

2.2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể
2.2.4.1 Cấu trúc hiển vi của nhiễm sắc thể
a) Nhiễm sắc thể thƣờng và nhiễm sắc thể giới tính
Trong bộ lƣỡng bội (2n) thƣờng tồn tại nhiều cặp tƣơng đồng giống nhau về
hình dạng, kích thƣớc đƣợc gọi là NST thƣờng (autosome). Ngoài ra còn có 1 cặp
NST trong đó 2 thành viên khác nhau về hình dạng, kích thƣớc hoặc trạng thái hoạt
động đƣợc gọi là NST giới tính (sex chromosome).

Hình 2.2 Cấu trúc nhiễm sắc thể
(Nguồn
b) Centromere
Centromere là cấu trúc định khu trên chiều dọc NST ở vùng đƣợc gọi là eo
thƣa cấp một. Centromere là vùng phân hóa của NST có vai trò đính kết hai nhiễm
sắc tử với nhau, đồng thời giúp cho nhiễm sắc tử phân ly khỏi nhau và di chuyển về
hai cực của tế bào nhờ các sợi của thoi vô sắc.
Centromere chia NST thành 2 vế, chiều của 2 vế phụ thuộc vào vị trí
centromere. Ngƣời ta thành lập chỉ số centromere (centromere index – Ic) để xác
định vị trí của centromere và các kiểu hình NST.
P: chiều dài vế ngắn.
Q: chiều dài vế dài.
7

Theo Eldridge (1985), nhiễm sắc thể có các kiểu hình sau:
־ Acrocentric có centromere ở rất gần điểm tận cùng nhiễm sắc.
־ Telocentric có centromere ở ngay điểm tận cùng nhiễm sắc thể.
־ Subtelocentric có centromere nằm gần điểm tận cùng nhiễm sắc thể.

־ Submetacentric có centromere ở gần chính giữa (Q > P).
־ Metacentric có centromere ở chính giữa chia 2 vế bằng nhau (P = Q).
Có một số tranh luận khoa học về kiểu hình nhiễm sắc thể. Ngƣời ta tự hỏi
telocentric có thật hay không. Một số nghiên cứu chứng minh rằng telocentric thật
sự tồn tại, centromere của telocentric có dính một lƣợng rất nhỏ chất nhiễm sắc mà
chúng ta khó xác định đƣợc.

Hình 2.3 Các kiểu hình nhiễm sắc thể
(Nguồn
c) Telomere
Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử ADN liên kết với protein tạo thành các
sợi NST xoắn, gấp khúc chạy suốt NST. Đầu tận cùng của phân tử ADN ở đầu tận
cùng của NST gọi là telomere. Những dẫn liệu về cấu trúc phân tử đã chứng minh
rằng telomere có ba chức năng quan trọng:
־ Ngăn cản không cho enzyme deoxiribonuclease phân giải đầu tận
cùng của phân tử ADN
־ Ngăn cản không cho NST trong bộ kết dính nhau
־ Tạo thuận lợi cho tái bản ADN ở phần đầu cuối của phân tử
Telomere có cấu trúc và thành phần đặc thù gồm những đoạn lặp nucleotid,
tuy khác nhau ở các loài nhƣng thƣờng thể hiện theo phƣơng thức 5’ – T
1-4
A
0-1
G
1-8

– 3’. Ví dụ ở ngƣời cũng nhƣ động vật có xƣơng sống có đoạn lặp lại là TTAGGG,
ở thực vật arabidopsis thaliana có đoạn lặp lại là TTTAGGG.
8

2.2.4.2 Cấu trúc siêu vi của nhiễm sắc thể
a) Sợi nucleosome
Trong nhiễm sắc thể, ADN liên kết với protein tạo nên cấu trúc sợi xoắn
nhiều cấp, đƣợc gọi là sợi nhiễm sắc. Sợi nhiễm sắc cơ bản có đƣờng kính 11 nm, là
chuỗi hạt cƣờm, đƣợc gọi là sợi nucleosome. Mỗi hạt cƣờm là một nucleosome có
kích thƣớc 11 nm dạng khúc giò gồm lõi đƣợc cấu tạo bởi 8 phân tử histon (2 H
2
A,
2 H
2
B, 2 H
3
, và 2 H
4
), sợi xoắn kép ADN cuốn xung quanh lõi histon với 1,75 vòng
(chứa khoảng 146 cặp nucleotid). Các nucleosome nối nhau qua sợi xoắn kép ADN
dài khoảng 60 nucleotid.
Các sợi nucleosome gấp khúc, cuộn lại nhờ các histon H
1
, mỗi cuộn gồm
sáu nucleosome, để tạo thành các sợi nhiễm sắc lớn hơn có đƣờng kính 30nm, đƣợc
gọi là sợi solenoid.
b) Các cấp độ cấu trúc nhiễm sắc thể
Sợi solenoid sẽ gấp khúc tạo nên các vòng bên (looped domains) chứa
khoảng 20.000 – 80.000 cặp nucleotid và có kích thƣớc khoảng 300nm. Các sợi 300
nm sẽ cuộn lại tạo nên các sợi nhiễm sắc ở cấp độ lớn hơn từ 700nm đến 1400nm
tức là các nhiễm sắc tử. Ngoài protein histon, trong NST còn có nhiều protein axit
có vai trò điều hòa hoạt động của gen.

Hình 2.4 Cấu trúc siêu vi và phân tử của nhiễm sắc thể

(Nguồn
9

2.3 Chu kỳ sống của tế bào
Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào đƣợc hình
thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thức sự phân bào hình thành tế bào mới.
Ngƣời ta chia chu kỳ tế bào ra hai thời kỳ chính: gian kỳ (interphase), kỳ phân bào
(mitosis). Thời gian của một chu kỳ sống của tế bào động vật rất dài, từ 20 đến 40
giờ.

Hình 2.5 Chu kỳ phân chia tế bào
(Nguồn
2.3.1 Gian kỳ
Trong gian kỳ tế bào thực hiện các chức năng trao đổi chất, các hoạt động
sống khác nhau nhƣ tổng hợp các ARN (acid ribonucleotide) và ADN, protein và
các enzyme chuẩn bị cho sự phân bào. Tùy theo đặc điểm chức năng ngƣời ta chia
tế bào gian kỳ ra làm ba giai đoạn hay pha liên tiếp nhau: giai đoạn G1 (gap 1), giai
đoạn S (synthesis) và giai đoạn G2 (gap 2). Thời gian tế bào ở giai đoạn gian kỳ rất
dài, chiếm hơn 90% thời gian chu kỳ sống của tế bào. Thời gian này tùy thuộc vào
thời gian của 3 pha G1 + S + G2, đặc biệt tùy thuộc vào G1. Vì ở các tế bào khác
nhau thì thời gian G1 là rất khác nhau, còn giai đoạn S và G2 tƣơng đối ổn định
(Eldridge, 1985).
Ví dụ ở tế bào chuột, thời gian ở G1 là 9,5 giờ, S 7,5 giờ, G2 là 1 giờ và
thời gian ở kỳ phân bào 45,5 phút. Vậy thời gian tế bào chuột ở giai đoạn gian kỳ
chiếm hơn 95% thời gian của một chu kỳ sống ở tế bào chuột.
10

2.3.1.1 Pha G1
Pha G1 tiếp ngay sau phân bào, là pha đầu tiên của tế bào con. Thời gian
của G1 kéo dài từ ngay sau khi tế bào tạo thành do phân bào, cho đến khi bắt đầu

pha S là pha tổng hợp ADN.
Vào cuối pha G1 có một thời điểm đƣợc gọi là điểm hạn định (restriction
point), điểm R. Nếu tế bào vƣợt qua điểm R, chúng tiếp tục đi vào pha S. Trong
nuôi cấy tế bào, tế bào có vƣợt qua điểm hạn định hay không phụ thuộc rất nhiều
vào điều kiện một trƣờng. Nhân tố điều chỉnh thời điểm R là hệ protein phức tạp
trong đó có các cyclin và kinase. Đối với các tế bào biệt hóa thì tế bào không vƣợt
qua R mà đi vào quá trình biệt hóa tế bào.
2.3.1.2 Pha S
Pha S là pha tiếp theo pha G1, đƣợc gọi là pha tổng hợp ADN vì chính
trong pha này xảy ra sự tái bản ADN và nhân đôi số lƣợng NST của tế bào. Vào
cuối pha G1, tế bào tổng hợp một loại protein đặc trƣng là cylin A và nhanh chóng
tích lũy trong nhân tế bào. Protein cyclin A cùng với enzyme kinase sẽ xúc tiến sự
tái bản ADN. Protein cyclin A tác động cho tới cuối pha S thì biến mất. Thời gian
kéo dài của pha S ở đa số tế bào nhân thực tƣơng đối ổn định từ 6 – 8 giờ.
2.3.1.2 Pha G2
Tiếp theo S là pha G2, thời gian của G2 ngắn từ 1 – 4 giờ. Trong pha G2,
các ARN và protein đƣợc tổng hợp chuẩn bị cho sự phân bào. Cuối pha G2 một
protein đƣợc tổng hợp là cyclin b đƣợc tích lũy trong nhân cho đến tiền kỳ phân
bào. Cyclin b hoạt hóa enzyme kinase tạo thành các vi ống tubulin hình thành các
thoi phân bào.
2.3.1.2 Phân bào
Tiếp theo pha G2 là pha M (mitosis) thời kỳ tế bào mẹ phân chia thành hai
tế bào con. Sự phân bào là phƣơng thức sinh sản của tế bào, và là phƣơng thức tế
bào mẹ truyền thông tin di truyền chứa DNA cho hai tế bào con. Ngƣời ta phân biệt
bốn dạng phân bào sau: nguyên phân, giảm phân, trực phân, nội phân.
11

2.3.2 Nguyên phân
2.3.2.1 Đặc điểm của nguyên phân
Nguyên phân hay còn đƣợc gọi là phân bào nguyên nhiễm, xảy ra trong pha

M của chu trình tế bào, tiếp ngay sau pha G2. Qua M, tế bào mẹ sau khi đã đi qua
pha S sẽ tạo hai tế bào con, mỗi tế bào con mang bộ máy di truyền giống hệt tế bào
mẹ. Hiện tƣợng này đƣợc phát hiện đầu tiên bởi Strasburger và Flemming từ những
năm 1882, khi quan sát thấy các cấu trúc sợi nên đặt tên là phân bào có tơ (Nguyễn
nhƣ hiền, 2005).
2.3.2.2 Các kỳ của phân bào
a) Tiền kỳ (prophase)
Tiền kỳ đƣợc tiếp theo sau pha G2 của gian kỳ. Rất khó phân biệt một cách
chính xác điểm chuyển tiếp này, các hiện tƣợng đặc trƣng cho tiền kỳ là:
Hình thành nhiễm sắc thể: chất nhiễm sắc ở gian kỳ bao gồm các sợi nhiễm
sắc đã đƣợc nhân đôi qua pha S, trở nên xoắn và cô đặc lại, hình thành các NST
thấy rõ dƣới kính hiển vi thƣờng, mà số lƣợng, hình thái đặc trƣng cho loài.
Màng hạch nhân có nhiều thay đổi: hạch nhân giảm thể tích, phân rã và
biến mất. Màng nhân đứt thành nhiều đoạn và biến thành các bóng không bào bé
phân tán trong tế bào chất.
Hình thành bộ máy phân bào: qua pha S, trung tử nhân đôi tạo thành 2 đôi
trung tử con, do sự hoạt hóa của các chất quanh trung tử, các đơn hợp tubulin trong
tế bào hợp tạo thành các vi ống tubulin. Các vi ống phóng xạ quanh trung tử tạo
thành sao phân bào, hai sao di chuyển về hai cực của tế bào. Giữa hai sao, các vi
ống phát triển sắp xếp thành hệ thống ống có dạng hình thoi, đƣợc gọi là thoi phân
bào hay thoi vô sắc. Cấu tạo nên thoi có hai dạng vi ống: vi ống cực và vi ống tâm
động. Đến cuối tiền kỳ, khi màng nhân biến mất thì bộ máy thoi với hai sao đƣợc
hình thành.
Tiền kỳ chiếm thời gian nhiều nhất trong kỳ nguyên phân. Ở tế bào động
vật, tiền kỳ chiếm hơn 50 % thời gian trong giai đoạn tế bào phân chia (Eldridge,
1985).
12

b) Trung kỳ sớm (prometaphase)
Bắt đầu khi màng nhân tiêu biến thành các bong bóng nhỏ phân tán trong tế

bào chất quanh thoi phân bào. Khi vùng nhân biến mất thì thoi vô sắc di chuyển
chiếm ngay vị trí trung tâm. Lúc này centromere đƣợc phân hóa thành 2 cấu trúc
đƣợc gọi là tâm động có kích thƣớc khoảng 1 µm. Thông qua tâm động, NST đƣợc
đính với các sợi tâm động của thoi.
c) Trung kỳ (metaphase)
Đối với tế bào động vật, thời gian tế bào ở giai đoạn trung kỳ rất ngắn, chỉ
kéo dài từ năm đến bảy phút (Eldridge, 1985). Trong giai đoạn này, nhiễm sắc thể
xoắn, cô đặc, co ngắn tối đa và sắp xếp trên mặt phẳng xích đạo của thoi vô sắc, tạo
nên tấm trung kỳ. Tấm trung kỳ nằm thẳng góc với trục dọc của thoi. Đây cũng là
thời điểm có thể quan sát hình dạng, số lƣợng NST rõ nhất. Vì thế ngƣời ta thƣờng
tập trung vào giai đoạn này để nghiên cứu kiểu nhân hay đặc điểm NST của mỗi
loài.
d) Hậu kỳ (anaphase)
Nhiễm sắc thể tách đôi và rời khỏi nhau tạo thành hai NST con độc lập.
Nhiễm sắc thể con di chuyển về 2 cực nhờ sự co ngắn của sợi tâm động, phối hợp
với sự kéo dài của các sợi cực và hẹp lại của thoi.
e) Mạt kỳ (telophase)
Trong kỳ này, các NST con đã di chuyển đến hai cực, giãn xoắn, dài ra và
biến dạng thành chất nhiễm sắc. Hạch nhân đƣợc tái tạo, hình thành 2 nhân con
trong khối tế bào chất chung.
Quá trình phân chia tế bào chất của tế bào bắt đầu từ cuối hậu kỳ hoặc đầu
mạt kỳ và diễn ra suốt mạt kỳ. Sự phân chia này bắt đầu bởi sự hình thành một eo
thắt, đƣợc cấu tạo bởi các vòng vi sợi actin nằm giữa hai nhân con. Khi vòng vi sợi
actin co rút kéo theo phần màng sinh chất lõm thắt vào trung tâm, và khi màng nối
với nhau sẽ phân tách tế bào chất thành 2 nửa, mỗi nửa chứa một nhân con. Mặt
phẳng phân cắt tế bào chất thẳng góc với trục của thoi phân bào.
13


Hình 2.6 Quá trình nguyên phân giảm nhiễm

(Nguồn
14

2.4 Sơ lƣợc các kỹ thuật nghiên cứu nhiễm sắc thể
Cơ chế chung của việc nghiên cứu kiểu nhân là giải phóng NST ở các tế
bào, mô ở giai đoạn trung kỳ. Sau đó tiến hành nhuộm để quan sát hình thái, cấu
trúc, số lƣợng cũng nhƣ những băng vạch trên nhiễm sắc thể. Có hai kỹ thuật dựa
trên cơ chế này để nghiên cứu NST là kỹ thuật splash và kỹ thuật squash.
2.4.1 Kỹ thuật splash
Kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể từ rất lâu. Cơ chế
của kỹ thuật này theo đúng theo tên gọi của nó là “splash” có nghĩa là “bắn” hay
“văng”. Với kỹ thuật này, màng tế bào sẽ bị phá hủy, những giọt dịch chứa nhân
của tế bào sẽ đƣợc cho rơi từ một độ cao thích hợp lên một mặt phẳng, nhờ điều này
mà nhiễm sắc thể bị bắn ra khỏi nhân và trải đều trên phiến kính. Ta có thể tiến
hành nhuộm và quan sát nhiễm sắc thể. Kỹ thuật này đơn giản, đáng tin cậy và đƣợc
ứng dụng trên các nguồn tế bào nhƣ:
a) Tế bào in vivo
Kỹ thuật splash đƣợc ứng dụng kỹ thuật đƣợc thực hiện đầu tiên ở các mô,
tế bào phân chia nhanh trong in vivo để nghiên cứu về NST. Những mô, tế bào có
thể sử dụng nghiên cứu nhiễm sắc thể ngay nhƣ: rễ ở thực vật, hay tủy xƣơng, tế
bào lách, biểu mô ruột ở động vật hữu nhũ, lƣỡng cƣ và chim (Herbert, 1993).
Những mẫu mô này đƣợc ngâm trong những hỗn hợp dung môi nhƣ metanol – acid
acetic để cố định mẫu, sau đó mẫu đƣợc nhuộm và bảo quản bởi một lớp papain.
Tuy nhiên phƣơng pháp này chỉ thực hiện đƣợc trên những loài có số lƣợng NST
thấp, đối với những loài nhƣ gia cầm có số lƣợng nhiều thì không có kết quả chính
xác.
b) Tế bào nuôi cấy in vitro
Khắc phục nhƣợc điểm của những tế bào in vivo, kỹ thuật trên sử dùng
nguồn tế bào đã đƣợc nuôi cấy in vitro để thay thế. Năm 1885, Roux là ngƣời báo
cáo đầu tiên về nuôi cấy tế bào in vitro, hơn 100 năm qua thuật ngữ “nuôi cấy tế

bào” vẫn đƣợc dùng, mặc dù lĩnh vực này đã đƣợc mở rộng từ thập niên 1950 khi
các nhà khoa học đã sử dụng những tế bào nuôi cấy rời (Eldridge, 1985).